Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.04 - біохімія

Біоінформатичний аналіз молекулярних механізмів диференціації лімфоїдних клітин

ГАЛИЦЬКИЙ Володимир Адамович

Київ-2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НAH України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, академік НАН України

КОМІСАРЕНКО Сергій Васильович,

завідувач відділу молекулярної імунології, директор Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України

ЄЛЬСЬКА Ганна Валентинівна,

завідувач відділу механізмів трансляції генетичної інформації, директор Інституту молекулярної біології і генетики НАН України,

доктор біологічних наук, професор

ДМИТРЕНКО Микола Петрович,

завідувач відділу регуляції обміну речовин Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України

Захист відбудеться 22 грудня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, за адресою: 01601, Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 20 листопада 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Диференціація клітин імунної системи є точно скоординованим процесом, що складається з ряду окремих етапів, котрі включають в себе одну чи кілька послідовних стадій. На сьогодні вже відкриті основні цитокіни та транскрипційні фактори, необхідні для лімфопоезу. Однак, незважаючи на безпрецедентний об'єм накопичених первинних експериментальних даних, залишаються неясними молекулярні механізми переходу клітин з одної стадії дозрівання на наступну, роль епігенетичних механізмів у запам'ятовуванні клітинами обраного напрямку та досягнутого рівня диференціації. Відсутній консенсус і в уявленнях щодо окремих інших аспектів диференціації лімфоїдних клітин, зокрема щодо механізмів стадієспецифічної регуляції активності рекомбіназ, координації сплайсингу ДНК у локусах генів антигензв'язуючих рецепторів, молекулярних механізмів алельного виключення, що має місце при цьому [Corcoran, 2005]. Не зовсім зрозуміла і роль некодуючих антисмислових РНК, які до моменту рекомбінації транскрибуються у алельних локусах [Corcoran, 2005].

Особливу увагу привертають питання можливої участі у зазначених процесах інтерферуючих РНК (RNAi). Нещодавно було встановлено, що певні мікроРНК (miRNA) здатні перешкоджати диференціації клітин, а також, що набір наявних у клітині miRNA закономірно змінюється під час Т-лімфопоезу [Wu et al., 2007]. Потребує осмислення і сам феномен інтерферуючих РНК. Інтригуючим видається вже те, що частка послідовностей генів miRNA у геномі є надзвичайно великою і сягає, згідно недавніх оцінок, 3% його об'єму [Taganov et al., 2007]. Показано, що лише на посттранскрипційному рівні miRNA можуть регулювати експресію не менше 30% структурних генів геному [Lewis et al., 2005]. У той же час відомо, що принаймні короткі інтерферуючі РНК (siRNA) можуть викликати сайленсинг генів і на транскрипційному рівні, викликаючи метилювання ДНК, механізм чого невідомий [Kawasaki, Taira, 2004]. Також предметом гострих дискусій на сьогодні є рамки і молекулярні механізми трансдетермінації та дедиференціації клітин. Особливий інтерес до цих питань викликає клонування ряду ссавців, здійснене протягом останнього десятиліття, а також практика трансплантації стовбурових клітин з лікувальною метою.

Зважаючи на ці обставини, видається актуальним детальніше дослідити генетичні та епігенетичні механізми диференціації лімфоїдних клітин, алельного виключення, зокрема участь miRNA у них. Також предметом нашої уваги є можлива молекулярна основа появи феномену спеціалізації клітин у процесі еволюції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у рамках тем № 9 “Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів” (номер держреєстрації 0104U003280, термін виконання 2004-2008 роки) та № 15 “Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики та лікування” (номер держреєстрації 0102U006218, термін виконання 2002-2006 роки), “Структурно-функціональний аналіз білків за норми і деяких патологій” (номер держреєстрації 0107V007187, термін виконання 2007-2011 роки) НДР відділу молекулярної імунології Інституту біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, затверджених Президією НАН України.

Дана робота відповідає цільовим програмам наукових досліджень Відділення біохімії, фізіології і молекулярної біології НАН України “Молекулярні основи функціонування геному”, “Фізіолого-біохімічні та молекулярно-генетичні основи функціонування живих систем і розробка принципів керування ними” (термін виконання 2002-2006 роки) та “Фундаментальні основи геноміки та протеоміки, клітинні та генні технології” (термін виконання 2007-2011 роки), що належать до пріоритетних напрямів розвитку науки і техніки.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є встановлення характерних принципів будови і функціонування генної мережі диференціації клітин, зокрема розкриття можливої участі miRNA у ній, а також реконструкція, на основі зазначених принципів та накопиченої на сьогоднішній момент інформації, єдиної схеми функціонування молекулярних механізмів спеціалізації лімфоїдних клітин.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Зібрати, опрацювати і проаналізувати сучасні літературні дані стосовно базових механізмів регуляції експресії генів та механізмів регуляції експресії генів, пов'язаних з процесами диференціації клітин.

2. Встановити роль окремих miRNA у диференціації лімфоїдних клітин, здійснивши пошук їх мішеней у мРНК стадієспецифічних генів. З'ясувати можливі молекулярні механізми RNAi-опосередкованого транскрипційного сайленсингу.

3. Запропонувати можливий механізм алельного виключення - явища, що супроводжує центральну подію диференціації лімфоїдних клітин - формування генів ланцюгів антиген-зв'язуючих рецепторів.

4. Запропонувати механізми пакетної активації та репресії стадієспецифічних генів. Створити схему будови генної мережі клітинної диференціації, яка б розкривала механізми вибору клітинами напрямку подальшої спеціалізації, його стійкого запам'ятовування, формування дозріваючими клітинами властивого їм мікрооточення.

5. Керуючись запропонованою загальною моделлю диференціації клітин та використовуючи інформацію наявних відкритих баз даних про стадії диференціації лімфоїдних клітин, відповідні цим стадіям гени, цитокіни, інші компоненти внутрішньоклітинних і позаклітинних сигнальних каскадів, регуляторні елементи генів, асоційовані з диференціацією лімфоїдних клітин, реконструювати структуру генної мережі, що забезпечує дозрівання окремої клітинної лінії - лінії лімфоїдних клітин.

6. З'ясувати імовірний механізм появи генної мережі диференціації клітин у процесі еволюції.

Об'єкт дослідження - процес диференціації лімфоїдних клітин.

Предмет дослідження - пошук із використанням методів біоінформатики невідомих раніше молекулярно-генетичних та епігенетичних механізмів, що забезпечують диференціацію лімфоїдних клітин і координують її перебіг.

Методи дослідження. Робота виконана in silico за допомогою методів біоінформатики. Інформація про локалізацію генів на хромосомах, послідовності генів, у т.ч. генів клітинних miRNA, а також білків була отримана з системи баз даних Entrez (Національний Центр біотехнологічної інформації США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/), про послідовності siRNA - з бази даних “siRNA Database and Resources for RNA Interference Studies”, http://www.rnainterference.org/Sequences.html, про послідовності зрілих miRNA - з бази даних miRBase, http://microrna.sanger.ac.uk/. Аналіз нуклеотидних послідовностей здійснювався програмними пакетами Discovery Studio Gene 1.5, Vector NTI Advance 10, Lasergene 6. Пошук сайтів зв'язування miRNA у 3'-UTR-ділянках мРНК проводився програмою TargetScan 4.2 (http://www.targetscan.org).

Наукова новизна отриманих результатів.

1. Вперше виявлено, що в інтерферуючих РНК (siRNA та miRNA) частота зустріваності динуклеотидів 5'-CG-3' та тринуклеотидів 5'-CNG-3' - тобто сайтів, комплементарних сайтам метилювання у ДНК - набагато перевищує випадкову, а частка RNAi, цілковито позбавлених даних сайтів, становить лише 15-20%. На основі цього вперше висловлено гіпотезу, що механізмом RNAi-опосередкованого транскрипційного сайленсингу є саме ініціація ними метилювання комплементарної ДНК de novo.

2. Вперше запропоновано, що ініціатором алельного виключення генів виступає молекула miRNA, котра утворюється в ході процесингу некодуючого транскрипта алелів та зв'язується з комплементарною ділянкою їх ДНК, зумовлюючи нанесення епігенетичних маркерів репресії. Також вперше запропоновано, що послідовність, яка визначає алельне виключення локусів імуноглобулінових генів, кодуючи відповідну miRNA (чи керуючи її синтезом), повинна знаходитись у спейсері між найближчими сусідніми V- та (D)J-сегментами.

3. Вперше запропоновано, що модулі генів (окремі елементарні функціональні одиниці, з яких повинна складатися генна мережа клітинної диференціації) керуються позитивним зворотнім зв'язком та відповідають кожен за свій окремий етап певного напрямку диференціації клітини за принципом “один етап диференціації - один модуль генів”.

4. Отримали подальший розвиток, були уточнені та об'єднані в загальну схему фрагменти генної мережі, відповідальної за окремий шлях диференціації клітин - В-лімфопоез. При цьому вперше показано, що інактивація рекомбіназ Rag1 та Rag2 може бути обумовлена сайленсингом мРНК фактора Foxp1 через вплив мікроРНК miR-181 та miR-150. Вперше отримано вказівки, що репресією гена мікроРНК miR-181 може визначатись перехід лімфоцитів на стадію зрілих В-клітин.

5. Вперше запропоновано, що наявність miRNA необхідна для реставрації втраченої епігенетичної інформації та транскрипційного сайленсингу множинних копій мобільних елементів геному, на основі чого у процесі еволюції і виникло явище алельного виключення.

Теоретичне і практичне значення отриманих результатів. Отримані результати мають фундаментальне значення. Створено єдину картину будови і функціонування генної мережі клітинної диференціації, участі miRNA у ній, пояснено, яким чином здійснюється вибір напрямку спеціалізації дозріваючої клітини та якими молекулярними механізмами забезпечується стійкість обраної клітиною спеціалізації. Запропоновані гіпотези про RNAi-опосередковані механізми транскрипційного сайленсингу, алельного виключення та реставрації епігенетичної інформації доповнюють сучасні уявлення про загальні принципи регуляції експресії генів, розкривають можливе еволюційне походження і первинну біологічну роль системи клітинних miRNA. Проаналізовано також імовірне еволюційне походження генної мережі диференціації клітин та роль у даному процесі мобільних елементів геному в контексті появи феномену багатоклітинності, що теж має загально-біологічне і, зрештою, світоглядне значення. Запропоновані ідеї отримали підтвердження при розгляді молекулярних основ диференціації лімфоїдних клітин, тому можна сподіватись, що у подальшому вони сприятимуть пошуку компонентів інформаційних мереж, відповідальних за інші напрямки та етапи диференціації клітин організму.

У віддаленій перспективі ідеї, викладені в дисертаційній роботі, можуть бути використані при створенні технології управління напрямком та рівнем диференціації клітин, що дозволить керувати регенерацією уражених тканин і органів, викликати нормалізацію пухлинних клітин, а також створювати організми з наперед заданими властивостями.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто здійснював опрацювання літературних даних, отримував з відкритих баз даних нуклеотидні послідовності, планував та проводив біоінформатичні дослідження, аналізував їх результати. Усі положення, викладені у дисертації, в т.ч. і ті, котрі мають наукову новизну, розроблені автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на наступних конференціях:

1. 2-ий Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених. 6 - 8 травня 1998 р., Тернопіль, Україна.

2. Conference on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology. September 20 - 22, 2001, Kyiv, Ukraine.

3. VIII з'їзд Українського біохімічного товариства. 1 - 3 жовтня 2002 року, Чернівці, Україна.

4. 3^rd International Conference “Controversies in Tumour Prevention and Genetics” and Annual Meeting of the International Society of Cancer Chemoprevention. February 12 - 14, 2004, St. Gallen, Switzerland.

5. 18^th Meeting of the European Association for Cancer Research. July 3 - 6, 2004, Innsbruck, Austria.

6. 5^th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling”. April 26 - 29, 2005, Kyiv, Ukraine.

7. 1^st International Symposium on Methods and Applications of Computational Chemistry. June 30 - July 1, 2005, Kharkiv, Ukraine.

8. Спільний науковий семінар Інституту біохімії імені О.В. Палладіна та Українського біохімічного товариства “Актуальні проблеми сучасної біохімії”. 27 жовтня 2005 р., Київ, Україна (доповідь була відзначена іменною стипендією та грантом для молодих вчених Інституту біохімії).

9. 19^th Meeting of the European Association for Cancer Research. July 1 - 4, 2006, Budapest, Hungary.

10. 14^th International Conference of the International Society of Differentiation. October 6 - 11, 2006, Innsbruck, Austria.

11. IX З'їзд Українського біохімічного товариства. 24 - 28 жовтня 2006 р., Харків, Україна.

12. 6^th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling”. May 30 - June 2, 2007, Krakow, Poland.

13. 14^th European Cancer Conference. September 23 - 27, 2007, Barcelona, Spain.

Публікації. За результатами, що подані у дисертації, опубліковано 7 статей у фахових виданнях та 12 тез доповідей у збірниках матеріалів українських і міжнародних конференцій.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 4 підрозділи), результатів досліджень та їх обговорення (5 розділів, 21 підрозділ), висновків, списку літератури з 372 джерел. Робота викладена на 186 сторінках машинописного тексту. Дисертація містить 24 ілюстрації, 7 таблиць, 1 додаток.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В даному розділі розглянуті сучасні дані про стадії Т- та В-лімфопоезу, молекулярний механізм рекомбінації у локусах фрагментів генів імуноглобулінів та Т-клітинних рецепторів, механізми регуляції експресії генів, опосередковані транскрипційними факторами, епігенетичними маркерами, а також RNAi.

Методологія та методи досліджень. Робота виконана in silico з використанням методів біоінформатики. Методологія з'ясування молекулярних механізмів диференціації лімфоїдних клітин передбачала висунення - на підставі розгляду механізмів окремих властивих прокаріотам феноменів, еквівалентних спеціалізації клітин у еукаріотів, - гіпотези про базові принципи будови генної мережі диференціації клітин та наступну перевірку зазначеної гіпотези на предмет відповідності накопиченим та опублікованим на сьогодні даним про процес дозрівання лімфоїдних клітин. Інформація про локалізацію генів на хромосомах, послідовності генів, у т.ч. генів клітинних miRNA, а також білків була отримана з системи баз даних Entrez (Національний Центр біотехнологічної інформації США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/). Інформація про тривимірну структуру ДНК-зв'язуючих доменів окремих транскрипційних факторів отримана із бази даних Protein Data Base (PDB, http://www.rcsb.org/pdb/). Послідовності siRNA людини, миші, пацюка - загалом 599 послідовностей - були отримані з бази даних “siRNA Database and Resources for RNA Interference Studies”, http://www.rnainterference.org/Sequences.html. Послідовності зрілих miRNA даних організмів - загалом 1083 послідовності - були отримані з бази даних miRBase, http://microrna.sanger.ac.uk/.

Аналіз нуклеотидних послідовностей (пошук сайтів, мотивів, консенсусних послідовностей) проводився при допомозі програмних пакетів Discovery Studio Gene 1.5, Vector NTI Advance 10, Lasergene 6. Пошук сайтів зв'язування miRNA у 3'-UTR-ділянках мРНК та класифікація виявлених сайтів за ступенем еволюційної консервативності проводився при допомозі програмного пакету TargetScan 4.2 (http://www.targetscan.org). Пошук мішеней miRNA проводився у базі даних miRNA Меморіального онкологічного центру Слоан-Кеттерінг (http://www.microrna.org). Реконструкція сигнальних шляхів проводилась при допомозі програмних пакетів SmartDraw 7, CellDesigner 3.1, PathWayAssist 3.0.8, E-Cell 3.

Гіпотеза про механізм метилювання ДНК de novo, ініційованого інтерферуючими РНК. У результаті аналізу вищезазначених баз даних siRNA та miRNA ми встановили, що сайти 5'-CG-3' та 5'-CNG-3' у досліджених послідовностях siRNA та miRNA виявляються значно частіше, ніж повинні були б зустрічатися у випадковій послідовності (табл. 1), а також, що лише п'ята частина miRNA і менше шостої частини siRNA повністю позбавлені даних сайтів. Дана обставина вказувала, що динуклеотиди 5'-CG-3' та тринуклеотиди 5'-CNG-3' в RNAi відіграють певну важливу біологічну роль.

Припущення, що ця роль пов'язана з участю комплементарних пар гуанін-цитозин (котрі, як відомо, є термодинамічно більш стабільними, аніж пари аденін-урацил, оскільки утворені при допомозі трьох водневих зв'язків, а не двох) у формуванні просторової структури RNAi - зокрема, під час її процесингу - слід відкинути, оскільки в той час як частота зустріваності триплетів 5'-CNG-3' достовірно перевищує випадковий для послідовностей RNAi рівень, частота зустріваності динуклеотидів 5'-GC-3' від цього рівня достовірно не відрізняється (див. табл. 1). Отже, біологічне значення має власне 5'-3'-порядок розташування цитозину та гуаніну в утворених ними ди- і тринуклеотидах, а не сама по собі присутність згаданих нуклеотидів у складі RNAi.

Таблиця 1. Частота зустріваності сайтів 5'-CG-3', 5'-CNG-3' та 5'-GC-3' у досліджених молекулах siRNA та miRNA, %

Примітки. ^а - згідно даних [Jabbari, Bernardi, 2004]. Жирним шрифтом виділена достовірна (p0,05) відмінність частоти зустріваності сайту від рівня, середнього для геному, символом * - від рівня, випадкового для послідовностей RNAi. Частота зустріваності сайтів 5'-CG-3' та 5'-GC-3' визначалась як відношення їх кількості до кількості усіх динуклеотидів, сайтів 5'-CNG-3' - до кількості усіх тринуклеотидів, наявних у досліджених послідовностях.

Зважаючи на здатність siRNA, спрямованої проти 5'-CG-3'-вмісних послідовностей, викликати метилювання ДНК de novo [Kawasaki, Taira, 2004], а також враховуючи присутність окремих miRNA у клітинному ядрі, зокрема дані про ядерцеву локалізацію miR-206 [Ritland Politz et al., 2006], механізм ядерного імпорту miR-29b [Hwang et al., 2007], ми припустили, що сайти 5'-CG-3' та 5'-CNG-3' у складі RNAi необхідні для ініціації метилювання залишків цитозину у комплементарних сайтах ДНК. Для цього RNAi повинні сканувати нуклеотидну послідовність ланцюгів молекули ДНК під час її розплітання РНК-полімеразою II при транскрипції. Виявивши комплементарну ділянку ДНК, siRNA або miRNA зв'язується з нею і рекрутує клітинну ДНК-метилтрансферазу DNMT3, котра і метилює у ДНК de novo цитозин динуклеотидів 5'-CG-3' та тринуклеотидів 5'-CNG-3', що виявилися спареними з аналогічними сайтами у складі RNAi [Halytskiy, 2007]. При цьому активність підтримуючої метилази DNMT1 повинна проявлятись після відокремлення RNAi та відновлення двохланцюгової структури ДНК і бути потрібною для метилювання іншого ланцюга ДНК - комплементарного тому, що зазнав метилювання внаслідок вищезгаданої гібридизації з siRNA чи miRNA. Також запропоновані механізми повинні або прямо, або опосередковано - через нанесення на ДНК метильних міток - приваблювати до хроматину, що містить ділянку ДНК, розпізнану RNAi, гістон-деацетилази (HDAC) та гістон-метилази (HMT), тим самим обумовлюючи, відповідно, відщеплення від гістонів маркерів активного хроматину та нанесення на них de novo маркерів репресії

На користь запропонованого механізму свідчить нещодавнє відкриття ядерного імпорту утвореного RNAi та білком Ago2 комплексу RISC [Ohrt et al., 2008], а також здатності мікроРНК miR-320 викликати асоціацію з промотором гена POLR3D іншого білка сімейства Argonaute, Ago1, та триметильованого по лізину-27 гістона H3 [Kim et al., 2008], котрий, як відомо, є маркером репресії.

Слід очікувати, що епігенетичні маркери репресії, нанесені таким чином, згодом здатні поширюватися на увесь домен хроматину - зокрема через те, що процеси деацетилювання та метилювання гістонів захоплюють не тільки ті нуклеосоми, які пов'язані з сайтом ДНК, метильованим de novo, але й сусідять із ним. При цьому ДНК-метилтрансферази, приваблені до метильованих гістонів, метилюють зв'язану з ними ДНК, що знову веде до модифікації прилеглих гістонів, і т.д. У підсумку, ген, розпізнаний RNAi, зазнає транскрипційного сайленсингу внаслідок мічення хроматину маркерами репресії на всьому своєму протязі.

Молекулярний механізм алельного виключення у локусах імуноглобулінових генів. Ми припускаємо, що алельного виключення зазнають гени, в яких транскрибується як матричний, так і антипаралельний ланцюг ДНК, причому транскрипт одного з них є попередником miRNA (зважаючи на ту обставину, що окремі miRNA кодуються інтронними послідовностями [Lin et al., 2006]). Тоді під час зчитування РНК-полімеразою одного з ланцюгів ДНК зріла форма згаданої miRNA отримує можливість сканувати послідовність іншого ланцюга, і, виявивши комплементарну собі ділянку, зв'язуватися з нею. Оскільки РНК-полімераза, транскрибуючи той чи інший ланцюг ДНК, повинна відокремлювати чи розщеплювати зв'язані з ним молекули miRNA, внаслідок чого вони можуть не встигати ініціювати та/або підтримувати вищезазначені зміни епігенетичних маркерів, ми припускаємо, що кількості miRNA, зчитаної тільки з одного алеля, не достатньо для його репресії de novo. Алельне виключення настає внаслідок того, що у клітині, де функціонує двоє чи більше алелів гена, концентрація зчитаної з них miRNA рано чи пізно досягає рівня, при якому РНК-полімераза не встигає відокремити miRNA, спарену з транскрибованим ланцюгом, до того як вона залучить ДНК-метилтрансферазу та ініціює нанесення метильної мітки на зв'язану ділянку ДНК, модифікування прилеглих гістонів і подальше ремоделювання хроматину.

У підсумку один з алелів зазнає мічення маркерами репресії та перестає зчитуватися, тоді як інший зберігає активний статус. Репресованим виявляється той алель, який менш активно звільняється від приєднаної miRNA, тобто слабкіше транскрибується (наприклад, через якісь випадкові особливості утримуючого його та прилеглого хроматину). Зауважимо, що ініціюючий репресію поріг концентрації miRNA для кожного з алелів не є якоюсь стандартною величиною, а гнучко налаштовується, стаючи тим вищим, чим активніше транскрибується алель та швидше відділяються гібридизовані з останнім miRNA, завдяки чому алельне виключення може встановлюватися при будь-яких рівнях експресії генів, що його зазнають.

Алельне виключення локусів імуноглобулінових генів теж здійснюється, на нашу думку, у запропонований спосіб. Локуси перед реаранжуванням зазнають активної смислової та антисмислової транскрипції. Імовірно, некодуючий транскрипт V-області і є попередником miRNA. У результаті зв'язування з цією miRNA ДНК в одному з локусів зазнає метилювання, яке поширюється на рекомбінаційні сигнальні послідовності (RSS). У свою чергу, метилювання ДНК, як відомо на сьогодні, прямо перешкоджає діяльності рекомбіназ. Тому реаранжування відбувається лише в одному з алельних локусів, і лише у випадку його невдачі інший алельний локус буде заново деметильований (оскільки у клітині, яка не отримала функціонуючий імуноглобуліновий ген, не зникне сигнал від рецептора IL-7, котрий викликає репозиціонування локусів та зняття з них маркерів репресованого хроматину).

Оскільки невдало реаранжований генний локус не може перешкодити дерепресії альтернативного локусу, слід очікувати, що відповідальна за алельне виключення транскрипція неперебудованої V-області регулюється розташованою між найближчими сусідніми V- та (D)J-сегментами спейсерною ділянкою, котра при V-(D)J-рекомбінації завжди втрачається і, таким чином, перестає чинити репресивний вплив на алель. У зазначеному спейсері могли б знаходитись або енхансер, який координує некодуючу транскрипцію V-області, або промотор цієї транскрипції чи її точка старту, або і ген miRNA та, відповідно, сайт опосередкованого нею метилювання ДНК. ген лімфопоез диференціація клітина

Зважаючи на ту обставину, що miRNA є похідними мобільних елементів геному класу MITE (miniature inverted-repeat transposable elements), первинне біологічне завдання системи клітинних miRNA полягало, на наш погляд, у захисті стабільності клітинного геному шляхом транскрипційного сайленсингу транспозонів та інших мобільних елементів завдяки вищезапропонованому механізму встановлення епігенетичних маркерів репресії та їх реставрації навіть у випадку повної втрати цих маркерів тою чи іншою ділянкою ДНК. Очевидно, клітини могли специфічно знижувати активність множинних копій транспозонів до мінімально можливого рівня, допускаючи транскрипцію максимум однієї з них та застосовуючи РНК, зчитану з неї і процесовану при допомозі ендонуклеаз Drosha та Dicer, для мічення усіх інших копій мітками репресії, окремим випадком чого і є алельне виключення.

Можлива будова та принципи функціонування генної мережі диференціації клітин. Враховуючи ідею пакетної активації окремим геном експресії групи генів, відповідальних за процес спеціалізації клітини [Britten, Davidson, 1969], ми припускаємо, що здійснення кожного окремого етапу певного напрямку клітинної диференціації відбувається внаслідок діяльності відповідної даному напрямку та етапу генної групи - модуля генів. Оскільки у прокаріотів кожен зі станів бактеріальної клітини (вегетативна форма, спора, стан теплового шоку), що є еквівалентами спеціалізації еукаріотичних клітин, визначається присутністю окремого -фактора, який підтримує транскрипцію лише відповідного даному стану кола генів, ми за аналогією припустили, що експресія всіх генів одного і того самого модуля узгоджено координується активністю одного з них - гена-активатора, білок якого є транскрипційним фактором, здатним підтримувати експресію власного гена за принципом позитивного зворотного зв'язку, а також експресію усіх інших генів модуля, таким чином визначаючи їх належність до даного, але не іншого генного угрупування. Дане припущення було перевірено у цій роботі (див. далі).

Поряд із геном-активатором, до складу окремого модуля повинні входити диференціюючі гени, білки яких забезпечують клітині реалізацію обраного напрямку диференціації і набуття відповідної спеціалізації, та контролюючі гени, покликані репресувати ключові гени модулів пройдених або альтернативних етапів диференціації клітини, а також нівелювати репресивний вплив окремих клітинних елементів, який останні (зокрема miRNA - див. далі) чинять на гени, що належать даному модулю. У ряді випадків, можливо, в якості контролюючих генів теж виступають гени miRNA. Завдяки метилюванню ДНК та ремоделюванню хроматину сайленсинг, ініційований впливом контролюючих генів, може підтримуватись тривалий час, не вимагаючи збереження їх активності на подальших етапах та стадіях дозрівання клітини.

Якщо котрийсь етап диференціації характеризується поступовим підвищенням вираженості одних ознак спеціалізації клітини і появою інших, що дозволяє виділити у ньому кілька індивідуальних стадій, послідовна зміна яких, однак, не супроводжується кардинальними змінами у фенотипі клітини та вибором нею одного з альтернативних напрямків дозрівання, це означає, що модуль генів, котрий контролює даний етап, містить у своєму складі відособлені підгрупи генів - субмодулі, відповідальні за здійснення кожної окремої стадії. Експресія генів субмодулів координується транскрипційним фактором, кодованим не геном-активатором, а іншим геном, що є підпорядкованим останньому. Вибір напрямку подальшої диференціації клітини після завершення кожного чергового етапу визначається активацією відповідного модуля генів під впливом сигналу, що генерується рецепторами цитокінів. Гени згаданих рецепторів, а також гени компонентів сигнальних каскадів, відповідальних за перенесення у клітині сигналів даних рецепторів, повинні входити як звичайні диференціюючі гени до складу модуля, який діє в клітині (чим і обмежується коло вибору напрямків її подальшої диференціації). Кожний рецептор активується специфічним йому цитокіном, і через відповідну тільки йому сигнальну молекулу (або їх каскад) активує експресію того з генів-активаторів модулів наступного етапу спеціалізації клітини, котрий несе сайт зв'язування цієї сигнальної молекули.

На наш погляд, нові напрямки та етапи диференціації у процесі еволюції з'являлись із появою у клітині нових модулів генів внаслідок вбудовування сайтів транскрипційних факторів - при допомозі, ймовірно, транспозонів - у регуляторні області генів, що носило характер, аналогічний вбудовуванню ділянок ДНК, кодуючих окремі домени білків, у структурні області генів. Очевидно, природній відбір закріплював найбільш оптимальні комбінації генів у модулях, при цьому до складу окремого модуля могли з часом входити й інші гени, якщо вони отримували сайт зв'язування білка гена-активатора даного модуля. Взаємовиключний характер експресії модулів генів (модульне виключення) встановився, імовірно, у результаті вбудовування сайтів транскрипційних репресорів, гени котрих підконтрольні одним модулям, у регуляторні області ключових генів альтернативних їм модулів та закріплення цих змін відбором. Таким чином, модульний та ієрархічний принципи будови генної мережі диференціації клітин відображають її еволюційне минуле.

Виходячи з того, що утворення нових генів та реаранжування їх регуляторних ділянок відбувались за участю транспозонів, внаслідок чого присутність послідовностей останніх у складі тих чи інших генів виглядає закономірною, ми висловлюємо ідею, що наявний у стовбурових клітинах специфічний набір miRNA репресує гени, відповідальні за подальші етапи дозрівання, оскільки вони містять послідовності, схожі з послідовностями мобільних елементів геному. Тому диференціація, починаючи від найбільш ранніх стадій, повинна потребувати репресії генів окремих miRNA з числа наявних у клітині.

Реконструкція генної мережі диференціації лімфоцитів. Як і очікувалось, генна мережа диференціації лімфоїдних клітин виявилась складеною з окремих модулів, експресія генів-активаторів яких самопідтримується завдяки наявності однієї чи кількох петель позитивного зворотного зв'язку. Наприклад, так забезпечується активність генів транскрипційних факторів T-bet та GATA-3, що координують, відповідно, експресію модулів Th1- та Th2-спеціалізації CD4⁺-клітин. Підтвердилась й ідея, що напрямок подальшого дозрівання визначається цитокіном, який, зв'язуючись з рецепторами клітини, викликає активізацію відповідального за даний напрямок модуля генів. Зокрема, сигналами, що ініціюють увімкнення Th1- або Th2-програми спеціалізації, є, відповідно, IFN або IL-4. Їх взаємодія з рецепторами активує гени транскрипційних факторів T-bet або GATA-3 при допомозі сигнальних молекул STAT1 або STAT6, відповідно. Також модуль генів, що виявляється активованим, прямо репресує модуль, відповідальний за альтернативний напрямок спеціалізації, чим досягається запропонований принцип “один етап диференціації - один модуль генів”.

Завдяки позитивному зворотному зв'язку підтримується і експресія гена транскрипційного фактора EBF1, що контролює відрізок шляху диференціації від стадії пре/проВ-клітин до стадії зрілих B-клітин. Це дає підстави вважати зазначений відрізок єдиним етапом В-лімфопоезу; його початкова стадія (пре/проВ-клітин) здійснюється одноосібно модулем генів, відповідальним за даний етап загалом, а наступні - субмодулями, функціонування яких координується білком Pax5, та деякими іншими залежними від нього транскрипційними факторами. Показово, що гени Pax5 та EBF1 підтримують експресію один одного.

Привертають увагу виявлені нами in silico в 3'-UTR-ділянці мРНК гена Foxp1 висококонсервативний сайт зв'язування мікроРНК miR-181 типу 7mer-m8 та консервативний сайт зв'язування miR-150, теж типу 7mer-m8.

Експресія miR-181, як відомо, проявляється вже у недиференційованих клітинах у кістковому мозку і підвищується у В-клітинах (у зрілих В-лімфоцитах вона припиняється), а експресія miR-150 знаходиться на високому рівні у зрілих Т- та В-лімфоцитах. Оскільки активність генів рекомбіназ Rag1 та Rag2 залежить від наявності фактора Foxp1, це дозволяє нам припустити, що їх тимчасова інактивація на стадії преВІ-клітин обумовлена сайленсингом мРНК фактора Foxp1 через вплив miR-181 за відсутності активної експресії гена, викликаної тимчасовим зникненням сигналу від рецептора IL-7. Даний механізм може відігравати важливу роль у перенацілюванні активності рекомбіназ з локусів гена важкого імуноглобулінового ланцюга на локуси генів легкого ланцюга. Остаточна інактивація генів рекомбіназ у зрілих В-лімфоцитів обумовлена, на наш погляд, в т.ч. і сайленсингом мРНК фактора Foxp1 через вплив miR-150. Водночас, у мРНК безпосередньо генів рекомбіназ Rag1 та Rag2 сайтів зв'язування даних miRNA нами виявлено не було.

Загалом, наявні у незрілих клітинах miRNA відіграють роль інгібіторів диференціації, викликаючи, принаймні на посттранскрипційному рівні, сайленсинг генів, що забезпечують дозрівання клітин. Зокрема, за допомогою програми TargetScan 4.2 було виявлено у 3'-UTR-ділянці мРНК генів факторів Bcl6 та MITF, відповідальних за стадію зрілих В-лімфоцитів, висококонсервативний сайт зв'язування мікроРНК miR-181 типу 7mer-1A. Тому молекулярною основою переходу клітини на зазначену стадію є, на наш погляд, репресія гена даної miRNA, внаслідок якої стає можливою експресія генів Bcl6 та MITF. Було виявлено також висококонсервативний сайт miR-223 типу 7mer-m8 у 3'-UTR-ділянці мРНК гена prdm1, котрий кодує ключовий фактор етапу плазмоцитів - білок Blimp1.

ВИСНОВКИ

Диференціація лімфоїдних клітин є складним багатостадійним процесом, здійснення якого забезпечується узгодженою активністю численних генів, внутрішньоклітинних та позаклітинних сигнальних каскадів, залученням епігенетичних механізмів регуляції експресії генів. У дисертаційній роботі запропоновано гіпотезу про будову і принципи функціонування генної мережі диференціації клітин, що включає у себе пояснення механізму RNAi-опосередкованого транскрипційного сайленсингу і алельного виключення. Основні положення даної гіпотези викладені у наступних висновках:

1. Частота зустріваності динуклеотидів 5'-CG-3' та тринуклеотидів 5'-CNG-3' у інтерферуючих РНК (siRNA та miRNA) набагато перевищує випадкову, а частка інтерферуючих РНК, цілковито позбавлених зазначених сайтів, становить лише 15-20%. Дані сайти комплементарні сайтам ДНК, у яких у ході транскрипційного сайленсингу, викликаного гібридизацією інтерферуючої РНК з ДНК, ініціюється метилювання залишків цитозину de novo.

2. Алельне виключення генів досягається через мічення одного з алелів епігенетичними маркерами репресії, ініціатором чого виступає молекула miRNA, котра утворюється в результаті процесингу некодуючого транскрипта алелів та зв'язується з їх ДНК. Алельне виключення виникло в процесі еволюції з метою репресії множинних копій мобільних елементів геному. Реставрація втраченої епігенетичної інформації та необмежений за тривалістю сайленсинг мобільних елементів геному забезпечуються метилюванням ДНК de novo, що ініціюється набором наявних у недиференційованих клітинах miRNA.

3. Генна мережа диференціації клітин складається з окремих елементарних функціональних одиниць - модулів генів, керованих позитивним зворотнім зв'язком і відповідальних кожен за свій окремий етап певного напрямку диференціації клітини за принципом “один етап диференціації - один модуль генів”. Еволюційною передумовою виникнення даної мережі було вбудовування сайтів транскрипційних факторів у регуляторні ділянки генів завдяки механізмам рекомбінації.

4. Реконструйована нами структура генної мережі, котра забезпечує дозрівання В-лімфоцитів, та генної мережі, яка координує завершальний етап спеціалізації Т-клітин, відповідає структурі, очікуваній у рамках гіпотези про будову генної мережі диференціації клітин.

5. Одним з найперших регуляторних рівнів при диференціації клітин є зміна спектру наявних у них miRNA, внаслідок якої уможливлюється експресія генів, відповідальних за процеси спеціалізації. Зокрема, молекулярною основою переходу лімфоцитів на стадію незрілих/зрілих В-клітин є припинення експресії гена мікроРНК miR-181.

6. Тимчасове пригнічення експресії генів рекомбіназ Rag1 та Rag2 на стадії преВІ-клітин обумовлюється сайленсингом мРНК фактора Foxp1 через вплив мікроРНК miR-181, а остаточна інактивація рекомбіназ на стадії зрілих В-лімфоцитів - сайленсингом даної мРНК через вплив мікроРНК miR-150.

Дані положення можуть бути перевірені експериментально, зокрема здатність miRNA зв'язуватись з комплементарними ділянками ДНК та ініціювати метилювання сайтів 5'-CG-3' і 5'-CNG-3' у них, і це буде завданням наступних досліджень.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Галицкий В.А. Детерминация и дифференцировка клеток: концепция кластеров генов // Цитология.- 2001.- Т.43, № 10.- С.913-925.

2. Галицький В.А. Пухлинний ріст - результат випадіння клітин з процесів диференціації // Вісник наукових досліджень.- 2001.- № 1 (21).- С.112-117.

3. Галицкий В.А. Старение и рост онкозаболеваемости: возможные молекулярные механизмы взаимосвязи // Пробл. старения и долголетия.- 2001.- Т.10, №2.- С.201-224.

4. Галицкий В.А. Канцерогенез и механизмы внутриклеточной передачи сигналов // Вопросы онкологии.- 2003.- Т.49, № 3.- С.278-293.

5. Галицкий В.А. Внутриклеточные и межклеточные пути передачи сигналов и возрастные изменения пролиферативной активности и интенсивности апоптоза клеток иммунной системы // Цитология.- 2005.- Т.47, № 4.- С.283-295.

6. Галицький В.А., Комісаренко С.В. Деякі механізми диференціації лімфоїдних клітин // Укр. біохім. журн.- 2007.- Т.79, №4.- С.5-17.

7. Halytskiy V.A. Hypothesis of initiation of DNA methylation de novo and allelic exclusion by small RNAs // Cell Tissue Biol.- 2008.- Vol. 2, No. 2.- P.97-106.

8. Галицький В. Кластери генів як складові елементи фрактальної структури генної системи, що контролює процеси диференціації та детермінації клітин // Тези доповідей 2-го Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених.- Тернопіль: Укрмедкнига, 1998.- C.36-37.

9. Halytskiy V.A. Cluster conception of cell differentiation // Conference on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology. Abstract book.- Kiev (Ukraine), 2001.- P.40.

10. Галицький В.А. Диференціація клітин з точки зору концепції кластерів генів та біологічний зміст стадій канцерогенезу // Укр. біохім. журн.- 2002.- Т.74, №4а (додаток 1).- С.34.

11. Halytskiy V.A. Determination of malignant or non-malignant phenotype of tumour cells.// Eur. J. Cancer Suppl.- 2004.- Vol. 2, № 1.- P.50-51.

12. Halytskiy V.A. Avoidance of transforming cells from differentiation as third stage of carcinogenesis // Proceedings of the 18^th Meeting of the European Association for Cancer Research.- Innsbruck (Austria), 2004.- P. 116-117.

13. Halytskiy V.A. Gene networks of cell differentiation and phenomenon of tumour growth // Ukrainian Biochem. J.- 2005.- Vol. 77, № 2 (special issue).- P.111.

14. Halytskiy V.A. The mathematical model of the gene network controlling terminal CD4⁺-lymphocytes differentiation // 1^st International Symposium on Methods and Applications of Computational Chemistry.- Kharkiv (Ukraine), 2005. - P.34.

15. Halytskiy V.A. Theoretical approach to tumour growth management // Proceedings of the 19^th Meeting of the European Association for Cancer Research.- Budapest (Hungary), 2006.- P. 282.

16. Halytskiy V.A. Modeling the gene network of cell differentiation // Differentiation.- 2006.- Vol. 74.- P. 476.

17. Галицький В.А. Генна мережа диференціації лімфоїдних клітин: відповідність теоретичним передбаченням.// Матеріали IX З'їзду Українського біохімічного товариства.- Харків, 2006.- С.15.

18. Halytskiy V.A. Small RNA can initiate DNA methylation de novo // Acta Biochimica Polonica.- 2007.- Vol. 54, Suppl., № 2.- P.5.3.

19. Halytskiy V.A. Mechanism of the initiation of DNA methylation de novo by small RNA // Eur. J. Cancer Suppl.- 2007.- Vol. 5, No. 4. - P. 75.

АНОТАЦІЯ

Галицький В.А. Біоінформатичний аналіз молекулярних механізмів диференціації лімфоїдних клітин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2008.

Дисертація має на меті встановлення загальних принципів будови генної мережі диференціації клітин та з'ясування участі мікроРНК у її функціонуванні, а також деталізації і реконструкції молекулярних механізмів лімфопоезу. Показано, що в інтерферуючих РНК (коротких інтерферуючих РНК та мікроРНК) частота зустріваності динуклеотидів 5'-CG-3' та тринуклеотидів 5'-CNG-3' набагато перевищує випадковий рівень. На підставі цього запропоновано механізми ініціації інтерферуючими РНК метилювання ДНК de novo та алельного виключення. Розглянуто еволюційні передумови та механізми виникнення генної мережі диференціації клітин. Висунуто концепцію модулів генів, згідно якої дана мережа повинна складатися з окремих елементарних одиниць (модулів генів), керованих позитивним зворотнім зв'язком і відповідальних кожен за свій окремий етап певного напрямку диференціації клітини. Реконструйовано структуру генної мережі В-лімфопоезу та завершального етапу Т-лімфопоезу. Встановлено можливу роль мікроРНК miR-181 та miR-150 у регуляції експресії генів рекомбіназ Rag1 та Rag2 і генів транскрипційних факторів Bcl6 та MITF. Узагальнено також імовірну роль мікроРНК у диференціації клітин та підтриманні стабільності їх геному.

Ключові слова: лімфоцит, диференціація клітин, генна мережа, модуль генів, мікроРНК, ремоделювання хроматину, епігенетичний маркер, транскрипційний сайленсинг, алельне виключення.

АННОТАЦИЯ

Галицкий В.А. Биоинформатический анализ молекулярных механизмов дифференцировки лимфоидных клеток. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2008.

Целью диссертации является установление базисных принципов строения генной сети дифференцировки клеток, раскрытие участия микроРНК в её функционировании, а также детализация и реконструкция молекулярных механизмов лимфопоэза. Мы выявили, что у интерферирующих РНК (коротких интерферирующих РНК и микроРНК) частота встречаемости динуклеотидов 5'-CG-3' и тринуклеотидов 5'-CNG-3' достоверно превышает случайный уровень, и лишь 15-20% интерферирующих РНК полностью лишены данных сайтов. Учитывая это, мы выдвинули гипотезу, что интерферирующие РНК, содержащие указанные ди- и тринуклеотиды, вызывают транскрипционный сайленсинг генов, связываясь с комплементарными участками ДНК и инициируя метилирование de novo находящихся в их составе сайтов 5'-CG-3' и 5'-CNG-3'. Мы предполагаем, что аллельному исключению подвергается ген, в котором транскрибируются обе цепи ДНК, и транскрипт хотя бы одной из них является предшественником микроРНК, зрелая форма которой с данной цепью связывается. Так как РНК-полимераза должна при транскрипции освобождать ДНК от присоединившейся микроРНК, количества микроРНК, транскрибируемой только с одного аллеля, не достаточно для его репрессии de novo. Однако, если в клетке функционируют два аллеля гена или больше, концентрация считываемой с них микроРНК преодолевает уровень, необходимый для инактивации аллелей, за исключением наиболее активно транскрибируемого. Вероятно, аллельное исключение возникло в ходе эволюции с целью репрессии множественных копий мобильных элементов генома. Последовательность, отвечающая за аллельное исключение локусов иммуноглобулиновых генов и кодирующая соответствующую микроРНК (или управляющая её синтезом), возможно, находится в спейсере, ограниченном ближайшими соседствующими V- и (D)J-сегментами.

Дифференцировка клеток осуществляется генной сетью, которая состоит из элементарных функциональных единиц (модулей генов), отвечающих каждая за свой отдельный этап определённого направления специализации клетки. В состав модуля генов, по нашему предположению, входят: (а) ген-активатор, поддерживающий как собственную экспрессию (положительная обратная связь), так и экспрессию остальных генов модуля, (б) контролирующие гены, способные подавлять экспрессию генов других модулей, (в) дифференцирующие гены, продукты которых отвечают за реализацию определённого этапа специализации клетки. Выбор направления дальнейшей дифференцировки определяется активацией соответствующего ему модуля генов сигналом клеточного рецептора, образующимся в ответ на воздействие цитокина. Модули генов возникали в процессе эволюции, вероятно, вследствие встраивания сайтов транскрипционных факторов в регуляторные участки генов при помощи транспозонов.

Реконструированная нами генная сеть В-лимфопоэза и завершающего этапа Т-лимфопоэза продемонстрировала правильность предложенных идей о строении и функционировании генных сетей клеточной дифференцировки. Также было установлено, что некоторые микроРНК способны препятствовать созреванию клеток, в частности были выявлены сайты связывания miR-181 в 3'-UTR-участках мРНК генов факторов Bcl6 и MITF. Поэтому репрессия гена данной микроРНК является одной из молекулярных основ перехода клеток на стадию незрелых/зрелых В-лимфоцитов. Кроме того, мы обнаружили сайты связывания микроРНК miR-181 и miR-150 в 3'-UTR-участке мРНК гена фактора Foxp1. Это обстоятельство может означать, что временное подавление экспрессии генов рекомбиназ Rag1 и Rag2, наблюдаемое на стадии преВІ-клеток при перенацеливании активности рекомбиназ с локусов гена тяжелой иммуноглобулиновой цепи на локусы генов лёгких цепей, обусловлено сайленсингом мРНК фактора Foxp1 под воздействием miR-181, тогда как окончательная инактивация генов рекомбиназ на стадии зрелых В-лимфоцитов - сайленсингом данной мРНК вследствие воздействия miR-150.

Реставрация утраченной эпигенетической информации, неограниченный по продолжительности сайленсинг транспозонов и, соответственно, высокий уровень стабильности генома должны достигаться метилированием ДНК de novo, инициируемым набором микроРНК, присутствующих в стволовых клетках. Но так как определённые микроРНК репрессируют и гены, отвечающие за дальнейшие этапы клеточной специализации, если эти гены содержат последовательности, сходные с последовательностями транспозонов, репрессия генов данных микроРНК оказывается необходимой для дифференцировки клеток.

Ключевые слова: лимфоцит, дифференцировка клеток, генная сеть, модуль генов, микроРНК, ремоделирование хроматина, эпигенетический маркер, транскрипционный сайленсинг, аллельное исключение.

SUMMARY

Halytskiy V.A. Bioinformatical analysis of molecular mechanisms of lymphoid cell differentiation. - Manuscript.

Thesis for a PhD degree in biological sciences on specialty 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

The main aims of the thesis are the investigation of basic structure of cell differentiation gene network, the discovery of microRNA role in functioning of this network as well as the elaboration and reconstruction of molecular mechanisms of the lymphopoiesis. These findings show that 5'-CG-3' and 5'-CNG-3' sites are discovered in interfering RNAs (short interfering RNAs and microRNAs) more often than they should be found in random sequence. Mechanisms of initiation of DNA methylation de novo and allelic exclusion by interfering RNAs were proposed on this basis. Evolution backgrounds and mechanisms of the origin of cell differentiation gene network were examined. We proposed gene module concept, according to which this network consists of elementary units (gene modules), which are specific only for certain stage and direction of cell differentiation and are controlled by positive feedback. Structure of the gene network of B-lymphopoiesis and terminal stage of T-lymphopoiesis was reconstructed. It was determined possible role of the microRNAs miR-181 and miR-150 in regulation of gene expression of recombinases Rag1 and Rag2 as well as transcription factors Bcl6 and MITF. Possible role of microRNAs in cell differentiation and genome stability maintenance was also summarized.