Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

УКБ 238.218.60

Гени, які контролюють глікозилювання та експорт ландоміцинів у streptomyces globisporus 1912 та STREPTOMYCES cyanogenus S136

03.00.22 - молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ОСТАШ ІРИНА СТЕПАНІВНА

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Федоренко Віктор Олександрович, Львівський національний університет імені Івана Франка, завідувач кафедри генетики та біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Товкач Федір Іванович, Інститут мікробіології та вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу молекулярної генетики бактеріофагів;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Борецький Юрій Романович, Інститут біології клітини НАН України, старший науковий співробітник відділу молекулярної генетики та біотехнології.

Захист дисертації відбудеться 23 грудня 2008 р. о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 17 листопада 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

АНОТАЦІЯ

Осташ І. С. Гени, які контролюють глікозилювання та експорт ландоміцинів у Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136. -Рукопис. ген гомолог ландоміцин глікозилювання

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Вивчено гени, що контролюють глікозилювання та транспортування ландоміцинів (La) з клітин продуцентів. У lnd-кластері Streptomyces globisporus відсутні гомологи генів lanGT3 та lanZ2 з lan-кластеру S. cyanogenus. Це зумовлює накопичення в S. globisporus LaЕ як кінцевого продукту. Очищено білки LanZ2 та LndGT4, що є базою для біохімії глікозилювання La. S. globisporus містить гени lndJ та lndW, що кодують протон- та АТФ-залежні транспортери, відповідно. За умов надекспресії ці гени надають стрептоміцетам підвищеної стійкості до La. S. cyanogenus містить гомолог lndJ - lanJ, що регулюється lanК. Показано in vivo та in vitro, що LanK репресує lanJ та низку генів глікозилювання за відсутності La з 3, 5 чи 6 цукрами. За певної концентрації ці La взаємодіють з LanK, дерепресують lanJ та гени глікозилювання і так підсилюють власний експорт та синтез.

Ключові слова: Streptomyces, ландоміцини, регуляція експорту.

АННОТАЦИЯ

Осташ И.С. Гены, контролирующие гликозилирование и экспорт ландомицинов у Streptomyces globisporus 1912 и Streptomyces cyanogenus S136. -Рукопись.

Диссертация на соискание учeной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Изучены гены, контролирующие заключительные этапы биосинтеза ландомицинов (La) - их гликозилирование и транспорт. В lnd-кластере Streptomyces globisporus 1912 нет гомологов lanGT3 и lanZ2 из lan-кластера S. cyanogenus. Это обуславливает накопление S. globisporus в качестве конечного продукта LaЕ. Очищены белки LanZ2 и LndGT4, что является основой для исследования гликозилирования La. S. globisporus содержит гены lndJ и lndW, кодирующие протон- и АТФ- зависимый транспортеры, соответственно. В условиях сверхэкспрессии эти гены увеличивают устойчивость Streptomyces к La. S. cyanogenus содержит гомолог lndJ - lanJ, рядом с которым расположен lanК. In vivo и in vitro LanK репрессирует lanJ и ряд генов гликозилирования при отсутствии La с 3, 5 или 6 сахарами. В определенной концентрации эти La связываются с LanK, дерепрессируют lanJ и гены гликозилирования и таким образом усиливают собственный экспорт и синтез.

Ключевые слова: Streptomyces, ландомицины, регуляция экспорта.

SUMMARY

Ostash I. S. Genes that control glycosylation and export of landomycins in Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136. - Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.22 - molecular genetics. - Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

Genes governing the glycosylation and export of landomycins in producing strain have been studied in this work. Certain differences in the organization of these genes have been uncovered in landomycin E (LaE) producer Streptomyces globisporus 1912 and landomycin A (LaA) producer S. cyanogenus S136. 1.5 kb DNA fragment of landomycin E biosynthesis (lnd) gene cluster has been completely sequenced and two open reading frames were identified. Gene lndZ1 resembles NDP-hexose-3,5-epimerase and lndZ3 is similar to NDP-hexose-4-ketoreductases. LndZ1 and LndZ3 proteins are suggested to accomplish two last catalytic steps towards deoxysugar L-rhodinose present in landomycin E carbohydrate moiety. The lnd cluster of S. globisporus lacks homologues of lanGT3 та lanZ2 genes from S. cyanogenus lan cluster. Analysis of lan and lnd nucleotide sequences allowed us to speculate, that there was deletion within lnd cluster 2806 bp in length (comprising entire orfs for lanZ2 and lanGT3 homologues) which was substituted with insertion of 401 bp sequence restoring correct in-frame stop codon of lndZ1 and start codon of lndZ3. This difference accounts for accumulation of LaE as a final product in S. globisporus cells.

Methods for overexpression and purification of LndGT4 and LanZ2 proteins have been developed. Particularly, a Streptomyces-based expression system has been proven to be the most useful for obtaining significant amounts of pure and soluble His-tagged LndGT4 glycosyltransferase. Its activity was tested in vitro using landomycin D (LaD) as an acceptor substrate and various deoxysugars as the donor ones. Preliminary results of HPLC-MS assay show that LndGT4 catalyzes the transfer of 2-deoxy-L-fucose onto LaD, albeit with low efficiency. LanZ2 nucleotidylyltransferase has been overexpressed using pET system. Our results show that LanZ2 possesses narrow substrate specificity, as the various hexose-1-phosphates unrelated to rhodinose- and olivose-1-phosphates (presumed natural substrates for LanZ2) weren't accepted by the enzyme. The above experiments lay the groundwork for thorough biochemical and structural studies on unusual sugars.

There are differences in the genetic organization and mode of regulation of landomycin transporter genes in studied producing strains. S. globisporus carries lndJ and lndW genes coding for proton-dependent antiporter and type II АВС-transporter, respectively. Their disruption does not affect landomycin E resistance or its production. Nevertheless, heterologous expression of lndW showed that it can confer the resistance to LaE. Since only expression of lndW confers increased resistance to LaE in heterologous host we suggest that LndW is responsible for recognition of LaE as a substrate and that another protein capable of interacting with LndW could form part of the export system in the S. lividans TK24. Since lndW-EGFP transcriptional fusion proved that lndW gene is expressed in S. globisporus strain, we propose that lndW is active during LaE production and might be involved in LaE export. Gene lndJ confers increased LaE resistance to various S. globisporus strains under overexpression conditions. It also leads to dramatic changes in landomycin production profile: namely, LaE biosynthesis is abolished and accumulation of its early precursors is observed. Therefore, lndW and lndJ genes are dispensable for S. globisporus survival during active LaE production, but under overexpression conditions they confer increased landomycin E resistance to Streptomyces.

S. cyanogenus lan cluster does not contain lndW counterpart, but it carries lndJ homologue, lanJ, adjacent to regulatory gene lanК. The overexpression and disruption studies showed that lanK and lanJ genes control LaA resistance. As it is the case for lndJ, lanJ overexpression shifts the biosynthesis towards the accumulation of landomycins with either no or short glycoside chains (landomycinone, landomycins D and B). Apparently, lanJ expression is strictly regulated in wild type strain to allow the accumulation of final product, LaA, and lanK encoding TetR-like protein is obvious candidate for that role. Constitutive lanK overexpression led to predominant accumulation of LaA precursors bearing shorter glycoside chains and renders S. cyanogenus more sensitive to LaA implying that lanJ and several dowstream genes are co-repressed by LanK. This assumption has been further strengthened with the results of in vitro assays showing that LanK is capable of specific binding lanK-lanJ intergenic region. Landomycins carrying at least three sugars in their carbohydrate tails interact with LanK and cancell its DNA binding activity thus triggering the expression of lanJ and some downtream genes. Taken together, the results are consistent with idea that LanK represses lanJ and one or several downstream lan genes involved in conversion of landomycin D (a disaccharide LaA precursor) into LaA. As a result, LaD accumulates in the cell. Basal expression of lanZ1-lanGT4 genes ensures LaB and LaA production. When the cellular concentration of LaB and/or LaA exceeds certain threshold level, they relieve lanKJp repression by LanK. This induces the expression of lanJ and certain downstream lan genes, thus amplifying the biosynthesis and export of landomycins with long glycoside chains. Therefore, the main biological role of LanK appears to be the inhibition of premature extrusion of early LaA precursors from the cells, which in turn creates the optimal conditions for accumulation of LaA as the major landomycin in S. cyanogenus S136. Our findings led us to construction of the lanK-based reporter system which allows facile phenotypic readout of presence of polyglycosylated landomycins in biological samples. In this system, lanK its bidirectional promoter (P_lanKJ) and promoterless kanamycin resistane gene neo are fused together so that expression of neo is dependent on P_lanKJ, and, consequently, on LanK. The utility of reporter system has been validated using S. lividans as a host strain and shown to respond to landomycins E, B, A, while landomycinone and landomycin D fail to induce neo expression. This reporter system can be used for rapid, sensitive and qualitative determination of known landomycins and discovery of producers of novel landomycin-like metabolites with potentially improved bioactivities. These results also show that future experiments aiming at generation of “hybrid” angucyclines should take into account an indispensable role of regulatory and transport genes in production of polyglycosylated landomycins.

Key words: Streptomyces, landomycins, regulation of export.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актульність теми. Ландоміцини - антибіотики полікетидної природи, що належать до ангуциклінової групи сполук. Вони мають широкий спектр протипухлинних активностей та ефективніші ніж блеоміцин, мітоміцин чи доксорубіцин (Crow et al., 1999; Depenbrock et al., 1996). Ландоміцини виявляють активність проти ракових клітин, що набули множинної стійкості до інших хіміотерапевтичних агентів (Crow et al., 1999; Depenbrock et al., 1996; Korynevska et al., 2007). Це свідчить про перспективність ландоміцинів як протипухлинних агентів. Водночас ландоміцини виявляють токсичний ефект на здорові клітини (Crow et al., 1999). Такі властивості перешкоджають безпосередньому використанню цих сполук у медичній практиці та стимулюють отримання нових ландоміцинів зі зниженою цитотоксичністю чи зміненим спектром дії. Тому актуальним є вивчення генів біосинтезу ландоміцинів, продукти яких є потенційним знаряддям у комбінаторному та хемоензиматичному синтезі нових антибіотиків ландоміцинової групи. Зокрема перспективним є дослідження ферментів, які беруть участь у синтезі L-родинози та її приєднанні до глікозидного ланцюга ландоміцинів.

Наявність генів транспортерів у кластерах генів біосинтезу ландоміцину Е та А дає змогу припустити, що активне транспортування ландоміцинів з клітини є потенційним механізмом захисту продуцентів від дії цих антибіотиків. Цікаво з'ясувати як характер експресії генів транспортерів пов'язаний з формуванням кінцевого продукту та чи підлягає транспортування ландоміцинів певній регуляції упродовж їхнього біосинтезу. Дослідження механізмів стійкості до ландоміцинів у штамів продуцентів є актуальною проблемою, вирішення якої дає змогу передбачити виникнення стійкості до цього класу сполук у ракових клітинах. Усі кластери генів біосинтезу ангуциклінових антибіотиків містять гени, що кодують транспортери та їхні ймовірні регулятори. Однак їхню роль у синтезі антибіотиків та стійкості до них практично не досліджено. Вивчення систем експорту ландоміцинів із клітин продуцентів є актуальним питанням, оскільки такий спосіб стійкості до цих антибіотиків може слугувати моделлю для дослідження подібних механізмів у ракових клітинах. Не менш важливим є виявлення регуляторних систем експортування ландоміцинів, які можуть бути використані для отримання штамів-надпродуцентів та конструювання сенсорних систем скринінгу нових ландоміцинів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у науково-дослідній лабораторії генетики, селекції та генетичної інженерії продуцентів антибіотиків (НДЛ-42) при кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка. Роботу виконано в межах бюджетних тем БГ-117 „Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протипухлинних антибіотиків групи ландоміцинів” (№ державної реєстрації 0103U001916, 2003-2005 рр.) та БГ-35Ф „Гени актиноміцетів, що контролюють синтез агліконової частини ангуциклінових антибіотиків”, (№ державної реєстрації 0106U001274, 2006-2008 рр.) Дослідження виконано також у рамках академічного обміну між кафедрою генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка та відділом мікробіології і молекулярної генетики Гарвардської Медичної Школи (Бостон, США).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є встановлення особливостей генетичного контролю глікозилювання та транспортування ландоміцинів у S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136. Для досягнення мети роботи поставлено такі завдання:

1) встановлення нуклеотидної послідовності та виявлення відкритих рамок зчитування секвенуванням фрагмента lnd-кластера обмеженого генами lndJ та lndGT4;

2) виділення, очищення нуклеотидилтрансферази LanZ2 та дослідження субстратної специфічності цього ферменту;

3) розробка системи надекспресії, очищення глікозилтрансферази LndGT4 та дослідження її субстратної специфічності;

4) секвенування генів lndJ та lndW, які кодують транспортери;

5) дослідження функції та особливостей експресії генів, що кодують транспортери у S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136.

6) встановлення ролі гена lanK у синтезі та транспортуванні ландоміцину А;

7) вивчення in vitro та іn vivo механізмів транскрипційної регуляції транспортування ландоміцину А та встановлення взаємозв'язку між транспортуванням та синтезом антибіотика;

8) розробка репортерної системи для скринінгу нових ландоміцинів.

Об'єктом дослідження є генетичні механізми, що контролюють окремі етапи глікозилювання та транспортування ландоміцинів А та Е у S. globisporus 1912 і S. cyanogenus S136.

Предмет дослідження - гени, що контролюють транспортування ландоміцинів та ферменти, які задіяні у синтезі L-родинози та її приєднанні до глікозидного ланцюга ландоміцинів А та Е.

Методи дослідження - генно-інженерні (виділення та аналіз сумарної та плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних молекул ДНК, гель-електрофорез ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, cеквенування ДНК), мікробіологічні (культивування штамів бактерій та аналіз їхніх ознак), хімічні (очищення, кількісний та якісний аналіз антибіотиків), біохімічні (очищення та аналіз білків), генетичні (отримання та вивчення мутацій, генетична трансформація клітин Escherichia coli, кон'югаційні схрещування між E. coli та актиноміцетами), молекулярно-біологічні (вивчення зміни електрофоретичної рухливості ДНК-білкових комплексів, конфокальна мікроскопія).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що в lnd-кластері S. globisporus 1912 відсутні гомологи генів lanGT3 та lanZ2, які необхідні для синтезу гексасахаридного ланцюга S. cyanogenus S136. Доведено, що гени, які контролюють транспорт та глікозилювання ландоміцинів координовано регулюються. Сконструйовано систему для надпродукції глікозилтрансферази LndGT4 у клітинах стрептоміцетів. Білки LndGT4 та LanZ2 отримано у розчинній формі та проаналізовано їхню субстратну специфічність. За допомогою надекспресії генів lndJ та lanJ у штамах продуцентів, доведено роль цих генів у транспортуванні ландоміцинів та стійкості до них. Використавши гетерологічну експресію lndW, встановлено, що експортування антибіотика з клітин стрептоміцетів є одним із механізмів захисту від екзогенного ландоміцину і забезпечується надекспресією генів транспортерів. Досліджено експресію генів, що кодують транспортери впродовж синтезу ландоміцину Е. Охарактеризовано функцію гена lanK та встановлено, що його продукт негативно контролює транскрипцію гена транспортера lanJ. Продемонстровано, що кінцевий продукт, ландоміцин А, індукує експорт ландоміцинів з клітин продуцента, зв'язуючи білок-репресор LanK. Доведено, що білок-репресор здатний зв'язувати лише ландоміцини з глікозидним залишком, що містять, як мінімум, трисахаридний ланцюг.

Практичне значення одержаних результатів полягає у можливості їхнього використання для комбінаторного і хемоензиматичного синтезу та пошуку нових біологічно активних сполук. Систему експресії та очищення глікозилтрансферази LndGT4 з клітин стрептоміцетів можна застосовувати для отримання в активній формі інших ферментів стрептоміцетного походження, які важко надекспресувати в E. coli. Розроблені системи експресії та очищення LndGT4 і LanZ2 можна використовувати для отримання цих білків у препаративних кількостях із метою встановлення кристалічної структури та їхнього подальшого використання у хемоензиматичному синтезі нових антибіотиків. Дані про механізм кореляції між синтезом і транспортуванням антибіотика потрібні для селекції їхніх надпродуцентів. З іншого боку, розуміння збалансованого механізму між транспортом та біосинтезом антибіотика можна використати для отримання інтермедіатів із цінними властивостями. Ґрунтуючись на властивості LanK розпізнавати ландоміцини з довгим глікозидним ланцюгом, нами сконструйовано систему скринінгу in vivo відомих та нових ландоміцинів. Результати, клоновані гени, штами E. coli та стрептоміцетів, отримані при виконанні роботи, використовують у навчальному процесі на кафедрі генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, отримано автором особисто або за беспосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема, автором самостійно створено рекомбінантні плазміди, підібрано умови експресії та очищення білків LndGT4, LanZ2 та LanK, оптимізовано умови тестування активності LanK in vitro та іn vivo, сконструйовано штами стрептоміцетів із зміненою експресією генів транспортерів, здійснено хімічний аналіз продукції ландоміцинів. Конфокальну мікроскопію виконано спільно із к.б.н. Ю. В. Ребцем. Для дослідження генів lanK та lanJ використано плазміду рlanKJ та косміду Н2-26 надані к.б.н. А. М. Лужецьким. Секвенування lnd генів виконано спільно із М. В. Самборським та к.б.н. Б.О. Осташем. Для дослідження субстратної специфічності LndGT4 та LanZ2 використано дезоксицукри, синтезовані аспіранткою К. Лемкулер (Відділ хімічної біології Гарвардського університету, США). Планування експериментів, аналіз та обговорення отриманих результатів проведені спільно з науковим керівником, д.б.н., професором В.О. Федоренком, к.б.н. Б.О. Осташем, к.б.н. Ю. В. Ребцем, к.б.н. А. М. Лужецьким, проф. С. Уокер, з якими автор має спільні публікації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень представлені на установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004); Х з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, Україна, 2004); VIIІ з'їзді Українського товариства генетиків та селекціонерів імені М. І. Вавилова (Алушта, Україна, 2007); II Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених „Біорізноманіття, екологія, еволюція, адаптація”, присвяченій 140-річчю Одеського національного університету імені І. І. Мечнікова (Одеса, Україна, 2005); І та ІІ Міжнародних конференціях „Молодь і поступ в біології” (Львів, Україна, 2005-2006); ХІ та ХІІ Мікробіологічних конференціях (Бостон, США, 2005-2006); ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, Україна 2006); на звітних наукових конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка (2004-2008).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 4-х статтях у фахових наукових журналах, 1-й статті у збірнику наукових праць та тезах 9 доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів, списку використаних джерел (133 найменування). Роботу викладено на 159 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 70 рисунками і 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. У роботі використано штами Escherichia coli DH5б, ET12567(pUB307), BL21(DE3), Origami2(DE3)(pLysS), штами актиноміцетів. S. globisporus 1912 (отриманий від д.б.н., проф., член-кор. НАНУ Б.П. Мацелюха, Ін-т мікробіології та вірусології НАНУ імені Д. К. Заболотного, м. Київ), S .cyanogenus (проф. А. Бехтольд, Фрайбурзький ун-т, ФРН) та їхні мутанти, виділені в цій роботі, S. lividans TK24 (М. Кобаяші, Токійський ун-т, Японія). У експериментах із секвенування, надекспресії та інактивації генів використали плазміди pUC19, pKC1218E, pSET152, pKC1139, pET24b, pET15c, pHP45. Для створення репортерних систем використали pIJ486, pIJ8660 (Kieser et al., 2000).

Для вирощування штамів актиноміцетів, визначення їхньої флуоресценції та продукції антибіотиків використали рідкі середовища TSB та SG (Kieser et al., 2000). Кон'югаційні суміші E. coli-Streptomyces вирощували на ВС.

Стійкість штамів актиноміцетів до антибіотиків визначили, як описано у роботах (Демидчук и др., 1996). Кон'югацію Escherichia coli - Streptomyces виконували як описано (Лужецкий и др., 2001). Тонкошарову (ТШХ) та високоефективну рідинну хроматографію спряжену з мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС), спектральний аналіз ландоміцинів виконували згідно (Henkel et al., 1990; Ostash et al., 2004). Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення, секвенування, конструювання та аналіз ДНК, ПЛР, ДНК-ДНК гібридизацію), очищення та аналіз білків виконували згідно методик (Kieser et al., 2000; Sambrook et al., 2000; Novagen pET system manual, 2007). Аналіз експресії репортерного гена зеленого флуоресцентного білка (EGFP) та отриманих на його основі генетичних конструкцій здійснювали за рівнем флуоресценції міцелію згідно (Sun еt al., 1999). Аналіз нуклеотидних та імовірних амінокислотних послідовностей виконували за допомогою програм BLAST 2.0, DNASIS, CLUSTAL W, TMHHM.

Результати досліджень та обговорення. Основна відмінність між lan- та lnd-кластерами S. cyanogenus S136 та S. globisporus 1912, відповідно, полягає в організації генів транспортування та глікозилювання ландоміцинів. Дослідження цих відмінностей необхідне для виявлення взаємозв'язку між транспортуванням ландоміцинів та їхнім біосинтезом, а також оцінки перспектив практичного використання відповідних lnd-генів і білків.

Cеквенування та аналіз генів lndZ1 та lndZ3 S. globisporus 1912. Незважаючи на детальні дослідження генів lndJ-кластера, нуклеотидна послідовність між генами lndJ та lndGT4 залишалася не встановленою. Нами просеквеновано ділянку lnd-кластера, обмежену генами lndJ та lndGT4. Аналіз цієї ділянки виявив дві відкриті рамки зчитування - lndZ1 та lndZ3 (рис. 1). Ген lndZ1 починається кодоном ATG, якому передує імовірний сайт зв'язування з рибосомою GAGA 5 п.н. у 5ґ-напрямі від ініціюючого кодону. Перший стоп-кодон у рамці зчитування (TGA) виявлено на відстані 570 п.н. у 3ґ-напрямі від ініціюючого кодону. На відстані 8 п.н. від 3ґ-кінця гена lndZ1 розташований ген lndZ3 з валіновим (GTG) ініціюючим кодоном.

Це дає змогу припустити, що гени lndZ1, Z3, GT4, Z4 та Z5 зчитуються як одна транскрипційна одиниця. Використавши базу даних GenBank для порівняльного аналізу, ми припускаємо, що продукт трансляції гена lndZ1, NDP-гексозо-3,5-епімераза, каталізує реакцію перетворення D-цинерулози в L-цинерулозу. Ген lndZ3 кодує NDP-гексозо-4-кеторедуктазу, яка, відновлюючи кетогрупу L-цинерулози, перетворює її у L-родинозу.

Як зазначено вище, ділянка між генами lndZ1 та lndZ3 складається лише з 8 п.н. Натомість у гомологічній ділянці lan-кластера виявлено два гени lanZ2 та lаnGT. Оскільки встановлено, що у S. cyanogenus S136 для синтезу гексасахаридного ланцюга ландоміцину А потрібно функціонування генів lаnGT3 та lanZ2 (Luzhetskyy et al., 2005), то це дає змогу зробити висновок, що відсутність гомологічних генів у lnd-кластері S. globisporus є однією з причин накопичення цим штамом саме ландоміцину Е .

Надекспресія та очищення білків LanZ2 та LndGT4. Білки, що задіяні у формуванні та приєднанні L-родинози під час синтезу ландоміцинів можуть бути знаряддям у хемоензиматичному синтезі нових антибіотиків, однак їхній потенціал у здійсненні експериментів подібного типу залишається не дослідженим.

Нами підібрано умови для надпродукції нуклеотидилтрансферази LanZ2 і глікозилтрансферази LndGT4. Використання pET-системи (Novagen Manual, 2006) дало змогу одержати розчинний білок LanZ2. Системи надпродукції білків у E. coli pET- і pTYB виявилися неефективним для отримання LndGT4 у розчинній формі. Для подолання цих труднощів, сконструйовано човникову E. coli-Streptomyces плазміду pMKI9, в якій ген lndGT4, злитий з шістьма гістидиновими кодонами на 3'-кінці, знаходиться під контролем сильного конститутивного промотора гена стійкості до еритроміцину (ermEp). Експресія цієї плазміди у S. lividans TK24 та S. globisporus LD3 дала змогу отримати розчинний білок LndGT4.

Згідно попередніх досліджень in vivo, субстратами LndGT4 та LanZ2 є активована НДФ-L-родиноза та L-родинозо-1-фосфат, відповідно (Ostash et al., 2005; Luzhetskyy et al., 2005). На сьогодні отримання цих субстратів у високій концентрації є складним завданням (Rupprath et al., 2005). Ми попередньо вивчили активності цих білків in vitro з використанням низки субстратів, споріднених з L-родинозою. Активності LanZ2 не виявлено за використаних умов реакцій. Згідно даних ВЕРХ-МС, LndGT4 здатний каталізувати приєднання залишку 2-дезоксифукози до ландоміцину D; внаслідок цього формується новий ландоміцин з m/z=727 Да. Однак, через складність хімічного синтезу вуглеводневого субстрату та низьку ефективність реакції in vitro, нам не вдалось очистити нову сполуку у кількостях, достатніх для структурного аналізу. Як результат, підібрано оптимальні умови надекспресії та очищення LanZ2 та LndGT4. Це є підґрунтям для подальшого дослідження та практичного використання цих ферментів.

Роль генів lndJ та lndW у біосинтезі ландоміцину E. Секвенування lnd-кластера S. globisporus виявило два гени lndJ та lndW, що кодують протон-залежний антипортер та АВС-транспортер ІІ-го типу, відповідно. Спрямована інактивація lndJ, lndW чи обох генів водночас у S. globisporus не спричиняє змін у стійкості до ландоміцину Е. Штами S. globisporus із нефункціональним lndJ накопичують як основну сполуку ландоміцин G, у молекулі якого відсутня гідроксильна група у позиції С11. Синтез ландоміцину G свідчить про полярний ефект інактивації lndJ на гени у 3'-напрямку (lnd Z1, Z3, GT4, Z4, Z5). Внаслідок інсерції у кодуючу послідовність lndJ плазміди рВІ, експресія генів lnd Z1, Z3, GT4 (які контролюють синтез трисахаридного ланцюга ландоміцину Е) забезпечує промотор гена стійкості до апраміцину, що міститься у плазміді. Однак активність цього промотора не достатня для того, щоб забезпечити експресію генів lndZ4, lndZ5, які контролюють реакцію окиснення попередника ландоміцинону в позиції С11. Отримані результати, підтверджені комплементційним аналізом, дають змогу припустити, що гени lndJ, Z1, Z3, GT4, Z4, Z5 є однією транскрипційною одиницею. Ці дані вказують на те, що функціонування генів lndJ та lndW не є важливим для виживання S. globisporus за умов активного синтезу ландоміцину Е. Можливо гени транспортерів, виявлені у lnd-кластері, не єдині детермінанти стійкості до ландоміцинів; транспорт цих антибіотиків, чи стійкість до них, може опосередковуватися іншими генами, що локалізовані поза межами lnd-кластера. Однак надекспресія гена lndJ надавала штамам S. globisporus 1912 та S. globisporus Smy622 підвищеної стійкості до ландоміцину Е. Наслідком надекспресії lndJ було зниження продукції ландоміцинів у дикому типі і накопичення ранніх попередників ландоміцину Е у надпродуценті Smy622. Надекспресія lndW у S. lividans TK24 надавала штамові підвищеної стійкості до ландоміцину Е. Щоб з'ясувати характер експресії генів lndJ та lndW впродовж синтезу ландоміцинів, сконструйовано плазміди, що містять транскрипційне злиття промоторних ділянок цих генів із геном зеленого флуоресцентного білка (EGFP). Максимальна активність промоторів генів lndJ та lndW у S. globisporus 1912 припадає на 42-48 год росту. Це збігається з піками експресії двох інших генів біосинтезу ландоміцину Е (lndE та lndI) та продукції ландоміцину Е. У підсумку, можна стверджувати, що експресія генів транспортерів lndJ та lndW координується з біосинтезом ландоміцинів. Ці гени надають стрептоміцетам стійкості до ландоміцину Е за умов їхньої надекспресії, однак точна фізіологічна роль lndJ та lndW і молекулярні механізми їхньої регуляції залишаються незрозумілими. Поблизу генів lndJ та lndW не виявлено регуляторних генів, які контролювали б експресію генів-транспортерів. Можливо, активність цих генів регулюється шляхоспецифічним активатором LndI (Rebets et al., 2005) або визначається структурними особливостями їхніх промоторів.

Генетичний контроль експортування ландоміцинів у S. cyanogenus S136. У lаn-кластері S. cyanogenus S136 не виявлено гомолога гена lndW. Водночас, цей штам містить ген lanJ, що є гомологом lndJ. Порівнявши нуклеотидні послідовності міжгенних ділянок, що передують lanJ та lndJ, ми не виявили гомології між ними. Отже можна припустити, що експресія цих генів регулюється різними способами. Дивергентно до lanJ розташований ген lanK, продукт якого виявляє гомологію до білків родини TetR. Відомо, що до цієї родини належать білки-репресори. Ми припустили, що гени lanK та lanJ контролюють експортування ландоміцинів із клітин S. cyanogenus S136 у спосіб, аналогічний до функціонування TetR-TetА системи в E. coli (Grkovic et al., 2002). Надекспресія гена lanJ надавала S. cyanogenus підвищеної стійкості до ландоміцину А. Вихідний штам S136 накопичує три основні ландоміцини - A, В і D (А - найбільше, D - найменше. Натомість у штамі з надекспресованим lanJ як основний продукт накопичується ландоміцин D, другим за кількістю - ландоміцин В і найменше утворюється ландоміцину A. Ми припустили, що конститутивна, а отже неконтрольована, експресія lanJ призводить до передчасного експорту інтермедіатів ландоміцину A. За нормальних умов експресія цього гена контролюється білком LanK. Роль lanK у біосинтезі ландоміцинів було досліджено у низці експериментів in vivo та in vitro. Зокрема, ми надекспресували ген lanK у штамі S136, використовуючи плазміду рМО18. Штам S136 рМО18⁺ є чутливішим до ландоміцину A порівняно із вихідним штамом і накопичує ландоміцин D як основний продукт. Ці результати, а також аналіз lanK^- мутанта, свідчать, що продукт гена lanK є репресором lanJ та генів, які беруть участь у глікозилюванні ландоміцинів. Виявлено, що LanK здатний зв'язувати in vitro ділянку ДНК між генами lanK та lanJ (P_lanKJ), а додавання в реакційну суміш ландоміцинів, які містять глікозидні ланцюги із трьох і більше вуглеводневих залишків, призводить до втрати білком ДНК-зв'язувальних властивостей. Ми встановили, що низка інших антибіотиків (апраміцин, канаміцин, спектиноміцин, ампіцилін, еритроміцин і тетрациклін) не здатні інгібувати зв'язування LanK з ДНК.

Аналіз електрофоретичної рухливості ДНК P_lanKJ після інкубації із сумарним білком клітин E. coli BL21 (рЕТ15b) не виявив утворення ДНК-білкових комплексів. Це свідчить, що саме LanK взаємодіє з ДНК. Отже, зв'язування LanK з промотором P_lanKJ високоспецифічне. Про це також свідчать дані експерименту в якому використали промоторну ділянку структурного гена lanE (P_lanE). У цьому випадку електрофоретичний аналіз не виявив зміни рухливості ДНК. Це свідчить, що LanK не взаємодіє з цим промотором. Схожий результат отримано при інкубуванні LanK із кодуючими послідовностями генів lanJ, lanK, lanZ2. Цю особливість LanK було підтверджено in vivo за допомогою репортерної плазміди рМО11, в якій експресія гена неоміцин-стійкості neo знаходиться під контролем промотора lanJ та гена lanK.

Плазміду перенесли у штам S. lividans TK24. Спори TK24(рМО11) у 0,7 % агарі посіяли на LB-агар з неоміцином у концентрації 45 мкг/мл. На кожну чашку нанесли диски з ландоміцином A (100 мкг), D (100 мкг) та ландоміциноном (100 мкг). На четверту добу вирощування спостерігали інтенсивний ріст колоній ТК24(рМО11) навколо диску з ландоміцином A (рис. 7). Очевидно, що у результаті дифузії ландоміцину А у клітини TK24(рМО11), білок LanK вивільняє промотор P_lanKJ і ген стійкості до неоміцину активно експресується. У результаті цих подій навколо диску з ландоміцином А ростуть колонії, стійкі до неоміцину.

При вирощуванні на чашці з'являлися поодинокі колонії. Виникнення поодиноких колоній на чашці може бути результатом базальної експресії гена neo з промотора P_lanKJ навіть за наявності репресора LanK.

Отримані дані розкривають роль LanK в біосинтезі ландоміцинів культурою S. cyanogenus S136 і дають змогу запропонувати модель взаємозв'язку між синтезом та експортом LaA, яку схематично зображено на рис. 8. Згідно цієї моделі, білок LanJ експортування ландоміцинів. Репресуючи промотор P_lanKJ, LanK одночасно блокує експресію lanJ та генів у 3'-напрямку від нього. Це призводить до накопичення у клітині ландоміцину D. Молекули ландоміцинів А чи В, синтезовані у результаті базальної експресії lan-генів, зв'язуються білком LanK, інгібують його активність і в такий спосіб ініціюють експорт ландоміцинів та підсилюють власний синтез. Імовірно, транспортер LanJ здатний експортувати з клітин попередники ландоміцину А, що за відсутності негативної регуляції його експресії могло б значно знизити ефективність глікозилювання ландоміцину D. З виконаної роботи випливає, що глікозилювання та експорт ландоміцинів у S. cyanogenus S136 - взаємопов'язані процеси і негативна регуляція гена транспортера необхідна для синтезу ландоміцину A як основної сполуки. З практичної точки зору, репортерну систему на основі регуляторного гена lanK можна використати для швидкого виявлення продуцентів відомих та нових сполук ландоміцинової родини з довгими глікозидними ланцюгами.

ВИСНОВКИ

У результаті виконаної роботи встановлено організацію і роль генів Streptomyces globisporus 1912 та S. cyanogenus S136, задіяних у пізніх етапах глікозилювання ландоміцинів та їхнього експорту. Відмінності в організації цих генів у згаданих штамів зумовлюють зміни у спектрі синтезованих ними ландоміцинів. Експресія генів транспортерів ландоміцинів підлягає транскрипційному контролю. Запропоновано використовувати репортерну систему на основі регуляторного гена lanK для виявлення сполук ландоміцинової родини. Розроблено методи надекспресії та очищення білків LndGT4 і LanZ2, які перспективні для використання у хемоензиматичному синтезі нових біологічно-активних сполук.

1. Клоновано та секвеновано гени lndJ lndZ1 lndZ3 Streptomyces globisporus 1912, задіяні у пізніх етапах глікозилювання ландоміцинів та їхнього експорту. У межах цієї групи не виявлено гомологів lanK, lanGT3 та lanZ2 з кластеру генів біосинтезу ландоміцину А S. cyanogenus S136, що зумовлює накопичення в S. globisporus ландоміцину Е як кінцевого продукту.

2. Підібрано оптимальні умови для надпродукції та очищення нуклеотидилтрансферази LanZ2.

3. Розроблено систему для надпродукції глікозилтрансферази LndGT4 у стрептоміцетних штамах на основі вектора рКС1139 та S. lividans.

4. Гени транспортерів lndJ та lndW надають стрептоміцетам стійкості до ландоміцину Е. Вони є активними під час синтезу ландоміцинів, проте не відіграють основної ролі у забезпеченні виживання S. globisporus за таких умов.

5. Регулювання експресїї гена lndJ у штамі S. globisporus 1912 важливе для синтезу ландоміцину Е як кінцевого вторинного метаболіту. Його надекспресія призводить до значного зниження вмісту ландоміцину Е, що є наслідком передчасного експорту інтермедіатів.

6. У S. cyanogenus експресія генів lanJ lanZ1 lanGT3 lanZ2 lanGT4 репресується білком LanK. Ландоміцини з довгими глікозидними ланцюгами (не менше 3-х вуглеводневих залишків) блокують репресорні властивості LanK. Запропоновано модель координації синтезу ландоміцинів та їхнього експорту з клітин.

7. Ген lanK може бути використано як компонент для створення репортерних систем виявлення відомих та нових сполук ландоміцинової родини з довгими глікозидними ланцюгами.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Kozarevska I. (Ostash I.) Biosynthesis of landomycin E deoxysugar part in Streptomyces globisporus 1912: sequencing and analysis of lndZ1 and lndZ3 genes / I. Kozarevska (I. Ostash), B. Ostash, M. Samborskyy, V. Fedorenko // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. Біол. - 2004. - Т. 38. - С. 92-98. Особистий внесок здобувача - субклонування генів, аналіз нуклеотидних послідовностей.

2. Ostash B. Generation of landomycin D producing strain Streptomyces globisporus LD3 / B. Ostash, I. Kozarevska (I. Ostash), V. Fedorenko // Folia Microbiol.- 2005.- Vol. 50, №3. - P. 19-23. Особистий внесок здобувача - визначення спектра стійкості та залежності виживання штамів від ландоміцинів, порівняльний аналіз стійкості стрептоміцетів до ландоміцинів Е та D.

3. Ostash I. Proton-dependent transporter gene lndJ confers resistance to landomycin E in Streptomyces globisporus 1912 / I. Ostash, B. Ostash, S. Walker, V. Fedorenko // Генетика - 2007. - Т. 43, №8. - С. 1032-1037. Особистий внесок здобувача - клонування генів, конструювання штамів актиноміцетів із надекспресією гена транспортера lndJ, визначення стійкості до антибіотиків методом дифузії антибіотика в агар.

4. Ostash I. An ABC transporter encoding gene lndW confers resistance to landomycin E / I. Ostash, B. Ostash, A. Kobylyanskyy, M. Myronovskyy, T. Nakamura, S. Walker, V. Fedorenko // Arch. Microbiol. - 2008. -Vol. 189, №4. - P. 105-109. Особистий внесок здобувача - субклонування та експресія генів, визначення стійкості до ландоміцину Е, отримання подвійного lndW^-lndJ^- мутанта та його характеристика за стійкістю до ландоміцинів та змінами у їхньому синтезі; конструювання EGFP-залежних репортерних плазмід для дослідження активності промотора гена lndW.

5. Федоренко В.О. Генетичний контроль біосинтезу ландоміцину Е культурою Streptomyces globisporus 1912 / В. О. Федоренко, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, О. М. Громико, Ю. В. Ребець, І. С. Осташ, Л. О. Горбаль, А. М. Кобилянський, М. Л. Мироновський // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. пр.- 2007.- C. 376 -380. Особистий внесок здобувача - конструювання штамів із пошкодженими та надекспресованими генами lanK та lanJ, хімічний аналіз продукції ландоміцинів мутантними штамами методами хроматографії та мас-спектрометрії.

6. Kozarevska I (Ostash I.). Interrelationship of landomycin E biosynthesis and it's transport in Streptomyces globisporus / I. Kozarevska (I. Ostash), B. Ostash, Yu. Rebets, V. Fedorenko // I-й Укр. конгрес клітинної біології (Львів, 25-28 трав. 2004 р.): тези доп. - Л., 2004. - С. 105. Особистий внесок здобувача - конструювання штамів із пошкодженим геном lndJ, аналіз мутанта методами гібридизації за Саузерном; очищення ландоміцинів з клітин мутанта, їхній аналіз методом ТШХ.

7. Ребець Ю. В. Регуляція біосинтезу ландоміцинів та гени стійкості до них у Streptomyces globisporus 1912 / Ю. В. Ребець, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, І. С. Козаревська (І. С. Осташ), О. М. Громико, А. М. Кобилянський, Л. О. Дутко, У. Я. Мік, В. О. Федоренко // Х-й з'їзд Т-ва мікробіологів України (Одеса, 15-17 вер. 2004 р.): тези доп. - О., 2004. - С. 320. Особистий внесок здобувача - надекспресія генів lanJ та lndJ, дослідження стабільності клонованих генів у стрептоміцетах, вирощування рекомбінантних штамів у рідких середовищах з метою аналізу продукції ландоміцинів та інших вторинних метаболітів.

8. Козаревська І. С. (Осташ І. С.), Транспозонний мутагенез у продуцентів ландоміцинів Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136 / І. С. Козаревська, (І. С. Осташ), Б. О. Осташ, М. В. Самбір, В. О. Федоренко // Х-й з'їзд Т -ва мікробіологів України (Одеса, 15-17 вер. 2004 р.): тези доп. - О., 2004. - С. 332. Особистий внесок здобувача - конструювання транспозонної плазміди, відбір штамів із вставкою транспозону у випадкові локуси геному S. globisporus.

9. Мік У. Я. Вивчення функції генів lndJ та lndW у S. globisporus / У. Я. Мік, Ю. В. Ребець, І. С. Осташ, Б. О. Осташ, В. О. Федоренко // Биоразнообразие, экология, эволюция, адаптация: II междунар. научн. конф. студ. асп. молод. уч., посвящ. 140-летию Од. нац. ун-та (Одеса, 28-31 бер. 2005 р.): тези доп. - О., 2005. - С. 141. Особистий внесок здобувача - створення штамів із пошкодженим та надекспресованим геном lndW, підбір праймерів для отримання фізичного доказу інактивації гена lndW у геномі S. globisporus.

10. Мироновський М. Л. Розробка системи транспозонного мутагенезу у штамі Streptomyces globisporus 1912 / М. Л. Мироновський, І. С. Осташ, Ю. В. Ребець, Б. О. Осташ, В. О. Федоренко // Молодь і поступ в біології: І міжнар. конф. студ. аспір. (Львів, 11-14 квіт. 2005 р.): тези доп. - Л., 2005. - С. 132. Особистий внесок здобувача - конструювання плазміди для транспозонного мутагенезу, оптимізація умов мутагенезу, дослідження морфології та гібридизаційний аналіз транспозантів.

11. Ostash I. The gene lanZ2 encodes a nucleotidyltransferase putatively involved in the biosynthesis of TDP-в-deoxysugars during landomycin A biosynthesis / I. Ostash, M. Fedoryshyn, A. Luzhetskyy, B. Ostash, V. Fedorenko, A. Bechthold, S. Walker // 11-th Annual Boston Bacterial Meeting (Boston, 17-18 jun. 2005): abstracts - B., 2005. - P. 34. Особистий внесок здобувача - очищення та дослідження активності білка LanZ2 за допомогою його in vitro тестування за наявності різних фосфорильованих дезоксицукрів.

12. Сініченко Ж. Роль гена lanJ, що кодує протон-залежний антипортер у біосинтезі ландоміцинів Streptomyces cyanogenus S136 / Ж. Сініченко, І. Осташ, Б. Осташ, А. Бехтольд, В. Федоренко // Молодь і поступ в біології: ІІ міжнар. конф. студ. аспір. (Львів, 21-24 бер. 2006 р.): тези доп. - Л., 2006. - С. 157. Особистий внесок здобувача - конструювання плвзміди для надекспресії lanJ, комплементаційний та хімічний аналіз мутантних штамів S. globisporus та S. cyanogenus.

13. Ostash I. LanK: a transcriptional regulator of the landomycin exporter gene in Streptomyces cyanogenus S136 I. Ostash, B. Ostash, A. Bechthold, V. Fedorenko, S. Walker // 12-th Annual Boston Bacterial Meeting (Boston, 9-10 jun. 2006): abstracts - B., 2006. - P. 41. Особистий внесок здобувача - очищення з клітин E. coli та in vitro дослідження білка LanK за здатністю зв'язувати ДНК (промотор між lanK та lanJ) за наявності та відсутності ландоміцинів з різної довжини дезоксицукрового ланцюга.

14. Федоренко В. О. Cтворення штамів актиноміцетів - продуцентів антибіотиків за допомогою методів генетичної інженерії / В. О. Федоренко, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, Ю. В. Ребець, О. М. Громико, І. С. Осташ, Л. О. Дутко, А. М. Кобилянський // IX Український біохім. з'їзд (Харків, 24-27 жов. 2006 р.): тези доп. - Х., 2006. - С. 159. Особистий внесок здобувача - очищення та дослідження активності білка LndGT4 in vitro та in vivo з використанням ландоміцину D як акцепторного субстрату та активованих дезоксицукрів - як донорних.

Размещено на Allbest.ru