Геном человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Геном человека

1. Строение гена человека

В каждой диплоидной клетке человека 46 хромосом, содержащих около 6пг ДНК и 3,2 х 10⁹ пар нуклеотидов, длина всех молекул ДНК около 2м. А если учесть, что тело взрослого человека состоит примерно из 5х10¹³ клеток, то общая длина молекул ДНК в организме достигнет 1х10¹⁴ м, что в тысячи раз превышает расстояние от Земли до Солнца.

В начале 80-х годов данного столетия начал осуществляться один из наиболее дерзновенных, дорогостоящих и потенциально важных международных проектов в истории цивилизации - «Геном человека».

В 1996-1998 гг. только в Америке было потрачено на реализацию проекта -200, 225 и 253 млн. долларов. В среднем определение 1п.о. оценивалось в 1$ на начало 90-х годов и в настоящее время цена составляет 0.4$ и продолжает снижаться.

Марк Адамс и Крейг Вентер (Институт Геномных Исследований в шт. Мэриленд) - внесли основной весомый вклад в решение этого проекта и на сегодняшний день являются самыми цитируемыми авторами во всех областях науки.

Целью проекта «Геном человека» было:

Составление генетической карты, на которую наносили гены отстоящие друг от друга на расстоянии 2млн оснований (2Мб)

Составление физической карты каждой хромосомы (разрешение 01.Мб (мегабаза - 1млн оснований наывается 1мегабазой)

Получить карту всего генома в виде в виде охарактеризованных по отдельности клонов 5Кб - в одном клоне)

Выяснение последовательности оснований во всех молекулах ДНК (разрешение 1основание)

Нанести все гены человека на полностью секвенсовую карту человека

Генетические - выявление всех генов, присутствующих в геноме организма и установление между ними хотя бы примерного расстояния.

Физические карты - установление соответствия полос (при дифференциальном окрашивании) и генов. Использование метода FISH окраски позволило достичь разрешения от 2-5 Мб, а потом повысить его до 100Кб (с помощью рестриктаз)

Секвенсовые карты - точная последовательность нуклеотидов - или методов секвенирования. Картирование генов

Выяснение группы сцепления

Поиск ближайших фланкирующих маркеров

Определение физической области (ДНК-последовательности) включающей искомый ген

Клонирование набора фрагментов ДНК, перекрываемую область;

Выделение из этого наборов клона, содержащих транскрибируемые последовательности ДНК соответсвующие гену или его фрагменту;

Анализ специфических м РНК и клонирование кДНК-последовательности;

Секвенирование и идентификация самого гена

Ген определяется как участок ДНК, который транскрибируется в РНК-копию одной из нитей ДНК. Большинство генов являются участками ДНК, которые несут информацию о последовательности аминокислотных остатков в белке, однако некоторые гены кодируют только РНК.

Сведения о функциях генов в организме

Примерное распределение генов человека по их функциям

Фактически все метаболические функции живых клеток опосредуются белками, но в то же время другие белки образуют множество внутриклеточных и внеклеточных структур. Со всеми генами связаны регуляторные последовательности ДНК, которые являются такими участками, к которым присоединяются белки, определяющие, будет ли ген экспрессирован в данное время и в данном месте. Некоторые генетики называют такие регуляторные последовательности тоже генами.

Транскрибируемые последовательности занимают около 15% всего генома человека (остальное повторяющиеся элементы генома). Кроме того большинство генов представлено прерывистой структурой (экзон-интрон - более длинные области). Предполагается, что кодирующие области генов занимают в молекуле ДНК 3%, а интронов - 40%

Количество генов, вовлеченных в развитие и функционирование органов и тканей человека

Строение гена человека

Многие гены повторены в геноме несколько раз - это мультигенные семейства, примерами служат - рибосомальные РНК, гены HLA-комплекса, гены альфа и бета-глобинов, тубулинов, миоглобина, интерферона, иммуноглобулины др. В некоторых случаях наблюдается избирательная амплификация гена - число копий увеличивается в сотни и тысячи раз (рибосомальные РНК).

Гены отделены друг от друга - спейсерами - которые помимо повторяющихся последовательностей могут иметь и уникальные не транскрибирующиеся последовательности.

Отличительной чертой генома человека является то, что плотность генов в разных участках генома неравномерна.

Для многих генов обнаружен целый ряд псевдогенов - они сходны с определенными нормальными генами, но не транскрибируются (в силу присутствия мутаций). Количество псевдогенов может варьировать от одного до нескольких десятков, как правило расположенных тандемно.

В геноме человека присутствуют также нуклеотидные последовательности, гомологичные некоторым ретровирусам. Впервые они были идентифицированы в геноме вирусов, индуцирующих опухоли и поэтому были названы онкогенами. Гомологичные последовательности этих ретровирусов называют - протоонкогенами, Известно более 100 протоонкогенов Они очень важны на ранних стадиях эмбриогенеза, они контролируют клеточный цикл и выбирают программу развития клетки. При возникновении специфических мутаций в протоонкогене он может начать себя вести как онкоген.

Типичный ген человека представляет собой чередование экзонов и интронов. Экзоны являются участками ДНК, которые будут представлены в зрелой матричной РНК (мРНК), которая образуется в процессе экспрессии гена. Большинство экзонов содержат информацию о последовательности аминокислот - элементарных единиц белков. Кроме этого, в начале и в конце мРНК находятся такие экзоны, которые не кодируют последовательность аминокислот, но могут содержать различные типы регуляторной информации. Интроны же являются такими участками генов, которые расположены между экзонами и отсутствуют в зрелых мРНК.

Отношение числа экзонов к числу интронов варьирует достаточно широко. Лишь небольшое количество генов не содержат интронов, в то же время есть гены, в которых интроны составляют более 95% их длины. Функция интронов и их эволюционное возникновение до сих пор не до конца поняты, но принято считать, что наличие генов, сконструированных из ряда коротких кодирующих последовательностей (экзонов), обеспечивает эволюционную пластичность. На рис. 1 схематически представлена экзон-интронная структура двух хорошо изученных генов, которые кодируют б- и в-полипептидные цепи глобиновой части гемоглобина.

Рис. 1. Структура глобиновых генов человека. Е-1, Е-2 и Е-3 являются экзонами; 1-1 и 1-2 - интроны. Закрашенные области на концах войдут в состав РНК-транкрипта (мРНК - матричной или информационной РНК), но не будут транслироваться в белковую последовательность. Числа на границах между нитронами и экзонами обозначают номера кодируемых аминокислот.

Согласно отчету Консорциума по секвенированию в среднем ген человека содержит 27 т.п.н. Если мы умножим 27 т.п.н. на 30000 генов, то получим, что гены человека занимают 0,8 млн. п.н., т.е. примерно лишь одну четверть от всего генома. Консорциум по секвенированию сообщает нам еще некоторые интересные количественные данные о генах, человека. Среднее число экзонов, приходящееся на один ген, равно примерно 8 (соответственно среднее число интронов в гене должно быть равно 7). Средний размер экзона составляет 145 п.н., а средний размер интрона - 3365 п.н. Легко сосчитать, что в среднем экзоны составляют менее 5% от общей длины гена. В среднем суммарная длина кодирующих экзонов в одном гене составляет 1340 п.н.; этого достаточно, чтобы образовать белок длиной в 447 аминокислотных остатков. Однако имеет место громадная вариабельность в размере генов, числе интронов, размере кодируемых белков и т.п. Размер наибольшего из известных генов превышает 2,4 млн.п.н., выявлены интроны длиной более 30 т.п.н., а некоторые белки содержат более 3000 аминокислотных остатков.

Упомянутая оценка числа генов в пределах 30 000-35 000 была получена путем компьютерного анализа геномных последовательностей. Сначала подсчитали число известных генов и к нему добавили число генов, наличие которых можно было предсказать из оценок числа возможных экзонов, числа сопряженных экзон-интронных последовательностей и некоторых других характеристик. Понятно, что число предсказанных генов довольно неопределенно, поскольку, с одной стороны, некоторые гены компьютер может не распознать, а с другой стороны, компьютер может ошибочно предсказать гены, которые в реальности не существуют.

Один из способов обнаруживать неизвестные гены заключается в установлении сходства с последовательностью известного гена. Многие белок-кодирующие гены образуют семейства, которые представляют собой группы генов, имеющих значительное сходство в своих последовательностях. Основным событием, приводящим к появлению семейств генов, является дупликация гена, которая может случайно возникать вследствие ошибок репликации и рекомбинации ДНК. Когда образуются две копии гена, одна из копий может мутировать таким образом, что образуется несколько измененный ген, который будет кодировать белок со свойствами, слегка отличными от оригинала. Если различия, приобретенные новым белком, придадут ему некоторые преимущества, то процесс отбора может увековечить их в последующих поколениях. Вследствие очередных ошибок в ходе репликации или рекомбинации число таких по-разному измененных копий генов может разрастись, и в результате получится мультигенное семейство и, кроме того, они могут рассредоточиться по геному на отдаленные расстояния.

Классическим примером генных семейств у человека является кластер генов в-глобина на хромосоме 11 и генов б-глобина на хромосоме 16. Их схема представлена на рис. 2.

Обратите внимание на наличие псевдогенов в каждом кластере (они обозначены греческой буквой Ґ). Псевдогены образуются из дуплицированных генов, одна из копий которых приобретает такие мутации, которые делают невозможным ее экспрессию. Известны многие другие генные семейства, число членов в которых исчисляется десятками; примерами являются семейства генов для актинов, миозинов, аполипопротеинов, гистонов и иммуноглобулинов. Когда анализируются удаленные друг от друга семейства, то многие из них можно назвать сверхсемействами, потому что они насчитывают сотни членов.

Рис. 2. Кластеры глобиновых генов

Давайте теперь вычислим еще одно интересное число. Какая доля генома человека содержит информацию для кодирования белков? Умножив 1340 п.н. на 30 000 генов, мы получаем, что за кодирование белков отвечают 40 200 000 п.н. Разделив это число на размер гаплоидного генома человека (3,2 млрд. п.н.), мы приходим к выводу, что только 1,25% нашего генома несут информацию о кодировании белков. Эти числа приблизительны, так что не удивляйтесь, если в других источниках вы встретите несколько отличные от этих числа. Важно то, что лишь очень малая доля человеческой ДНК кодирует белки.

Что же представляет собой остальная часть генома? Мы знаем, что 20-25% занимают интроны, но большая часть остальной ДНК является межгенной ДНК. Значительную часть межгенной ДНК составляют регуляторные последовательности, которые мы сейчас обсудим. Существует несколько групп генов, которые не кодируют белки, продуктами таких генов являются РНК, которые играют важную роль во многих клеточных процессах и структурах. Иногда из них образуются нуклеопротеиновые структуры, иногда они нацеливают ферменты на другие РНК. Кроме того, некоторые части генома играют структурную роль. Тем не менее у нас нет никакого очевидного объяснения, почему так много ДНК не участвует непосредственно ни в качестве структуры для генов, ни в любых других функциях. Некоторое понимание проблемы «избытка» ДНК можно получить, взглянув на геном с несколько иной стороны. Что мы сейчас и сделаем.

2. Повторяющаяся ДНК

В любом сложном геноме ДНК можно подразделить на два типа: однокопийную ДНК (т.е. последовательности, представленные в гаплоидном геноме единственными экземплярами) и повторяющуюся ДНК (последовательности, представленные в гаплоидном геноме многократно). Примерно 50% генома человека представляют собой повторяющуюся ДНК. Популярный термин для большинства повторяющихся ДНК и для некоторых однокопийных ДНК, которые не являются частью генов, - это «мусорная (junk) ДНК». Да, скорее всего в настоящее время наши геномы содержат некоторое количество ДНК, которые не несут никакой функции и могут вполне законно считаться «мусорными», но чем больше мы узнаем о геномах и о регуляции экспрессии генов, тем больше мы открываем новых функций для ДНК, о которых раньше мы не имели никакого представления. Кроме того, значительная часть ДНК, которая в настоящее время явно не используется, определенно является запасным материалом для эволюции генома. Таким образом, если мыслить о биологических видах как о динамических сущностях, изменяющихся (эволюционирующих) во времени, то вполне возможно, что «мусора» в их геномах не так уж и много.

Различают два класса повторяющейся ДНК: (1) тандемно повторяющиеся последовательности (повторы), которые расположены друг за другом «голова к хвосту», и (2) диспергированные повторы, которые разбросаны по всему геному, причем чаще всего они бывают представлены одной копией в данном месте (сайте).

Тандемно повторяющиеся последовательности

Основным классом тандемно повторяющихся последовательностей является центромерная ДНК. Наиболее распространенный тип цен-тромерной ДНК называется альфоидной (alphoid) ДНК, повторяющиеся единицы которой имеют длину примерно в 170 п.н. Эти единицы образуют ряды, длина которых варьирует от 250 т.п.н. до 5 млн. п.н., и они составляют не менее 3% генома. Внутри одного ряда повторы неидентичны, они немного различаются, и между хромосомами эти различия еще больше. Центромерная ДНК образует центромеры, сложные структуры, которые кроме ДНК содержат белки нескольких типов, к которым присоединяются нити веретена в процессе деления клетки.

Тандемно повторяющиеся последовательности найдены также в теломерах, которые расположены на концах каждой хромосомы. У человека теломерными последовательностями являются GGGTTA; в разных хромосомах они повторяются от 250 до 1500 раз. В последние годы теломерная ДНК стала предметом пристального внимания исследователей из-за того, что была обнаружена связь между укорочением теломер и старением. Я не буду здесь детально обсуждать этот вопрос, скажу только, что основная идея состоит в том, что укорочение теломер является одним из последствий процесса репликации ДНК, который происходит перед каждым актом клеточного деления. Если такое продолжается достаточно долго, то теломерные последовательности элиминируются и станут повреждаться прилежащие к ним гены. В результате клетка может умереть или перестать делиться. Такое происходит в большинстве нормальных соматических клеток, и поэтому в организме или в клеточной культуре они имеют ограниченную способность к размножению. Однако в зародышевых (половых) клетках, стволовых клетках и разнообразных раковых клетках имеется фермент теломераза, способный восстанавливать теломерные последовательности, которые в его отсутствие укорачиваются при каждом акте репликации ДНК. Теломераза является необычным ферментом, у которого имеются два компонента: РНК и белок; при этом РНК служит матрицей для восстановления утраченных теломерных повторов. Рис. 3 в общих чертах показывает, как осуществляется этот процесс.

Некоторые другие классы тандемно повторяющихся последовательностей являются генами для некодирующих РНК. Наиболее известными из них являются гены для рибосомной РНК (рРНК). В геноме человека имеются пять групп таких генов, каждая из которых содержит около 60 копий. Они расположены в коротких плечах акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21 и 22. Эти кластеры для рРНК вместе с некоторыми дополнительными участками ДНК называются ядрышковыми организаторами, потому что ядрышко может быть образовано каждым их них. Ядрышки расположены в клеточном ядре и являются фабриками по сборке рибосом.

Рис. 3. Поддержание структуры теломераз

Существует более 80 типов рибосомных белков. Они синтезируются в цитоплазме и мигрируют в ядро, где они связываются с рРНК, которая синтезируется в ядрышке. В каждом ядрышке накапливается также множество других белков, где они принимают участие в сборке рибосом. Кроме того, в сборке рибосом участвуют небольшие некодируюшие РНК нескольких типов. В хромосоме 1 расположен еще один кластер тандемно повторяющихся генов для 5S-pPHK, которая также является важным компонентом рибосом.

Диспергированные повторяющиеся последовательности

Диспергированные повторяющиеся последовательности чаще всего разбросаны по геному по отдельности, а не кластерами. Согласно размеру их подразделяют на две группы: длинные диспергированные элементы, обозначаемые как LINE (Long INterspersed Elements), и короткие диспергированные элементы, обозначаемые как SINE (Short INterspersed Elements). Оба класса являются подвижными (мобильными) генетическими элементами, которые называются ретротранспозонами. Полностью функционирующий ретротранспозон способен размножать либо сам себя, либо родственные последовательности, как это будет описано в следующем абзаце. Ретротранспозоны могут возникать как ретровирусы.

Одним из важнейших классов диспергированных повторяющихся последовательностей является LINE-] или группа L1, которая представлена в геноме человека в количестве до 500 000 копий и составляет примерно 15% от всего генома. Большинство элементов L1 являются укороченными копиями полноценных единиц, длина которых составляет около 5000 п.н., но несколько тысяч элементов L1 имеют полную длину. Только 40-50 из них функционально активны, т.е. они кодируют несколько белков, которые способны вызывать транспозицию либо самого элемента L1, либо некоторых других мобильных элементов. Элементы L1 несут два гена (называемых открытыми рамками считывания - ORF). ORF1 кодирует белок, связывающийся с нуклеиновыми кислотами (р40), ORF2 кодирует и обратную транскриптазу (фермент, который использует mРНК как матрицу и создает комплементарную ей одноцепочечную ДНК -копию, кДНК) и эндонуклеазу, которая производит надрезы в геномной ДНК, куда может встраиваться новая кДНК.

Когда мРНК из элемента L1 транслируется, то образующиеся белки обычно связываются непосредственно.со своей мРНК. Та кой комплекс белка с РНК перемещается в ядро, где эндонуклеаза разрезает одну из цепей ДНК, и в результате образуется свободный конец. Обратная транскриптаза использует этот свободный конец в качестве затравки и создает ДНК-копию мРНК элемента L1. В конце концов образуется вторая цепь кДНК и двунитевая молекула встраивается в хромосому на место однонитевого разрыва. Мы до сих пор не знаем, почему только часть элемента L1 является наиболее частым продуктом ретротранспозиции.

Считается, что обратная транскриптаза ответственна также за образование процессированных псевдогенов, которые являются ДНК-копиями мРНК и которые встраиваются в места, неродственные (негомологичные) исходному гену, из которого произошла скопированная мРНК. Процессированные псевдогены не содержат интронов и обычно неспособны экспрессироваться в виде полипептидов (хотя иногда и случаются исключения). Происходит это либо из-за того, что они не имеют регуляторных последовательностей, либо потому, что они содержат мутации. Псевдогены (как процессированные, так и обычные) довольно распространены и в геноме человека составляют 0,5-1%. Например, секвенирование хромосомы 22 выявило 134 псевдогена.

Наибольший класс элементов SINE состоит из последовательностей Alu (название происходит от названия фермента рестрикции Alu I - эндонуклеазы, которая расщепляет ДНК в местах нахождения специфичных коротких последовательностей и может использоваться для вырезания последовательностей Alu из геномной ДНК)'. В геноме человека находится примерно миллион последовательностей Alu, которые равняется примерно 10-12% всей ДНК. Длина основной единицы составляет примерно 300 п.н., но в классе Alu существует много различных последовательностей. В основном они находятся между генами и внутри интронов, но изредка они могут быть включены в мРНК. Последовательности Alu не кодируют белков, и поэтому они неспособны сами перемещаться из одного места в другое. Однако многие последовательности Alu транскрибируются, и на их концах существуют некоторые короткие последовательности, подобные РНК у элементов L1. Поэтому распространено мнение, что ферменты, которые производятся элементами L1, участвуют в ретротранспозиции последовательностей Alu, хотя окончательные доказательства этого все еще не получены.

Встраивание (инсерция) нового мобильного элемента в ДНК потенциально способно нарушить функцию гена, и действительно, у человека известно более 30 примеров ретротранспозиции, вызывающих болезни. Более того, присутствие столь большого числа копий родственных последовательностей делает возможным потерять или дуплицировать генетический материал во время мейозаи, в результате могут появляться аномальные фенотипы. Возникает вопрос, почему же наши геномы не избавятся от таких опасных участков ДНК, кажущихся бесполезными? Ответ, возможно, заключается в их необходимости для эволюционной пластичности. Повторяющиеся последовательности в ДНК являются важным источником ремоделирования генома. Это станет яснее, когда мы будем обсуждать механизмы геномных изменений в следующей главе.

3. Медицинская геномика

В Соединенных Штатах болезни и другие аномальные состояния, которые вызываются мутантными аллелями одиночных генов, встречаются примерно у одного из 100 новорожденных. За большую часть заболеваемости ответственны комплексные болезни (такие, как диабет, сердечно-сосудистые заболевания и рак), при которых генетические варианты выступают как факторы предрасположенности.

Гены могут также затрагивать нашу чувствительность к различного рода инфекционным и паразитическим агентам как через иммунную систему, так и посредством изменений во многих других молекулах, таких, например, как рецепторы на поверхности клеток. Так или иначе, симптомы, которые проявляются у значительной доли пациентов, находящихся под наблюдением врачей, непосредственно или опосредованно связаны с их генотипами. Прогресс, достигнутый в анализе генома человека, помогает теперь определять вклад генетических вариантов в возникновение болезней, а в некоторых случаях удается даже спланировать оптимальные схемы лечения. Однако мы находимся еще на самых дальних подступах к индивидуализированной медицине, а реальные успехи на этом пути еще только ожидаются в будущем.

Прежде чем лечить болезнь, ее наличие надо сначала распознать, а затем идентифицировать. Со взрослыми пациентами это происходит тогда, когда больной обращается за медицинской помощью. В случае с новорожденными их метаболические нарушения могут не проявляться при рождении, и в таких ситуациях проведение генетической диагностики (генетического скрининга) может оказаться чрезвычайно полезным. Поэтому мы начнем эту главу с обзора соответствующих методов. Очевидно, что вне зависимости от того, определяется ли данная болезнь исключительно генетическими факторами, или лишь частично, к ее лечению привлекается весь арсенал клинических средств: от антибиотиков до хирургии.

Сначала мы рассмотрим некоторые примеры успешного лечения генетических болезней с помощью специальных диет. Затем мы кратко обсудим перспективы использования стволовых клеток как многообещающего средства восстановления или замещения пораженных органов. Кроме того, в настоящее время предпринимаются активные поиски путей замещения или восстановления дефектных генов, что составляет суть генной терапии.

Глава завершится кратким экскурсом в зарождающуюся область фармакогеномики и обсуждением перспектив разработки оптимальных схем лечения пациентов на основе их генотипов.

Генетический скрининг

Популяции, в которых осуществляется генетический скрининг, чрезвычайно разнообразны. Генетический скрининг новорожденных в настоящее время сконцентрирован на обнаружении моногенных нарушений. Генетический скрининг взрослых часто проводится на семейном уровне для того, чтобы идентифицировать супружеские пары с повышенным риском рождения у них пораженных детей. Иногда скрининг у взрослых проводится среди таких групп людей, в геноме которых присутствуют более или менее распространенные мутации, про которые известно, что они значительно повышают вероятность развития комплексной болезни, такой, например, как рак молочной железы (рак груди). В будущем, очевидно, станет возможным тестировать у каждого новорожденного большой набор полиморфизмов, которые влияют на предрасположенность человека к различным комплексным нарушениям типа сердечно-сосудистых заболеваний, артритов и диабетов.

Генетический скрининг новорожденных

Основная цель генетического скрининга новорожденных состоит в * Обнаружении аномалий еще до того, как они станут симпоматичными, дабы успеть применить превентивное лечение или хотя бы такое лечение, которое снизило бы тяжесть симптомов, наверняка развившихся бы без такого лечения. Такой скрининг проводится только для тех нарушений, которые подвергаются лечению. Генетический скрининг новорожденных стартовал в 1962 г. в штате Массачусетс и в настоящее время проводится по всей стране (США), для чего используется простой тест (проба), разработанный Гатри. Этот тест предназначен для выявления младенцев с аномально высоким уровнем содержания фенилаланина, что указывает на отсутствие активности фенилаланингидролазы (ФАГ) - фермента, который превращает фенилаланин в тирозин (пара-оксифеншшланин). У младенцев, лишенных ФАГ, в течение первых недель жизни развивается фенилкетонурия (ФКУ), которая приводит к тяжелой форме умственной отсталости и ряду других неврологических дефектов. Для теста Гатри из пятки новорожденного берут каплю крови. Для обнаружения фенилаланина в такой пробе используется мутантный штамм бактерии сенной палочки (Bacillus subtilis), который неспособен расти на среде без фенилаланина. Если в образце крови присутствует фенилаланин, то через 24 часа наблюдается рост бактерии вокруг лунки, в которую был внесен образец.

Детям с развившейся классической формой ФКУ (с содержанием фенилаланина в крови, в 10 раз превышающим норму) требуется пожизненное помещение в медицинское учреждение закрытого типа, что чрезвычайно дорого как для родителей таких детей, так и для общества. Частота встречаемости ФКУ в США составляет 1 на 10 000 живорождений. Тест Гатри дешев, и с его помощью в одной лаборатории можно проанализировать тысячи образцов в год. Но этот тест хорош не только в силу его экономичности, он освобождает от страданий и самих больных и их родителей. Достаточно таких детей обеспечить диетой без фенилаланина, и если такая диета строго соблюдается до достижения ими половозрелости, то во взрослом состоянии их интеллектуальные способности оказываются практически нормальными.

Вскоре, после того как скрининг на ФКУ стал повсеместным, стало ясно, что подобный подход можно применять и для скрининга некоторых других излечиваемых и относительно распространенных генетических нарушений. Для этого достаточно диагностировать изменения в количестве легко обнаруживаемых метаболитов в крови. В настоящее время такие методы широко используются для скрининга врожденного гипотиреоза (первичного гипотиреоидизма), врожденной гиперплазии коры надпочечников, галактоземии, гомоцистинурии и болезни с запахом кленового сиропа. Тесты на серповидно-клеточную анемию, недостаточность биотинидазы и врожденную гиперплазию надпочечников также можно проводить с образцами крови новорожденных. Наиболее успешным из этих тестов оказался тест на обнаружение врожденного гипотиреоза, который почти полностью излечивается путем орального применения синтетического тиреоидного гормона (тироксина).

Биологическая изменчивость, однако, создает некоторые технические трудности при широкомасштабных реализациях программ скрининга с использованием методик типа теста Гатри. К одному и тому же клиническому фенотипу могут приводить дефекты более чем в одном гене.

Например, у небольшой доли младенцев с гиперфенилаланинемией не обнаруживается ничего аномального в активности фенилаланингидролазы; у них генетический эффект выражается в отсутствии кофактора для ФАГ - тетрагидробиоптерина (ВН₄). Лечение таких детей в корне отличается от лечения классической недостаточности ФАГ. Таким образом, когда обнаружено, что у данного младенца аномально повышено содержание фенилаланина в крови, то целесообразно провести дополнительный тест на недостаточность ВН₄.

Более общей проблемой являются так называемые ложноположительные и ложноотрицательные диагнозы. Для краткости условно можно назвать «ложными позитивами» и «ложными негативами». Вследствие врожденной биологической изменчивости в момент отбора крови не у всех младенцев с генетическими дефектами в метаболизме фенилаланина уровень содержания этой аминокислоты в крови будет отличаться от нормального уровня. Для того чтобы не упустить таких детей из виду, необходимо повысить чувствительность метода до такой степени, чтобы он давал немного ложноположительных результатов, т.е. выявлял кажущиеся высокими уровни содержания фенилаланина, которые в действительности не являются показательными для ФКУ. Окончательно установить, являются ли такие положительные результаты ложными, можно при повторном более тщательном тестировании детей с пограничными уровнями содержания фенилаланина. Однако сделать это бывает нелегко, потому что в таких случаях требуется, чтобы родители повторно принесли ребенка в клинику для отбора новой пробы крови. К тому же это пугает родителей и травмирует их психику. Частота ложноположительных диагнозов для разных генетических болезней варьируется от 1 на 1000 до 1 на 100.

Противоположной проблемой являются ложноотрицательные диагнозы, т.е. постановка ребенку отрицательного диагноза, в то время как в действительности у него имеется генетический дефект. Наиболее распространенным источником «ложных негативов» являются лабораторные ошибки, но и биологическая изменчивость также может сыграть свою роль. У некоторых ей диагностируемый метаболит может еще не накопиться в крови за время их пребывания в роддоме (в США матерей с новорожденными обычно выписывают из больницы спустя один-два дня после родов). Чтобы избежать таких ситуаций, родителей информируют, что при малейших намеках на появление у ребенка каких бы то ни было симптомов, кажущихся аномальными, они должны сразу же обращаться к врачу. генетический хромосома тандемный карта

В настоящее время все большее распространение приобретает скрининг сразу многих метаболитов в образцах крови, отбираемых у новорожденных по методу Гатри. Такой скрининг становится все более чувствительным и эффективным, поскольку для него используется новейшая изощренная методика, называемая тандемным масс-спектрометром, которая позволяет в одной пробе крови тестировать не менее 25 генетических нарушений. Как явствует из самого названия метода, в нем с помощью масс-спектрометра определяются молекулярные массы различных метаболитов в высушенных образцах крови. Слово «тандемная» отражает тот факт, что сначала массы измеряются для интактных метаболитов, а затем - для их фрагментов, которые образуются при столкновении молекул с молекулам инертного газа под высоким давлением. Высокая чувствительность этого метода существенно смягчает проблему «ложных негативов», а ее высокая точность, обусловленная тем, что измеряется сразу несколько продуктов одного из метаболических путей, смягчает проблему «ложных позитивов». Полностью возможности использования тандемной масс-спектрометрии для генетического скрининга еще будут уточняться, но уже несомненно, что у этой технологии большие преимущества перед старой системой.

Генетический скрининг взрослых

В настоящее время нет общенациональных программ генетического скрининга взрослого населения, но некоторые достижения заслуживают упоминания. Лучшим кандидатом для этого является гемохроматоз - аутосомное рецессивное нарушение метаболизма железа, которое до середины жизни не становится клинически очевидным, хотя повышенное содержание железа в крови (которое в принципе можно выявить в ранние годы жизни) может указывать на предрасположенность к этой болезни.

Гомозиготы по предрасположенности к гемохроматозу встречаются у европеоидов с частотой от 1:200 до 1:500. По неизвестным причинам мужчины становятся симптоматичными в 5 раз чаще, чем женщины. Если не лечиться, то болезнь вызывает угрожающие жизни повреждения печени, сердца, поджелудочной железы и других органов.

Эффективный способ лечения гемохроматоза простой: на разных стадиях болезни надо избегать употребления железа (которое содержится, например, в поливитаминных комплексах), а если начинает развиваться перегрузка железом, то следует произвести флеботомию (кровопускание). Факт доступности эффективного лечения гемохроматоза является решающим для организации широкомасштабной программы генетического скрининга. Каким же образом можно выявлять индивидуумов, предрасположенных к гемохроматозу? Эта болезнь вызывается мутациями в гене, кодирующем белок HFE, который присоединяется к трансферритовому рецептору, расположенному на поверхности клеток, и тем самым участвует в регуляции проникновения (транспорта) железа в клетки. Из всех известных мутантных аллелей в гене HFE две мутации встречаются у больных с частотой 70%, а то и чаще, поэтому довольно легко создать тест, основанный на анализе ДНК.

Подсчитано, что каждый год можно спасти жизни примерно 1000 жителям США, если каждый человек пройдет проверку таким тестом. Тем не менее правительственные органы не рекомендуют этого, ссылаясь на разнообразные причины, включая неполную пенетрантность (болезнь развивается далеко не у всех лиц, предрасположенных к болезни), стигматизацию и дискриминацию.

Стигматизация - это ощущение индивидуума и (или) их «друзей по несчастью», знающих о наличии у них мутантной аллели, что они считаются изгоями (неполноценными). Она является серьезной проблемой в среде плохо осведомленной части населения. Однако очевидно, что значимость этой проблемы должна снижаться по мере того, как генетическая медицина станет все более понятной ее потребителям. Дискриминацию, особенно со стороны страховщиков, мы обсудим в этой главе позднее.

Если будет принята программа широкомасштабного скрининга мутантных аллелей, обусловливающих предрасположенность к гемохроматозу среди населения, то его можно было бы проводить одновременно со скринингом многих других мутантных аллелей, которые влияют на вероятность образования у человека рака молочной железы, колоректального рака (рака толстого кишечника), возникновения сердечнососудистых заболеваний и диабета (понятно, что здесь перечислены лишь наиболее распространенные болезни).

Конечно же, общество должно быть информировано о том, что подобные тесты могут снизить шансы заболевания, для чего людям зачастую будет достаточно всего лишь изменить стиль жизни. Однако информированное и адекватно реагирующее общество сможет сформироваться, скорее всего, лишь из последующих поколений людей.

Немаловажным является вопрос: кто может иметь доступ к результатам тестов? Должен ли иметь право такого доступа любой врач любой специальности, к которому обращается за помощью пациент? Многие врачи считают, что такое право дало бы возможность предложить пациенту исчерпывающее превентивное лечение.

Другой категорией скрининга взрослых является посемейный скрининг. В противоположность скринингу популяций, при котором упор делается на здоровье непосредственно обследуемых людей, основное предназначение посемейного скрининга - избежать появления на свет ребенка, пораженного тяжелым генетическим заболеванием. Хорошо известным примером является муковисцидоз (МВ). Эта аутосомная рецессивная болезнь обусловлена дефектами в белке хлоридного канала, который называется муковисцидозным трансмембранным регулятором проводимости (CFTR). Такие дефекты нарушают транспорт ионов хлора и натрия через апикальную мембрану эпителиальных клеток, и происходит это, прежде всего в воздушных ходах легких, потовых железах и в поджелудочной железе. В результате слизь, которая в норме образуется этими клетками, утолщается, что приводит к закупорке воздушных ходов в легких и протоков в поджелудочной железе. Массивная слизь в легких способствует развитию бактериальной инфекции, и поэтому больным приходится принимать излишне много антибиотиков. Прогрессирующее ухудшение функции легких обычно завершается смертельным (летальным) исходом примерно к 30 годам, хотя тяжесть симптомов может широко варьировать.

В популяциях выходцев из Западной Европы муковисцидоз встречается с частотой примерно 1 на 1500-2000 новорожденных. Это означает, что в этой этнической группе примерно один человек из двадцати является гетерозиготным носителем мутантной аллели в гене CFTW. Супруги, у одного из которых или у обоих имеется родственник, больной муковисцидозом, часто хотят знать, каков риск, что у них родится больной ребенок. Если такой риск существует, то они могут решить вообще не иметь детей, удочерить или усыновить приемного ребенка, или все же рискнуть обзавестись собственным ребенком. Супруги, которые уже имеют ребенка, больного муковисцидозом, живо интересуются, будет ли следующий ребенок здоровым. Обычно об этом можно узнать с помощью преимплантационной (доимплантаццонной) генетической диагностики (ПИГД) эмбриона, полученного путем «пробирочного» (искусственного или экстракорпорального) оплодотворения (оплодотворения in vitro - IVF, ЭКО). Для этого используется одна из нескольких начальных клеток эмбриона, и в ее ДНК, размноженной (амплифицированной) посредством ПЦР, проводится тест на наличие мутантной аллели. Поскольку при искусственном оплодотворении обычно получается несколько жизнеспособных эмбрионов, то специалист может проверить их и выбрать нормальный эмбрион для имплантирования его в организм матери.

Конечно, далеко не все супружеские пары, которые знают о риске рождения у них ребенка с серьезным генетическим дефектом, готовы согласиться на искусственное оплодотворение и ПИГД. Это связано не только с дороговизной таких процедур, но и с тем, что они могут вызвать сильный эмоциональный стресс у родителей. Некоторые родители могут предпочесть дождаться начала нормальной беременности, а затем согласиться на анализ клеток эмбриона, извлекаемых из околоплодных вод (из амниотической жидкости). В этих клетках тестируется наличие той мутантной аллели, про которую известно, что она имеется у одного из родителей. (Заметим, что в случае с рецессивной аутосомной болезнью совсем не обязательно тестировать мутантные аллели обоих родителей, потому что для проявления нормального фенотипа достаточно одной нормальной аллели.)

Самое время теперь перевести дух и задаться вопросом, будет ли выгодным скрининг муковисцидоза в масштабах крупных популяций, даже если предположить, что проблемы стигматизации и дискриминации удерживаются в рамках здравого смысла. Доводом в пользу такого скрининга является то, что болезнь довольно распространена и что уход за больными чрезвычайно дорог как в материальном, так и в эмоциональном смысле. К сожалению, существует практическая проблема, связанная с фундаментальными аспектами генетических болезней: инактивировать ген можно очень многими способами, а не каким-либо одним.

В популяциях выходцев из Западной Европы знаменитая мутация ДF508 является основным представителем (70%) среди других мутантных аллелей в гене CFTR, но в этнических группах из Южной Европы она встречается гораздо реже и очень редко в остальных популяциях. В целом во всем мире описано более 800 (!) мутаций в гене CFTR, с которыми связан муковисцидоз. Поэтому если проводить широкомасштабный (тотальный) скрининг, то включить в тесты все эти мутации практически невозможно. И как же в такой ситуации мы будем оправдываться перед супружеской парой, когда у них родится ребенок, больной муковисцидозом, при том что генетическая диагностика показала, что у них отсутствуют мутантные аллели, ответственные за 95% вариантов муковисцидоза? Скажем им: «Жаль, но вам не повезло. Но вы же не станете отрицать, что мы сделали для вас все от нас зависящее?»? Совершенно не важно, в сколь осторожные формулировки будут закамуфлированы результаты генетического теста. Всегда в таких делах найдется место для множества недоразумений, недоумений, недопонимания, а иногда и для судебных разбирательств. Аналогичные проблемы будут возникать и при скрининге популяций как в отношении гемохроматоза, так и в отношении почти всех других генетических болезней.

Даже при этих обстоятельствах Американский колледж медицинских генетиков, Американский колледж акушеров и Национальный институт здоровья рекомендовали в 2001 г., чтобы скринингу подвергались все те мутации MB, которые встречаются в американской популяции с частотой не ниже 0,1%. Особенно это касается взрослых, среди родственников которых имеются больные MB, и здоровых членов супружеских пар, если второй супруг болен MB. Этому критерию отвечают 25 мутаций, и в настоящее время коммерчески доступны наборы тестов, которые позволяют сканировать их, а многие доктора рекомендуют пройти такое тестирование всем парам, планирующим иметь ребенка. В этой связи возникает серьезнейшая проблема неверного толкования и восприятия результатов таких тестов.

Все обсуждавшиеся до сих примеры касались нарушений, которые наследуются согласно менделевским правилам и которые встречаются у очень незначительной части населения. Бурный рост наших познаний о генах, которые вносят вклад в возникновение комплексных болезней, в недалеком будущем приведет к принципиально новым программам скрининга. Мы знаем немногие ситуации, когда специфические генетические изменения повышают вероятность приобретения болезни, но действуют они не в столь прямолинейной менделевской манере. Одним из хорошо известных примеров является аллель 4 в гене, который кодирует аполипопротеин Е (АРОЕ). Многочисленные исследования показали, что у пациентов с болезнью Альцгеймера частота этой аллели выше, чем в контроле. Принято считать, что наличие аллели АРОЕ-4 повышает риск развития болезни Альцгеймера, но о самой степени риска ведутся ожесточенные споры. АРОЕ играет роль в транспорте холестерина, но каким образом это может приводить к болезни Альцгеймера, до сих пор непонятно.

По мере того как все больше мы узнаем о вкладе генов в предрасположенность к таким болезням, как атеросклероз, ревматоидный артрит, диабет и другие распространенные недуги, мы постепенно создаем каталог аллелей различных генов, связанных с болезнями. В геноме человека наблюдается гигантское (астрономическое) количество вариаций, большинство которых представляют собой однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) (в зарубежных научных кругах для них принято обозначение SNP -single nucleotide polymorphism и произношение «снипы» - «snips»). Заключается это явление в том, что в одном и том же положении одиночная пара нуклеотидов у некоторых индивидуумов отличается от пары нуклеотидов в том же положении у большинства других людей. В реальности примерно один ОНП приходится на 1000 п.н. (1 на 1 т.п.н.), что означает, что ваш геном отличается от генома вашего близкого друга примерно в 3 миллионах позиций. Множество ОНП находятся в некодируюших районах, и подавляющее их большинство должны быть функционально инертными, хотя и среди них есть такие, которые могут затрагивать регуляцию активности генов. Однако малая доля ОПН встречаются в кодирующих районах (в экзонах), одни из которых являются синонимичными изменениями (т.е. они не изменяют кодируемую аминокислоту вследствие вырожденности генетического кода), но другие приводят к заменам аминокислот в этих сайтах. Несинонимичные кодирующие ОНП являются источником изменений в функции белков, и тем самым они способны повышать вероятность развития различных комплексных болезней.

В 1999 г. крупные фармацевтические компании, в том числе Wellcome Trust в Великобритании, осознали, сколь важная роль принадлежит ОНП при изучении человеческих генов в норме и при патологии, а также и при создании новых лекарств. Они организовали SNP Consortium, целью которого стала разработка крупнейшей базы данных по ОНП человека, доступной всем заинтересованным. Их достижения превысили все ожидания, и в настоящее время идентифицировано несколько миллионов ОНП. что составляет в среднем 1 ОНП на 1 т.п.н. в геноме человека.

Когда мы создадим более или менее исчерпывающий каталог ОНП, связанных (ассоциированных) с болезнями, тогда станет возможным тестировать сотни (и тысячи) ОНП в геноме каждого человека. В результате станет доступным громадное количество информации, которую индивидуумы смогут использовать при выборе собственного стиля жизни, а их врачи смогут назначать им по возможности индивидуальные средства лечения.

Крупномасштабные программы скрининга ОНП в популяциях будут использовать новую технику анализа с помощью ДНК-микрочипов, которые уже сейчас предоставляют возможность на каждом таком чипе обследовать тысячи генов или молекул мРНК. Таким образом, столь массовое обследование ОНП, которое еще несколько лет тому назад казалось фантастикой, вскоре станет доступным по вполне приемлемой цене. Оно явится фундаментальным достижением для генетических исследований, как в научных лабораториях, так и в клиниках. Клиницисты уже сейчас используют эту технику для получения характеристик различных типов опухолей в терминах паттерна (подробной картины) экспрессии генов, а также для подбора наиболее эффективных лекарств для лечения данного пациента. Несомненно, что эта техника находит массу применений и в фундаментальных научных исследованиях.

Поскольку ДНК-чипы изготавливаются с использованием технологий, пришедших из полупроводниковой промышленности, их можно применять и для анализа ОНП, и некоторые компании сейчас активно разрабатывают инструменты и устройства для того, чтобы резко повысить пропускную способность таких анализов. Представьте себе: каждое крошечное пятнышко на таком чипе будет содержать олигонуклеотид, т.е. фрагмент однонитевой молекулы ДНК длиной примерно в 25 нуклеотидов (25-мер, пента-икосамер), в котором центральное место занимает основание, по которому в данной популяции наблюдается полиморфизм. Мы можем прозондировать этот чип с помощью небольшого содержащего флюоресцентную метку участка ДНК, выделенного из генома любого человека - здорового или больного. Мы можем подобрать такие условия для гибридизации, при которых, если испытуемая ДНК содержит последовательность, точно комплементарную 25-меру на чипе, то тогда образуется флюоресцирующий гибрид ДНК-ДНК. Но если всего лишь одно основание в этом 25-мере не будет комплементарным олигонуклеотиду на чипе, то гибрид не будет образовываться. Микрочип может содержать тысячи капель с подобными 25-мерами, каждая из которых представляет различные сайты ОНП.

Теоретически один чип ОНП может содержать все энциклопедическое количество информации о геноме одного человека. Поэтому очевидно, что достаточно скоро возникнет потребность в самого различного рода программах генетического скрининга больших популяций. Неизбежно найдутся сторонники поголовного скрининга всех новорожденных, другие же будут призывать ограничивать такие программы скринингом лишь взрослых людей. Кое-кто будет убежден в необходимости принудительного скрининга (особенно для новорожденных), а другие будут настаивать на исключительной добровольности таких процедур. Ясно, что потребуется немало времени, чтобы согласовать столь резко конкурирующие интересы.

Несомненно, в пользу проведения программ массового скрининга будет иметь место мощное давление со стороны коммерческих структур, поскольку они обещают огромную выгоду. Прискорбно, конечно же, что такое давление может повлиять на решения, которые следует принимать только после длительных и объективных сопоставлений индивидуальных и общественных выгод и ответственностей, в которых можно будет убедиться лишь после того, как любые новые программы скрининга будут санкционированы государством или профессиональными медицинскими сообществами или учреждениями. В дополнение к уже упомянутым проблемам мы не можем игнорировать и тот факт, что от массового скрининга аллелей, которые обусловливают генетические болезни или предрасположенность к комплексным (многофакторным) болезням, за версту отдает евгеническим душком. В особенности если программа скрининга будет принята в принудительном порядке, то само ее существование будет воспринято обществом как запрет на рождение детей с любой из таких болезней. Негативные аспекты программ генетического скрининга нельзя игнорировать полностью, но есть надежда, что позитивные аспекты возобладают как на индивидуальном уровне, так и на уровне взвешенных политических решений. Ведь, в конце концов, цель у генетического скрининга самая что ни на есть благородная - предложить лучшее здоровье (качество жизни) как можно большему количеству людей.

Литература:

1. Баранов В., Баранова Е., Иващенко Т., Асеев М. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину. СПб.: «Интермедика». 2000. 271 с.

2. Баранов В., Кузнецова Т., Иващенко Т., Кащеева Т. Лабораторные методы в пренатальной диагностике. М.: Реальное время, 2002. С. 122-152.

3. Баранов В., Хавинсон В. Определение генетической предрасположенности к некоторым мультифакториальным заболеваниям. Генетический паспорт. СПб.: ИКФ - «Фолиант». 2001. 48 с.

4. Горбунова В., Баранов В. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная литература, 1997. 287с.

5. Иллариошкин С. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование. М.: Медицинское информационное агентство. 2004. 207 с.

6. Киселев Л. Геном человека и биология XXI века // Вестник РАН. 2000. Т 70. С. 412-424.

7. Свердлов Е. Очерки современной молекулярной генетики по курсу лекций для студентов биологического факультета МГУ. Очерк 6. Генная терапия и медицина XXI века // Мол. Генетт, микробиол., вирусло. 1996. №4. С. 3-32.