Поширення і характеристика криптичних плазмід Еrwinia carotovora

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

УДК 579.842.1/.2:579.252

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ПОШИРЕННЯ І ХАРАКТЕРИСТИКА КРИПТИЧНИХ ПЛАЗМІД ERWINIA CAROTOVORA

03.00.07 - мікробіологія

СЕРГЄЄВА ЖАННА ЮРІЇВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова та у відділі молекулярної генетики бактеріофагів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Товкач Федір Іванович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу молекулярної генетики бактеріофагів

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, проф., член-кор. НАН України,

Коваленко Надія Костянтинівна,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фізіології промислових мікроорганізмів

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Козировська Наталія Олексіївна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, відділ регуляторних механізмів клітини

Захист відбудеться „18” листопада 2009 року о 12 годині на засіданні

Спеціалізованої вченої ради Д26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: Д03680, м. Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий « » жовтня 2009 року.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

криптичний плазміда бактеріофаг

Актуальність теми. Фітопатогенний вид Erwinia carotovora являє собою складний таксон, який містить штами з різноманітними фенотиповими, біохімічними та генетичними характеристиками [Kotoujansky, 1987]. Ця бактерія є одним із найбільш економічно важливих фітопатогенів і може завдавати значних збитків аграрному виробництву. Завдяки широкому розповсюдженню в оточуючому середовищі та здатності інфікувати широке коло рослин - хазяїв E. carotovora є зручною модельною системою для вивчення екології та генетичних основ патогенності представників родини Enterobacteriaceae [Kotoujansky, 1987]. В лабораторних умовах E. carotovora здатна викликати м`яку гниль тканин багатьох рослин, але в природних умовах спостерігається вузька адаптація підвидів ервіній до специфічних хазяїв [Bouma, Lenski, 1988; Suyama, Bork, 2001].

Причетність таких автономних генетичних елементів (АГЕ) як плазміди та бактеріофаги до формування нових варіантів бактерій, більш адаптованих до умов оточуючого середовища, за рахунок горизонтального перенесення генів патогенності є безперечним науковим фактом сучасної бактеріології, а також одним з аспектів загальнобіологічної проблеми, безпосередньо пов'язаної з горизонтальним потоком генів у бактеріальних популяціях і асоціаціях. Завдяки перенесенню генів між спорідненими бактеріями, які заселяють певну екологічну нішу розширюються їх адаптивні можливості, а також з'являються нові штами і формується біорізноманіття [Дэвис и др., 1984; Sherley et al., 2003].

Відомо, що прояв патогенності у ентеробактерій має безпосереднє відношення до автономних генетичних елементів. На теперішній час найбільш ґрунтовно досліджено АГЕ інфекційно небезпечних бактерій, де їх причетність до патогенних процесів не викликає ніякого сумніву. У E.carotovora до сих пір не було визначено жодної із генетичних детермінант, відповідальних за адаптаційну спроможність та патогенний потенціал, пов'язаних з плазмідами, фагами або, наприклад, з островами патогенності.

В зв'язку з цим дисертаційна робота була спрямована на дослідження криптичних плазмід штамів E. carotovora різного походження, а також виявлення в геномі плазмід факторів патогенності, бактеріоциногенності та елементів, які мають відношення до профагів.

Дисертаційна робота виконувалась на основі теоретичної концепції ії керівника, д.б.н. Товкача Ф. І., про причетність плазмідних детермінант до формування патогенності і підсилення адаптаційної спроможності серед штамів E. carotovora, які спільно заселяють одну і ту ж екологічну нішу [Perombelon, 1992; Toth et al., 2003; Товкач, 2001].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідної теми „Молекулярна генетика та екологічна роль мегаплазмід фітопатогенної бактерії Erwinia carotovora” (реєстраційний номер 0107V006874) Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова та бюджетної теми відділу молекулярної генетики бактеріофагів Інституту мікробіології і вірусології НАН України „Молекулярно-генетична організація та біотехнологічне застосування лізогенних систем Erwinia carotovora” (реєстраційний номер 0105U000788).

Мета і задачі дослідження. Основною метою роботи було дослідження молекулярно-біологічних властивостей криптичних плазмід фітопатогенної бактерії E. carotovora. Відповідно до мети вирішували наступні завдання:

- виділити та охарактеризувати плазміди штамів E. carotovora різного походження;

- провести порівняльний аналіз плазмід E. carotovora великого розміру;

- охарактеризувати бактеріофаг NF16, специфічний щодо плазмідного штаму E. carotovora 33А;

- дослідити властивості плазміди рСА25 E. carotovora 48А;

- провести рестрикційний аналіз та фізичне картування плазміди рСА25.

Об'єкт дослідження - криптичні плазміди фітопатогенної бактерії E. carotovora.

Предмет дослідження - властивості криптичних плазмід E. carotovora, їх відношення до патогенності та роль у екології і фізіології ервіній.

Методи дослідження - вірусологічні, мікробіологічні, генетичні, молекулярно-біологічні, біохімічні; комп'ютерна обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі встановлено зв'язок між утриманням плазмід штамами E. carotovora різного походження та їх належністю до певного географічного ареалу. Вперше з'ясовано, що найбільш поширеною групою серед плазмід ервіній є плазміди розміром 9,8 т.п.н. та їх природні делеційно-інсерційні варіанти (8,7 - 10,4 т.п.н.).

Вивчено вплив автономних генетичних елементів ервіній на чутливість клітин до бактеріофагів ZF40 с5/5, Т4 і Р1. Доведено відсутність зв'язку між плазмідоутриманням та кілерною активністю каротоворіцинів штамів E. carotovora.

Здійснено порівняльний рестрикційний аналіз плазмід великого розміру (129 т.п.н.) з трьох штамів E. carotovora різного походження, а також фагової і плазмідної ДНК плазмідовмісного штаму E. carotovora 33А. Показано, що між плазмідними ДНК ервіній великого розміру, а також між послідовностями ДНК плазміди рСА16-1 та бактеріофагу NF16, відсутня гомологія.

За допомогою рестрикційного аналізу, вперше показано, що плазміди E. carotovora із найбільш поширеного розмірного класу 9,8 т.п.н. співпадають за первинною послідовністю.

Здійснено фізичне картування позахромосомного елемента рСА25 E. carotovora і його транспозонного варіанта рСА25::Tn9. Побудовано рестрикційну карту плазміди для ендонуклеаз HpaІ, BglI, EcoRV, EcoRI і PstI, а також встановлено місце вбудовування транспозона Tn9 у плазмідну ДНК. Висловлено припущення щодо профагового походження елемента рСА25.

Практичне значення одержаних результатів. Одержана в роботі плазміда рСА25::Tn9 E. carotovora штаму 48А-7/4b може бути використана для конструювання векторних систем переносу генетичної інформації і експресії чужорідних генів в клітинах ервіній.

Результати та висновки щодо плазмід різного розміру та виділених з різних географічних ареалів створюють підґрунтя для розуміння проявів та розвитку патогенного процесу у E. carotovora за різних умов оточуючого середовища.

Методи виділення і дослідження плазмід E. carotovora застосовувалися на I-IV літніх школах «Молекулярна мікробіологія і біотехнологія», які проводились на базі Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова, та ввійшли до методичних вказівок до проведення IV літньої школи.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, обробка та аналіз одержаних даних здійснено безпосередньо здобувачем. Автором проведено скрінінг штамів E. carotovora subsp. carotovora і Е. carotovora subsp. atroseptica на наявність позахромосомних ДНК, проведено рестрикційний аналіз виявлених плазмід. Одержано фаг NF16 із плазмідовмісного штаму Е. carotovora 33А та проведено порівняльний рестрикційний аналіз фагової і плазмідної ДНК. Виявлено дисоціанти плазмідовмісного штаму та здійснено дослідження впливу плазміди рСА 16-1 на патогенність Е. carotovora.

Одержання делеційних плазмідних варіантів, дослідження стабільності успадкування плазміди рСА25, а також вивчення транспозиції проведено спільно зі старшим науковим співробітником відділу молекулярної генетики бактеріофагів ІМВ НАН України, к.б.н. Т. Ю. Горб і асистентом кафедри мікробіології, вірусології і імунології Львівського національного медичного університету, к.б.н. Л. М. Буровою, які є співавторами відповідних публікацій.

Планування напрямку роботи, формулювання основних положень і висновків дисертаційної роботи проведено під керівництвом д.б.н. Ф. І. Товкача.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи доповідались на міжнародних конференціях: „Мікробні біотехнології” (Одеса, Україна, 2006), Російській школі-конференції „Генетика микроорганизмов и биотехнология”, присвяченій 100-річчю від дня народження С.І. Аліханяна (Пущино, Росія, 2006), The young scientists` and students` International scientific conference „Modern problems of microbiology and biotechnology” (Odessa, Ukraine, 2007), „Биоресурсы и вирусы” (Київ, Україна, 2007), 11-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених „Биология - наука XXI века” (Пущино, Росія, 2007), Міжнародній конференції «ELIAVA - 2008: Phage Biology, Ecology and Therapy Meeting» (Tbilisi, Georgia, 2008), IV Міжнародній науковій конференції «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, Україна, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 робіт, з них 4 статті в фахових виданнях, 1 стаття в збірнику і 6 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка має 4 розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, списку використаних літературних джерел, що охоплює 164 найменування. Дисертацію викладено на 136 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 37 рисунків і 7 таблиць.

Огляд літератури

В огляді літератури, який складається з двох підрозділів, представлено загальну характеристику плазмід і описано плазміди бактерій, асоційованих з рослинами. Огляд літератури обґрунтовує доцільність виконання роботи.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

В роботі були використані такі бактерії і бактеріофаги: 60 штамів E. carotovora subsp. сarotovora (Есс), 4 штами E. carotovora subsp. atroseptica, 2 штами Erwinia sp., 3 штами Escherichia сoli, 1 штам Agrobacterium tumefaciens; коліфаги Р1, Т4, ервініофаги clear-мутант ZF40с_5/5 [Панщина, Товкач, 2006], ZF40/421 [Кушкина, 2007]; NF16, бактеріоцин MCTV25.

Для вирощування бактерій і одержання бактеріофагів використовували повноцінні і мінімальні середовища [Миллер, 1976].

Всі дослідження з бактеріями, плазмідами, бактеріофагами і бактеріоцинами проводили згідно стандартних протоколів [Миллер, 1976; Маниатис и др., 1984; Товкач, 2001].

Виділення фагової ДНК здійснювали детергент-фенольним методом [Товкач и др., 1988]. Плазмідну ДНК виділяли лужним методом [Kado, Liu, 1981].

Для рестрикційного аналізу плазмідної та фагової ДНК були використані ендонуклеази рестрикції: HindIII, SalI, PstI, BamHI, HpaІ, EcoRI, BglI і EcoRV.

Для встановлення фагочутливості штамів E. carotovora на верхній шар напіврідкого агару, який містив бактеріальні клітини, наносили фаголізат у об'ємі 5 мкл. Після висихання рідини чашки культивували 24 години при 28^оС. Облік результатів проводили після утворення негативних зон лізису на газоні культури.

При електронно-мікроскопічному дослідженні фагові частки контрастували 2%-вим уранілацетатом, спостерігали і фотографували при інструментальному збільшенні 36 000- 40 000 на електронному мікроскопі Jeol модель JEM 1400.

Для отримання плазміди рСА25::Tn9 використовували оригінальний метод інкорпорації транспозона Tn9 [Сергеева и др., 2006]. Для цього на газон з бактеріальними клітинами E. carotovora штама 48А з плазмідою рСА25 наносили 5 мкл суспензії з коліфагом Р1 (1-2Ч10⁹ БУО/мл). Після висихання рідини чашки культивували перевернутими 18-24 год при 28^оС. Верхній агар в місцях негативних зон лізису вирізали та переносили в 2-3 мл бульйону LB. Після інкубування при температурі 28 °С протягом 2-5 год культури висівали на чашки з повноцінним середовищем, яке містило хлорамфенікол у концентрації 20 мкг/мл. Отримані бактеріальні клони пересівали на чашки зі збільшеною концентрацією антибіотика. Так як у бактерій, які містять транспозон у складі плазміди, доза гена хлорамфеніколацетилтрансферази є підвищеною, вони здатні переживати значні концентрації антибіотика. Транспозонмічені клони були відібрані в умовах більш суворого селективного пресу, ніж Р1-трансдуктанти. Клони, які несли плазміду рСА25::Tn9, виживали при концентраціях хлорамфеніколу 100 мкг/мл і більше. Р1-трансдуктанти при цих концентраціях антибіотика гинули. Остаточне внесення транспозона Tn9 у плазміду рСА25 перевіряли за допомогою методу електрофоретичного розділення плазмідних ДНК.

Для одержання штамів-дисоціантів на газон з бактеріальними клітинами вихідного штаму наносили 5 мкл кожної фракції бактеріоцину MCTV25. Після висихання рідини чашки культивували 18-24 год при 28^оС. Верхній агар в місцях негативних зон лізису зі стійкими до бактеріоцину клітинами вирізали та переносили в 2-3 мл бульйону LB. Після інкубування при температурі 28°С протягом 2-5 год з культур формували газон і наносили 5 мкл фракцій бактеріоцину MCTV25. Процедуру повторювали до зникнення негативних зон лізису на газоні (10-12 циклів).

Фагові капсиди розділяли в нативній системі з використанням гелів агарози в 40 мМ тріс-фосфатному буфері, рH 7,8 без додавання Nа₂ЕДТА.

Для визначення ступеня патогенності досліджуваних штамів Есс використовували комерційний сорт картоплі (Solanum tuberosum) «Синеглазка». Асептично приготовлений шматочок бульби інфікували 100 мкл висококонцентрованої суспензії бактеріальних клітин. Шматочки інкубували в закритих стерильних чашках Петрі впродовж однієї доби при кімнатній температурі. Патогенність штамів оцінювали за ступенем і характером мацерації рослинних тканин [Zink et al., 1985].

Рослини каланхое Дегремона (Kalanchoe daigremontiana) заражали шляхом ін`єкції у рослинну тканину листя рідкої суспензії добових культур вихідного штаму Есс 33А та його дисоціантів, а також контрольного штаму A. tumefaciens С58 у об'ємі 100-200 мкл.

Статистичну обробку даних проводили з використанням стандартних таблиць Exel, а також комп'ютерних програм TotalLab, Gel-Pro-Analyzer і Vector NTI.

Розділ 3. Загальна характеристика плазмід

Erwinia carotovora

В результаті вивчення плазмідного складу 54 штамів E. carotovora різного походження було виявлено, що приблизно 30% із них утримують плазміди (табл. 1). Як і було показано для ервіній раніше, розміри цих плазмід попадають у діапазон від, приблизно, 3,8 т.п.н. до 129 т.п.н. Клітини деяких штамів можуть утримувати декілька позахромосомних елементів. Найчастіше мегаплазміди розміром від 50 т.п.н. до 129 т.п.н. супроводжує невелика плазміда. В одному випадку виявити плазмідовмісність штаму було неможливо через наявність у бактеріальних клітинах високої нуклеазної активності.

Альтернативним до LB для вирощування ервіній є середовище з пектином. При подальшому використанні для виділення плазмідних ДНК клітин E. carotovora, які виросли на 1% рідкому пектині, ми спостерігали, що позахромосомні ДНК виділяються набагато краще, ніж з клітин, що виросли на LB. При цьому бактеріальна хромосома майже повністю видаляється розчином, що є дуже важливим, особливо при подальшому використанні зразків для проведення рестрикційного аналізу.

Отже, ці досліди показали, що виділення плазмід E. carotovora лужним методом є адекватним, і отримані таким чином плазмідні ДНК є придатними для подальших молекулярно-генетичних досліджень.

Таблиця 1. Утримання плазмід штамами E. carotovora

Штам E. carotovora	Плазміда	Довжина молекули, т.п.н.	Географічне походження
75	рСА 75	9,8	Росія
718	рСА 718	9,8	Росія
566 ВКМ	рСА 566	9,8	Росія
246	рСА 246	9,8	Росія
2	рСА 2	9,8	Росія
184	рСА 184	6,8	Україна
921	рСА 921	10,4	Вірменія
G147	рСА 147	9,8	Румунія
495	рСА 495	5,8	Росія
NCPPB 312T	рСА 312-1 рСА 312-2	64,5 3,8	Чехія
NCPPB 549T	рАТ 549-1 рАТ 549-2	129 47,7	Бельгія
9 Ф	рАТ 9	16,7	Росія
3`	рСА 3`	4,8	Україна
16`	рСА 16`	6,8	Україна
23`	рСА 23`	8,7	Україна
89++	рСА 89	15,5	Білорусь

За розміром виявлені плазміди ервіній можна розподілити на чотири дискретні класи: 3,8-6,8; 8,7-16,7; 47,7-64,5 і 129 т.п.н. Приблизно 60% виділених плазмід відносяться до другого дискретного класу і більшість з них має розмір 9,8 т.п.н. Цей розмір співпадає з розміром позахромосомного елемента рСА25 (рис. 1).

Наступними за частотою виявлення в клітинах ервіній є великі плазміди та мегаплазміди розміром до 129 т.п.н. включно. (рис. 2). Наявність плазмід розміром 47,7 і 64,5 т.п.н. виявлено в одиничних випадках. Плазміда довжиною 47,7 т.п.н. є характерною для штама Е. atroseptica NCPPB 549^Т = ATCC 33260^T (рис. 2, доріжка 5). На відміну від попередніх даних стосовно того, що мегаплазміди у бактеріальних клітинах Е. carotovora часто супроводжує одна або декілька саме невеликих плазмід, у випадку штама NCPPB 549^Т клітини несуть мегаплазміду розміром 129 т.п.н. і плазміду 47,7 т.п.н. Іншим виключенням є плазміда розміром 64,5 т.п.н. (рис. 2, доріжка 4), виділена із штаму Е. carotovora ATCC 15713^T = NCPPB 312^T. Наявність у ервіній плазміди такого розміру показано вперше. В клітинах цього штаму також присутня плазміда розміром 3,8 т.п.н.

В літературі відсутні дані стосовно наявності зв'язку між екологією штамів E. carotovora та утриманням ними плазмід. В нашому дослідженні вперше було виявлено, що плазміди одного і того ж самого розмірного класу зустрічаються у штамах, виділених з певного географічного ареалу (табл. 1). Половина штамів, які мають плазміду розміром 9,8 т.п.н. або її природні делеційно-інсерційні варіанти, були з російських колекцій. Інші штами цієї групи невеликих плазмід були з України, Вірменії та Румунії. Штами ервіній з Канади виявились безплазмідними. За одиничним виключенням білоруські штами, які використовувались в даному дослідженні, також не утримували позахромосомних плазмідних ДНК. Великі плазміди були виявлені виключно у штамах з чеської та бельгійської колекцій мікроорганізмів.

В цьому дослідженні ми також вивчали можливу причетність позахромосомних генетичних елементів E. carotovora до формування чутливості бактеріальних клітин до бактеріофагів ZF40 с5/5 E. carotovora, Р1 і Т4 E. coli. Результати показали, що 25% плазмідних і 37% безплазмідних штамів E. carotovora чутливі до інфікування ервіній фагом ZF40 с5/5. При цьому серед плазмідовмісних штамів були переважно ті, що несли невеликі плазміди розміром 4,8 - 6,8 т.п.н. Виявлено також, що 70% штамів, чутливих до кілерної дії фага Т4 E. coli, утримують плазміди. Більшість штамів при цьому мала плазміди розміром 9,8 т.п.н. Цікавим є той факт, що не дивлячись на наявність чи відсутність позахромосомних ДНК, штами E. carotovora стосовно чутливості до бактеріофагів ZF40 с5/5 і Т4 розділились на дві групи: серед тих, які виявили чутливість до фага ZF40 с5/5, майже не було таких, які були чутливі до фага Т4, і навпаки. Але були і такі штами E. carotovora, і саме плазмідовмісні штами, які виявляли одночасно чутливість до двох або трьох бактеріофагів. Наприклад, штам E. carotovora G147, який має плазміду розміром 9,8 т.п.н., виявився чутливим до бактеріофагів Р1 і Т4. Інший штам Е. atroseptica 9Ф, який має позахромосомну ДНК розміром 16,7 т.п.н., виявив чутливість до усіх використаних нами бактеріофагів. Особливо привертає до себе увагу той факт, що серед безплазмідних штамів ервіній не було жодного випадку виявлення множинної чутливості до бактеріофагів. Невелика група штамів виявилась чутливою до вбивства ззовні фагом Р1. Співвідношення між штамами, клітини яких містять плазміди, і безплазмідними штамами у цьому випадку не розрізнялось. Серед штамів бактерій, які мають великі плазміди, не виявлено жодного штаму, чутливого до бактеріофагів ZF40 с5/5, Т4 і Р1.

В подальших дослідженнях ми не виявили зв'язку плазмідного спектру штамів E. carotovora з кілерною активністю каротоворіцинів, які вони синтезують при лізогенній індукції клітин [Горб, Товкач, 1997; Товкач, Муквич, 2003]. При цьому виявилось, що до кожної групи різних за активністю бактеріоцинів входять штами, які мають плазміди різного розміру. Отже, це показує, що розмір позахромосомного елемента штаму не корелює з активністю його бактеріоцина. Як контроль у кожній групі ми використовували безплазмідні штами з аналогічним спектром кілерної активності. Встановлено, що наявність або відсутність у штамі плазміди не спричиняє впливу на активність каротоворіцинів. Ці дані підтверджують припущення стосовно того, що позахромосомні елементи E. carotovora не несуть гени, які кодують синтез каротоворіцинів.

Ми провели порівняльне вивчення внутрівидового розподілу плазмід за молекулярною масою для двох представників родини Enterobacteriaceae -- E. coli і E. carotovora [Sherley et al., 2003]. При цьому було виявлено, що плазмідні профілі цих бактерій суттєво відрізняються. Найбільш розповсюдженою групою плазмід для досліджених штамів E. coli є плазміди, які входять до класу з діапазоном розмірів 64-128 т.п.н. Плазміди досліджених нами штамів E. coli також входять до класів з діапазоном розмірів 2-4 т.п.н. і 32-64 т.п.н. Характерним показником для плазмідного профілю ервіній є наявність великих плазмід 129 т.п.н., які не зустрічаються у штамах E. coli. Крім того плазміди ервіній також попадають у класи з діапазонами розмірів 4-8 т.п.н. і 8-16 т.п.н., які є нехарактерними для плазмідних профілів E. coli.

Таким чином, утримання плазмід є широко розповсюдженим явищем для фітопатогенної бактерії E. carotovora. Це явище пов'язане з географічним ареалом, в якому персистують бактерії. Не виключена можливість того, що плазміди можуть бути причетні до формування фагових рецепторів. Але позахромосомні елементи ервіній не впливають на активність каротоворіцинів, які продукують штами.

Розділ 4. Дослідження мегаплазмід

Erwinia carotovora та бактеріофага nf16

Мегаплазміди було виявлено у трьох штамах E. carotovora subsp. carotovora і одному штамі E. carotovora subsp. atroseptica (рис. 3) [Товкач, 2001]. Не дивлячись на різне походження штамів 33А, С366, NCPPB 312^T і NCPPB 549^T, всі вони несуть великі плазміди, три з яких мають абсолютно однаковий розмір -- 129 т.п.н., і одна, унікальна за розміром, зі штаму NCPPB 312^T -- 64,5 т.п.н.

В результаті проведення рестрикційного аналізу мегаплазмід чотирьох штамів Е. carotovora ендонуклеазами SalI, HpaI і EcoRI було виявлено, що кожна ДНК великої плазміди має унікальну первинну послідовність (рис. 4).

Через наявність в клітинах штамів декількох плазмід ми порівнювали ті фрагменти на електрофореграмі, які входять у діапазон розмірів від 25 до 9 т.п.н., бо саме вони представляють собою фрагменти гідролізу мегаплазмід. В усіх випадках, крім одного, на плазмідних ДНК є сайти рестрикції для кожної із зазначених ендонуклеаз рестрикції -- SalI, HpaІ і EcoRI. Усі отримані фрагменти рестрикції мегаплазмід не співпадають за розміром, розташуванням та кількістю. Враховуючи той факт, що усі мегаплазміди були виділені з різних географічних ареалів, неспівпадання їх первинних послідовностей може свідчити про те, що ці мегаплазмідні ДНК є унікальними і можуть відігравати важливу роль в екології ервіній, підвищуючи рівень їх адаптації до умов оточення. В перспективі було б важливо знати про вплив цих плазмід на підвищення патогенного потенціалу бактерій.

Бактерія Е. carotovora являє собою полілізогенну систему [Товкач, 2002]. Багато штамів цього виду одночасно несуть декілька різних автономних генетичних елементів, таких як плазміди чи помірні профаги. Клітини Е. carotovora штаму 33А, який має мегаплазміду рСА16-1, є псевдолізогенними по бактеріофагу NF16 і після індукції бактеріоцинами починають продукувати фагові частки [Товкач, Бурова, 2004].

Частки індукованого бактеріофага NF16 ми концентрували за допомогою іонообмінної хроматографії на DEAE-целюлозі. В результаті були одержані різні фракції очищеного бактеріофага. Після встановлення наявності опалесценції у певних фракціях ми проводили їх електрофоретичне дослідження, щоб остаточно встановити пікову фракцію. Вихід фага NF16 Е. carotovora при елюції 0,25М розчином NaCl виявився вищім за вихід, як ми припустили, іншого варіанта фага елююваного з колонки 0,4М розчином NaCl.

Порівняння картин рестрикції генома бактеріофага NF16 і генома іншого ервініофага ZF40/421 [Кушкіна, 2007], отриманих з використанням ендонуклеаз HpaІ, EcoRI, PstI, HindIII і BamHI, показало, що геном бактеріофага NF16 фракції NF16/0,4М NaCl співпадає за рестрикційною картиною з геномом фага ZF40/421 (рис. 5). При цьому геном бактеріофага NF16 фракції NF16/0,25М NaCl, відрізняється за картиною рестрикції від генома фага ZF40/421 і, можливо, представляє собою дискретно пермутований геном [Панщина, Товкач, 2006]. На доріжках можна побачити, що геноми обох фагів мають ідентичні фрагменти ДНК, однак на рестрикційній картині фага NF16 фракції NF16/0,25М NaCl у верхніх частинах доріжок мають також додаткові фрагменти ДНК (рис. 5, доріжки 1, 4, 8, 12, 15).

Можливу причетність мегаплазміди рСА16-1 (129 т.п.н.) до профагового геному NF16 було перевірено за допомогою їх порівняльного рестрикційного аналізу ендонуклеазами рестрикції HpaІ и BamHI (рис. 6).

На наявність можливої гомології первинної послідовності фагового і мегаплазмідного геномів було досліджено обидві фракції фага NF16, а також ервініофаг ZF40/421, геном якого має лише деякі відмінності від генома фага NF16. В результаті аналізу отриманих картин рестрикції було встановлено, що геноми мегаплазміди рСА16-1 і бактеріофага NF16, а також бактеріофага ZF40/421, відрізняються за первинною послідовністю і не мають ідентичних за розміром і рухливістю фрагментів ДНК. Таким чином, плазміда рСА16-1 не споріднена до фага NF16.

Мегаплазміди фітопатогенної бактерії E. carotovora є криптичними і їх роль у екології ервіній невідома, то ж ми вирішили перевірити, чи здатні вони викликати появу пухлин на сприйнятливих рослинах. Через те, що клітини E. carotovora після інфекції викликають у рослинах розвиток швидкої та сильної реакції гіперчутливості, а також генералізовану інфекцію усієї рослини, нам спочатку необхідно було отримати штами-дисоціанти E. carotovora 33А, які б не викликали реакції гіперчутливості, або мали б незначний вплив на тканину рослини-індикатора. Дисоціанти були одержані шляхом селекції бактерій стійких до дії макромолекулярних каротоворіцинів штама Есс 48А [Товкач, 2002].

Далі проводили зараження рослин каланхое Дегремона (Kalanchoe daigremontiana) шляхом ін`єкції у рослинну тканину рідкої суспензії добових культур вихідного штаму Е. carotovora 33А, його дисоціантів 1/1, 1/2, 2/1, 2/2, 2/3, 3/1, 3/2 і контрольного, в плані відсутності плазміди великого розміру, штаму Е. carotovora 50RІ. Нашою метою було з'ясувати, чи здатні клітини Е. carotovora провокувати появу пухлин на рослинах каланхое і чи мають відношення до цієї властивості мегаплазміди ервіній. Як контроль ми використовували бактерію A. tumefaciens, яка провокує появу корончатих галів, трансформуючи рослинні клітини, завдяки експресії генів вірулентності її мегаплазмідної ДНК.

У рослин, які були інфіковані клітинами вихідного штама Е. carotovora 33А вже на 1-2 тижні виявляли генералізовану інфекцію рослини. При зараженні рослин каланхое суспензіями дисоціантів (окрема рослина для кожного) генералізована інфекція не проявлялася. Також не було виявлено різниці між усіма штамами-дисоціантами у проявах реакції гіперчутливості в місці ін'єкції бактеріальної суспензії та процесах порушення рослинної тканини. В усіх дисоціантів рівень реакції гіперчутливості був однаковим. В результаті вивчення впливу мегаплазміди рСА16-1 на формування патогенності у Е. carotovora штам 33А, було з'ясовано, що клітини ервіній не здатні провокувати появу корончатих галів чи інших проявів трансформації на рослинах каланхое Дегремона.

Розділ 5. Властивості плазміди рса25 та її варіантів

При проведенні скрінінгу штамів E. carotovora на наявність плазмід ми виявили, що більшість невеликих за розміром позахромосомних ДНК мають розмір 9,8 т.п.н. або близький до нього. У штамі E. carotovora 48А у попередніх дослідженнях було виявлено і вивчено позахромосомний елемент рСА25 (рис. 7). Раніше було зроблено припущення про можливе профагове походження плазмід ервіній, а саме плазміди рСА25 E. carotovora штаму 48А [Бурова и др., 2007]. З іншого боку, як було показано, лише штам E. carotovora 48А проявив сприйнятливість до трансдукції фагом Р1, що дозволило маркувати плазміду pCA25 транспозоном Tn9 (штам 48А-7/4b, плазміда рСА25::Tn9) (рис. 7).

Плазміди E. carotovora розміром 9,8 т.п.н. є найпоширенішою групою плазмід серед штамів ервіній. Більшість штамів E. carotovora з плазмідами цього розмірного класу були виділені з одного географічного ареалу. Через те, що до цього розмірного класу також відноситься і найбільш досліджений позахромосомний елемент рСА25, який, на нашу думку, має профагове походження, було запроваджено рестрикційний аналіз для дослідження спорідненості між ними.

При проведенні рестрикційного аналізу ендонуклеазою HpaІ ми виявили, що рестрикційна картина плазмід розміром 6,8 т.п.н., виявлених у двох штамах ервіній 184 і 16`, відрізняється від рестрикційної картини, яка є характерною для плазмід інших досліджених штамів.

Для плазмід, які мають розмір 9,8 т.п.н., у тому числі і плазміди рСА25, рестрикційні картини, отримані з використанням ендонуклеази HpaІ, співпадають. На ДНК цих плазмід є три сайти для рестриктази HpaІ, завдяки чому утворюється три рестрикційні фрагменти: 9,2, 0,4 і 0,2 т.п.н.

Рестрикційний аналіз показав наявність лише одного сайту для ендонуклеази BglI на плазмідних ДНК Е. carotovora (рис. 9).

У випадку з ендонуклеазою BglI привертає до себе особливу увагу плазміда штаму 921 Е. carotovora. Природна вставка у її ДНК має додатковий сайт для рестриктази BglI, що призводить до появи другого фрагменту, розмір якого складає приблизно 2,6 т.п.н. (рис. 9).

Найкращим підтвердженням гомологічності первинних послідовностей групи даних плазмід, а також наявності серед них природних делеційно-інсерційних варіантів є результат гідролізу їх ДНК ендонуклеазою EcoRV.

Верхній рестрикційний фрагмент розміром 4,7 т.п.н. співпадає у всіх досліджених штамів ервіній, крім штамів 184 і 16`, плазміди яких відрізняють від інших плазмід даної групи за розміром і, як було виявлено в ході рестрикційного аналізу, за первинною послідовністю, тобто не відносяться до природних делеційних варіантів плазмід розміром 9,8 т.п.н.

Верхні фрагменти плазмідної ДНК, отримані за допомогою рестриктази EcoRV, співпадають у плазмід інших штамів, у тому числі і 48А, а також і у штамів 921 і 23`, підтверджуючи той факт, що плазміди цих штамів є делеційним (23`) і інсерційним (921) варіантами плазмід розміром 9,8 т.п.н. Плазмідні ДНК досліджених штамів мають по три сайти для рестриктази EcoRV, утворюючи при рестрикції цією ендонуклеазою три фрагменти. Найменший фрагмент розміром приблизно 0,65 т.п.н. співпадає у плазмід цих штамів, так само, як і найбільший. Делеційно-інсерційні зміни ДНК плазмід спостерігаються у другому фрагменті, розмір якого для нативних плазмід розміром 9,8 т.п.н. складає 4,5 т.п.н. У штучно отриманого штама 48А-7/4b вставка транспозона Tn9 відбувається саме у другий фрагмент. У природного штама 23` делеція також локалізована у другому фрагменті EcoRV. Збільшений розмір плазміди штаму 921 теж зумовлює вставка у ДНК, локалізована у другому фрагменті. Але, як і у випадку з рестриктазою BglI, на цій вставці є додатковий сайт для рестриктази EcoRV. Через це в результаті рестрикції плазміди штаму 921 розміром 10,4 т.п.н. утворюється не три рестрикційні фрагменти, а чотири. Найбільший і найменший співпадають з фрагментами плазмід інших штамів, а замість другого фрагменту рестрикції, розмір якого повинна збільшувати вставка ДНК, виявляються два близькі за розміром фрагменти приблизно 2,4 і 2,6 т.п.н., сумарний розмір яких дійсно буде перевищувати розмір вихідного фрагмента, який складає для нативних плазмід 4,5 т.п.н. (рис. 10).

В рамках проведення дослідження криптичних плазмід E. carotovora ми здійснили рестрикційне картування плазміди рСА25 та її транспозонного варіанта рСА25::Tn9, маючи за мету створення фізичної карти сайтів цієї плазміди, а також визначення взаємного положення сайтів рестрикції та області вбудовування транспозона Tn9 в молекулу плазмідної ДНК.

Плазміда рСА25 є найбільш вивченим генетичним елементом E. carotovora. У попередніх дослідженнях нами було показано, що після взаємодії з клітинами даного штаму бактеріофага Р1 E. coli відбувається спеціалізована трансдукція маркера стійкості до хлорамфеніколу у клітини ервіній з одночасним внесенням транспозона Tn9 в плазміду pCA25 [Сергеева и др., 2006]. Завдяки дослідженню значної кількості транспозон-мічених клонів було виявлено високу стабільність плазміди як у клітинах E. carotovora, так і у клітинах лабораторних штамів-трансформантів E. coli DH1. Виліковування клітин від плазміди не відбувалося ані у разі обробки SDS, ані за допомогою температурного впливу чи обробки етідій бромідом [Бурова и др., 2007]. Також було показано, що транспозон вбудовується тільки у певний локус на плазміді рСА25. Аналогічним чином транспозон Tn9 вбудовується у геном фага л, у якого Tn9 виявляється в 3 сайтах у незначущих областях генома [Rosner, Gottesman, 1977]. Однак і досі не було виявлено жодних фенотипових ознак, які може кодувати плазміда рСА25. На основі надзвичайної стабільності успадковування плазміди pCA25 і її розміру, який є близьким до розміру кільцевого профага Р4 E. coli, було висловлено припущення щодо можливого профагового походження даного генетичного елемента E. carotovora.

В результаті проведення рестрикційного аналізу з використанням ендонуклаез HpaІ, BglI, EcoRI, EcoRV і PstI ми виявили, що ДНК нативної плазміди рСА25 не має сайтів для PstI і EcoRI. Рестрикційний аналіз ДНК плазміди рСА25::Tn9 тим же набором рестриктаз, що і плазміди рСА25, дозволив виявити область вбудовування транспозона Tn9 в плазмідну ДНК і уточнити положення сайтів рестрикції для плазміди рСА25.

Таким чином, в результаті проведення фізичного картування плазмід рСА25 і рСА25::Tn9, була запропонована рестрикційна карта криптичної плазміди E. сarotovora (рис. 11), яка є представником найбільш розповсюдженого розмірного класу позахромосомних ДНК для даної бактерії. Завдяки наявності транспозонної мітки у плазміді, стало можливим уточнення взаємного розташування сайтів рестрикції, а також місцезнаходження транспозона Tn9 на плазмідній ДНК [Сергеева, Товкач, 2009].

На рестрикційній карті плазміди рСА25::Tn9 (рис. 11) відображено три сайти для рестриктази HpaІ, які розташовані на невеликій відстані один від одного, таким чином спричиняючи при рестрикції появу одного великого фрагменту плазмідної ДНК та двох фрагментів невеликого розміру (рис. 11). Сайт для ендонуклеази BglI також розташовано в цій області плазмідної ДНК між сайтами ендонуклеази HpaІ. Завдяки наявності одного сайту при гідролізі ендонуклеазою BglI утворюється відкрита кільцева форма плазміди. Сайти для рестриктаз HpaІ і BglI розташовані у межах найбільшого фрагменту EcoRV, безпосередньо на невеликій відстані від одного з трьох сайтів для ендонуклеази EcoRV.

Рис. 11. Рестрикційна карта плазміди рСА25::Tn9.

Було встановлено, що транспозон Tn9 вбудовується в плазмідну ДНК в межах другого фрагменту EcoRV також на невеликій відстані від сайту для рестриктази EcoRV (рис. 11). Вбудовування транспозона Tn9 лише у певне місце ДНК плазміди рСА25 було підтверджено при дослідженні значної кількості клонів з плазмідою рСА25::Tn9, які були отримані незалежно [Бурова и др., 2007; Сергеева, Товкач, 2008]. Сайти для рестриктаз EcoRI і PstI відсутні на ДНК нативної плазміди рСА25. На ДНК транспозона Tn9 плазміди рСА25::Tn9 є один сайт для EcoRI, розташований у гені САТ, і два сайти для PstI, розташовані в межах прямих кінцевих IS1-послідовностей транспозона Tn9.

Таким чином, плазміда рСА25 разом з рСА25::Tn9 являє собою перспективну модель для вивчення ролі позахромосомних ДНК у фізіології та екології ервіній. Подальше вивчення плазміди рСА25 створює передумови для конструювання векторів для переносу генетичної інформації між штамами E. carotovora.

ВИСНОВКИ

1. Криптичні плазміди широко розповсюджені у важливої фітопатогенної бактерії Erwinia carotovora. Біля 30% штамів містять плазміди різного розміру. Два штами утримують по дві різні плазміди одночасно. Статистичний розподіл плазмід ервіній за розміром суттєво відрізняється від такого плазмід іншого представника ентеробактерій Escherichia coli. Наявність плазмід у Е. carotovora не корелює з синтезом клітинами бактеріоцинів і чутливістю до каротоворіцинів, ервініо- і коліфагів. Плазмідоутримання штамів пов'язане з географічним ареалом, в якому персистують ервінії.

2. Великі позахромосомні ДНК сталого розміру (129 т.п.н.) формують окрему групу мегаплазмід Е. carotovora. Рестрикційний аналіз ендонуклеазами SalI, HpaІ і EcoRI виявив, що ДНК мегаплазмід мають унікальні рестрикційні картини. Мегаплазміда рСА16-1 штаму Е. carotovora 33А не здатна провокувати появу пухлин на рослинах Kalanchoe daigremontiana.

3. Автономні генетичні елементи штама Е. carotovora 33А, мегаплазміда рСА16-1 і бактеріофаг NF16, відрізняються за первинною послідовністю і не мають ідентичних за розміром рестрикційних фрагментів ДНК.

4. Плазміди розміром 9,8 т.п.н. і їх природні делеційно-інсерційні варіанти утворюють найбільш розповсюджену групу позахромосомних елементів E. carotovora. Рестрикційні картини, отримані для ендонуклеаз HpaІ, BglI і EcoRV, співпадають у плазмід цієї групи.

5. Плазміда рСА25 (9,8 т.п.н.) штаму E. carotovora 48А являє собою перспективну модель для вивчення ролі позахромосомних ДНК у фізіології та екології ервіній. Рестрикційна карта плазміди рСА25::Tn9 має по 3 сайти для ендонуклеаз HpaІ і EcoRV, 1 сайт для BglI, а також 2 сайти для PstI і 1 сайт для EcoRI на транспозонній послідовності. Плазміда рСА25::Tn9 є перспективною для конструювання генетичних векторів.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сергеева Ж.Ю. Внесение транспозона Tn9 в эндогенные плазмиды Erwinia carotovora при лизогенизации клеток колифагом Р1 / Ж.Ю. Сергеева, Л.М. Бурова, Ф.И. Товкач // Мікробіол. журн. - 2006. - Т. 68, № 4. - С. 34 - 39 (Здобувач проводила електрофорез ДНК E. carotovora в гелях агарози, здійснювала скрінінг позахромосомних ДНК з транспозоном та встановила молекулярні маси плазмід з використанням комп`ютерної програми Total Lab (версія 2.01). Приймала участь у плануванні експерименту, аналізі даних та обговорювала результати).

2. Сергеева Ж.Ю. Распространение внехромосомных кольцевых ДНК у Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Ф.И. Товкач // Доп. НАН України. - 2008. - № 12. - С. 149 - 153.

3. Сергеева Ж.Ю. Сравнительный рестрикционный анализ ДНК мегаплазмид и бактериофагов Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Ф.И. Товкач // Мікробіологія і біотехнологія. - 2009. - № 2 (6). - С. 23 - 27.

4. Сергеева Ж.Ю. Рестрикционное картирование внехромосомного элемента рСА25 Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Ф.И. Товкач // Мікробіологія і біотехнологія. - 2009. - № 2 (6). - С. 66 - 68.

5. Товкач Ф.И. Перспектива создания биотехнологической системы на основе Erwinia carotovora, ее бактериофагов и плазмид / Ф.И. Товкач, Н.В. Черватюк, А.И. Кушкина, Л.М.Бурова, А.И. Панщина, Т.В. Иваница, Ж.Ю. Сергеева, Т.Е. Горб, Л.В. Романюк // Мікробні біотехнології: міжнар. наукова конф., 11 - 15 вересня, 2006 р.: тези доп. - Одеса, 2006. - С. 30.

6. Товкач Ф.И. Использование транспозона Tn9 для изучения криптической плазмиды рСА25 Erwinia carotovora / Ф.И. Товкач, Т.Е. Горб., Л.М. Бурова, Н.В. Черватюк, Ж.Ю. Сергеева // Генетика микроорганизмов и биотехнология: Российская школа - конференция, посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна.: сборник тезисов. - Пущино, 2006. - С. 37.

7. Sergeeva Zh.U. Study of the autonomous genetic elements of Erwinia carotovora and their influence on the sensibility to bacteriophages / Zh.U. Sergeeva // Modern problems of microbiology and biotechnology: The young scientists` and students` International scientific conference, 28 - 31 May 2007. - Odesa: Astroprint, 2007. - P. 175.

8. Сергеева Ж.Ю. Профаговая природа внехромосомных ДНК Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Т.Е. Горб, Ф.И. Товкач // Біоресурси та віруси: V міжнар. конф., 10 - 13 вересня 2007 р.: тези доп. - Київ, 2007. - С. 160.

9. Сергеева Ж.Ю. Изучение плазмид Erwinia carotovora штаммов различного происхождения / Ж.Ю. Сергеева // Биология - наука ХХI века: 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, 29 окт. - 2 нояб. 2007 г.: сборник тезисов. - Пущино, 2007. - С. 46.

10. Sergeeva Zh.U. Prophage nature of the extrachromosomal DNA of Erwinia carotovora / Zh.U. Sergeeva, T.E. Gorb, F.I. Tovkach // Phage biology, ecology and therapy meeting: June 12 - 15, 2008. - Tbilisi, 2008. - P. 75.

11. Сергеева Ж.Ю. Молекулярно-генетическое исследование криптических плазмид Erwinia carotovora / Ж.Ю. Сергеева, Т.Е. Горб, Л.М. Бурова, Ф.И Товкач // Факторы экспериментальной эволюции организмов: IV междунар. научная конф., 22 - 26 сентября 2008 г.: сборник тезисов. - Алушта, 2008. - С. 311- 314.

АНОТАЦІЯ

Сергєєва Ж. Ю. Поширення і характеристика криптичних плазмід Erwinia carotovora. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2009.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню криптичних плазмід штамів E. carotovora різного походження з метою встановлення їх молекулярно-біологічних властивостей.

Проведено скрінінг штамів E. carotovora subsp. carotovora і Е. carotovora subsp. atroseptica на наявність позахромосомних ДНК. В роботі виявлено зв'язок між утриманням плазмід штамами E. carotovora різного походження та їх належністю до певного географічного ареалу. Виявлені плазміди ервіній за розміром можна розподілити на чотири дискретні класи: 3,8-6,8, 9,8-16,7, 47,7-64,5 і 129 т.п.н. Вперше з'ясовано, що найбільш поширеною групою серед плазмід ервіній є плазміди розміром 9,8 т.п.н. та їх природні делеційно-інсерційні варіанти (8,7 - 10,4 т.п.н.).

Побудовано рестрикційну карту плазміди рСА25::Tn9 для ендонуклеаз HpaІ, BglI, EcoRI, EcoRV і PstI, а також виявлено область вбудовування транспозона Tn9 у плазмідну ДНК. Висловлено припущення щодо профагового походження елемента рСА25. Плазміда рСА25::Tn9 розглядається як вектор для переносу генетичної інформації між штамами E. carotovora.

Ключові слова: Erwinia carotovora, автономні генетичні елементи, криптичні плазміди, мегаплазміди, плазмідні спектри, патогенність, рестрикційний аналіз.

АННОТАЦИЯ

Сергеева Ж. Ю. Распространение и характеристика криптических плазмид Erwinia carotovora. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена изучению криптических плазмид штаммов E. carotovora различного происхождения с целью установления их молекулярно-биологических свойств.

Проведён скрининг штаммов E. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica на наличие внехромосомных ДНК. В работе показано связь между содержанием плазмид штаммами E. carotovora различного происхождения и их принадлежностью к определённому географическому ареалу. Обнаруженные плазмиды эрвиний по размеру можно распределить на четыре дискретных класса: 3,8-6,8, 9,8-16,7, 47,7-64,5 и 129 т.п.н. Впервые выявлено, что наиболее распространённой группой среди плазмид эрвиний являются плазмиды размером 9,8 т.п.н. и их природные делеционно-вставочные варианты (8,7 - 10,4 т.п.н.).

Построена рестрикционная карта плазмиды рСА25::Tn9 для эндонуклеаз HpaІ, BglI, EcoRI, EcoRV и PstI, а также выявлена область встраивания транспозона Tn9 в плазмидную ДНК. Сделано предположение относительно профагового происхождения элемента рСА25. Плазмида рСА25::Tn9 рассматривается как вектор для переноса генетической информации между штаммами.

Ключевые слова: Erwinia carotovora, автономные генетические элементы, криптические плазмиды, мегаплазмиды, плазмидные спектры, патогенность, рестрикционный анализ.

RESUME

Sergeeva Zh. U. The expansion and characteristic of Erwinia carotovora`s cryptic plasmids. - Manuscript.

Thesis for Candidate`s degree in specialty 03.00.07 - Microbiology. - Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

PhD work is devoted to the study of the cryptic plasmids of E. carotovora strains isolated from the different sources for the purpose of molecular-biological properties determination.

The study of plasmid composition of E. carotovora subsp. carotovora and Е. carotovora subsp. atroseptica strains was carried out. Certain correlation between geographical origin of the strains and plasmid maintenance of these strains was detected. These E. carotovora plasmids belong to the four discrete size classes: 3.8-6.8, 9.8-16.7, 47.7-64.5 and 129 kb. For the first time it was shown that the most widespread size group among erwinias plasmids were 9,8 kb plasmids and their deletion/insertion variants (8.7 - 10.4 kb). The influence of the autonomous genetic elements of these strains of E. carotovora on the sensibility of bacterial cells to bacteriophages was studied. No correlation between the plasmid composition and the carotovoricins killer activity of E. carotovora strains was also detected.

The comparative restriction analysis of E. carotovora megaplasmids (129 kb) from three stains of different origin was carried out. And for the first time the comparative restriction analysis of phage and plasmid DNA from a plasmid strain was carried out. It was found out that all the studied megaplasmid DNAs were represented with the unique sequences. Also for the first time it was detected that рСА16-1 megaplasmid and NF16 bacteriophage DNAs isolated from the E. carotovora 33A strain differed in primary sequences.

The existence of the primary sequence homology in the most widespread E. carotovora plasmid size class (9.8 kb) was shown for the first time using the results of restriction analysis.

The bacterial clone E. carotovora 48А-7/4b was detected during the study of plasmid composition of the E. carotovora 48А strain P1-transductants. The 7/4b clone cells contained extrachromosomal DNA of the enlarged size. The enlargement of plasmid рСА25 in size in the 7/4b clone cells appeared due to the insertion of the Tn9 transposon. Plasmid pCA25 (9.8 kb) belongs to the most widespread size class of erwinias extrachromosomal DNAs. It was supposed earlier that pCA25 plasmid was of a prophage origin. For the first time ever the restriction site mapping of the E. carotovora extrachromosomal element pCA25 and its transposon variant рСА25::Tn9 was performed. The restriction map of the plasmid was created for endonucleases HpaІ, BglI, EcoRI, EcoRV and PstI and the site of the Tn9 transposon incorporation was detected corresponding to the obtained data. Plasmid рСА25::Tn9 can be used as a vector for genetic information transfer between strains in perspective.