Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ

УДК 616-006.441:616.056.552+615.227.3+615.276

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

РОЛЬ ЦИТОКІНІВ У МОЛЕКУЛЯРНИХ МЕХАНІЗМАХ ЕНДОГЕННОЇ ІНТОКСИКАЦІЇ, ВИКЛИКАНОЇ ПУХЛИННИМ РОСТОМ ТА ПІД ВПЛИВОМ АНТИНЕОПЛАСТИЧНИХ ПРЕПАРАТІВ (НА МОДЕЛІ МИШАЧОЇ ЛІМФОМИ NK/LY)

Панчук Ростислав Русланович

Львів - 2008

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті біології клітини НАН України, м. Львів

Науковий керівник - член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Стойка Ростислав Степанович, Інститут біології клітини НАН України, завідувач відділу регуляції проліферації клітин і апоптозу

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Мінченко Олександр Григорович, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу молекулярної біології доктор медичних наук, професор Ященко Антоніна Михайлівна, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, кафедра гістології, цитології та ембріології.

Захист відбудеться "10" вересня 2008 р. о 15.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розіслано " 6 " серпня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Убийвовк В.М.

Анотації

Панчук Р.Р. Роль цитокінів у молекулярних механізмах ендогенної інтоксикації, викликаної пухлинним ростом та під впливом антинеопластичних препаратів (на моделі мишачої лімфоми NK/Ly). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.

Дисертація присвячена вивченню сигнальних механізмів, задіяних у патогенезі мишачої лімфоми NK/Ly, особливо на термінальній стадії розвитку пухлини. Показано, що основним фактором при розвитку лімфоми NK/Ly є цитокін IL-6, який продукується цими пухлинними клітинами. IL-6 не лише викликає ендогенну інтоксикацію в організмі мишей-пухлиноносіїв, але й виступає важливим фактором росту для пухлинних клітин. На пізній стадії розвитку лімфоми NK/Ly відбувається дегенерація пухлинних клітин. Причиною загибелі цих лімфомних клітин є їхня надмірна проліферація, яка супроводжується вичерпанням метаболітів та факторів росту у асцитній рідині. Загибель клітин лімфоми NK/Ly відбувається шляхом каспазо-незалежного апоптозу, який модулюється транскрипційними факторами c-Myc і E2F-1/2. Хіміотерапія із використанням доксорубіцину не лише приводила до суттєвого продовження тривалості життя тварин-пухлиноносіїв, але й викликала інтенсивний апоптоз у лімфомних клітинах NK/Ly, опосередкований каспазами. Вінкристин викликав зупинку у цих клітин у переході G1/S, а також індукував відтермінований каспазо-незалежний апоптоз, опосередкований білком Bax. Застосування синтетичних стероїдів дексаметазону та мегестерол ацетату, окремо або у поєданні з доксорубіцином чи вінкристином, не дало суттєвого терапевтичного ефекту у мишей-пухлиноносіїв.

Ключові слова: лімфома NK/Ly, ендогенна інтоксикація, цитокіни, IL-6, проліферація, апоптоз, c-Myc, Bax, хіміотерапія, доксорубіцин, вінкристин.

Панчук Р.Р. Роль цитокинов в молекулярных механизмах эндогенной интоксикации, вызванной опухолевым ростом и под воздействием антинеопластических препаратов (на модели мышиной лимфомы NK/Ly). - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2007.

Диссертация посвящена изучению сигнальных механизмов, задействованных в патогенезе мышиной лимфомы NK/Ly, особенно на терминальных стадиях роста опухоли. Основным фактором при развитии лимфомы NK/Ly является цитокин IL-6, который продуцируется этими опухолевыми клетками. IL-6 не только вызывает эндогенную интоксикацию в организме мышей-опухоленосителей, но и выступает важным фактором роста для опухолевых клеток. На поздних стадиях роста лимфомы NK/Ly происходит дегенерация опухолевых клеток. Причиной гибели этих лимфомных клеток является их избыточная пролиферация, которая сопровождается исчерпанием метаболитов и факторов роста в асцитной жидкости. Гибель клеток лимфомы NK/Ly происходит путем каспазо-незалежного апоптоза, который модулируется транскрипционными факторами c-Myc и E2F-1/2. Химиотерапия с использованием доксорубицина не только приводила к существенному продолжению длительности жизни животных-опухоленосителей, но и вызывала интенсивный апоптоз в клетках лимфомы NK/Ly, опосредованный каспазами. Винкристин вызывал остановку у этих клеток в переходе G1/S, а также индуктировал отложенный каспазо-незалежний апоптоз, опосредованный белком Bax. Применение синтетических стероидов дексаметазона и мегестерол ацетата, отдельно или в сочетании с доксорубицином или винкристином, не давало существенного терапевтического эффекта у мышей-опухоленосителей.

Ключевые слова: лимфома NK/Ly, эндогенная интоксикация, цитокіни, IL-6, пролиферация, апоптоз, c-Myc, Bax, химиотерапия, доксорубицин, винкристин.

Panchuk R.R. Role of cytokines in mechanisms of endogenous intoxication, caused by tumor growth and under action of anticancer drugs (on the model of murine NK/Ly lymphoma). - Manuscript.

Thesis for Ph. D. scientific degree on cytology, cell biology, histology 03.00.11, Institute of Cell Biology of the NAS of Ukraine, Lviv, 2007.

Dissertation is devoted to a study of signaling pathways, involved in pathogenesis of NK/Ly lymphoma development, especially at terminal stages of tumor growth. It is shown that cytokine IL-6 is the main factor, involved in development of NK/Ly lymphoma,. IL-6 is produced by lymphoma cells and causes endogenous intoxication in the organism of tumor-bearing animals, and also plays an important role in proliferation of tumor cells.

Western-blot analysis using antibodies to MEK-ERK signaling pathway, E2F-1/2 and c-Myc, pSTAT1, pSTAT3, pSTAT5, anti-apoptotic Bcl-XL and pro-apoptotic p53 and Rb proteins, active cleaved forms of caspases-3,6,7 was performed in order to investigate growth and survival status of the NK/Ly cells. We found a marked increase in expression of E2F-1/2 transcription factors, MAPK signaling cascade and c-Myc, that suggests intensive proliferation of lymphoma cells at terminal stage of its development. However, cytomorphological investigation and electrophoretic study of DNA fragmentation have shown degeneration of NK/Ly lymphoma cells and increase in their death. No expression of p53 protein and cleaved forms of caspases-3,6,7 was shown, that suggests caspase-independent apoptosis in these tumor cells. We found that the ascitic fluid collected at terminal stage of NK/Ly lymphoma development was supporting tumor cell growth statistically weaker than the ascitic fluid collected at the initial stage of that tumor development. It is suggested that uncontrolled cell proliferation at terminal stage of the NK/Ly lymphoma development caused by over-expression of MEK/ERK, E2F and c-Myc, causes nutrient deprivation and deficiency of specific growth factors in the ascitic fluid that leads to apoptosis induction in these tumor cells. лімфома мишачий пухлина

Chemotherapy treatment with doxorubicin significantly prolonged animals' lifespan and led to caspase-mediated apoptosis induction in NK/Ly lymphoma cells. Vincristine blocked these cells in G1/S phase of cell cycle, and induced delayed apoptosis induction, mediated by Bax protein. Synthetic steroid hormones dexamethasone and megesterol acetate, alone or in combination with doxorubicin or vincristine, had no significant therapeutic effect towards tumor-bearing animals.

Key words: NK/Ly lymphoma, endogenous intoxication, cytokines, IL-6, proliferation, apoptosis, c-Myc, Bax, chemotherapy, doxorubicin, vincristine

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Прозапальні цитокіни IL-1, IL-6, IFN-г, TNF-б відіграють важливу роль в імунній відповіді організму при інфекціях, травмах, злоякісних новоутвореннях та ін. Під час канцерогенезу надмірна продукція цих цитокінів разом з іншими патогенними факторами, які утворюються пухлиною, часто призводить до загального виснаження та інтоксикації організму. Це явище, яке отримало назву кахексії, зустрічається більш ніж у 50% хворих на рак (Tisdale, 1997; Dewys et al, 2003). Ускладнення, викликані кахексією, вважаються основною причиною смерті багатьох онкохворих, а також причиною низької ефективності хіміотерапії (Argiles et al, 2003, Van Eys et al., 1982). Незважаючи на значний прогрес сучасної медицини у дослідженні кахексії, молекулярні механізми цього патологічного стану залишаються недостатньо вивченими. Створено ряд експериментальних моделей кахексії, спричиненої солідними пухлинами у гризунів, однак серед них практично нема гематологічних пухлин, а патологічні процеси, що спостерігаються під час розвитку таких новоутворень, не завжди ідентичні перебігу кахексії в онкохворих (Strassmann et al, 1993).

Лімфому NK/Ly було запроваджено Неметом і Келнером у 1960 р. Вона вважається перспективною моделлю для тестування протипухлинної активності нових антинеопластичних препаратів. Однак ця експериментальна пухлина не набула широкої популярності і згодом була витіснена іншими модельними лейкеміями - P388 і L1210. Унікальною особливістю лімфоми NK/Ly є характерні симптоми ендогенної інтоксикації, які спостерігаються у тварин-пухлиноносіїв на термінальній стадії розвитку цієї пухлини і нагадують кахексію, викликану сомлідними пухлинами у людини та експериментальних тварин. Оскільки основні причини кахексії, індукованої мієлоїдними новоутвореннями, практично не висвітлені в літературі, важливо з'ясувати клітинні і молекулярні механізми, які лежать в основі цього явища. Лімфома NK/Ly виявилася зручною моделлю для подібного дослідження.

Для зменшення негативних ефектів кахексії і зниження продукції прозапальних цитокінів у хіміотерапії злоякісних пухлин застосовують допоміжні чинники, такі як кортикостероїди та синтетичні стероїдні сполуки дексаметазон, медроксипрогестерон і мегестерол ацетат (Bessler et al., 1999; Berenstein et al, 2005). В основному, ці препарати (за виключенням дексаметазону, який успішно застосовують при терапії множинної мієломи) було протестовано на пухлинах епітеліального і мезенхімного походження у тварин із проявами кахексії, тоді як про їх ефективність при мієлопроліферативних захворюваннях практично нічого не відомо. Важливим завданням даної роботи було також з'ясування ефективності впливу моно- і комбінованої хіміотерапії на виживання тварин-пухлиноносіїв, продукцію прозапальних цитокінів і на розвиток лімфоми NK/Ly.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в рамках держбюджетної теми Інституту біології клітини Національної Академії Наук України "Механізми індукції антипроліферативної і цитотоксичної активності у нормальних і трансформованих клітин" упродовж 2003-2005 років, (номер державної реєстрації №0103U001404) та теми "Дослідження процесів, що відбуваються під час апоптозу, індукованого антинеопластичними препаратами з різним механізмом дії" упродовж 2006-2008 років, (номер державної реєстрації №0106U002599). У 2006-2007 та 2007-2008 роках роботу було також підтримано грантами Західно-Українського біомедичного дослідницького центру (WUBMRC), наданими здобувачу.

Мета і завдання дослідження. Головною метою роботи було дослідити молекулярні процеси, які відбуваються в клітинах лімфоми NK/Ly у мишей та ідентифікувати основні фактори, що впливають на цей патологічний стан.

Для досягнення поставленої мети у дисертаційній роботі вирішували такі завдання:

1. дослідити функціональний стан лімфомних клітин на різних стадіях розвитку лімфоми NK/Ly, а також патофізіологічні зміни в організмі мишей-пухлиноносіїв;

2. визначити продукцію прозапальних цитокінів (IL-1б, IL-1в, IL-6, IFN-г, VEGF, TNFб, TNFв) клітинами лімфоми NK/Ly на початковій і термінальній стадіях росту лімфоми NK/Ly за такими критеріями, як рівень мРНК цитокінів у цитоплазмі пухлинних клітин та кількість їх білкових продуктів у асцитній рідині мишей-пухлиноносіїв;

3. проаналізувати зміни у продукції інгібіторів протеаз під час розвитку лімфоми NK/Ly із використанням білкового електрофорезу та MALDI-TOF спектрометрії;

4. дослідити сигнальні шляхи, які активуються у пухлинних клітинах в процесі розвитку лімфоми NK/Ly, використовуючи для цього метод Вестерн-блот аналізу із застосуванням специфічних антитіл до білків, задіяних у регуляції проліферації клітин та апоптозу;

5. вивчити зміни у продукції цитокінів та у сигнальних системах клітин лімфоми NK/Ly під час лікування мишей протипухлинними антибіотиками із різними механізмами дії, використовуючи для цього методи імуноензимного та Вестерн-блот аналізу.

Об'єкт дослідження. Прозапальні цитокіни та білки, залучені до регуляції проліферації та апоптозу пухлинних клітин у процесі розвитку лімфоми NK/Ly.

Предмет дослідження. Зміни у регуляторних системах та сигнальних механізмах у клітинах лімфоми NK/Ly, які призводять до ендогенної інтоксикації під час розвитку лімфоми NK/Ly in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі вперше показано, що цитокін IL-6 виступає основним чинником ендогенної інтоксикації, зумовленої розвитком лімфоми NK/Ly. Водночас IL-6 є важливим автокринним фактором росту для пухлинних клітин. Встановлено, що причиною загибелі пухлинних клітин на пізній стадії розвитку лімфоми NK/Ly є їхня надмірна проліферація, яка супроводжується вичерпанням метаболітів та факторів росту в асцитній рідині. Загибель клітин лімфоми NK/Ly відбувається шляхом каспазо-незалежного апоптозу, який модулюється транскрипційними факторами c-Myc і E2F-1/2. Використання протипухлинних антибіотиків доксорубіцину і вінкристину призводить до збільшення тривалості життя тварин-пухлиноносіїв в 1,7-2 рази порівняно з контрольною групою. У той же час застосування синтетичних стероїдів дексаметазону та мегестерол ацетату, окремо або в поєданні з доксорубіцином чи вінкристином, не виявляло суттєвого терапевтичного ефекту у мишей-пухлиноносіїв. Курс доксорубіцину знижував рівень продукції IL-6 та індукував каспазо-залежний апоптоз у пухлинних клітинах, тоді як вінкристин, навпаки, викликав зупинку росту цих клітин у переході G1/S в клітинному циклі, а також індукував відтермінований каспазо-незалежний апоптоз, опосередкований білком Bax.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, представлені в дисертаційній роботі, дозволяють краще зрозуміти молекулярні механізми, задіяні у розвитку ендогенної інтоксикації при лімфомах, а також з'ясувати причини появи резистентності пухлинних клітин до хіміотерапії. Характеристика молекулярних процесів, які лежать в основі феномену старіння пухлинних клітин під час розвитку лімфоми NK/Ly, може бути корисним при розробці схем хіміотерапії пухлин, у першу чергу при лікуванні злоякісних мієлопроліферативних захворювань, які супроводжуються кахексією у пацієнтів.

Одержані результати й теоретичні узагальнення, що стосуються сигнальних механізмів дії різних цитокінів у канцерогенезі, особливо на термінальних стадіях цього процесу, використовуються при викладанні спецкурсу "Молекулярні механізми регуляції проліферації і диференціації клітин" та загального курсу "Проблемні питання сучасної біології" (д.б.н., проф. Стойка Р.С.).

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно опрацював літературу за темою дисертаційної роботи, виконав експериментальну частину та статистично обробив отримані результати. Мас-спектрометричний аналіз MALDI-TOF, був здійснений проф. Ульфом Гельманом (Інститут ракових досліджень Людвіга в м. Уппсала, Швеція). При проведенні цитоморфологічних досліджень дисертант отримував консультації і технічну допомогу від д.б.н., професора М.Д. Луцика (Інститут біології клітини НАН України). Перевивання лімфоми та хіміотерапію мишей із лімфомою NK/Ly проведено к.б.н. Н.М. Бойко (Інститут біології клітини НАН України). Визначення головних завдань роботи, а також обговорення результатів дослідження здійснено спільно з науковим керівником, членом-кореспондентом НАН України, д.б.н., проф. Стойкою Р.С.

Апробація результатів дисертації. За матеріалами дисертації зроблено доповіді на ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 24-27 жовтня, 2006 р.), на Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю "Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів" (Київ, 2-3 листопада 2006 р.), на 6-й Парнасівській конференції "Молекулярні механізми клітинного сигналювання" (Краків, Польща, 30 травня-2 червня 2007 р.), Міжнародній конференції молодих вчених з молекулярної біології і генетики (Київ, 20-22 вересня 2007 р.), 2-му Українському з'їзді клітинних біологів (Київ, 23-26 жовтня 2007 р.), Сесіях комісії хемії і біохемії Наукового товариства ім. Шевченка у 2007 та 2008 роках (Львів). Окрім того, результати роботи було представлено на конференціях молодих вчених Інституту біології клітини НАН України у 2006 та 2007 роках.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, із них 5 - у фахових періодичних виданнях і 7 - у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 153 сторінках комп'ютерного набору. Вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 5-ти розділів, де викладено отримані результати, проведено їх аналіз та узагальнення, а також із висновків і списку використаної літератури. Робота містить 44 рисунки. Бібліографічний список налічує 297 джерел.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Проаналізовано інформацію щодо молекулярних механізмів ендогенної інтоксикації при пухлинному рості, сигнального шляху цитокіна IL-6 у клітинах-мішенях, інгібіторах протеаз родини серпінів, сигнальних механізмів, задіяних у регуляції проліферації клітин та апоптозу, зумовленому дефіцитом метаболітів і факторів росту.

Матеріали і методи дослідження. У роботі використовували мишачу лімфому NK/Ly, отриману із клітинного банку Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ. Пухлину підтримували шляхом доочеревинного перещеплення 0,2-0,3 мл асцитної рідини (20-30 млн клітин) на 7-8 день росту лімфоми від тварини-пухлиноносія до тварини-реципієнта. Експериментальні тварини утримували відповідно до нормативів законодавства України, а також рекомендацій Національного Інституту Здоров'я (NIH) США.

Інтенсивність росту пухлини контролювали щоденним зважуванням мишей. Кількість живих клітин в асцитній рідині, яку використовували для інокуляції, була не менше 98%. Забір лімфомних клітин для досліджень проводили на 7-8 (1-й пасаж), 13-14 (2-й пасаж) та 20-21 (3-й пасаж) дні після інокуляції пухлини. В кінці експерименту робили розтин тварин і зважували їхні органи. У дослідженні використовували протипухлинні препарати доксорубіцин, вінкристин, а також протизапальні препарати дексаметазон та мегестерол ацетат. Курс хіміотерапії складався з 10 ін'єкцій препарату через день, починаючи з 5-го дня після інокуляції пухлини. При використанні комбінованих схем хіміотерапії (два і більше препаратів) курс іншого препарату зміщували на один день відносно першого, щоб звести до мінімуму ризик алергічної реакції тварин та несумісність препаратів.

Морфологію клітин лімфоми NK/Ly досліджували, вивчаючи мазки, зафарбовані азур-еозином за Романовським-Гімза, нейтральним червоним, або гематоксиліном Делафільда. Для візуалізації F-актинових філаментів мазки клітин асциту інкубували у розчині фалоїдину, кон'югованого з флуоресцентним барвником AlexaFluor 594 (InVitrogen, США), а для візуалізації ядер клітин використовували розчин 4,6-диамідино-2-феніліндолу (DAPI) (Sigma, США).

Для виявлення змін експресії прозапальних цитокінів застосовували метод зворотної полімеразної ланцюгової реакції (RT-PCR) із використанням специфічних праймерів до досліджуваних цитокінів (IL-1б, IL-1в, TNFб, TNFв, IL-6, VEGF, IFNг). Тотальну РНК виділяли з лімфомних клітин за допомогою реагенту Trizol (Gibco, США), зворотню транскрипцію проводили за допомогою набору "RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit" (Fermentas, Литовська Республіка). Нормалізацію кількості РНК здійснювали відносно мРНК в-актину. Отримані зображення аналізували програмою GelPro 4.0 (Media Cybernetics, США). Вміст інтерлейкіну-6 та інтерферону-г визначали імуноферментним методом, використовуючи набори фірми eBioscience (США).

Вплив асцитної рідини на клітини NK/Ly досліджували шляхом інкубації in vitro клітин початкових стадій росту (7-8 днів після інокуляції лімфоми) в асцитній рідині, отриманій на ранній (7-8 днів) і термінальній (20-21 день) стадіях росту асциту. Для оцінки ефективності життєдіяльності клітин визначали споживання глюкози у часових інтервалах 0-6 годин, 6-12 годин і 12-24 години. На початку і в кінці інкубації підраховували кількість клітин після їх фарбування 0,1% розчином трипанового синього у гемоцитометричній камері Горяєва.

Вміст окремих білків у лізатах клітин визначали за допомогою Вестерн-блот-аналізу із використанням антитіл до фосфорильованих форм білків pSTAT1 (Tyr 701), pSTAT3 (Tyr 705) та pSTAT3 (Ser 727), кінази МАР-кінази (MEK 1/2), мітоген-активованої протеїнкінази p42/p44 ERK 1/2, фосфорильованих форм білка pRb (Ser 807/811) та pRb (Ser 795), кінази Сdc2 (Tyr 15), розщепленої форми каспази-3, каспази-6 та каспази-7 (Cell Signaling, США), транскрипційних факторів E2F1/2, c-Myc, кінази Cdc2, проапоптичних білків p53, Вax, Вcl-XL/S (Santa Cruz Biotech, США), а також до -актину (Sigma, США)

Для вивчення концентрації інгібіторів протеаз в асцитній рідині на різних стадіях розвитку лімфоми NK/Ly було використано стандартний тест із бензоїларгінін-пара-нітроанілідом (BApNA) як субстратом реакції (Preiser et al, 1975). Метод ґрунтується на спектрофотометричній детекції хромофора п-нітроаніліду (pNA) після його відщеплення від субстрату (BApNA) внаслідок дії трипсину в реакційній суміші. Зниження вмісту п-нітроаніліда вказувало на зростання інгібіторної активності у використаному зразку асцитної рідини.

Очистку білків асцитної рідини здійснювали шляхом електрофорезу у градієнті ПААГ 7,5-17,5% за нативних умов, після чого білкові смуги, характерні для асциту лімфоми NK/Ly, вирізали з гелю, гомогенізували, кип'ятили з буфером Леммлі та повторно піддавали електрофорезу за денатуруючих умов.

Мас-спектрометрію MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass) здійснював проф. Ульф Гельман (Інститут ракових досліджень Людвіга, м. Уппсала, Швеція). Після трипсинового протеолізу та екстракції утворених пептидів їхню суміш аналізували за допомогою методу Peptide Mass Fingerprinting (PMF), використовуючи прилад Bruker Ultraflex TOF/TOF (Bruker Daltonics, Бремен, Німеччина) відповідно до рекомендацій виробника.

Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів проводили із використанням критерію Стьюдента за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel 2007.

Результати досліджень та їх обговорення

Цитоморфологічні зміни у процесі розвитку лімфоми NK/Ly. Нами виявлено, що розміри асцитних клітин у популяції достовірно зростають у процесі росту лімфоми NK/Ly

Ці зміни особливо помітні при порівнянні розподілу клітин за розмірами на початку росту цієї пухлини (7-8 днів після інокуляції) і на термінальній стадії її розвитку перед загибеллю тварини (20-21 день після інокуляції). Зокрема, якщо на початку розвитку пухлини максимальний діаметр клітин становив 14 мкм, то на кінцевій стадії цей показник зростав до 18 мкм. Для з'ясування питання, які саме морфологічні зміни у клітинах лімфоми NK/Ly супроводжують збільшення їхніх розмірів, було проведено спеціальне цитологічне дослідження, в якому вивчали зміни у структурі хроматину, який фарбували гематоксиліном Делафільда і нейтральним червоним.

На початкових стадіях росту лімфоми NK/Ly (7-8 днів після інокуляції пухлини) досить часто зустрічається картина мітозу, цитоплазма клітин має насичений голубий колір завдяки високому вмісту РНК, ядро клітин достатньо інтенсивно зафарбоване, і майже не видно ядерець. В окремих випадках у полях зору зустрічаються клітини з пухирчастими утвореннями на поверхні ("блеббінг"), що свідчить про неблагополучний стан клітини, який, очевидно, є зворотнім. У той же час на термінальній стадії розвитку лімфоми (20-21 день після інокуляції) все частіше зустрічаються клітини збільшених розмірів. Крім того, має місце руйнування клітинного ядра внаслідок втрати ним хроматину, або його конденсації, а також вакуолізація цитоплазми з подальшим утворенням великих вакуолей

Отже, розподіл клітин за їхніми розмірами є важливим кількісним показником стану популяції клітин лімфоми NK/Ly. Ми вважаємо, що розмір клітин відображає їхній функціональний стан, причому його погіршення призводить до збільшення розмірів клітини.

Дослідження продукції прозапальних цитокінів у процесі розвитку лімфоми NK/Ly. Характерною особливістю лімфоми NK/Ly є поява запального процесу та загальної інтоксикації тварин-пухлиноносіїв на термінальній стадії її розвитку (20-21 день після інокуляції). Як наслідок, погіршується функціональний стан тварини, відбувається втрата маси скелетних м'язів, печінки та селезінки, тоді як маса таких життєво важливих органів, як серце і мозок, залишається без суттєвих змін.

Однією з причин ендогенної інтоксикації при канцерогенезі можуть виступати прозапальні цитокіни, зокрема, інтерлейкін-1, інтерлейкін-6, інтерферон-гамма, фактори некрозу пухлин б і в та ін. (Noguchi et al, 1996; Sherry et al, 1989; Strassmann et al, 1992; Belizario et al, 1991; Langstein et al, 1991; Zebrowski et al, 1999; Hehlgans and Pfeffer, 2005). Для того, щоб виявити, які саме цитокіни можуть бути задіяні у розвитку кахексії при рості лімфоми NK/Ly, нами проведено зворотну полімеразну ланцюгову реакцію (RT-PCR) із використанням специфічних праймерів до 7-и цитокінів: IL-1б, IL-1в, TNF-б, TNF-в, IFN-г, VEGF та IL-6.

Встановлено, що у пухлинних клітинах має місце високий рівень експресії мРНК лише двох цитокінів - IL-6 та VEGF (електрофоретичні доріжки мРНК інших цитокінів, за винятком IL-1б, не наведено через відсутність помітної кількості продуктів ПЛР). Відомо, що VEGF є одним з ключових цитокінів, що задіяний у канцерогенезі. Високий рівень його експресії призводить до формування асциту та дегідратації периферійних тканин, що суттєво погіршує загальний функціональний стан тварин-пухлиноносіїв (Koukorakis et al, 2004; Senger et al, 1983). Оскільки мРНК інших досліджуваних цитокінів (IL-1б, IL-1в, TNF-б, TNF-в) перебувала на низькому рівні, є підстави вважати, що ці цитокіни не відіграють значної ролі у розвитку ендогенної інтоксикації, яка супроводжує розвиток лімфоми NK/Ly. Ми не виявили суттєвих змін в експресії мРНК VEGF на ранніх і пізніх стадіях пухлинного росту тоді як рівень мРНК IL-6 зростав у 4 рази порівняно з початковою стадією розвитку лімфоми.

Для підтвердження результатів аналізу RT-PCR рівня мРНК цитокінів нами проведено імуноензимне визначення вмісту IL-6 та IFN-г в асцитній рідині тварин-пухлиноносіїв на різних стадіях росту лімфоми NK/Ly. IL-6 було обрано як цитокін, задіяний у патогенезі лімфоми NK/Ly, а IFN-г було обрано для якісної оцінки статусу імунної системи тварин-пухлиноносіїв під час розвитку лімфоми. Оскільки рівень мРНК VEGF суттєво не змінювався протягом досліджуваного періоду розвитку лімфоми NK/Ly, ми не проводили визначення концентрації цього цитокіна в асцитній рідині.

Концентрація IL-6 на ранніх стадіях розвитку асциту (1-й пасаж, 7-8 днів після інокуляції пухлини) становила 90 пг/мл і різко зростала до 570 пг/мл на термінальній стадії пухлинного росту (20-21 день після інокуляції асциту). Ці дані повністю узгоджуються з раніше отриманими результатами використання RT-PCR для визначення динаміки рівня мРНК IL-6 у пухлинних клітинах (коефіцієнт кореляції r=0,85).

Беручи до уваги дані літератури та результати власних досліджень, що показали суттєве зростання рівня IL-6 на пізніх стадіях канцерогенезу, ми припускаємо, що саме цей цитокін задіяний у ендотоксичних процесах, які відбуваються під час розвитку лімфоми NK/Ly. Виявлено сильну негативну кореляцію (r=0,9) між рівнем IL-6 у асциті та кількістю мертвих лімфомних клітин, і позитивну кореляцію (r=0,95) між концентрацією IL-6 в асциті та кількістю макроцитів (клітин зі збільшеними розмірами). Одержані дані дають підстави припустити, що IL-6 негативно діє як на загальний функціональний стан організму, так і безпосередньо на лімфомні клітини, які його продукують.

На відміну від IL-6, для IFN-г характерна дещо інша динаміка його рівня а асцитній рідині тварин-пухлиноносіїв. Результати зворотної полімеразної ланцюгової реакції засвідчили, що експресія мРНК цього цитокіна у пухлинних клітинах була на дуже низькому рівні протягом усіх стадій росту лімфоми, тоді як в асцитній рідині простежувалася протилежна тенденція. Якщо на 7-8 день розвитку пухлини рівень IFN-г становив 1200 пг/мл, то на термінальній фазі росту лімфоми (20-21 день після інокуляції) він суттєво знижувався до 30 пг/мл. Вміст IFN-г негативно корелює із тривалістю життя тварин-пухлиноносіїв, що опосередковано свідчить про погіршення стану їхньої імунної системи у процесі розвитку лімфоми NK/Ly. Якщо на початкових стадіях росту цієї пухлини спостерігається високий рівень IFN-г (1000 пг/мл), то вже на 13-14-й день після інокуляції його концентрація в асциті зменшується у 30 разів (40 пг/мл), утримуючись на такому низькому рівні до загибелі тварини. Тому рівень IFN-г в асцитній рідині можна використовувати як важливий прогностичний показник стану тварин-пухлиноносіїв та прогресії лімфоми NK/Ly.

Продукція інгібіторів протеаз під час розвитку лімфоми NK/Ly. Відомо, що пухлинні клітини можуть продукувати низькомолекулярні білки, які негативно впливають на організм онкохворих (Rubin et al, 2005). Ми дослідили білковий спектр асцитної рідини на ранній і пізній стадії розвитку пухлини NK/Ly, використовуючи для цього білковий електрофорез у ПААГ за нативних та денатуруючих умов. За його результатами виявлено три білкові смуги з молекулярною масою від 50 до 65 кДа, які було вирізано з гелю і повторно очищено електрофорезом у 12% ПААГ за денатуруючих умов. Для ідентифікації виділених білків застосовано метод мас-спектрометричного аналізу MALDI-TOF із використанням пошукової системи ProFound (http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe) та актуальної версії бази даних NCBI's nr.

Білкову фракцію 62 кДа було ідентифіковано (перекривання послідовності 25%) як альфа-фетопротеїн (білок-попередник альбуміну, онкофетальний маркер). Рівень цього білка часто зростає у плазмі крові при злоякісних новоутвореннях. Мас-спектрометричне дослідження білкової фракції 50 кДа виявило з високим рівнем достовірності (перекривання послідовності 33%) її схожість із інгібітором серинових протеаз cерпіном a1c (альфа-1 інгібітор трипсину), який продукується гепатоцитами у відповідь на розвиток запальних процесів. Білкову фракцію 64 кДа було ідентифіковано (перекривання послідовності 25%) як інгібітор серинових протеаз серпін а 3k (контрапсин, альфа-1 інгібітор хімотрипсину).

Відомо, що рівень інгібіторів протеаз підвищений у плазмі крові онкохворих і це може бути пояснено високим рівнем у них прозапальних цитокінів. Посилена секреція серпінів печінкою може також бути захисною реакцією організму на інвазивний канцерогенез, оскільки при цьому блокується дія еластаз, які продукуються злоякісними клітинами, що перешкоджає метастазуванню пухлини (Mignatti et al, 1986). Крім того, показано, що знижений рівень а 1-інгібітора трипсину позитивно корелює із більш агресивним ростом пухлин (Huang et al, 2004).

Оскільки альфа-фетопротеїн і серпіни а 3с/а 3k синтезуються лише в печінці (Stoller and Aboussouan, 2005, Kalsheker, 1996; Elmaouhoub et al, 2007) ми припустили, що лімфома NK/Ly не продукує інших факторів, окрім IL-6 і VEGF. Для верифікації даних аналізу MALDI-TOF нами було досліджено інгібувальну дію асцитної рідини на протеазну активність із використанням бензоїларгінін-п-нітроаналіду (BAPNA), як субстрату реакції. Виявлено зростання на 50% інгібіторної активності асцитної рідини на пізній стадії розвитку лімфоми NK/Ly, що узгоджується з даними білкового електрофорезу та спектрометричного аналізу MALDI-TOF.

Беручи до уваги тісну позитивну кореляцію (r=0,93) між концентрацією IL-6 та серпінів а 3с/а 3k в асцитній рідині, ми дослідили, чи справді IL-6, який продукується клітинами лімфоми NK/Ly, може індукувати продукцію серпінів гепатоцитами печінки. Застосування зворотної полімеразної ланцюгової реакції (RT-PCR) із використанням специфічних праймерів до мРНК серпіну а 3с, а 3k та транскрипційного фактора NF-IL6 (C-EBP/в), який діє як медіатор реакцій запальної відповіді, індукованих IL-6 (Morgan and Kalsheker, 1997), дозволило виявити виявив істотне збільшення рівня експресії (у 4 рази) мРНК серпіну а 1с у клітинах печінки тварин-пухлиноносіїв на термінальній стадії росту лімфоми NK/Ly, у той час як рівень мРНК серпіну а 3k зростав менш помітно (у 2 рази). Експресія мРНК ядерного фактора C-EBP/в також зростала в 3 рази на термінальній стадії розвитку лімфоми NK/Ly (20-21 день після інокуляції), причому це зростання позитивно корелювало (r=0,92) з високим рівнем IL-6 у асцитній рідині. Відомо, що транскрипційний фактор NF-IL6 (C-EBP/в) регулює індукцію генів запальної відповіді у печінці за дії IL-6 (Kishimoto et al, 1996). Тому результати RT-PCR підтвердили наше припущення про залучення цього цитокіна у процеси продукції надмірної кількості інгібіторів протеаз клітинами печінки під час розвитку лімфоми NK/Ly. Отже, основним джерелом інгібіторів протеаз у асцитній рідині можна вважати серпін а 1с, і його продукція гепатоцитами безпосередньо індукується IL-6 на пізній стадії розвитку лімфоми NK/Ly. Високий рівень серпіну а 1с в асцитній рідині може зменшувати негативні наслідки запальної реакції, яка спостерігається при розвитку даної пухлини.

Дослідження внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, що діють під час розвитку лімфоми NK/Ly. Імуноензимний аналіз виявив суттєві зміни у концентрації двох цитокінів - IL-6 та IFN-г, у асцитній рідині в процесі росту лімфоми NK/Ly. У зв'язку з цим виникла потреба дослідити внутрішньоклітинні механізми сигналювання цих цитокінів у пухлинних клітинах. Відомо, що як IL-6, так і IFN-г, використовують шлях Jak-STAT у передачі регуляторних сигналів, а їхні внутрішньоклітинні каскади сигналювання відрізняються лише за одним ефекторним білком - STAT3 (IL-6) або STAT1 (IFN-г).

Проведений нами Вестерн-блот аналіз із використанням моноклональних кролячих антитіл до фосфорильованих форм білків STAT1 та STAT3 не виявив pSTAT1 (Tyr 701) і показав наявність слідових кількостей білка pSTAT3 (Tyr 705) у клітинах лімфоми NK/Ly. У той же час нами виявлено помітне зростання вмісту білка pSTAT3 із іншим локусом фосфорилювання (Ser727) у пухлинних клітинах на термінальній стадії розвитку лімфоми. Відомо, що активація даного транскрипційного фактора відбувається за участю MAP-кіназного каскаду, який також ініціюється IL-6 (Ogata et al, 1997). Тому нами було більш детально досліджено дану регуляторну систему в клітинах мишачої лімфоми NK/Ly залежно від стадії розвитку цієї пухлини.

Виявлено зростання рівня фосфорильованої (активної) форми кінази МАР-кінази (МЕК 1/2) та МАР-кінази (р 42/р 44 ERK 1/2) на термінальній стадії росту лімфоми NK/Ly, що може вказувати на здатність IL-6 індукувати ріст лімфомних клітин. Ми також виявили зростання рівня антиапоптичного білка Bcl-XL на термінальній стадії розвитку лімфоми NK/Ly. Встановлено, що цей білок також задіяний у регуляції проліферації клітин (Zinkel et al, 2006)

Відомо, що однією із внутрішньоклітинних молекулярних мішеней як МАР-кінази, так і pSTAT3 є продукт протоонкогена с-myc, який відіграє важливу роль в ініціації проліферації клітин. Нами продемонстровано, що вміст білка c-Myc суттєво зростає на термінальній стадії росту (20-21 день після інокуляції) лімфоми NK/Ly. Оскільки експресія c-Myc за механізмом зворотного зв'язку також може індукуватися транскрипційними факторами родини E2F, нами досліджено вміст транскрипційних факторів E2F1 та E2F2. Встановлено, що рівень експресії E2F2 зростає майже на порядок у пухлинних клітинах на термінальній стадії розвитку лімфоми NK/Ly. У той же час зростання рівня E2F1 у цих клітинах було менш вираженим. Отже, підвищений рівень експресії протоонкогена c-Myc та транскрипційних факторів E2F може свідчити про активні проліферативні процеси, які відбуваються в клітинах лімфоми NK/Ly на пізніх етапах її розвитку.

Оскільки цей висновок не узгоджується з нашими даними про масову загибель лімфомних клітин, ми вважаємо, що найбільш імовірним поясненням цього протиріччя може бути дефіцит факторів росту і метаболітів у асцитній рідині мишей-пухлиноносіїв на термінальній стадії розвитку лімфоми NK/Ly внаслідок бурхливої проліферації пухлинних клітин у цей період. Щоб перевірити це припущення, нами було порівняно здатність асцитної рідини, отриманої на початковій і термінальній стадії росту лімфоми NK/Ly, підтримувати ріст лімфомних клітин in vitro. Критеріями оцінки життєздатності лімфомних клітин слугували рівень утилізації клітинами глюкози та кількість живих клітин, які не поглинули барвник трипановий синій. Показано, що при інкубації пухлинних клітин в асцитній рідині, отриманій на 20-21 день після інокуляції лімфоми NK/Ly, не лише знижується рівень утилізації глюкози (який слугував для оцінки метаболічної активності цих клітин), але й зростає відсоток трипан-позитивних (мертвих) клітин NK/Ly у порівнянні з такими показниками, визначеними для клітин, які вирощували в асцитній рідині, отриманій на 7-8 день після інокуляції лімфоми. Отже, на термінальній стадії розвитку лімфоми може виникати дефіцит факторів росту і відбуватися накопичення цитотоксичних сполук у навколоклітинному середовищі (асцитній рідині). Результати проведеного Вестерн-блот аналізу виявили суттєве зростання рівня неактивної форми кінази Cdc2 на термінальній стадії розвитку лімфоми NK/Ly, що вказує на зупинку пухлинних клітин у фазах G1/S клітинного циклу

Відомо, що надекспресія гена c-myc в клітинах за умов дефіциту факторів росту в позаклітинному середовищі призводить до загибелі цих клітин шляхом апоптозу (Фільченков і Стойка, 2007). Цей парадоксальний феномен пояснюють одночасним впливом на клітину регуляторних сигналів, які взаємно виключають дію один одного: транскрипційний фактор с-Мус сприяє проліферації клітин, тоді як дефіцит факторів росту зупиняє цей процес. Як наслідок, клітина вступає на шлях апоптозу (Фільченков і Стойка, 2007).

Для підтвердження вірності даної гіпотези у випадку дозрівання лімфоми NK/Ly, ми провели Вестерн-блот аналіз вмісту деяких проапоптичних білків у клітинах цієї пухлини. Крім того, за допомогою електрофорезу ядерної ДНК в гелі агарози було показано міжнуклеосомну фрагментацію ДНК, характерну для апоптичних клітин. У досліджуваних лімфомних клітинах на пізній стадії розвитку пухлини дійсно має місце міжнуклеосомне розщеплення ядерної ДНК, характерне для апоптозу.

За результатами проведеного аналізу необхідно відзначити відсутність активних форм каспази-3, каспази-6 та каспази-7, а також проапоптичного білка pRb у клітинах лімфоми NK/Ly, що може вказувати на функціонування в цих клітинах каспазо-незалежних шляхів індукції апоптозу. Це припущення підтверджується відсутністю у цих клітинах білка р 53, який, як відомо, задіяний у каспазо-залежному апоптозі. У той же час на термінальній стадії росту лімфоми NK/Ly у пухлинних клітинах спостерігається підвищення вмісту про-апоптичного білка Вax який може індукувати апоптоз, незалежно від участі каспаз (Lindenboim et al, 2000).

Результати наших досліджень вказують на можливість дуалізму в дії IL-6 під час розвитку мишачої лімфоми NK/Ly. Впливаючи на клітини за автокринним механізмом, IL-6 може сприяти неконтрольованій проліферації пухлинних клітин і вичерпанню ними ріст-стимулюючих факторів у асцитній рідині. У поєднанні з індукцією надекспресії продукту онкогена c-myc, транскрипційних факторів E2F1 та E2F2, антиапоптичного білка Bcl-XL та білків-учасників MAP-кіназного каскаду це може призводити до зупинки лімфомних клітин у фазі G1/S, а також до збільшення розмірів клітин та їх загибелі шляхом каспазо-залежного апоптозу.

Вплив протипухлинних препаратів із різними механізмами дії на продукцію цитокінів, інгібіторів протеаз та сигнальні системи у клітинах лімфоми NK/Ly. Нами досліджено тривалість життя та рівень IL-6 та IFN-г під час хіміотерапії мишей із лімфомою NK/Ly протипухлинними чинниками, які широко застосовуються в клініці - доксорубіцином, вінкристином, дексаметазоном та мегестерол ацетатом. Найбільш суттєво тривалість життя зростала у тварин, які отримували доксорубіцин та вінкристин - до 38 та 32 днів, відповідно, тоді як дексаметазон суттєво не впливав на цей показник - 22 дні порівняно з 20-21 днів у контрольній групі. Лікування мегестерол ацетатом не виявило вираженого ефекту, а в окремих випадках нами навіть було зафіксовано зменшення тривалості життя тварин-пухлиноносіїв порівняно з контрольною групою.

Імуноензимний аналіз засвідчив, що у дослідних груп тварин, які отримували дексаметазон, доксорубіцин та вінкристин, мало місце суттєве зниження рівня IL-6 на термінальній стадії росту лімфоми (107-175 пг/мл у порівняні з 570 пг/мл у тварин, що не проходили лікування). У той же час нами було виявлено зростання рівня IL-6 у тварин, які отримували мегестерол ацетат (до 450 пг/мл на термінальній стадії росту лімфоми NK/Ly). Динаміка рівня IFN-г при лікуванні мишей-пухлиноносіїв дексаметазоном та мегестеролом суттєво не змінювалась порівняно з контрольною групою, однак у мишей, що отримували доксорубіцин та вінкристин, на термінальній стадії розвитку лімфоми виявлено зростання рівня IFN-г в 4-10 разів порівняно з контрольною групою (30 пг/мл) - 320 пг/мл і 110 пг/мл, відповідно.

Ми пропонуємо наступне пояснення одержаних результатів. Відомо, що дексаметазон є потужним протизапальним стероїдом, який активно інгібує продукцію усіх прозапальних цитокінів, включно із IL-6, який, як нами було показано відіграє негативну роль у розвитку лімфоми NK/Ly. У той же часі IFN-г, навпаки, підвищує опірність організму й імунної системи до цієї пухлини. Отже, відбувається своєрідне "зрівноважування" ефектів цих двох цитокінів і тому дексаметазон не дає бажаних результатів при його застосуванні для лікування лімфоми NK/Ly. Мегестерол ацетат у діапазоні терапевтичних доз 400-800 мг/кг не проявляв позитивного ефекту на функціональний стан тварин-пухлиноносіїв.

Вивчення динаміки вмісту інгібіторів протеаз у асцитній рідині лімфоми NK/Ly за умов хіміотерапії показало, що лікування мишей-пухлиноносіїв доксорубіцином та вінкристином супроводжувалось зростанням продукції серпінів. У той же час при лікуванні доксорубіцином і дексаметазоном чи вінкристином і дексаметазоном було виявлено певне зниження рівня цих інгібіторів протеаз у асцитній рідині. Оскільки відомо, що серпіни можуть пригнічувати запальні процеси, у подальших дослідженнях ми виключили дексаметазон із загальної схеми хіміотерапії.

Щоб з'ясувати молекулярні механізми, які можуть лежати в основі пригнічення продукції IL-6 у лімфомних клітинах NK/Ly доксорубіцином і вінкристином, було проведено Вестерн-блот аналіз експресії білків, задіяних у регуляції проліферації і апоптозу клітин. Встановлено, що доксорубіцин (1 мг/кг) не лише пригнічував проліферативні процеси в лімфомних клітинах, але й блокував їх у фазі G2/M (за даними експресії Cdc2 (Tyr 15). Нами також показано активацію каспази-3 та каспази-7 у лімфомних клітинах після дії доксорубіцину та зниження у цих клітинах вмісту білків Bcl-XL і Bax. Ці дані вказують на залучення каспазо-залежного шляху в індукцію апоптозу в лімфомних клітинах при дії доксорубіцину.

У тварин, які отримували вінкристин, на термінальній стадії пухлинного росту виявлено зростання рівня pSTAT3 (Ser 727) та Bcl-XL. Експресія фактора с-Myc залишалася на високому рівні протягом усього курсу лікування вінкристином. Активація pSTAT3 у цих пухлинних клітинах частково може бути зумовлена як дією IL-6, так і впливом несприятливих чинників, наприклад цитостатика вінкристину, який блокує деполімеризацію мітотичного веретена у цих клітинах у процесі клітинного поділу.

Вестерн-блот аналіз із застосуванням антитілам до фосфорильованої форми протеїнкінази Cdc2 показав, що значна частина лімфомних клітин мишей-пухлиноносіїв при лікуванні вінкристином перебуває у фазі G1/S. Нами не виявлено експресії р 53 і виявлено високий рівень білка Bcl-XL у лімфомних клітинах NK/Ly при лікуванні вінкристином, що вказує на ріст цих клітин за умов їхнього блоку в фазі G1/S. Як доказ цього можна також навести суттєве зростання кількості клітин із збільшеними розмірами (до 30-40%) у популяції лімфомних клітин, а також надекспресію фактора c-Myc у пухлинних клітинах на термінальній стадії росту лімфоми за умов хіміотерапії з використанням вінкристину. У цьому випадку також не відбувається активації каспаз і зростає рівень білка Bax, що вказує на відтермінований каспазо-незалежний шлях індукції апоптозу вінкристином у клітинах лімфоми NK/Ly. Отже, найбільш ефективною схемою лікування лімфоми NK/Ly виявилась монохіміотерапія із використанням доксорубіцину. Синтетичний стероїд дексаметазон, незважаючи на його здатність понижувати рівень IL-6 у асцитній рідині, суттєво не продовжував життя тварин, а ефективність дії вінкристину була нижчою, ніж у доксорубіцину. Разом з тим слід зазначити досить високу стійкість лімфоми NK/Ly до різних протипухлинних агентів, що можна пояснити надекспресією в цих клітинах білка Bcl-XL. У той же час, у зв'язку із певною подібністю до лімфомних пухлин, які зустрічаються у клініці, лімфома NK/Ly може мати перевагу над іншими мишачими лейкеміями, такими Р 388 і L1210. Суттєве продовження життя (більше 35-40 днів) у тварин з лімфомою NK/Ly за дії доксорубіцину свідчить про високу ефективність цього протипухлинного чинника.

Висновки

У дисертаційній роботі досліджено розвиток лімфоми NK/Ly in vivo, зокрема, вперше. охарактеризовано зміни в рівні цитокінів за умов ендогенної інтоксикації у мишей-пухлиноносіїв та досліджено сигнальні шляхи в лімфомних клітинах під час розвитку цієї пухлини. Розроблено оптимальну схему хіміотерапії лімфоми NK/Ly і досліджено регуляторні процеси у лімфомних клітинах під час хіміотерапії із використанням антинеопластичних препаратів з різними молекулярними механізмами дії. За результатами дослідження зроблено такі висновки

1. На 13-14 день розвитку лімфоми NK/Ly в асцитній рідині тварин-пухлиноносіїв зростає рівень прозапального цитокіна IL-6 і різко знижується рівень IFN-г. Це супроводжується проявом ознак ендогенної інтоксикації із зниженням маси тіла тварин, їхнім фізичним виснаженням і скорочення тривалості життя, що характерно для стану кахексії.

2. Паралельно до підвищення рівня IL-6 в асцитній рідині зростає активність інгібіторів протеаз, таких як серпіни а 1с і a3k. У печінці тварин-пухлиноносіїв також зростає рівень експресії транскрипційного фактора NF-IL6 (C-EBP/в), який задіяний у IL-6-індукованому розвитку реакції гострої запальної відповіді.

3. На термінальному етапі розвитку лімфоми NK/Ly (20-21 день після інокуляції пухлини) відбувається дегенерація лімфомних клітин, яка супроводжується збільшенням розмірів частини цих клітин у їхній популяції. Одночасно знижується здатність асциту підтримувати ріст лімфомних клітин NK/Ly при їхньому культивуванні in vitro.

4. У лімфомних клітинах NK/Ly на термінальній стадії розвитку пухлини відмічено підвищену експресію транскрипційних факторів c-Myc, E2F-1/2 та компонентів MAP-кіназного регуляторного каскаду, а також зупинку клітин на переході G1/S клітинного циклу (зростання рівня кінази сdc2, фосфорильованої по залишку тирозину в положенні 15). Тому за цих умов лімфомні клітини NK/Ly продовжують збільшувати свої розміри без мітотичного поділу.

5. Основна маса старіючих лімфомних клітин гине шляхом апоптозу, очевидно, викликаного дефіцитом метаболітів у асцитній рідині. Цей процес супроводжується зростанням рівня проапоптичного білка Bax, індукованого транскрипційним фактором c-Myc, але відбувається без участі білка р 53 і каспаз.

6. Найбільш ефективним хіміотерапевтичним препаратом у лікуванні лімфоми NK/Ly є доксорубіцин (1 мг/кг, 10 ін'єкцій через день), який вдвічі продовжував життя мишей-пухлиноносіїв (з 20-21 дня до 38-40 днів). Синтетичні стероїди дексаметазон та мегестерол ацетат, які використовували для подолання негативних наслідків кахексії, були неефективними як при застосуванні окремо, так і в їхньому поєднанні з протипухлинними препаратами доксорубіцином і вінкристином.

7. Введення доксорубіцину (1 мг/кг, 10 ін'єкцій через день) призводить до суттєвого зниження рівня IL-6 в асцитній рідині, зупинки росту пухлинних клітин у фазах G2/M (відсутність кінази Cdc2, фосфорильованої по залишку тирозину в положенні 15) і їхньої загибелі шляхом каспазо-опосередкованого апоптозу.

8. Введення вінкристину (1 мг/кг, 10 ін'єкцій через день) викликає зупинку росту клітин у фазі G1/S (зростання рівня кінази Cdc2, фосфорильованої по залишку тирозину в положенні 15), зростання рівня експресії транскрипційних факторів c-Myc і E2F-1/2, і відтерміновану загибель клітин шляхом каспазо-незалежного апоптозу за умов дефіциту метаболітів і факторів росту в асцитній рідині. Ці дані свідчать про суттєву відмінність шляхів активації апоптозу у лімфомних клітинах NK/Ly при дії доксорубіцину і вінкристину.