Молекулярно-біологічні аспекти змін формотворення у сосни звичайної, індукованих хронічним випромінюванням

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

УДК 575.2:575.117

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ ЗМІН ФОРМОТВОРЕННЯ У СОСНИ ЗВИЧАЙНОЇ, ІНДУКОВАНИХ ХРОНІЧНИМ ВИПРОМІНЮВАННЯМ

Зелена Любов Борисівна

КИЇВ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біофізики та радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Наукові керівники: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор Гродзинський Дмитро Михайлович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач відділу біофізики та радіобіології;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Сорочинський Борис Володимирович, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідувач лабораторії детекції ГМО та біобезпеки відділу геноміки та біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Тищенко Олена Миколаївна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, в.о. завідувача відділу генетичної інженерії;

доктор біологічних наук, професор Коршиков Іван Іванович, Донецький ботанічний сад НАН України, завідувач відділу популяційної генетики.

Захист дисертації відбудеться ”23” жовтня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий ”22” вересня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.А. Кравець



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЇ

Актуальність теми. Виникнення морфологічно змінених форм рослин відбувається як завдяки мутаціям, так і при зміні лімітуючих факторів природного середовища та впливу його забруднювачів техногенного походження (Bruschi et al., 2003). Зокрема, у насадженнях сосни звичайної (Pinus sylvestris L.) у 30-км зоні відчуження ЧАЕС у перші роки після аварії та, починаючи з 90-х років, на деревах хвойних рослин спостерігали прояви різноманітних морфологічних аномалій, зростання кількості яких, вірогідно, спричинене постійною дією хронічного випромінювання в малих дозах (Сорочинский, 1998). Найбільш поширеним видом морфологічних аномалій є варіювання лінійних розмірів хвої. Результати проведених досліджень морфологічно зміненої хвої сосни звичайної та ялини європейської (Picea abies (L.) Karst.) виявили відмінності у кількості та розмірах клітин та їх органел, складі білків, а також збільшення або зменшення площі поперечного перетину тканин (Козубов и Таскаев, 1994; Сорочинский, 1998).

На сьогоднішній день у невеликій кількості наукових праць розглянуто ефекти дії хронічного випромінювання на хвойні рослини за допомогою молекулярно-біологічних методів. Головним чином проведені дослідження присвячені розгляду пошкоджуючої дії іонізуючого випромінювання, що фіксується на морфологічному, цитологічному, гістологічному рівні; відмічено також збільшення кількості хромосомних та хроматидних аберацій у клітинах меристем рослин (Козубов и Таскаев, 1994; Гродзинський, 2000; Гудков, 1985; Geraskin et al., 2003). Прогнозування віддалених наслідків дії радіації та з'ясування механізмів формування морфологічно змінених форм хвойних рослин у зоні відчуження ЧАЕС потребує здійснення комплексного аналізу цього явища.

Зв'язок роботи з науковими програми, планами, темами. Робота виконувалась у рамках бюджетних тем відділу біофізики і радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України: “Хронічне опромінення рослин як фактор формування нестабільності їх геному”, номер державної реєстрації - 0101 U 000394; “Сигнальні і регуляторні системи в формуванні адаптивної відповіді у рослин”, номер державної реєстрації - 0103 U 005729, а також цільової програми "Генетична та клітинна інженерія як основа нової "зеленої революції" в рослинництві", номер державної реєстрації - 0102 U 002963.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи - дослідження молекулярно-біологічних процесів, що можуть обумовити аномальний морфогенез серед рослин сосни звичайної, що росте на території зони відчуження ЧАЕС.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1) вивчити морфологічну та анатомічну структури хвої сосни звичайної; мітотичний аномалія хвоя поліморфізм

встановити вміст цезію-137 у хвої сосни звичайної;

визначити рівень мітотичних аномалій у хвої сосни звичайної;

методом ПЛР проаналізувати рівень поліморфізму ДНК у контрольній і морфологічно аномальній хвої;

дослідити та охарактеризувати особливості експресії різних генів у контрольній і морфологічно аномальній хвої.

Об'єкт дослідження. Аномальний морфогенез у дерев сосни звичайної з зони відчуження ЧАЕС.

Предмет дослідження. Фенотипова та геномна мінливість сосни звичайної в умовах хронічного випромінювання.

Методи дослідження. Морфометричний, гамма-спектрометричний для визначення радіоактивності рослинного матеріалу, цитологічні, цитогенетичні та молекулярно-біологічні методи (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), метод мікроматриць).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше здійснено комплексний аналіз морфологічно зміненої хвої сосни звичайної, що росте в умовах хронічної дії радіації в малих дозах. Відмічено, що зменшення лінійних розмірів хвої відбувається внаслідок зменшення кількості клітин. Виявлено, що меристема морфологічно короткої хвої містить підвищену кількість клітин з хромосомними абераціями та порушеннями мітотичного апарату. У роботі показано, що сформовані в умовах хронічної дії радіації в малих дозах морфологічні аномалії латеральних органів рослин сосни звичайної, характеризуються зміною рівня експресії цілої низки генів, продукти яких беруть участь у різноманітних клітинних процесах.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дослідження молекулярно-біологічних аспектів змін формотворення у сосни звичайної, індукованих хронічним випромінюванням, доцільно використовувати для прогнозування віддаленних наслідків дії хронічного випромінювання у зоні відчуження ЧАЕС на рослинні організми, зокрема на їх генетичний аппарат, а також для пояснення загальних закономірностей морфогенезу хвойних рослин.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом виконаний весь викладений у дисертації об'єм експериментів по дослідженню молекулярно-біологічних процесів, що можуть обумовити аномальний морфогенез сосни звичайної з зони відчуження ЧАЕС, проведено аналіз отриманих результатів та сформульовано висновки. Спільно з науковими керівниками проведено вибір напрямку досліджень та обговорення результатів наукової роботи. Результати виконаних автором досліжень відображені у публікаціях у співавторстві з науковими керівниками завідуючим відділом академіком Гродзинським Д.М. та к.б.н. Сорочинським Б.В. Права співавторів публікацій при викладенні дисертації та автореферату не порушено.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати доповідались на 12 конгресі FESPP (м. Будапешт, 21-25 серпня 2000 р.); на міжнародній конференції "Modern problems of radiobiology, radioecology and evolution" (м. Дубна, 6-9 вересня 2000 р.); на науковій конференції інституту ядерних досліджень НАН України (м.Київ, 20-22 січня 2001 р.); на 13 конгресі FESPP (м. Геракліон, 2-6 вересня 2002 р.); на міжнародному симпозиумі НАТО “The plant cytoskeleton: functional diversity and biotechnological implications” (м. Київ, 23-27 вересня 2002 р.); на VIII конференції молодих учених “Сучасні напрямки у фізіології та генетиці рослин” (м. Київ, 23-25 жовтня 2002 р.); на II міжнародній конференції молодих учених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (м. Харків, 19-23 травня 2003 р.); на щорічній конференції Українського товариства радіобіологів (м. Київ, 22-25 серпня 2006 р.); на ІІ міжнародній конференції молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (м. Харків, 19-21 листопада 2007 р.).

Публікації. Результати дисертаційних досліджень представлено 12 друкованими працями, серед яких 6 статей у фахових виданнях та 6 тез доповідей у збірках матеріалів вітчизняних та міжнародних симпозіумів, конгресів, конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних джерел, що охоплює 252 найменування. Дисертацію викладено на 182 сторінках машинопису, з яких 26 сторінки займає список використаних джерел. Робота містить 26 таблиць та 21 ілюстрацію.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень

У роботі були використані зразки однорічної хвої сосни звичайної, що росте у 10-км зоні ЧАЕС. Потужність дози по зовнішньому гамма-опроміненню у місцях відбору зразків складала 1-3 мР/год. З кожного дерева одночасно збирали як контрольну, так і аномальну, коротку однорічну хвою з пагонів одного віку.

У кожного зразка вимірювали за допомогою штангенциркуля довжину, ширину, товщину та розраховували індекси форми. Визначення радіоактивності рослинного матеріалу проводили за допомогою гамма-спектрометру “Nokia”, оснащеного германієво-літієвим детектором. Радіоактивність матеріалу визначали у лабораторії УкрНДІ сільгоспрадіології (с.Чабани, Київська обл.). Статистичну обробку результатів проводили, використовуючи загальноприйняті методи (Лакин, 1990; Мамаев, 1972).

Аналіз анатомічних структур і цитогенетичний аналіз здійснювали за допомогою мікроскопа Jenamed (Carl Zeiss, Німеччина).

Анатомічну структуру хвої досліджували на поздовжньому та поперечному зрізі. Препарати аналізували без додаткового фарбування. На поперечному зрізі визначали: товщину і ширину клітин епідерми, довжину і товщину клітин гіподерми і ендодерми, підраховували кількість клітин ендодерми, а також розрахункові індекси форми. На поздовжніх зрізах вимірювали довжину і ширину замикаючих клітин продихів, обчислювали їх площу і індекс форми. Оцінку лінійних розмірів клітин проводили при збільшенні х100 за допомогою мікрометра МОВ-1-15. Всього було проаналізовано по 50 клітин епідерми, гіподерми, ендодерми і по 50 пар замикаючих клітин продихів у кожному типі хвої (контрольної і морфологічно аномальної).

Аналіз порушень мітотичного апарату та хромосомних аберацій проводили у меристематичних клітинах контрольної та морфологічно аномальної хвої, які розташовані при основі хвоїнок, використовуючи методику приготування давлених препаратів (Micieta and Murin, 1997). Зразки фарбували 2% розчином оцетоорсеїну у 45% оцтовій кислоті. Всього було проаналізовано по 300 меристематичних клітин, що знаходились на стадії поділу, як у контрольній, так і у короткій хвої. Достовірність отриманих результатів оцінювали відповідно до критерію Фішера.

Дослідження генетичної структури сосни звичайної. ДНК виділяли з хвої сосни звичайної за допомогою методики, запропонованої Дойл і Дойл (Doyle and Doyle, 1990). Генетичний поліморфізм детектували на підставі результатів ПЛР аналізу з 18 довільними праймерами довжиною 10 нуклеотидів (RAPD PCR), а також з 8 праймерами до мікросателітних повторів (ISSR PCR). ПЛР проводили згідно до умов, наведених у роботах (Williams et al., 1990; Tsumura et al., 1996). Аналіз продуктів ампліфікації здійснювали за допомогою електрофорезу в 1,7% агарозному гелі. Для статистичної обробки використовували програму PopGen32 (Yeh and Boyle, 1997).

Аналіз експресії генів у хвої сосни звичайної. Транскрипційну активність генів досліджували за допомогою методу мікроматриць. Транскрипти, відібрані для аналізу, репрезентували різні функціональні категорії та умовно були поділені на 4 функціональні групи, згідно до інформації на сайті http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ (табл. 1).

Підготовку та виготовлення мембран для гібридизації, виділення загальної РНК з хвої, синтез і мічення кДНК, гібридизацію мембран з пробою здійснювали згідно до (van Zyl et al., 2002). Детекцію і кількісну оцінку отриманих результатів гібридизації проводили за допомогою програми Quantity One Image Analysis Program (QOIA; Biorad Ltd, США). Для розрахунку відмінностей в експресії генів і достовірності отриманих результатів виконували нормалізацію даних інтенсивності гібридизації, використовуючи два методи: нормалізація за середнім та Z-score

Таблиця 1 - Функціональні групи транскриптів, використаних для аналізу

Функціональні групи	Кількість транскриптів	% від загальної кількості
I. Зберігання та реалізація генетичної інформації J Трансляція, структура рибосом та біогенез K Транскрипція L Реплікація, рекомбінація та репарація ДНК	33 13 15 5	8,8 3,5 4,0 1,3
II. Клітинні процеси D Поділ клітин O Посттрансляційні модифікації M Біогенез клітинної стінки N Функції та структура цитоскелету P Транспорт іонів T Передача сигналів	164 1 55 64 9 15 20	4,1 0,3 14,8 17,2 2,4 4,0 5,4
III. Метаболізм C Енергетичний обмін G Транспорт та обмін вуглеводів E Транспорт та обмін амінокислот H Коензимний обмін I Метаболізм ліпідів Q Біосинтез, транспорт та катаболізм вторинних метаболітів	86 19 15 15 5 3 29	23,0 5,0 4,0 4,0 1,4 0,8 7,8
IV. Функцію не встановлено	90	24,1
Всього	373	100,0

нормалізація (van Zyl et al., 2002). Математичну обробку результатів здійснювали за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel 97. Статистично достовірними вважались відмінності експресії генів при р < 0,01.

Пошук gi-номерів генів у GenBank здійснювали через Internet на сайті http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Визначення і порівняння нуклеотидних послідовностей генів з іншими у GenBank проводили за допомогою BLAST - аналізу.

Результати досліджень та їх обговорення

Морфологічні та анатомічні ознаки зміненої хвої з сосни звичайної, що росте на території зони відчуження ЧАЕС. У дослідженні використали хвою з сосни звичайної із зменшеними лінійними розмірами, приклад якої наведений на рис. 1.

Результати проведених вимірів показали, що середні значення довжини морфологічно аномальної хвої становили 19,8 мм, ширини - 0,98 мм, товщини - 0,44 мм, що є меншим за контрольні величини у 2,8, 1,5 та 1,5 рази, відповідно. Порівняльний аналіз сирої маси хвої показав зменшення значення цього показника у короткої хвої майже у 6 разів. Середні величини індексу форми, що визначає відношення ширини до довжини і товщини до довжини виявились достовірно більшими у морфологічно аномальній хвої, ніж у контрольній у 1,7 і 2 рази, відповідно. Ймовірно, що відмінність цих індексних показників обумовлена, насамперед, значною відмінністю довжини хвої. Однак характерна видова форма листа зберігалась сталою.

Результати аналізу вмісту цезію-137 виявили неоднорідність у розподілі радіонукліду як між рослинами, так і між хвоєю з відмінними лінійними розмірами одного дерева. Отримані результати узгоджуються з результатами щодо варіабельності розподілу радіонукліду серед насаджень деревних рослин у 30-км зоні ЧАЕС (Щеглов, 2000; Юшков и др., 1993). Середнє значення вмісту цезію-137 у короткій хвої становило 1,6 MБк/кг і виявилось меншим у 1,6 разів за величину цього показника у контрольній хвої, де вона складала 2,5 MБк/кг.

Відомо, що зменшення або збільшення розмірів органу відбувається за рахунок зміни розмірів клітин або ж їх кількості (Мирославов и Кравкина, 1990; Воробьева и Бендер, 2001). Проведені у перші роки після аварії на ЧАЕС дослідження показали зміни гістологічної структури, розмірів і кількості клітин у морфологічно аномальній хвої сосни звичайної та ялини європейської (Козубов и Таскаев, 1994). Зважаючи на це, був проведений аналіз анатомічних структур вкороченої хвої.

Цитологічний аналіз не виявив значних відмінностей розмірів клітин епідерми, гіподерми й ендодерми між контрольною і морфологічно аномальною хвоєю, однак, середня кількість клітин ендодерми в одній хвоїнці для контрольних зразків становила 49 і достовірно перевищувала у 1,5 рази цей показник в аномальній хвої, для якої середня кількість складає 33 клітини на хвоїнку.

Результати порівняльного аналізу розмірів замикаючих клітин хвої сосни, виконаного на поздовжніх зрізах, показали незначне зменшення довжини, ширини та площі замикаючих клітин у короткій хвої, а значення відносного показника форми було однаковим у двох вибірках.

Отже, аналіз морфологічних і анатомічних показників хвої сосни звичайної з зони ЧАЕС показав, що найбільша відмінність між контрольною та аномальною хвоєю спостерігається для таких показників, як довжина хвої та кількість клітин.

Характеристика цитогенетичної та геномної мінливості у тератогенних та контрольних тканинах Pinus sylvestris L. Результати анатомічних досліджень свідчать, що розміри клітин у контрольній і морфологічно аномальній хвої сосни звичайної не відрізняються. Однак у короткій хвої відмічено зменшення кількості клітин, що може бути зумовлене порушеннями у процесі мітозу, наприклад, наслідком цитогенетичних ушкоджень. Для того, щоб оцінити та порівняти стан хромосомного апарату у контрольній і вкороченій хвої, здійснили цитогенетичний аналіз меристематичних тканин в основі хвої. Як у контрольній, так і у морфологічно аномальній хвої встановлено такі порушення: наявність к-мітозів, хромосомні мости і хромосомні фрагменти, при цьому коротка хвоя містила більшу кількість клітин як з мітотичними аномаліями, так і з хромосомними абераціями. Загальна частка клітин із зазначеними порушеннями складала 36% в аномальній хвої, що перевищує у 1,6 рази контрольні показники.

Оскільки поділ клітин контролюється на генетичному рівні, а також пошкодження хромосомного апарату можуть спричинити зміни у нуклеотидній послідовності, то подальше вивчення морфологічно аномальної хвої сосни звичайної, що росте на території Чорнобильської зони відчуження, було спрямовано на аналіз мінливості геному. З цією метою у нашому дослідженні були використані ДНК-маркери, що мають множинну локалізацію у геномі, а саме RAPD- та ISSR-маркери.

Аналіз продуктів ПЛР з використанням довільних праймерів. ПЛР-аналіз здійснювали, використовуючи 18 декануклеотидних праймерів. Варіювання кількості та розмірів фрагментів ПЛР у спектрах різних зразків встановлено після ампліфікації лише з 4 з усіх використаних праймерів, ці праймери і були використані у подальших дослідженнях. У результаті ПЛР з вибраними 4 праймерами, що наведені у табл. 2, була отримана однакова кількість ампліконів, по 33, як для контрольної, так і для аномальної хвої. У середньому для одного зразка відмічено по 8 - 9 електрофоретичних смуг при використанні одного праймеру. Розмір фрагментів ампліфікації варіював від 300 до 2500 п.н. (табл. 2).

Таблиця 2 - Загальна кількість продуктів ампліфікації та їх молекурна маса для зразків контрольної та морфологічно аномальної хвої сосни звичайної

Тип хвої	Загальна кількість продуктів ПЛР	Молекулярна маса продуктів ПЛР, п. н.
		Праймер №1 GCACCGAGAG	Праймер №2 CTCAGCCCAG	Праймер №3 GGCTAGGGCG	Праймер №4 GGTCCCTGAC
Контрольна	33	400-800	300-800	300-2500	300-1500
Аномальна	33	400-800	300-800	300-2500	300-1500

На основі отриманих електрофореграм за допомогою програми PopGen32 у кожній групі зразків був розрахований відсоток поліморфних ампліконів і коефіцієнт попарної подібності. Ці показники, відповідно, становили для контрольної хвої 76% і 0,74, а для морфологічно короткої - 70% і 0,73.

Результати порівняльного аналізу продуктів ПЛР при аналізі контрольної та вкороченої хвої показали, що загальна кількість продуктів ампліфікації складала 35, серед яких 28 (80%) були поліморфними. Відмічено також, що за використання праймеру №3 два амплікони з розміром більшим від 1000 п.н. зустрічалися лише серед продуктів ампліфікації ДНК з контрольної хвої, а з розміром меншим від 300 п.н. -при аналізі морфологічно аномальної хвої (рис. 2).

Аналіз мінливості геному сосни за допомогою ISSR-маркерів. Використання ISSR-маркерів дозволяє уникнути недоліків, що виникають при застосуванні RAPD-маркерів: збільшити точність ампліфікації та відтворюванність спектрів продуктів ПЛР, зменшити “анонімність” фрагментів ампліфікації, що є ділянками ДНК, розташованими між інвертованим повтором мікросателітного локусу (Глазко и др., 1999). У нашій роботі були використані 8 праймерів до мікросателітних послідовностей, серед яких 5 виявились поліморфними та були використані у подальшому дослідженні.

Спектр продуктів ампліфікації з 5 праймерами та ДНК контрольної хвої нараховував 75 фрагментів, а ДНК з морфологічно аномальної хвої - 71. Розмір отриманих ампліконів варіював від 200 до 3000 п.н. (рис. 3).

Частка виявлених поліморфних локусів залежала від нуклеотидної послідовності праймера і у середньому складала 77 і 82% у зразках ДНК з контрольної і короткої хвої, відповідно. Значення коефіцієнта попарної подібності становило 0,74 у контрольній і 0,76 у вкороченій хвої. Порівняльний аналіз продуктів ПЛР між контрольною та морфологічно аномальною хвоєю показав, що при загальній кількості фрагментів (77) відсоток диференційно ампліфікованих фрагментів варіював від 63,6 до 100%, у середньому - 88,4% (табл. 3).

Фрагментів ампліфікації, специфічних для контрольної або короткої хвої, виявлено не було.

Таким чином, виявлений за використання обох типів ДНК-маркерів високий рівень поліморфних локусів унеможливлює визначення ділянок генома, що відповідають за формування морфологічно вкороченої хвої. Тому подальші дослідження були спрямовані на аналіз транскрипційної активності генів у контрольній та аномальній хвої.



Таблиця 3 - Характеристика продуктів ампліфікації ДНК контрольної і морфологічно аномальної хвої з праймерами до мікросателітних послідовностей

Послідовність праймера 5` 3`	Розмір ампліконів, п.н.	Загальна кількість ампліконів	% поліморфних локусів
(AC)8T	300 - 1300	11	63,6
(GA)8TC	300 - 1800	18	83,3
(AG)8G	200 - 2000	21	95,2
(GACA)4	200 - 3000	13	100
GGG(TGGGG)2TG	250 - 2500	14	100

Особливості експресії генів у хвої сосни звичайної. Вивчення транскрипційної активності генів за допомогою методу мікроматриць дає змогу аналізувати значну кількість генів одночасно. В останні роки метод набув широкого використання у дослідженнях дії різних стресорних чинників на експресію генів багатьох організмів, у тому числі і рослин (Kerr et al., 2000), а також при проведенні транскриптомного аналізу процесів розвитку та росту (Girke et al., 2000). Дослідження спектру експресії генів надає можливість зрозуміти роль кожного гена протягом життєвого циклу рослини, у захисних реакціях, у процесах пристосування організму до змін оточуючого середовища.

У нашій роботі ми аналізували транскрипційну активність генів у контрольній та аномальній хвої сосни звичайної за допомогою методу мікроматриць з використанням матриці кДНК сосни ладанної (Pinus taeda). Як показано у попередніх дослідженнях, матрицю кДНК сосни ладанної використовують для аналізу експресії генів у філогенетично споріднених видів, зокрема сосни звичайної (van Zyl et al., 2002). Аналіз транскрипційної активності генів здійснювали для зразків з окремих рослин, а також порівнювали групи зразків контрольної та вкороченої хвої. Результати проведеної нами гібридизації з 373 транскриптами виявили відмінності експресії генів у хвої різної довжини (рис. 4).

Особливості експресії генів вкороченої хвої індивідуальних рослин сосни звичайної. З урахуванням встановленого раніше критерій статистичної достовірності p < 0,01 (van Zyl et al., 2002), для подальшого аналізу з 373 проаналізованих були відібрані гени, рівень експресії яких відрізнявся (підвищився або зменшився) у короткій хвої у порівнянні з контрольними значеннями. Частка

таких генів від загальної їх кількості у матриці варіювала у межах 8,6 - 17,2%, з середнім значенням - 13%. Розподіл відповідно до функціональних груп і підгруп показав, що зміна транскрипційної активності зафіксована у всіх функціональних категоріях: серед генів, що відповідають за зберігання й обробка інформації (I), регулюють клітинні процеси (II) та метаболізм (III) і для групи генів, функцію яких не встановлено (IV) (табл. 4).

Найбільш чисельною була група генів, що беруть участь у процесах метаболізму у рослині, а найменш чисельною - тих, що відповідають за зберігання й реалізацію генетичної інформації. Всі досліджені функціональні підгрупи можна поділити на 3 умовні категорії:

- підгрупи, експресія генів в яких змінюється лише в одному напрямку (збільшується або зменшується). До таких належать підгрупи генів з негативною регуляцією експресії, продукти яких беруть участь у метаболізмі ліпідів і коензимному обміні, а також підгрупа генів з позитивною регуляцією експресії, продукти цих генів беруть участь у процесі поділу клітин;

- підгрупи, що нараховують рівну кількість генів із підвищеною і зменшеною транскрипційною активністю. Це гени, що кодують білки необхідні у процесах реплікації, рекомбінації, репарації, в енергетичному обміні, а також група генів з невстановленою функцією;

- підгрупи, в яких переважають або гени з підвищеним рівнем експресії, або зі зменшеним. Загальна кількість таких підгруп - 13, серед них у 8 переважають гени, транскрипційна активність яких вища у короткій хвої, а у 5 - нижча. Слід також зазначити, що 5 з 6 підгруп II групи, що охоплює гени клітинних процесів, містять більшу кількість генів з підвищеною експресією, а транскрипційна активність більшості генів, що беруть участь у процесах посттрансляційної модифікації, є

Таблиця 4 - Розподіл генів з різним рівнем експресії у морфологічно аномальній та контрольній хвої Pinus sylvestris L. згідно до функціональних груп і підгруп (див. табл. 1)

Групи та підгрупи	Кількість генів зі зміненою експресією
	Дерево №1	Дерево №2	Дерево №3	Дерево №4	Дерево №5
I	J	2	3	2	2	2
	K	1	1	-	2	2
	L	-	1	1	-	-
II	D	1	-	-	-	1
	O	7	9	4	7	2
	M	9	5	6	8	8
	N	3	1	2	2	1
	P	5	3	1	3	1
	T	3	4	3	1	3
III	C	1	6	2	3	-
	G	4	1	4	3	1
	E	1	4	1	1	-
	H	1	1	-	1	-
	I	-	-	-	-	1
	Q	7	-	4	6	2
IV	19	14	9	9	8
Всього	64	53	39	48	32

меншою у морфологічно аномальній хвої.

Загалом, транскрипційна активність 58% усіх генів виявилась вищою, а для 42% - нижчою у вкороченій хвої .

Цілком імовірно, що відмінності в експресії генів між зразками на одному дереві можуть бути обумовлені особливостями фізіологічних процесів, що відбуваються у рослині. Підтвердженням цього є той факт, що значна частина генів, транскрипційна активність яких у короткій хвої підвищилась або зменшилась, бере участь у метаболічних процесах. Тому для виявлення закономірності експресії генів в аномальній хвої попарним порівнянням спектрів окремих дерев були виділені гени зі зміненою експресією у короткій хвої, спільні щонайменш для 2 рослин. Мінімальна кількість таких генів - 2, максимальна - 20. Для більшості цих транскриптів величина активності є вищою у морфологічно аномальній хвої. Загалом, всього генів зі зміненою експресією у короткій хвої щонайменш 2 рослин - 42. Продукти більшості з них беруть участь у різноманітних клітинних процесах, а найменший відсоток належить генам, що відповідають за зберігання й реалізацію генетичної інформації.

З 42 генів, що складають загальний спектр, транскрипційна активність 7 є меншою, а 35 більшою у морфологічно короткій хвої у порівнянні з результатами, отриманими для контрольної хвої. Коефіцієнт співвідношення показників рівня експресії генів між контрольною і вкороченою хвоєю варіює від 1,07 до 1,75 для генів з позитивною регуляцією їх експресії в аномальній хвої і від 1,05 до 1,17 - для генів з негативною регуляцією. Серед останніх найбільша відмінність в експресії зафіксована для гена, що кодує УДФ-глюкозо-6-дегідрогеназу, а найменша - для гена білка теплового шоку, транскрипційна активність якого майже однакова у хвої різної довжини. Серед генів з позитивною регуляцією у короткій хвої коефіцієнт співвідношення був найбільшим для гена, що кодує білок з невизначеною функцією, а найменшим для гена, продукт якого бере участь в енергетичному обміні (IN2-2 білок). Зростання транскрипційної активності 4 генів, що кодують білок клітинної стінки, арабіногалактан-подібний білок, аскорбатпероксидазу та убіквітин-зв`язуючий фермент, визначено у морфологічно короткій хвої 3 дерев. Збільшення рівня експресії 2 останніх генів відмічено у вкороченій хвої 5 дерев. Ці гени кодують ензими, які беруть участь у процесах розвитку рослини та у відповіді організму на стресові умови. Так, при детоксикації хімічно активних форм кисню зростає синтез аскорбатпероксидази, тобто змінюється експресія гена, що кодує аскорбатпероксидазу (Cushman and Bohnert, 2000). Убіквітин-зв`язуючий фермент є невід`ємним елементом при формуванні комплексу убіквітин - білок та сприяє усуненню аномальних / пошкоджених білків з ядра та цитоплазми (Ingvardsen and Veierskov, 2001). Зміна експресії цих двох генів, ймовірно, є важливою для всіх біологічних процесів, що відбуваються у рослині.

Оскільки зафіксовані відмінності транскрипційної активності 42 генів між контрольною і морфологічно аномальною хвоєю можуть бути проявом індивідуальної мінливості і, враховуючи високий рівень генетичної мінливості серед хвойних рослин, був проведений порівняльний аналіз експресії цих генів у контрольній і короткій хвої. Подібність величин транскрипційної активності генів оцінювали за допомогою коефіцієнтів кореляції. Проведені розрахунки показали, що значення коефіцієнтів кореляції знаходяться в межах від 0,65 до 0,88 у контрольної та від 0,82 до 0,96 у морфологічно аномальної хвої. Зафіксовані високі значення коефіцієнту кореляції як для контрольної, так і для вкороченої хвої вказують на низький рівень мінливості транскрипційної активності генів серед контрольної та короткої хвої. Тобто, ймовірно, у морфологічно аномальній хвої відбулась зміна експресії 42 генів, що реєструється у підвищенні або зменшенні їх транскрипційної активності.

Транскриптомний аналіз контрольної та морфологічно аномальної хвої сосни звичайної. Аналіз результатів транскриптомної активності генів здійснювали також з метою порівняти генну експресію між групою контрольної та морфологічно аномальної хвої. Кожна група складалась із зразків, зібраних з 5 дерев. У результаті такого аналізу були відібрані 12 генів, відмінність у транскрипційній активності яких між двома групами зразків була статистично достовірною - p < 0,01 (табл. 5).



Таблиця 5 - Гени, експресія яких відрізняється між контрольною (К) та аномальною (А) хвоєю

ID клону	gi номер	Назва за GenBank	Коефіцієнт співвідношення
			A / K	К / А
19C8	5424015	Функцію не визначено	1,12
1CAB7E	3365725	1-аміноциклопропан-1-карбоксилатоксидаза	1,16
19G3	5424042	Пектинестераза	1,17
ST26H09	5903438	Фенілаланінамонійліаза	1,26
ST35A05	6019796	L-аскорбатпероксидаза	1,28
ST37B01	6019964	Убіквітин-зв`язуючий фермент	1,67
24F10		Неохарактеризований		1,07
18E7	5423957	Гістон H2A-подібний білок		1,08
ST5D04	5859132	Рибулозобіфосфаткарбосилаза (РБФК), мала субодиниця		1,18
N67B05	7363493	Лаказа		1,2
PC1E10	5858784	Глутатіонпероксидаза		1,32
5N5F	3366025	AP2 домен-вміщуючий транскрипційний фактор		1,32

За розподілом згідно до функціональних груп (див. табл. 1) по 2 гени належать до I і IV групи, 3 до ІІІ та 5 до ІІ групи.

Серед 12 відібраних генів експресія 6-ти була вищою у морфологічно аномальній хвої. До них відносяться:

Гени, що кодують 1-аміноциклопропан-1-карбоксилатоксидазу, аскорбатпероксидазу та убіквітин-зв`язуючий фермент. Зміна активності цих генів пов'язана, головним чином, з реакцією організма на стресові фактори;

Гени, що кодують пектинестеразу і фенілаланінамонійліазу, ферменти клітинної стінки;

Гени, функцію яких не встановлено.

Експресія 6-ти інших генів була меншою у морфологічно аномальній хвої:

1. Ген, що кодує глутатіонпероксидазу - оксидоредуктазу, яка бере участь у метаболізмі глутатіону. Зростання кількості цього фермента відмічено в умовах окисного стресу. Ген, що кодує фермент клітинної стінки лаказу, який бере участь у процесі лігніфікації клітинної стінки, росту і розвитку рослини (Ranocha et al., 1999; McDougall, 2001);

2. Змішана група генів, що кодують гістон H2A-подібний білок, малу субодиницю РБФК, AP2 домен-вміщуючий транскрипційний фактор і білок з невизначеною функцією. Гістон Н2А належить до групи висококонсервативних нуклеосомних гістонів. Відомо, що гістон Н2А ковалентно зв'язаний з убіквітином, що свідчить про його участь у протеолізі білків (Сингер, 1998). Рибулозобіфосфаткарбоксилаза - ключовий фермент фотосинтезу, гетеромультимер, що складається з 8 великих і 8 малих субодиниць (Сингер, 1998). Ген великих субодиниць розташований у хлоропластному геномі, а малі субодиниці кодуються ядерною ДНК. Експресія генів відбувається у різних тканинах на різних стадіях розвитку рослини і залежить від освітлення. Фермент бере участь в утилізації вуглекислого газу, у метаболізмі гліоксилату і дикарбоксилату. АР2 домен-вміщуючі транскрипційні фактори відіграють центральну роль у формуванні меристеми квітки і регулюванні експресії гомеотичних генів; показана їх активність у листі та стеблі, а також під час розвитку насіння (Jofuku et al., 1994). Індукція генів транскрипційних факторів, що містять AP2 домен, відбувається у відповідь на дію низьких температур, засолення і посухи (Chen et al., 2002). Загалом, отримані на сьогоднішній день результати свідчать про те, що АР2 - це клас регуляторних білків рослини, що здійснюють загальний контроль розвитку рослини. Зростання транскрипційної активності гена АР2 домен-вміщуючого транскрипційного фактора вказує на вірогідність порушення проходження процесу морфогенезу у морфологічно аномальній хвої сосни звичайної.

Експресія генів, продукти яких беруть участь у різноманітних клітинних процесах, залежить від регуляторних білків, у тому числі транскрипційних факторів. Зміна їх кількості обумовлює збільшення або зменшення експресії цілої низки генів. Дослідження транскрипційної активності генів показало, що між контрольною та морфологічно аномальною хвоєю існують відмінності в експресії генів ряду регуляторних білків. Так, результати аналізу, проведеного для індивідуальних рослин, свідчать, що у спектрах 2 дерев наявний ген TUBBY-подібного білка, який взаємодіє з іншими білками та направляє їх до місць деградації за участю убіквітин-залежної системи протеоліза (Xiao and Jang, 2000), бере участь у контролі проходження клітинного циклу, трансдукції сигналу, регуляції транскрипції, росту і розвитку рослини (Xie et al., 1998; Samach et al., 1999); у спектрах інших дерев виявлені також ген ДНК-зв'язуючого білка, аналога білка CND41 татюну, що пригнічує експресію генів хлоропластів і бере участь у деградації факторів транскрипції (Murakami et al., 2000; Олескина и др., 2001); ген фактора транскрипції, що містить AP2 домен, який згадано вище; ген tsi1, що кодує ДНК-зв'язуючий білок, який належить до класу AP2 регуляторних білків і здійснює регуляцію експресії генів у відповідь на стресові чинники (Park et al., 2001). Ймовірно, що порушення активності навіть незначної кількості регуляторних білків на початкових етапах розвитку хвої, можливо в апікальній меристемі пагона, призвело до зміни програми розвитку органу і зменшення його розмірів.

Таким чином, внаслідок проведених досліджень транскрипційної активності генів у хвої сосни звичайної виявлені гени, рівень експресії яких змінився у морфологічно аномальній хвої. Транскрипційна активність більшості з цих генів зросла.



ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проведено аналіз аномальної хвої сосни звичайної, що сформувалась в умовах хронічної дії радіації, за допомогою морфологічних, цитологічних, молекулярно-біологічних методів. З'ясовано, що утворення аномального органу обумовлено зміною регуляції експресії генів.

За умов хронічної дії радіації у сосни, що росте на території зони відчуження ЧАЕС, спостерігаються прояви морфологічних аномалій, найбільш вираженими серед яких є зміна лінійних розмірів хвої. При цьому вся хвоя, представлена на окремих гілках, має однакову форму: довга або коротка. В останні роки зустрічаються переважно випадки зменшення лінійних розмірів хвої.

За результатами морфологічного аналізу останніх років встановлено, що морфологічно аномальна хвоя сосни звичайної із зони відчуження ЧАЕС була коротшою у 2,8 разів і мала меншу у 6 разів вагу у порівнянні з контрольними середніми значеннями.

Вміст цезію-137, як одного з головних дозоформуючих радіонуклідів, характеризувався широким варіюванням концентрації у контрольній і морфологічно зміненій хвої, при цьому середня питома активність радіонукліду була меншою у короткій хвої.

Шляхом вивчення кількості і розмірів клітин епідерми, гіподерми, ендодерми, а також розмірів замикаючих клітин продихів визначено, що укорочення лінійних розмірів хвої обумовлено зменшенням кількості клітин, а не їх розмірів.

Аналіз меристематичних клітин у хвої показав підвищену кількість клітин з аномаліями мітозу та хромосомними абераціями у морфологічно аномальній хвої у порівнянні з контролем.

За допомогою методів RAPD- та ISSR-ПЛР встановлено високий рівень поліморфізму у контрольній і вкороченій хвої.

Результати транскриптомного аналізу показують, що у морфологічно аномальній хвої у порівнянні з контрольною змінювався рівень експресії генів, задіяних у різних клітинних процесах (поділу клітин, транспорту іонів, передачі сигналів, енергетичному обміні, транспорту та обміну вуглеводів, синтезу амінокислот, метаболізмі ліпідів та інших), а також генів регуляторних білків, у тому числі транскрипційних факторів. Особливо помітне зростання транскрипційної активності спостерігали для генів, що кодують убіквітин-зв'язуючий фермент та аскорбатпероксидазу.

Встановлено якісні та кількісні зміни функціональної активності генів у морфологічно аномальній хвої з сосни звичайної, що росте в умовах хронічної дії радіації, що свідчить про порушення регуляції експресії багатьох генів.

На підставі отриманих результатів з'ясовано, що процес формування морфологічно аномальної хвої обумовлений змінами у структурно-функціональній організації генома сосни звичайної.



СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Зеленая Л.Б. Особенности кариотипа тканей сосны (Pinus silvestris), сформировавших морфологические аномалии в условиях зоны отчуждения Чернобыльской АЭС / Л.Б. Зеленая, Б.В. Сорочинский, Д.М. Гродзинский // Доповіді НАН України. - 2002. - №1. - С. 172-175. (Здобувачем проаналізовано літературу, зібрано матеріал, розроблено та поставлено експериментальну частину, проведено цитогенетичний аналіз і статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів досліджень, написано статтю).

2. Sorochinsky B. Is the cytoskeleton involved in the irradiation-induced аbnormal morphogenesis of coniferous plants?/ B. Sorochinsky, L. Zelena // Cell Biology International. - 2003. - Vol.27. - P. 275-277. (Здобувачем проаналізовано літературу, виконано експериментальну частину, здійснено статистичну обробку та інтерпретацію отриманих результатів, написано статтю).

3. Zelena L. Influence of a contaminated environment on the stability of plant genomes/ L. Zelena, B. Sorochinsky // Genomics for Biosafety in Plant Biotechnology, IOS Press. - 2004. - P. 132-136. (Здобувачем проаналізовано літературу, зібрано матеріал, розроблено і здійснено експериментальну частину, проведено статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів досліджень, написано статтю).

4. Зелена Л.Б. Особливості експресії генів у морфологічно аномальній хвої сосни звичайної / Л.Б. Зелена, Б.В. Сорочинський // Український біохімічний журнал. - 2005. - Т.77, №1. - С. 78-83. (Здобувачем проаналізовано літературу, розроблено та поставлено експериментальну частину, проведено транскриптомний аналіз і статистичну обробку даних, написано статтю).

5. Indications of limited altered gene expression in Pinus sylvestris trees from the Chernobyl region / L. Zelena, B. Sorochinsky, S. von Arnold, L. van Zyl, D.H. Clapham // Journal of Environmental Radioactivity. - 2005. - Vol.84. -P. 363-373. (Здобувачем проаналізовано літературу, зібрано матеріал, розроблено та поставлено експериментальну частину, проведено молекулярно-генетичний аналіз і статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів досліджень, написано статтю).

6. Зеленая Л.Б. Сравнительный анализ генной экспрессии в нормальной и морфологически аномальной хвое сосны обыкновенной, произрастающей в зоне отчуждения ЧАЭС / Л.Б. Зеленая, Б.В. Сорочинский // Збірник наукових праць інституту ядерних досліджень. - 2002. - №2. -С. 120-122. (Здобувачем проаналізовано літературу, зібрано матеріал, розроблено і здійснено експериментальну частину, проведено статистичну обробку даних, здійснено обговорення результатів досліджень, написано статтю).

7. Sorochinsky B.V. Investigation of the abnormal morphogenesis among the coniferous plants from the Chernobyl zone / B.V. Sorochinsky, L.B. Zelena // Modern problems of radiobiology, radioecology and evolution: international conference, 6-9 September 2000: abstracts. - Dubna, Russia. - P. 155.

8. Zelena L.B. Cytogenetic studies of morphologically abnormal needles of Pinus sylvestris from the Chernobyl exclusion zone/ L.B. Zelena, B.V. Sorochinsky // 12th Congress of the FESPP, 21-25 August 2000: abstracts. - Budapest, Hungary. - P. s209.

9. Zelena L.B. Microarray analysis of the morphologically abnormal pine plants from the Chernobyl exclusion zone / L.B. Zelena, B.V. Sorochinsky, S. von Arnold, L. van Zyl, D.H. Clapham // 13th Congress of the FESPP, 2-6 September 2002: abstracts. - Hersonissos, Greece. - P. 348.

10. Зеленая Л.Б. Анализ морфологически аномальной хвои сосны обыкновенной с помощью ДНК-маркеров // Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений: II международная конференция молодых ученых, 19-23 мая 2003 г.: сборник тезисов. - Харьков, 2003. - С. 41.

11. Zelena L. Cytological studies of morphologically abnormal pine needles // European radiation research: The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society, 22-25 August 2006: abstracts. - Kyiv, 2006. - P. 228.

12. Zelena L. Genomic analysis of Pinus sylvestris needle abnormality // Біологія: від молекули до біосфери: ІІ міжнароднa конференція молодих учених, 19-21 листопада 2007 р.: тези доповідей. - Харків, 2007. - С. 137-138.



АНОТАЦІЇ

Зелена Л.Б. Молекулярно-біологічні аспекти змін формотворення у сосни звичайної, індукованих хронічним випромінюванням. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено дослідженню молекулярно-біологічних аспектів формування морфологічно аномальної хвої сосни звичайної, що росте на території зони відчуження ЧАЕС. Потужність дози по зовнішньому гамма-опроміненню у місцях відбору зразків складала 1 - 3 мР/год. Здійснено аналіз вкороченої хвої на морфологічному, цитологічному та молекулярному рівні. Встановлено, що морфологічно аномальна хвоя характеризується зменшеними у 2,8 разів довжиною, у 1,5 рази шириною і у 1,5 рази товщиною в порівнянні з контролем. Проведений радіометричний аналіз не виявив достовірних відмінностей у вмісті цезію-137 між контрольною та вкороченою хвоєю. Результати цитологічного аналізу показали, що зменшення лінійних розмірів хвої відбувається за рахунок зменшення у 1,5 разів кількості клітин, а не їх розмірів. У меристемі короткої хвої відмічено зростання у 1,6 разів кількості клітин з мітотичними порушеннями.

Оцінку рівня мінливості генома дослідних та контрольних знарзків хвої з сосни звичайної здійснювали за допомогою методу RAPD- та ISSR-ПЛР. Встановлено, що відсоток поліморфних локусів є високим і складає 80% (RAPD-маркери) і 88,4% (ISSR-маркери).

Методом мікроматриць було проаналізовано експресію 373 генів.у хвої сосни звичайної. Показано збільшення рівня експресії генів, що кодують убіквітин-зв'язуючий фермент і аскорбатпероксидазу, у всіх проаналізованих зразках морфологічно аномальної хвої.

Ключові слова: сосна звичайна, морфологічно аномальна хвоя, хронічне випромінювання, мінливість геному, ДНК-маркери, експресія генів.

Зеленая Л.Б. Молекулярно-биологические аспекты изменений формообразования у сосны обыкновенной, индуцированных хроническим излучением. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена исследованию молекулярно-биологических аспектов формирования морфологически аномальной хвои сосны обыкновенной, произрастающей на территории зоны отчуждения ЧАЭС. Мощность дозы по внешнему гамма-облучению в местах отбора образцов составляла 1 - 3 мР/час. Осуществлен анализ укороченной хвои на морфологическом, цитологическом и молекулярном уровне.

Обнаружено, что морфологически аномальная хвоя характеризуется меньшими в 2,8 раза длиной, в 1,5 раза шириной и толщиной. Проведенный радиометрический анализ не выявил достоверных отличий концентрации цезия-137 между контрольной и укороченной хвоей.

Результаты цитологического анализа показали, что уменьшение линейных размеров хвои происходит за счет уменьшения в 1,5 раз количества клеток, а не их размеров. В меристеме короткой хвои отмечено увеличение в 1,6 раз количества клеток с митотическими нарушениями.

Оценку уровня изменчивости генома сосны обыкновенной проводили с помощью метода RAPD- и ISSR-ПЦР. Установлено, что процент полиморфных локусов высок и составляет 80% (RAPD-маркеры) и 88,4% (ISSR-маркеры). Методом микроматриц проанализировано экспрессию 373 генов в хвое сосны обыкновенной. Увеличение уровня экспрессии генов, кодирующих убиквитин-связывающий фермент и аскорбатпероксидазу, определено во всех проанализированных образцах морфологически аномальной хвои. Ключевые слова: сосна обыкновенная, морфологически аномальная хвоя, хроническое излучение, изменчивость генома, ДНК-маркеры, экспрессия генов.

Zelena L.B. Molecular-biological aspects of morphogenesis modifications in Scots pine induced by chronic radiation. - Manuscript.

The thesis submitted to acquire the degree of Candidate of Science in Biology (PhD), speciality 03.00.15 - Genetics. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

The thesis is devoted to studying of molecular-biological aspects of Scots pine morphologically abnormal needle formation. 1-year pine needles were collected in Chernobyl region where gamma-irradiation dose rate was 1 - 3 mR/h. Control and shorten needles were taken from the same trees. The morphological, cytological and molecular analysis of pine short needles was carried out.

It was revealed that morphologically abnormal needle length, width and thickness were 2,8, 1,5 and 1,5 times as little. There was no difference in cesium-137 content between control and shorten needles.

The analysis of needle anatomical structures was performed: the cell size and the amount of cells were defined. The size of epidermal, hypodermal, endodermal and stomata guard cells was the same in both control and short needles but the amount of endodermal cells was less in shorten needles up to 1,5 times. It indicates that decreasing of needle length is caused by reduction of cell amount.

The increasing of cell number with mitotic damages was detected in morphologically abnormal needles. The percent of such cells was 36% in short and 23% in control needles.

To examine genetic variability that can underlie morphological variation in pine needle length PCR analysis with RAPD- and ISSR-markers was applied. Patterns of PCR products obtained by using 18 random decamer primers and 8 primers to microsatellite repeats were scored, explored and compared between control and shortened needle samples. The size of amplicons varied from 300 to 2500 bp (RAPD PCR) and ranged between 200-3000 bp (ISSR PCR). Level of polymorphic loci calculated for control and short needles was equal to 76% and 70% (for RAPD-markers); 77% and 82% (for ISSR-markers), respectively. The comparative analysis of amplicon patterns produced by amplification with DNA isolated from control and morphologically abnormal needles revealed that level of polymorphic loci was 80% (RAPD-markers) і 88,4% (ISSR-markers).

In order to evaluate the levels of gene expression in control and morphologically abnormal pine needles, arrays consisting of 373 identifiable genes of loblolly pine printed on nylon membranes were hybridized with labelled cDNA derived from control and short needles of Scots pine. Differences in gene expression between control and abnormal tissues were revealed. 58% genes with altered expression were up-regulated and 42% down-regulated in morphologically abnormal needles. Two nucleotide sequences, coding for a ubiquitin-conjugating enzyme and for ascorbate peroxidase, were significantly up-regulated in all analyzed abnormal tissues.

Key words: Scots pine, morphologically abnormal needle, chronic radiation, genome variability, DNA-markers, gene expression.

Размещено на Allbest.ru