Методы исследования популяции человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

68

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ ЧЕЛОВЕКА

Комплексная цель: 1. Дать основные понятия о методах исследования популяций человека и познакомить студентов с разнообразием применяемых методов исследования. 3. Познакомить студентов с методиками расчета различных коэффициентов, используемых при изучении популяционно-генетической структуры населения.



1. Методы исследования в генетической эпидемиологии

В настоящее время оценка генетической структуры различных популяций осуществляется с использование биологических и небиологических источников информации, следующими методами:

· анализ брачно-миграционной структуры;

· изучение генетико-демографических характеристик;

· исследование полиморфных белков;

· анализ частот ДНК-маркеров;

· определение распространенности генов наследственных заболеваний.



2. Оценка параметров популяционно-генетической структуры из небиологических источников информации

2.1 Брачно-миграционная структура популяции

Брачно-миграционное поведение населения существенным образом влияет на состояние генофонда популяции, поэтому описание брачно-миграционных характеристик является обязательным при изучении популяционно-генетической структуры и медико-генетическом обследовании любых изучаемых регионов.

При изучении брачно-миграционных характеристик используют брачные записи, анализ которых позволяет оценить такие параметры как индекс эндогамии, индекс брачной этнической ассортативности, локальный инбридинг через модель изоляции расстоянием Малеко.

Для характеристики определенного поколения в популяции копируются брачные записи не более чем за 10 лет. Брачные записи содержат сведения о добрачной фамилии жениха и невесты, их возрасте, национальности, месте рождения и месте жительства и позволяют оценить брачную миграцию. Человек является «удобным» объектом для изучения миграционной активности, так как обладает паспортом и прочими документами. Изучение и обобщение подобной документации является одним из разделов демографической генетики. При проведении анализа исключаются следующие браки:

· супруги после регистрации покинули исследуемую популяцию;

· браки пенсионеров;

· браки, в которых один из супругов - уроженец несуществующей деревни;

· браки, в которых оба супруга - из не исследуемой популяции.

Конечно, бывают случаи, при которых супруги, прожив всю жизнь вместе, регистрируют брак только под старость, однако такие браки необходимо учитывать в предыдущем поколении, поскольку реальная популяция существует не только в пространстве, но и во времени, а исследование направлено на характеристику определенного поколения популяции.

Индекс эндогамии

Одной из важнейших генетических характеристик популяции является индекс эндогамии, который с одной стороны отражает уровень миграционной активности населения, с другой - показывает уровень изолированности элементарной популяции, то есть, имеются ли в ней условия для возникновения инбридинга.

Индекс эндогамии - доля мужей и жен, родившихся в данной популяции. Чем выше уровень эндогамии в популяции, то есть чем чаще супруги происходят из одной и той же популяции, тем выше вероятность, что они являются родственниками и, следовательно, несут одни и те же гены, полученные от общих предков. Эндогамия приводит в противоположность миграциям к повышению генетических различий между субпопуляциями, входящими в состав единой популяции более высокого иерархического уровня. Эндогамия, отражая интенсивность давления миграций, является количественной мерой генетической подразделенности.

Показано существование прямой регрессионной зависимости между миграционными характеристиками, значениями случайного инбридинга и грузом наследственной патологии. Для вычисления индекса эндогамии составляется миграционная матрица.

Миграционное поведение представителей разных этносов в полиэтнических популяциях различно, причем русское население характеризуется более высокой миграционной активностью сельского населения и большей оседлостью городского.

Этническая брачная ассортативность

Принцип свободного и случайного скрещивания в популяциях человека может нарушаться, если образование пар по какому-либо признаку происходит не случайно. В генетике такой неслучайный подбор пар носит название "ассортативность". Ассортативность может быть по этнодемографическим (возраст, национальность, профессия), морфофизиологическим признакам (рост, цвет кожи, глаз) и личностным характеристикам (уровень интеллекта).

Под этнической брачной ассортативностью понимают предпочтение человека в заключении брака внутри своей национальности. Количественной мерой изолированности популяций по национальному признаку является коэффициент этнической брачной ассортативности (Н), который определяется как отношение наблюдаемой доли однонациональных браков к ожидаемой доле таких браков в предположении о панмиксии. Если Н = 1, то популяция панмиксна, если Н < 1, то в популяции наблюдается отрицательная ассортативность по этническому признаку, при Н > 1 ассортативность положительна.

При проживании на одной территории различных этносов обнаруживается «эффект национального меньшинства», заключающийся в том, что этническая ассортативность наиболее высока у представителей наименее малочисленных этносов.

Время смешения различных этносов, проживающих на одной территории можно оценить по формуле:

t = ln(1-M)/ln(1-m)

где t - число поколений,

M - уровень смешения,

m - интенсивность генного обмена,

ln - натуральный логарифм.

Локальный инбридинг

Между реально существующими популяциями человека постоянно происходит миграционный процесс, который вносит дополнительную генетическую изменчивость в популяцию и может приводить к изменению генных частот. Как правило, миграции способствуют выравниванию генных частот в популяциях и сдерживают процесс микродифференциации субпопуляций.

Для анализа медико-генетических результатов необходимо апеллировать показателями, одинаково пригодными как для оценки меж-, так и внутрипопуляционного родства. Этим условиям отвечает метод оценки локального инбридинга, построенный на представлении об изоляции расстоянием Малеко, который позволяет установить зависимость степени родства супругов от расстояния между местами их рождения.

Модель популяционной структуры, построенная на представлении об изоляции расстоянием Малеко, предполагает, что население равномерно распределено по изучаемой территории (система односемейных хуторов), брачные миграции изотропны (происходят отовсюду достаточно равномерно), а вероятность каждой из них обратно пропорциональна расстоянию между местами рождения супругов.

Сосредоточение населения в отдельных населенных пунктах с выраженной дисперсией их размеров ограничивает адекватность этой модели, однако этим обстоятельством можно пренебречь, если изучаемая территория и количество поселений на ней достаточно велико.

Отличительная особенность модели - возможность применения только в моноэтнических популяциях. При изучении полиэтнических популяций параметры изоляции рассчитываются для каждого этноса отдельно. Использование этой модели позволяет оценить уровень инбредности популяции в тех регионах, где в силу тех или иных условий невозможно использовать изонимный метод (недолгое существование фамилий, нестрогое наследование фамилии по отцу и др.).

Расстояния между местами рождения супругов измеряются в километрах, по прямой линии. При отсутствии точной информации (исчезнувшие и переименованные деревни, неточности в брачных записях и др.) расстояния можно измерять с точностью до сельсоветов (если супруги родом из разных сельсоветов), до районов или областных центров. Для оценки инбридинга в сельской местности рассчитываются средневзвешенные по сельским советам.

Зависимость коэффициента родства Ф от расстояния d задается формулой:

(d) = ae^-bd

где Ф(d) -- средний коэффициент родства для пары индивидов, родившихся на расстоянии d друг от друга,

а -- средний коэффициент родства в локальной популяции (локальный инбридинг), то есть Ф(0)=а, который в элементарной популяции зависит от ее эффективного размера и уровня иммиграции в нее и задается уравнением:

а = 1/(4N_e m_e+1),

где N_e -- эффективный размер популяции (часть популяции репродуктивного возраста, заключающая брак), обычно принимаемый за треть от ее цензового размера.

Эффективное давление миграций

m_e = ,

где m -- половина доли дальних миграций, то есть

m = 1/2Р(d4/),

а k -- половина доли промежуточных миграций, то есть

k = 1/2Р(d '/ 10).

Коэффициент линейного систематического давления миграций (b), возвращающий генные частоты множества рассматриваемых популяций к равновесным значениям, вычисляется как

b = /'.

В модели изоляции расстоянием Малеко миграции делятся на длинные, короткие и промежуточные:

длинными считаются такие миграции, при которых расстояние между местами рождение супругов

d>4/, ;

короткими - где

d `/ 10 ,

a ` это , где d₁ -- множество миграций, не включающих дальние, то есть любое d_1i таково, что

d_1i 4 /;

промежуточные - в которых расстояние между местами рождения супругов d удовлетворяет неравенству:

`/10 d 4/.

На основании параметров изоляции расстоянием рассчитывается инбредное расстояние. За расстояние между двумя популяциями принимается сумма двух элементов, первым является разность между локальным инбридингом а, подсчитанным в первой популяции, и инбридингом, который рассчитывается при помощи формулы Малеко

Ф(d)=ae^-bd

на расстоянии d до второй популяции, то есть падение инбридинга. Вторым слагаемым в этой сумме будет аналогичная разность между локальным инбридингом а, подсчитанным во второй популяции, и инбридингом, подсчитанным по формуле Малеко на, естественно, том же расстоянии d от второй до первой популяции, но уже с параметрами изоляции расстоянием второй популяции. Формальная формула выглядит следующим образом:

D₁₂=[a₁-a₁e^{-b1 d}]+[a₂-a₂e^{-b2 d}]

где a_i, b_i - параметры Малеко в i-ой популяции, i=1,2.

Полученную метрику считают инбредным расстоянием, или расстоянием Малеко, и используют при проведении кластерного анализа, а проекцию полученной дендрограммы на географическую карту местности, называют ландшафтом инбридинга изученной популяции, или инбредным ландшафтом, или ландшафтом Малеко.

При использовании модели изоляции расстоянием популяция ранга район является наиболее предпочтительной. Во-первых, при оценке случайного инбридинга учитываются все фамилии, а при оценке локального инбридинга рассматриваются только моноэтнические браки. Во-вторых, имеет место успешная ассимиляция мигрантов предыдущего поколения, потомки которых являются местными уроженцами, но при этом имеют «чужие» фамилии. В третьих, вполне возможно, что модель изоляции расстоянием не вполне адекватна при описании популяций, для которых отличительной особенностью является высокий уровень иммиграции.

Необходимо отметить, что при изучении количественных признаков размер выборки должен быть не менее 30 единиц, хотя формальные расчеты иногда можно выполнить и при меньшем количестве брачных миграций, попавших в анализ.

При подсчете средневзвешенных значений для сельсоветов в качестве весов можно использовать как число браков, так и численность населения (или N_e) этих сельсоветов, при этом важно, чтобы подсчет проводился одинаковым способом для всех районов исследуемого региона, хотя различия в полученных значениях невелики.

Инбредно-эндогамная характеристика

На основании проведенных исследований населения европейской части России и с целью повышения достоверности полученных результатов в лаборатории генетической эпидемиологии МГНЦ РАМН была разработана и предложена инбредно-эндогамная (ie) характеристика генетической структуры популяции. Данная статистика предполагает, что инбридинг в популяции реализуется с вероятностью соответствующей индексу эндогамии и вычисляется как произведение локального инбридинга а на индекс эндогамии, что более корректно, нежели локальный инбридинг, отражает степень изолированности и уровень подразделенности популяций.

2.2 Оценка случайного инбридинга методом изонимии

Фамилия - основная часть триединого полного русского именования человека - является очень интересным словом, которое может расцениваться и как памятник культурной истории народа, и как свидетельство определенной эпохи, и как памятник языка, способный вбирать в себя и консервировать явления, актуальные для какого-либо исторического момента. Фамилия, наследуемая патроклинно (по отцу) представляет достаточно полный аналог генетических маркеров, используемых при изучении длительно существующих популяций, в которых фамилии употребляются не менее 10 поколений, то есть использование фамилий является традиционным.

Распределение фамилий в популяции позволяет оценить случайный инбридинг. Уже стала классической формулировка Н.Мортона - использование фамилий в качестве селективно нейтрального маркера имеет информационную ценность, равную лучшей кодоминантной генетической системе, но она должна отвечать требованию о монофилетичности каждой фамилии в пределах изучаемых популяций. Распределение фамилий в пределах региона определяется случайными процессами, в нем отражается история популяции и главным образом особенности миграций за ряд поколений.

Принципиальный вклад в описание локальной дифференциации частот генов в подразделенной популяции с использованием фамилий был внесен С. Райтом. На основании данных о распределении фамилий им был рассчитан коэффициент случайного инбридинга (F_st). Райт предложил называть его индексом фиксации одного аллеля и утраты другого в двухаллельном локусе в результате генетического дрейфа. Таким образом, случайный инбридинг выступает в качестве меры интенсивности генетического дрейфа, что позволяет на основе данных о распределении фамилий в популяции выявить эффекты генетического дрейфа и миграционного процесса из прочих факторов, формирующих генетическую структуру популяции.

Предположение, что фамилии могут быть использованы в качестве биологического маркера, точнее, как его замена, неоднократно получило подтверждение в работах отечественных и зарубежных авторов. В значительном количестве работ, проведенных зарубежными исследователями, базой данных для анализа распределения фамилий среди населения послужили телефонные справочники. В России частоты фамилий подсчитывают из списков избирателей.

Оценка случайного инбридинга Райта проводится методом Кроу и Манжа:

F_st=S_imS_if/4,

где S_if - частота фамилии у женщин,

S_im - частота фамилии у мужчин.

Если различиями в частотах фамилий мужчин и женщин можно пренебречь, то

F_st=q_i² /4,

где q_i - частота i-ой фамилии.

Списки избирателей организованы посельсоветно, поэтому подсчет значений случайного инбридинга проводится для каждого сельсовета, а затем для характеристики района в целом рассчитывается средневзвешенное значение. Можно также в качестве единицы измерения рассмотреть район, но в этом случае значения F_st оказываются очень низкими (за счет большого знаменателя).

Как расширение классического метода изонимии предложен еще один способ описания генетической структуры популяций - с использованием индекса миграций н, показателя разнообразия фамилий б, энтропии распределения фамилий Н и избыточности распределения фамилий R в популяции.

Случайная изонимия рассчитывается как

I_r=Уq_i²,

где q_i - частота i-ой фамилии в популяции.

Индекс миграций рассчитан как

н=(1-I_r)/[I_r(N-1)],

где N - число индивидов в популяции.

Он будет равен 0, если все индивиды имеют одну фамилию, и 1, если все фамилии разные.

Показатель разнообразия фамилий в популяции определяется из формулы

б=Nн/(1-н).

Энтропия (мера априорной неопределенности) в распределении фамилий рассчитана по формуле:

H=-Уq_ilog₂q_i.

Свойства энтропии легко понять из пограничных случаев: если в распределении имеется N индивидов и N фамилий, то H₀=log₂N, а если все индивиды имеют одну фамилию, H=0.

Поскольку списки избирателей, с которыми обычно работают, организованы посельсоветно, то и подсчет всех параметров производится для каждого сельсовета. Для общей характеристики района вычисляется средневзвешенное значение.

После определения частых фамилий рассчитываются фамильные расстояния по формуле:

,

где, p_1k и p_2k частоты k-ой фамилии в изучаемых 1-ой и 2-ой популяциях.

Затем составляется схема фамильного ландшафта на географической карте местности. В ранних публикациях фамильный ландшафт называли генетическим, подчеркивая тем самым правомочность использования фамилий для популяционно-генетических исследований. Однако, название «фамильный ландшафт» является более правильным, поскольку сразу отражает информационный первоисточник.

картографический анализ распределения фамилий

Одним из новых направлений исследований в антропонимике, интенсивно развивающемся в последние годы, является картографический анализ частот фамилий с помощью технологий компьютерной картографии.

Компьютерная геногеография открывает новые возможности в изучении подразделенных популяций, а картографический анализ позволяет выявить закономерности микроэволюций популяций, и их взаимоотношения между собой и со средой. Данный метод позволяет получить количественное выражение информации, содержащейся в неявном виде (закономерности, тренды, связи); провести одно- и многомерный статистический анализ карт для выявления важнейших характеристик генофонда. Приоритет в развитии данного направления принадлежит коллективу под руководством L.L. Cavalli-Sforza, а также отечественным ученым - коллективам под руководством Ю.Г. Рычкова и Е.В. Балановской.

В работах Е.В. Балановской приведены результаты анализа изменчивости частот фамилий в пяти основных географических регионах исконного ареала русского народа, регионы, отстоящие один от другого в среднем на 1000 км. По наиболее частым фамилиям выявлено сходство трех регионов средней полосы и ярко выраженное своеобразие Южного региона. Число «общих фамилий» оказалось неожиданно велико - 257 фамилий. В итоге создана карта пространственной изменчивости случайного инбридинга в России: с юго-запада на восток возрастают уровень случайного инбридинга и, соответственно, прогнозируемый груз наследственной патологии. Хотя вопрос о допустимости подобных исследований до сих пор остается открытым.

Таким образом, модель изоляции расстоянием Малеко и метод изонимии, эффективно используются для описания популяционно-генетических характеристик населения, включающих:

· определение уровня инбридинга и его составляющих;

· оценку генетических взаимоотношений как внутри популяции, так и между различными популяциями;

· расчет показателя разнообразия фамилий;

· описание генетического ландшафта с помощью геногеографических технологий.

2.3 Генетико-демографическая характеристика популяций

Демографические параметры, витальные статистики и индекс Кроу и его компоненты, позволяют оценить интенсивность естественного отбора в популяции и приспособленность этой популяции к условиям проживания, направленным образом влияющих на частоты генов. Для оценки интенсивности естественного отбора в популяции человека и приспособленности этой популяции к условиям ее проживания используют такие генетико-демографические параметры как витальные статистики, индекс Кроу и его компоненты.

В лаборатории генетической эпидемиологии МГНЦ РАМН разработана специальная анкета для получения демографических данных (рис. 1).



Рис. 1. Демографическая анкета

Оценка витальных статистик

Под витальными статистиками понимают средние значения исходов беременностей для женщин, закончивших репродукцию. Изучение витальных статистик позволяет выявить особенности репродуктивного поведения исследуемой популяции, в том числе, каким образом осуществляется контроль над рождаемостью. Полученные данные о различиях в продолжительности реализованного репродуктивно-активного периода позволяют судить о распространении в популяции практики планирования семьи и регулирования рождаемости и, следовательно, о том, насколько широко поле для естественного отбора.

Дорепродуктивные потери рассчитываются как разница между средним числом живорожденных и средним числом доживших до репродукции. Длина поколения соответствует среднему возрасту рожениц в популяции. Средняя продолжительность физиологического репродуктивно-активного периода оценивается как разница между возрастом вступления в первый брак и началом менопаузы. Существует также понятие реального репродуктивно-активного периода, который рассчитываемый как разница между возрастом вступления в первый брак и возрастом рождения последнего ребенка.

Репродуктивная активность в молодом возрасте снижает вероятность хромосомных болезней и спонтанных мутаций у ребенка, связанных с возрастом родителей. Это, несомненно, оказывает влияние на формирование генофонда популяции, а также снижает риск развития акушерской и мультифакториальной патологии.

Сопоставление различных демографических параметров и витальных характеристик у разных этнических групп (марийцы, русские, чуваши и татары), проживающих на территории Республики Марий Эл, создало реальную возможность оценить такой важный параметр, как дифференциальная приспособленность этнически различных популяций в единых климатогеографических условиях. Значения таких важных витальных характеристик, как число мертворождений и спонтанных абортов достаточно сходны для всех исследованных этнических групп. Не выявлено значительных различий в размере дорепродуктивных потерь. Выявленные различия могут быть обусловлены эффектами некоторых социально-медицинских мероприятий, таких как распространенность контрацепции и использование женщинами абортов как способа прерывания беременности и вряд ли имеют под собой серьезные биологические основания.

В табл. 1 приведены средние значения беременностей и их исходов для сельских популяций, полученные рядом исследователей, в различных этнических группах в процессе изучения репродуктивного поведения.

Таблица 1. Средние значения беременностей и их исходы для ряда сельских этнических групп

Среднее число
Этническая группа	Беременностей	Живорождённых детей	Доживших до репродукции	Выкидышей
Казахи	6,01	5,02	4,43	0,80
Киргизы	7,44	5,94	4,92	0,95
Марийцы	5,8	3,4	3,1	0,37
Тувинцы	7,06	5,82	4,79	0,73
Чуваши	6,21	2,94	2,78	0,30
Якуты	6,47	5,08	4,60	0,75
Русские
Тверской обл	5,13	2,25	2,19	0,30
Чувашии	4,44	2,06	2,00	0,24

Индекс Кроу

Для оценки дифференциальной приспособленности отдельных групп или генотипов используется индекс Кроу. Этот показатель на основании параметров демографической статистики оценивает эффект максимально возможного естественного отбора (I_tot), и его составляющие компоненты: дифференциальную плодовитость (I_f) и дифференциальную смертность (I_m). Расчет индекса Кроу основывается на фундаментальной теории Р.Фишера о естественном отборе и исходит из предположения, что все различия в приспособленности популяций генетически детерминированы.

Методика расчета индекса Кроу с его составляющих заключается в следующем:

дифференциальная смертность рассчитывается по формуле:

I_m = P_d/P_s,

где P_d - доля детей в популяции, не доживших до репродукции;

P_s - доля детей, доживших до репродукции.

дифференциальная плодовитость:

I_f = V_k / k²

где V_k - дисперсия среднего размера семьи;

k - среднее число детей, доживших до репродукции.

индекс Кроу:

генетический заболевание источник информации

I_tot =I_m + I_f / P_s.

Низкие значения индекса Кроу и его компонентов свидетельствуют о невысоком вкладе естественного отбора в генетико-демографическую структуру населения.

По характеру репродукции все популяции человека можно разделить на два типа. Для первого типа характерны высокие показатели среднего числа живорождений в семье, а ограничение рождаемости минимально; такие популяции могут быть рассмотрены как популяции с «естественным» характером репродукции. Второй тип - это популяции, планирующие размер семьи. В тоже время практика ограничения рождаемости приводит к значительному снижению основных репродуктивных параметров. В результате, доля дифференциальной плодовитости в структуре индекса Кроу в популяциях, планирующих размер семьи при учете только генетической компоненты дисперсии плодовитости, значительно снижается. Поэтому, в современных популяциях, планирующих размер семьи, основными механизмами естественного отбора являются дорепродуктивная гибель зигот и инфертильность.

Ретроспективные исследования, проведенные в ряде европейских стран, показали, что значения индекса Кроу претерпели значительные количественные изменения. За последние сто лет индекс I_m уменьшился более чем в 10 раз, что обусловлено значительным падением детской смертности, а индекс I_f снизился на треть вследствие широкого распространения практики планирования семьи и роста образовательного уровня населения. Аналогичные результаты получены российскими учеными, показавшими, что компонента I_m за период с 1926 по 1987 гг. для СССР в целом так же уменьшилась более чем в 10 раз. Столь быстрые изменения в величине тотального отбора и его компонентов вряд ли обусловлены изменением частот генов и генотипов в популяции, скорее всего это связано с изменением социальных условий. Эти данные указывают, что реальный вклад генетических различий в показатели отбора, по-видимому, относительно невелик, и его трудно вычленить из влияния других факторов.

2.3 Оценка параметров популяционно-генетической структуры с использованием биологических источников

Биологическими маркерами принято считать устойчивые биохимические, физиологические, анатомические и иные признаки организмов, варьирующие в норме в определенных пределах, заданных генотипом и условиями окружающей среды.

Особой формой биологических маркеров являются генетические маркеры. К ним относятся такие генетически контролируемые признаки, наличие которых у организма однозначно указывает на наличие у него и соответствующего гена. Эти признаки могут быть нормальными или патологическими (наследственные болезни), но их проявление не зависит от окружающей среды.

В качестве генетических маркеров при проведении генетико-эпидемиологических исследований используют различные дискретные иммунологические признаки (группы крови, антигены систем HLA, Gm и др.), биохимические признаки (ферментные и другие белки), молекулярно-генетические маркеры (различные ДНК-маркеры: полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов ДНК - ПДРФ, гетерогенность микро- и минисателлитов ДНК, полиморфизм вариабельного числа тандемных повторов - VNTR и др.). Генетические маркеры позволяют проанализировать генетическую конституцию индивидов по конкретным генам. Широкое применение генетические маркеры находят в популяционной генетике для описания генетических процессов на популяционном уровне с целью изучения проблем микро- и макроэволюции в рамках выявления роли инбридинга, генного дрейфа, миграций, метисации, роли аутбридинга, скорости мутационного процесса и эффектов отбора в этих процессах. Независимо от иммунологического, генетико-биохимического или молекулярного рассмотрения полиморфных систем можно идентифицировать следующие типы изменчивости аллельных частот в этно-территориальном ракурсе:

· универсальные полиморфизмы, когда два или более аллелей одного локуса представлены повсеместно с различными, весьма варьирующими от популяции к популяции частотами;

· эндемичные полиморфизмы, для которых характерно наличие особых аллелей или гаплотипов, ограниченных распространением в крупных антропологических общностях в конкретных широких ареалах ойкумены. Следует подчеркнуть, что именно эта категория генетической изменчивости представляет исключительный интерес в решении проблем этно- и расогенеза;

· диффузный тип изменчивости в генах, в которых один или два аллеля можно рассматривать в качестве обычных. Повсеместно распространенных форм, тогда как другие оказываются достаточно редкими и «вкрапленными» среди населения различных регионов мира с частотой, близкой к полиморфизму;

· приватная генетическая изменчивость, отличающаяся наличием особого аллеля, присущего исключительно одной, подчас малой этнической группе или племени. Такие аллели, как правило, встречаются с весьма низкими частотами, но в ряде случаев их концентрация может достигать достаточно высоких полиморфных величин;

· гипервариабельная изменчивость минисателлитных последовательностей. Вследствие высокой специфичности эти полиморфизмы используются в криминалистике при индивидуализации личности.

2.3.1 ДНК-маркеры

Для изучения структуры генофонда и этногенеза современных популяций человека в качестве первых молекулярно-генетических маркеров стали использовать полиморфные аутосомные локусы ядерного генома. Их отличительной чертой является то, что они, отражая генетический вклад в формирование популяционной структуры обоих полов в равной степени, характеризуют человеческие сообщества в целом, дают более сбалансированную картину генетического разнообразия и более объективную оценку генетической структуры популяций. Аутосомные локусы ядерного генома позволяют достаточно точно дифференцировать крупные антропологические общности мира, включая кластеры внутри них.

Существует два основных типа полиморфизма ДНК аутосомных локусов: диаллельный, представленный однонуклеотидными заменами (SNP - single nucleotide polymorphism), а также инсерционно-делеционным полиморфизмом и полиаллельный, представленный гипервариабельными сателлитными повторами.

Особый интерес с популяционно-генетической точки зрения представляет исследование диаллельного полиморфизма SNP-локусов, ассоциированных с генами наследственных и наследственно обусловленных заболеваний. Анализ гаплотипов, сцепленных с мажорными мутациями в генах распространенных наследственных заболеваний, дает возможность идентифицировать изначальную хромосому, выяснить источник и природу ее происхождения, изучить миграции населения по дрейфу характерных для данной популяции мутаций. Сопоставляя спектры распределения однотипных мутаций в разных этнических группах можно определить степень генетической близости между ними и реконструировать их филогенетические взаимоотношения.

Гипервариабельные повторы представляют собой мультиаллельные системы с уровнем гетерозиготности, приближающимся к 100%, и подразделяются на минисателлиты (VNTR - variability number of tandem repeats), включающие 11-60 нуклеотидов в «коровых» звеньях с числом повторов от двух до нескольких сотен, и микросателлиты (STR - short tandem repeats), включающие 2-6 нуклеотидов в «коровых» звеньях с числом повторов от десяти до ста. Гипервариабельные полиморфные локусы обладают рядом свойств, делающих их удобными и высокоинформативными маркерами для решения вопросов популяционной и эволюционной генетики. К ним относятся: широкое распространение в геноме; простота генотипирования; высокая скорость спонтанного мутирования (10^-2 - 10^-4 на локус за поколение) локализация преимущественно в не кодирующих областях и, следовательно, селективная нейтральность (за исключением случая тесного сцепления с адаптивно значимыми генами).

Для анализа ДНК-маркеров кровь из вены набирают в количестве 4-8 мл в пробирки Vacuette с консервантом 0,5М ЭДТА (рН 8,0). Образцы ДНК выделяют из цельной крови стандартным методом ферментативного гидролиза с протеиназой К и последующей фенольно-хлороформной экстракцией.

Анализ полиморфных локусов проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с использованием ДНК-полимеразы Termus aquaticus. Для анализа результатов амплификации, полученные амплификаты, разделяют электрофоретически в полиакриламидном геле. В качестве маркера размеров аллелей использовали ДНК фага .

При изучении генетической структуры населения в регионе проводят исследование следующих локусов ДНК-маркеров: IVS6aGATT(CFTR) (тетрануклеотидные тандемные повторы 6а интрона гена CFTR), KM.19/PstI (диаллельный полиморфизм локуса D7S23, фланкирующего ген CFTR), HUMTHOI (тетрануклеотидные AATG повторы в 1 интроне гена TH), HUMFABP (тринуклеотидные тандемные повторы ATT во 2 интроне гена FABP). Последовательности использованных праймеров приведены в табл. 2.

Локус IVS6aGATT (CFTR)

Ген муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) расположен на длинном плече хромосомы 7 в регионе 7q31. В гене CFTR существует ряд повторяющихся последовательностей, к которым относится тандемные тетрануклеотидные GATT повторы микросателлитного локуса IVS6aGATT в 6а интроне. На данный момент известно пять аллелей, имеющих четыре, пять, шесть, семь или восемь повторов GATT (номенклатура аллелей строится соответственно количеству повторов). При амплификации изучаемого участка 6а интрона гена CFTR происходит синтез фрагментов ДНК различающихся длиной на 4 п.н. в зависимости от того, с какого аллеля идет амплификация. Фрагменты ДНК такой длины легко можно разделить при гель-электрофорезе и, следовательно, различить аллели и генотипы исследуемых образцов.

Таблица 2. Последовательности праймеров, использованных для амплификации

Название локуса	Последовательности праймеров
KM.19/PstI	5' - GCTGCATCATATAAGTTGCC - 3' 5' - AACGCTACACTGTTAATTTT - 3'
IVS6aGATT (CFTR)	5' - CAAGTCTTTCAGTGATCTTC - 3' 5' - TGAGCAGTTCTTAATAGATAA - 3'
HUMTHOI	5'- GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT 5'-ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG
HUMFABP	5' - GTAGTATCAGTTTCATAGGGTCACC 5' - CAGTTCGTTTCCATTGTCTGTCCG

Наиболее частыми являются аллели 7 и 6. Причем в популяциях Евразии преобладает аллель 7 с частотой до 0,75-0,85 в Европе, а в популяциях коренного населения Нового Света преобладает аллель 6 с концентрацией до 0,77. Аллели 4 и 5 встречаются крайне редко с пропорцией 0,005, а аллель 8 в европейских популяциях также выявляется нечасто. Тем не менее, в популяциях волго-уральского региона, включая чувашей, марийцев, удмуртов, его частота достигает полиморфных величин, варьируя от 0,05 до 0,1. В этих популяциях данный полиморфизм целесообразно использовать в качестве эффективного генетического ДНК- маркера при проведении популяционно-генетических исследований.

Локус D7S23(KM.19)

Локус D7S23 фланкирует 5'-конец гена CFTR и характеризуется наличием полиморфных сайтов рестрикции для рестриктаз Hin6I (участок CS.7) и PstI (участок KM.19). Полиморфизм КМ.19 характеризуется наличием двух аллелей: аллель 1 - отсутствие сайта рестрикции для эндонуклеазы PstI, аллель 2 - наличие сайта рестрикции. В результате рестрикции эндонуклеазой PstI амплифицированного фрагмента ДНК в случае аллеля 2 образуется два фрагмента длиной 600 и 400 п.н., в случае аллеля 1 рестрикции не происходит и наблюдается один фрагмент длиной 1000 п.н. В большинстве популяций мира преобладающим по частоте встречаемости является аллель 1.

Локус HUMTHOI

Ген тирозингидроксилазы человека (TH) локализован на коротком плече 11 хромосомы (11p15.5) обнаружил наличие короткого тандемного повтора с коровой последовательностью AATG в 1 интроне, этот полиморфизм гена тирозингидроксилазы обозначается HUMTH0I. В данном локусе обнаруживается аллельное разнообразие. Когда из тетрануклеотидной последовательности элиминируется 1 нуклеотид, такие аллели обозначаются как n,3, где n число коровых повторов (9,3). Данный полиморфный локус имеет высокий уровень гетерозиготности, достигая 70-80%-го уровня, в связи с этим он нашел широкое применение при идентификации личности.

Локус HUMFABP2

Ген белка, связывающего жирные кислоты в слизистой кишечника, FABP2, локализован на коротком плече хромосомы 4. Микросателлитный локус, локализованный во втором интроне этого гена, представляет собой тринуклеотидный повтор АТТ, и обозначается как HUMFABP2. Номенклатура аллелей соответствует числу повторов коровой тринуклеотидной последовательности. В литературе описано восемь аллелей этого локуса с числом повторяющихся коровых единиц от 8 до 15. Изучение данного полиморфного маркера не обнаружило никаких ассоциаций с какими-либо заболеваниями. Исходя из довольно высокого значения гетерозиготности в популяциях Европы (Н?0,6), становится очевидной целесообразность использования этого маркера в популяционно-генетических исследованиях.

2.3.2 Полиморфные белки

Изучая генетическую структуру населения определенного региона проводятся исследования генетико-биохимического полиморфизма систем транспортных белков гаптоглобина (НР), витамин-Д-транспортирующего белка (GC), эритроцитарного фермента кислой фосфатазы-1 (АСР1) и фосфоглюкомутазы-1 (PGM1).

Для идентификации генетико-биохимических полиморфных систем образцы венозной крови собираются без консерванта и фракционируются на сывороточную и эритроцитарную компоненты. Определение фенотипов сывороточного белка гаптоглобина (НР) проводят посредством методов горизонтального или вертикального электрофореза в крахмальном или полиакриламидном гелях, как изложено в руководстве. Фенотипирование витамин-Д-транспортирующего белка (GC) осуществляют с помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ). Идентификация генетически полиморфных вариантов кислой эритроцитарной фосфатазы (ACP1) и фосфоглюкомутазы-1 (PGM1) проводят разными приемами ИЭФ согласно методам, описанным в публикациях.

Система гаптоглобина (НР)

Сывороточный белок гаптоглобин открыт в 1938 г. M. Polonovski, M.F. Jayle при изучении пероксидазной активности гемоглобина крови человека. В 1955 г O. Smithies в результате применения нового метода зонального электрофореза получил точное представление о трех электрофоретически различных типах гаптоглобина и доказал совместно с N. F. Walker их генетическую детерминированность. Они показали, что полиморфизм системы гаптоглобина контролируется действием двух аутосомных кодоминантных аллельных генов Нр¹ (HP*1) и Нр² (HP*2), которые ответственны за формирование двух генотипически гомозиготных фенотипов Нр 1-1 и Нр 2-2 и одного генотипически гетерозиготного фенотипа Нр 2-1.

Гаптоглобин является ₂-гликопротеином. Наиболее характерным свойством гаптоглобина является способность образовывать со свободным гемоглобином, трудно диссоциирующий комплекс, который вследствие большой величины молекулы не может пройти через почечный фильтр. Гемоглобинсвязывающий белок содержит около 83% чистого белка, остальные 17 % приходятся на углеводные компоненты. Гаптоглобин связывает и гемоглобины других видов, но не взаимодействует с миоглобином. При первичной или вторичной недостаточности гаптоглобина появляется симптом гемоглобинурии. Известны также антителоподобные функции различных генетически детерминированных типов гаптоглобина. Сыворотка крови фенотипов Нр 2-2 и Нр 2-1, генетически детерминированных аллелем Нр² (HP*2), обладает функциями антител против некоторых патогенных микроорганизмов и физиологически более устойчива по сравнению с фенотипом гаптоглобина Нр 1-1, не обладающим подобной функцией.

Система группо-специфического компонента (GC)

Синтезируемый клетками печени белок GС относится к альфа-2-глобулиновой фракции. Молекула GС включает один витамин-Д-стеролнесущий сайт. Таким образом, функциональное значение этого белка заключается в переносе Д3-25-гидроксихолекальциферола в организме человека. С помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ) было установлено 3 аллеля этого белка: 1S, 1F, и 2.

В мировой литературе накоплены обширные данные о распределении факторов группоспецифического компонента сыворотки крови среди населения. При исследовании фенотипов GС в различных популяциях был установлен градиент наиболее редкого аллеля GС*1F, увеличивающийся в направлении экваториальной зоны Ойкумены. Показано, что частоты GС*2 отрицательно коррелируют с такими характеристиками, как среднегодовая температура и интенсивность солнечной радиации. Три основных аллеля встречаются среди европейских популяций с довольно постоянной частотой. В европейских популяциях соотношение частот встречаемости аллелей 1F:1S составляет от 2:10 до 3:10. Выявлена связь фенотипа 2-2 с ревматоидным артритом, а также некоторых фенотипов GС с инсулин-независимым диабетом.

Система кислой эритроцитарной фосфатазы (АСР1)

Кислая фосфатаза эритроцитов катализирует превращение алифатических и ароматических моноэфиров ортофосфорной кислоты. Полиморфизм АСР контролируется тремя аллелями А, В и С аутосомного локуса и представлен шестью фенотипами: АА, АВ, ВВ, АС, ВС и СС.

При изучении ферментов различных фенотипов было установлено, что они существенно различаются по активности, которая убывает в ряду СВА и соотносится как 4:3:2. Полиморфизм АСР был детально изучен в различных локальных популяциях земного шара, и эта система может считаться одной из наиболее изученных. Существует экологически обусловленный градиент частот аллелей АСР*А и АСР*В. Частоты аллелей у человека меняются в зависимости от амплитуд температурных колебаний и интенсивности суммарной солнечной радиации.

Система фосфоглюкомутазы-1 (PGM1)

Фосфоглюкомутаза (PGM) - фосфотрансферазный фермент (-D-глюкозо-1,6-дифосфат: -D-глюкозо-1-фосфат-фосфотрансфераза), обладающий способностью катализировать взаимопревращения глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фосфата.

Впервые изоферменты фосфоглюкомутазы были идентифицированы в эритроцитах. Затем было обнаружено, что характерные наборы изоферментов PGM имеются также в печени, почках, мышцах, мозге, плаценте. Фосфоглюкомутаза широко распространена и играет значительную роль в углеводном обмене обладая генетически обусловленным полиморфизмом, который был открыт в 1964 году. Обнаружены четыре независимых локуса, контролирующие синтез этого фермента: PGM1, PGM2, PGM3, PGM4.

Проведенные исследования фосфоглюкомутазы-1 показали, что три общих фенотипа PGM₁1, PGM₁2-1, PGM₁2 - определяются двумя аутосомными кодоминантными аллелями PGM¹₁ (PGM1*1) и PGM²₁ (PGM1*2). При этом характер расщепления подчиняется менделевским законам. Фенотипы 1 и 2 соответствуют гомозиготным генотипам PGM¹₁/ PGM¹₁ и PGM²₁/ PGM²₁, а фенотип 2-1 - гетерозиготному генотипу PGM¹₁ /PGM²₁.

Наибольший интерес представляют три основных фенотипа фермента генного локуса PGM₁ (PGM₁1, 2-1, и 2), поскольку их совокупная частота встречаемости в подавляющем большинстве популяций составляет 100% от числа других, исключительно редко наблюдаемых атипичных фенотипов этой ферментной системы.

Соотношение концентраций четырех обычных аллелей PGM1 характеризуется выраженной стабильностью как для русских популяций, так и для большинства других европейских групп населения. Формула градиента частот факторов PGM1, определяемых методом ИЭФ, выглядит следующим образом: PGM1*1+ > PGM1*2+ > PGM1*1- > PGM1*2-. Как правило, концентрация фактора PGM1*2+ оказывается заметно выше в европеоидных группах, чем среди монголоидных популяций Центральной Азии.

Для характеристики генного разнообразия в подразделенной популяции обычно используется кроме гетерозиготности и индекса фиксации показатель межпопуляционной дифференциации (F_ST Райта, G_ST Нея и др.). При этом средние оценки F_ST, полученные по репрезентативному набору полиморфных маркеров, адекватно описывают разнообразие большей части всех структурных генов генома.

2.4 Статистические методы

Статистика Нея

На основании данных о численностях фенотипов рассчитывают частоты соответствующих аллелей всех исследованных полиморфных систем, величину наблюдаемой и теоретической гетерозиготности.

Среднюю гетерозиготность по L локусам находят как среднюю арифметическую по всем кодоминантным локусам.

Достоверность различий между выборками оценивают с помощью критерия ² в случае, когда все ожидаемые численности, кроме одного значения, больше 5, а одно - не меньше 0,5. В других случаях используютя метод более точного вычисления ² с учетом малых теоретически ожидаемых численностей - модифицированный ² критерий.

Генетическую дифференциацию популяции оценивали по методу Нея. Общее и внутрипопуляционное генное разнообразие рассчитывают по следующим формулам:

,

,

,

где - частота i-го аллеля в субпопуляции S,

- средняя частота аллеля во всей подразделенной популяции, состоящей из n субпопуляций.

В качестве меры межпопуляционных различий используют статистику Нея (G_ST) (эквивалент F_ST статистики Райта), которая связывает общее и внутрипопуляционное генное разнообразие следующей формулой:

.

Величина G_ST подразделена на компоненты, соответствующие уровню иерархической системы популяций:

G_ST=G₁+G₂

где G₁ является мерой генетического разнообразия между районами,

G₂ - между сельскими советами.

Генетические расстояния

Для расчета генетических расстояний используют метод Нея. Для определения расстояния по одному j-ому полиаллельному локусу между двумя популяциями с концентрациями аллелей xi и yi используется показатель индентичности. Идентичность j для двух случайно выбранных генов из одной и той же (jx и jy) или различных популяций (jxy) находится по формулам:

, , .

Нормализованная идентичность между двумя популяциями в отношении j-того локуса определяется как:

.

В случае нескольких локусов показатели идентичности j заменяются на соответствующие средние арифметические (по локусам) значения J и общая нормализованная идентичность находится как:

.

Генетическое расстояние между популяциями определяется через общую нормализованную идентичность по формуле:

D = - ln I.

Полученную матрицу генетических расстояний используют для построения филогенетического древа через выявление кластеров с помощью иерархической агломеративной процедуры, состоящей в последовательном объединении в класс сначала самых близких по генетическим расстояниям, а затем все более отдаленных друг от друга элементов. Для иллюстрации пространственного расположения популяций строили консенсусные дендрограммы с применением метода ближайшего соседа (NJ-tree) (пакет программ Statistica 6.0).

2.5 Груз моногенных наследственных заболеваний и методы его оценки

Груз наследственных заболеваний является составной частью общего генетического груза популяций. Оценка отягощенности наследственной патологии в популяциях человека дает представление не только о количественных характеристиках суммарной распространенности, но и позволяет оценить структуру груза с учетом типов наследования, а так же описать особенности территориального распределения семей с наследственной. Кроме того, значения груза наследственных заболеваний в регионе позволяют определить потребность в медико-генетическом консультировании.

В настоящее время, изучение отягощенности популяций наследственными болезнями проводится с использованием нескольких подходов таких как:

· изучение отдельных или относительно немногих болезней;

· скринирующие программы;

· создание генетических регистров;

· комплексный подход.

2.5.1 Изучение отдельных или относительно немногих болезней

С использованием первого подхода выполнено наибольшее число исследований, посвященных изучению отдельных или относительно немногих наследственных заболеваний. Указанный метод позволяет получить качественную и количественную оценку изучаемой патологии в популяции. Однако, подобные работы не дают представление о размерах груза наследственных болезней в популяциях, если только не суммировать их результаты.

В последнее время все чаще при проведении эпидемиологических исследований применяются молекулярно-генетические методы, позволяющие определить не только частоту наследственной патологии, но и определить ее молекулярную природу. Кроме этого, данный метод дает возможность изучить клинический и генетический полиморфизм заболеваний, а в некоторых случаях определить факторы популяционной динамики, определяющие частоты редких мутантных генов в популяции.

2.5.2 Скринирующие программы

Государственные скринирующие программы на наследственные болезни обмена у новорожденных, один из примеров подобных исследований.

Первый этап скрининга характеризуется формированием целей, задач программы и основных положений: метод, используемый при скрининге должен быть простым в исполнении, диагностически значимым, надежным и эффективным; биологический материал должен быть легко доступным; частота заболевания должна быть не менее 1:50000; выявляемое заболевание должно иметь эффективное лечение.

Цель скринирующих программ - выявление заболевания на доклинической стадии, когда возможно эффективное лечение. На первом этапе, проходившем во второй половине 20 века, проводилось выявление одного или нескольких заболеваний с использованием для каждого различных методов исследования. В настоящее время, с внедрением в практику здравоохранения современных методов исследования, таких как, тандемная масс-спектрометрия, микрочипы и др., программы скрининга проходят под девизом «один тест - много заболеваний».