Размещено на http://www.allbest.ru/

Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського

УДК 577.3:57.086.8

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Застосування міліметрових і субміліметрових радіохвиль та їх комбінації в дослідженні біологічних об'єктів

Древаль Наталія Володимирівна

Сімферополь - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова Національної академії наук України.

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК: член-кор. УААН, доктор сільськогосподарських наук, професор, Рубан Сергій Юрійович, Українська академія аграрних наук, Академік - секретар відділення зоотехнії УААН.

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ:

доктор біологічних наук, професор кафедри біофізики Київського національного університету ім.. Тараса Шевченка, Мартинюк Віктор Семенович, Київський національний університет ім. Тараса Шевченка;

доктор біологічних наук, доцент кафедри генетики і цитології, Шкорбатов Юрій Георгійович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач відділом генетики НДІ біології ХНУ.

Захист відбудеться 19.03. 2009 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 Таврійського національного університету ім. В. І. Вернадського, 95007, Україна, Автономна Республіка Крим, м. Сімферополь, пр. Ак. Вернадского, 20, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Таврійського національного університету ім. В. І. Вернадського, 95007, Україна, Автономна Республіка Крим, м. Сімферополь, пр. Вернадського, 4.

Автореферат розіслано 17.02. 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.Р. Хусаінов

Анотації

Древаль Н.В. Застосування міліметрових та субміліметрових радіохвиль та їх комбінації в дослідженні біологічних об'єктів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02-біофізика. Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського, Сімферополь, 2009.

Дисертацію присвячено дослідженню стану вільної - зв'язаної води в суспензіях еритроцитів, тромбоцитів крові людини, спермі бугаїв-плідників, культурах мікроводоростей та E.coli в присутності біологічних регуляторів за зміною параметрів комплексної діелектричної проникності методом НВЧ-діелектрометрії. У дисертації також вивчався електромагнітний відгук біологічних об'єктів при комбінованому впливі модульованого лазерного терагерцевого й міліметрового випромінювань на біологічні об'єкти при одночасній оцінці їх гідратного оточення в області дисперсії діелектричної проникності вільної води. еритроцит кров сперма

Показано, що характер зміни гідратного оточення біологічних об'єктів у присутності біологічних регуляторів та при дії лазерного терагерцевого опромінення є інформативною характеристикою їх функціонального стану. Виявлено залежність електромагнітного відгуку біооб'єктів від частоти модуляції міліметрового та субміліметрового випромінювань.

Ключові слова: міліметровий та субміліметровий діапазон радіохвиль, гідратне оточення, нативні клітини, біотехнологія.

Древаль Н.В. Применение миллиметровых и субмиллиметровых радиоволн и их комбинации в исследовании биологических объектов. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02-биофизика. Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, Симферополь, 2009.

Диссертация посвящена изучению состояния свободной - связанной воды суспензий нативных клеток в присутствии гормонов и антибиотиков по изменению параметров комплексной диэлектрической проницаемости с помощью метода КВЧ-диэлектрометрии. В диссертации также изучался электромагнитный отклик биологических объектов при комбинированном воздействии лазерного терагерцевого (f = 0,89 ТГц) и миллиметрового (f = 37,7 ГГц) излучений на суспензии эритроцитов, спермии быков-производителей и плазму крови человека, при этом одновременно оценивали состояние свободной - связанной воды в суспензиях клеток.

Объектами исследования были спермии быков-производителей, одноклеточные микроводоросли представители отделов Chlorophyta и Cyanobacteria, клетки E.coli, а также суспензии эритроцитов, тромбоцитов и плазма крови человека.

Фиксированная частота генерации радиоволн КВЧ-диапазона (f = 37,7 ГГц), которая входит в диапазон частот, где наблюдается дисперсия диэлектрической проницаемости свободной воды при наложении переменного электромагнитного поля, а также геометрические размеры измерительных волноводных кювет (сечение волновода 5,2 мм х 2,6 мм), позволили в условиях максимальной жизнеспособности биологического материала оценивать диэлектрические свойства биообъектов. В области дисперсии диэлектрической проницаемости свободной воды есть возможность слежения за диполями молекул воды при наложении переменного электромагнитного поля. Диэлектрические свойства воды описываются комплексной диэлектрической проницаемостью * = + і, где - действительная часть комплексной диэлектрической проницаемости, определяющая поляризацию исследуемого образца в электромагнитном поле, - мнимая часть диэлектрической проницаемости, определяющая диэлектрические потери, обусловленные релаксацией диполей молекул воды.

HCN-лазер с рабочей частотой f = 0,89 ТГц был использован для изучения особенностей взаимодействия лазерного излучения со спермиями, эритроцитами и плазмой крови. С целью усовершенствования способа определения воздействия на выбранные биологические объекты было использовано лазерное терагерцевое излучение с одновременным контролем изменений гидратации клеточных структур в миллиметровом диапазоне радиоволн. При этом физические свойства стоячей волны в волноводном тракте позволили судить о факте воздействия лазерного облучения в любой момент времени.

В работе установлено, что гидратация мембранных и внутриклеточных структур, определяемая методом КВЧ-диэлектрометрии, включающая изменения количества свободной и связанной воды при действии биологических реагентов, является информативной характеристикой биологических объектов и может быть использована при оценке функционального состояния клеток в различных биотехнологических процессах.

Проведенные на частоте f = 36,5 ГГц измерения действительной части () комплексной диэлектрической проницаемости эякулятов разных быков, позволяющие оценить в реальном времени качество свежеполученной спермы, дают возможность использования волноводных методов в биотехнологии криоконсервации спермы. Проведен качественный анализ изменения при действии желточной и безжелточной криопротекторных сред на спермии быков-производителей.

Показано, что характер изменения гидратации эякулятов может быть использован для контроля уровня контаминации микрофлорой спермы быков разных взятий, а также при разбавлении разными криопротекторными средами. Впервые проведены исследования жизнедеятельности спермиев в терагерцевом диапазоне радиоволн с помощью HCN-лазера. Показано увеличение подвижности нативных спермиев, а также спермиев в присутствии раствора гентамицина при лазерном облучении эякулятов, что может служить альтернативой традиционному использованию антибиотиков в биотехнологии разведения крупного рогатого скота.

Определен характер изменения гидратного окружения в культуре E.coli в зависимости от возраста культуры, а также одноклеточных водорослей в комплексе с микроорганизмами в зависимости от условий выращивания. Показано, что состояние воды в клетках (свободная/связанная) является информативным маркером контроля функциональных процессов в этих организмах и слежения за динамикой жизнедеятельности организмов, в том числе при синтезе белкового материала.

Исследована гидратация суспензий эритроцитов и тромбоцитов в присутствии растворов адреналина, дексаметазона, простагландина Е 2 и водного экстракта эхинацеи пурпурной. Путем оценки гидратного окружения, показано, что последние проявляют нивелирующее действие адреналину и дексаметазону, при этом наблюдается увеличение количества связанной воды в суспензиях клеток. Показано, что при изучении электромагнитного отклика суспензий эритроцитов и белков плазмы крови целесообразно использовать импульсную модуляцию лазерного терагерцевого, а также миллиметрового излучений с одновременной регистрацией параметров комплексной диэлектрической проницаемости.

Ключевые слова: миллиметровый и субмиллиметровый диапазон радиоволн, гидратное окружение, нативные клетки, биотехнология.

Dreval N.V. Application of millimeter and submillimeter radiowaves and their combinations in investigation of biological objects.- Manuscript.

This dissertation is on competition of scientific degree of the candidate of biological sciences according to speciality 03.00.02, which is biophysics. Taurida National University, Simferopol, 2009.

The thesis is devoted to investigation of free - bound state water of human blood cells suspension, bovine semen, E. coli and microalgae culture over biological reagents measured by permittivity parameters with the help of EHF dielectrometry method. Electromagnetic response of biological objects during simultaneous interaction of modulated electromagnetic waves which include laser terahertz and millimeter radiations on human erythrocytes suspension and blood plasma, bovine semen was also studied in this thesis. At the same time the free - bound water state of suspensions cells was estimated.

It is shown, that hydration change (free water/bound water) is informative marker for control of functional processes in these organisms and watching dynamics of vital functions of these organisms. It was discovered the dependence of electromagnetic response from modulation frequency millimeter and submillimeter radiations.

Key words: millimeter and submillimeter radiowave range, hydrate environment, alive cells, biotechnology.

Загальна характеристика роботи

Актуальність роботи.

Активне освоєння діапазонів міліметрових та субміліметрових радіохвиль є важливим фактором на сучасному етапі створення нових діагностичних і терапевтичних апаратурних комплексів та методів. Однією з актуальних задач у цьому напрямку є створення високоефективних технологій впливу на біологічні системи на основі вивчення їхнього електромагнітного відгуку.

До числа перспективних способів відноситься комплексний вплив радіохвиль міліметрового та субміліметрового діапазонів частот на біологічні об'єкти при одночасній модуляції наднизьким та низьким діапазонами частот (f = 0,1 ч 21 Гц, f = 20 ч 5000 Гц).

Поряд із традиційними методами застосування хвиль міліметрового діапазону в клінічній медицині, такими як НВЧ-терапія (Туманянц Е.Н. та ін., 1995, Корнаухов А.В. та ін., 2003), терапія фоновим резонансним випромінюванням, мікрохвильова резонансна терапія (Куропатова Е.С., 1994) і прецизіонно-хвильова терапія (Петросян В. І. та ін., 2002, Гуляєв А. І., 1996, Гуляєв Ю.В. та ін., 1999), перспективними є роботи зі створення комплексів, до складу яких входять лазери, що випромінюють у терагерцевому діапазоні частот (f = 1 ч 30 ТГц) і апаратура міліметрового діапазону радіочастот (НВЧ-діапазон).

Вибір НВЧ-діапазону обумовлено наявністю в ньому області дисперсії діелектричної проникності вільної води, а також можливістю аналізувати як стан водного оточення клітинних структур, так і можливістю прогнозувати конформаційні зміни макромолекул при різних фізико-хімічних впливах (Малая Л.Т. та ін., 1987, Сидоров Д.Ю., 2001). Ефективність використання лазерів, у тому числі ціанистоводневих (HCN-лазер) (Камєнєв Ю. Ю., 1999, Кісельов В. К., 1993), очевидна через збіг енергетичних характеристик випромінювання терагерцевого діапазону радіохвиль (h = 0,39 х 10-2 ч 3,9 10-2 еВ) з енергією квантів водневих зв'язків біологічної системи (h = 0,9 х 10-2 ч 8,7 10-2 еВ) (Бецький О.В. та ін., 1988).

При цьому оцінити електромагнітний відгук клітинної системи на лазерний вплив в момент опромінення, з урахуванням збереження всіх процесів життєдіяльності, є можливим шляхом аналізу стану зв'язаної та вільної води за допомогою НВЧ-діелектрометрії, яка фіксує фізичні параметри взаємодії радіохвиль з біооб'єктами за параметрами комплексної діелектричної проникності (*).

В біологічних системах при розвитку будь-яких патологічних станів в першу чергу змінюється вміст води й діелектричні властивості. Наприклад, діелектричні властивості здорових та ішемізованих ділянок серцевого м'яза в міліметровому діапазоні частот відрізняються на 20 %, що лежить в основі не інвазійного діагностування стану серцевого м'яза за допомогою мікрохвильової томографії.

Існує декілька принципово відмінних шляхів впливу на біологічні об'єкти. Перший шлях - це безпосередня дія сфокусованої енергії лазерного випромінювання високої потужності при оперативному втручанні з метою фотодеструкції, абляції та ін. в хірургії, офтальмології, дерматології.

Другий шлях - це вивчення молекулярних механізмів взаємодії низькоінтенсивного лазерного випромінювання на рівні водневих зв'язків у цілісній біологічній системі, а також дослідження електромагнітного відгуку й пошук біорезонансних частот. При реалізації другого шляху виникає ряд складностей, пов'язаних з непростою інтерпретацією експериментальних даних і їх трансформуванням на рівень цілісного організму. На теперішній час задачі другого шляху залишаються менш вивченими, вони є предметом даної дисертаційної роботи.

Застосування НВЧ-діелектрометрії в дослідженні механізмів регуляції росту мікроорганізмів відкриває можливості для вивченні патогенезу багатьох кишкових інфекцій, а також для розробки й контролю виробництва біологічно чистих кормів в експериментах на культурах мікроводоростей.

Методи аналізу якості спермопродукції та ембріонального матеріалу, які традиційно використовуються при штучному заплідненні, можуть бути доповнені діелектричними характеристиками при виборі найбільш оптимальних режимів кріоконсервації та санації біологічного матеріалу. Цьому сприяють зміни діелектричних параметрів, що виявляють при підготовці біологічних об'єктів, наприклад, суспензій клітин, плазми крові до заморожування. Завдяки вимірюванням діелектричних параметрів можна оптимізувати процес кріоконсервації, у результаті якого відбуваються зміни як структури та міжмолекулярних взаємодій білкових молекул, так і структурно-динамічні зміни молекул води в біологічних системах, що виникають при фазових переходах вода - лід.

Актуальність проведення досліджень з одночасним застосуванням НВЧ-діелектрометрії та лазерних установок терагерцевого діапазону очевидна через взаємозв'язок практичної користі розроблювальних технологій і контролю над біооб'єктами в реальному часі в момент опромінення. При цьому робота з малими об'ємами біологічного матеріалу, нетривалість дослідження є основними пунктами, які визначають переваги використання апаратури міліметрового та субміліметрового діапазонів радіохвиль. Такі характеристики лазерного випромінювання як направленість, монохроматичність, висока ефективність температури, можливість модуляції з широкою варіацією скважності при імпульсному режимі, а також поляризація дозволяють впливати на водневі зв'язки макромолекул клітинних структур. При цьому застосування лазерного терагерцевого опромінювання з одночасним контролем зміни гідратації клітинних структур в області дисперсії діелектричної проникності вільної води (міліметровий діапазон радіохвиль) дають можливість обґрунтувати застосування радіофізичної апаратури міліметрового та субміліметрового діапазонів для впровадження отриманих результатів в біотехнологічний процес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами, проектами.

Дисертацію виконано у відділі "Біологічної фізики" Інституту радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України в рамках трьох науково-дослідницьких робіт, затверджених Президією НАН України: "Мезон 1" - "Дослідження фізичних механізмів обумовлюючих релаксаційні процеси в НВЧ-діапазоні водного компонента біологічних об'єктів різних рівнів організації" (№ 0196U006111), "Буксир" - "Теоретичні й експериментальні дослідження хвильових процесів в активних та пасивних приладах, а також системах мікрохвильового і міліметрового діапазонів" (№ 0100U006441), "Напрямок" - "Методи і засоби дослідження процесів взаємодії електромагнітних хвиль і полів з різними матеріальними об'єктами природного та штучного походження і вивчення їх макроскопічних та мікроскопічних властивостей" (№0102U003140).

Мета й задачі дослідження.

Метою роботи є дослідження електромагнітного відгуку біооб'єктів на комплексний вплив радіохвиль терагерцевого та міліметрового діапазонів, а також аналіз стану водної компоненти біооб'єктів при дії біологічних реагентів за параметрами комплексної діелектричної проникності.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

· обґрунтувати об'єкти досліджень, які оптимально підходять до робочого об'єму кювети, а також взаємодіють з хвилями міліметрового ( = 1 ч 10 мм) та субміліметрового діапазонів ( = 0,1 ч1 мм);

· показати, що в області дисперсії діелектричної проникності вільної води електромагнітні відгуки обраних об'єктів на лазерне опромінення можуть бути охарактеризовані параметрами комплексної діелектричної проникності;

· створити методичний підхід на основі інтеграції міліметрової та субміліметрової апаратури з метою визначення ознак дії терагерцевого лазерного випромінювання на біологічні об'єкти (на прикладі сперміїв бугаїв-плідників, клітин та плазми крові), при одночасному контролі гідратного оточення в області дисперсії діелектричної проникності вільної води;

· на основі параметрів комплексної діелектричної проникності вивчити стан водної компоненти в суспензіях еритроцитів та тромбоцитів, а також її зміни при додаванні до суспензії клітин розчинів адреналіну, дексаметазону, простагландину Е 2 та водного екстракту ехінацеї пурпурової;

· за параметрами комплексної діелектричної проникності проаналізувати зміни стану водної компоненти в суспензіях E. colі та одноклітинних мікроводоростей у присутності водних розчинів ампіциліну та стрептоміцину;

· на основі результатів експерименту розробити практичні рекомендації щодо використання комбінованого лазерного та міліметрового випромінювань у різних біотехнологіях на етапах контролю стану води в біологічних системах.

Об'єкт дослідження - еякуляти бугаїв-плідників, одноклітинні зелені водорості - Chlamydomonas reinhardtii Dang., Chlorella vulgaris Bejer., Scenedesmus quadricauda Turp., одноклітинні синьо-зелені водорості - Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk., культура клітин E. coli, суспензія еритроцитів та тромбоцитів, а також плазма крові.

Предмет дослідження - електромагнітний відгук клітин при дії радіохвиль міліметрового та субміліметрового діапазонів, а також зміна співвідношення вільної та зв'язаної води в біооб'єктах.

Методи дослідження - аналіз гідратного оточення біологічних об'єктів в області дисперсії діелектричної проникності вільної води за допомогою НВЧ-діелектрометрії, а також метод комбінованого впливу лазерного терагерцевого випромінювання та хвиль міліметрового діапазону на біологічні об'єкти.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше досліджено комплексну дію радіохвиль міліметрового (f = 37,7 ГГц) та терагерцевого (f = 0,89 ТГц) діапазонів на сперму бугаїв-плідників, суспензію еритроцитів крові та плазму крові людини при одночасному аналізі гідратації клітинних структур в області дисперсії діелектричної проникності вільної води.

Запропоновано методичний підхід для контролю стану живої клітинної системи при різних біотехнологічних процесах з одночасним застосуванням радіохвиль міліметрового та субміліметрового діапазонів, зокрема, при кріоконсервації сперміїв бугаїв-плідників, при аналізі гідратації суспензій еритроцитів і тромбоцитів, а також для оцінки стану водного оточення культур одноклітинних водоростей у біореакторах при виробництві біологічно чистих кормів.

Доведена доцільність використання імпульсної модуляції міліметрового та субміліметрового випромінювання для виявлення резонансних механізмів взаємодії радіохвиль з біологічними об'єктами. Показано, що область резонансної взаємодії для білкових комплексів еритроцитів при частоті лазерного випромінювання f = 0,89 ТГц знаходиться в області частот модуляції лазерного випромінювання більших ніж f = 485 Гц.

Вперше виявлено можливість підсилення дії лазерного терагерцевого випромінювання на біологічні об'єкти за допомогою модуляції випромінювання міліметрового діапазону частотами від f = 60 Гц до f = 485 Гц.

Практичне значення отриманих результатів.

Показано, що дійсна частина комплексної діелектричної проникності () у довгохвильовій частині міліметрового діапазону радіохвиль має відмінності в еякулятах як різних бугаїв-плідників, так і в еякулятах одного бугая від різного взяття. Це дозволяє використовувати НВЧ-діелектрометрію в технології контролю якості еякуляту бугаїв-плідників відразу після його одержання, причому час аналізу еякуляту не перевищує двох хвилин.

Застосування НВЧ-діелектрометрії також доцільне в технології кріоконсервації сперми бугаїв-плідників для тестування стану еякуляту після додавання кріопротекторних середовищ та антибіотиків з метою прогнозування кріорезистентності.

Застосування лазерного терагерцевого випромінювання частотою f = 0,89 ТГц при потужності випромінювання 1,5 мВт/см 2 може бути рекомендовано для збільшення рухливості як нативних сперміїв бугаїв-плідників, так і сперміїв в присутності сануючих середовищ в біотехнології кріоконсервації.

Встановлено можливість аналізувати гідратне оточення культури клітин E.coli за допомогою НВЧ-діелектрометрії в присутності водних розчинів ампіциліну та стрептоміцину.

Особистий внесок здобувача заключається в підготовці та проведенні експериментів, обробці й аналізі результатів, пошуку та огляді літератури, написанні наукових статей. Разом з науковим керівником визначено напрямок і розроблено загальну схему досліджень, проведено обговорення отриманих результатів наукової праці. Автор брав участь у розробці методичного підходу стосовно одночасного застосування міліметрового та терагерцевого випромінювань для аналізу гідратного оточення нативних клітин, на прикладі сперміїв бугаїв-плідників, клітин та плазми крові. Наукові висновки сформульовані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на 14-й міжнародній конференції "Horizons in Hydrogen Bond Research" (Турін, 2001), на 15-й міжнародній конференції "Horizons in Hydrogen Bond Research" (Берлін, 2003), на 3-й міжнародній конференції "Hydrogen Bonding and Molecular Interactions" (Київ, 2006), на міжнародній конференції "Миллиметровые и субмиллиметровые волны MSMW'2001" (Харків, 2001), на 12-й міжнародній конференції "Microwave & Telecommunication Technology" (Севастополь, 2002), на I и II Харківських конференціях молодих вчених "Радиофизика и СВЧ-электроника" (Харків, 2001, 2002), на семінарі "Квазиоптика и СВЧ-электроника" (Харків, 2002), на міжнародному семінарі "Лабораторные животные - возможные альтернативы в экспериментальной фармакологии" (Харків, 2002), І Національному конгресі з біоетики (Київ, 2001), на міжнародній конференції "Фотосинтез и растениеводство" (Київ, 2002), на конференції молодих вчених "Холод в биологии и медицине" (Харків, 2002), на Всеукраїнській науково-практичній конференції "Актуальные вопросы теоретической и практической медицины" (Суми, 2002), І Російській школі-конференції "Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине" (Саратов, 2002), на міжнародній конференції "С эхинацеей в третье тысячелетие" (Полтава, 2003).

Публікації. Результати досліджень знайшли відображення в 23 друкованих роботах, що включають 8 статей, із них 4 - у фахових реферованих журналах, 1 патент і 14 матеріалів вітчизняних та закордонних конференцій.

Обсяг та структура роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури (1 розділ), експериментальної частини (2 та 3 розділи), обговорення (4 розділ), висновків, списку літератури, який містить 197 джерел на 24 сторінках та додатку на 7 сторінках. Робота ілюстрована 9 таблицями, 65 рисунками. Загальний обсяг роботи: 163 сторінки.

Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, показано зв'язок виконаних досліджень із науковими програмами й темами, сформульовано мету роботи, обговорена новизна отриманих результатів і їх практичне значення, особистий внесок автора в дисертаційну роботу, а також дані про публікації та апробацію роботи.

Перший розділ присвячено огляду літератури. У ньому розглянуто деякі аспекти застосування радіофізичних методів міліметрового та субміліметрового діапазону радіохвиль в біотехнології, сільському господарстві, біології та медицині з метою вивчення електромагнітного відгуку біологічних об'єктів. Обговорено роль води в клітинній системі. Обґрунтовано вибір НВЧ-діапазону радіохвиль для аналізу гідратного оточення клітинних структур та білкових молекул за параметрами комплексної діелектричної проникності. Розглянуто деякі аспекти впливу міліметрового хвиль та лазерного випромінювання на структурно-динамічні властивості води.

У другому розділі викладено методику експерименту та обґрунтовано вибір об'єктів дослідження.

Експерименти на спермі бугаїв-плідників проводилися згідно Харківській технології кріоконсервації (Осташко Ф.І., 1990) з використанням безжовткового та жовткового кріопротекторних середовищ та водних розчинів антибіотиків ампіциліну та гентаміцину у концентраціях с = 100 ОД та с = 25 мкг/мл відповідно (Бугров А.Д., 2004).

У дослідах з одноклітинними водоростями - Chlamydomonas reinhardtii Dang., Chlorella vulgaris Bejer., Scenedesmus quadricauda (Turp.), Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk. був використаний розчин гетероауксину у трьох концентраціях с = 1 мг/л, с = 50 мг/л, с = 100 мг/л, а також водні розчини ампіциліну та левоміцетину за стандартною методикою (Сиренко Л.А., 1975).

В експерименті з культурою E. coli були використані водні розчини антибіотиків - ампіциліну, левоміцетину, стрептоміцину, кожний в концентраціях с = 6,5 мкг/мл, с = 32 мкг/мл, с = 65 мкг/мл. У дослідах з вивчення гідратації клітин крові підготовку суспензії еритроцитів, тромбоцитів і плазми крові проводили за стандартною методикою (Малая Л.Т., 1992, Малая Л.Т., 1988); використовували розчини адреналіну, дексаметазону в концентрації 40 мкг/л та простагландину Е 2 в концентрації 60 мкг/л.

Загальна методика має дві частини, перша - стандартна (Щеголева Т.Ю., 1999 та ін.), яка включає вимірювання діелектричних параметрів суспензій клітин L, мм, X, мм на експериментальній установці, схему вимірювальної секції якої зображено на рисунку 1.

Друга методика включає дослідження електромагнітного відгуку біологічних об'єктів з одночасним контролем в них співвідношення вільної - зв'язаної води за параметрами комплексної діелектричної проникності за допомогою апаратурно-реєструючого комплексу, схема якого представлена на рисунку 2. Електромагнітний відгук є сигнал, отриманий при впливі на біологічні об'єкти (розміщених у хвилеводній вимірювальній кюветі) лазерним низькоінтенсивним випромінюванням, яке вводиться в 8-міліметровий хвилеводний тракт вимірювальної кювети, та реєструється на виході детектора хвилеводної лінії.

Рис. 1. Вимірювальна секція експериментальної установки для вимірювання L, X в НВЧ-діапазоні радіохвиль. Х, Z - система координат та положення зонду по осі 0Х, нормована на довжину хвилі у хвилеводі g (х/лg); k0 - хвильове число, що характеризує напрямок руху хвилі, періодичність поширення хвилі в просторі



Рис. 2. Схема апаратурно-реєструючого комплексу для вивчення комплексного впливу електромагнітних хвиль міліметрового та субміліметрового діапазонів на біологічні об'єкти. Цифрами на малюнку позначено: 1 - джерело інфрачервоного випромінювання; 2 - детектор інфрачервоного випромінювання; 3 - комплекс двигунів постійного струму механічного модулятора; 4 - вимірювальний підсилювач

Вимірювання реальної частини комплексної діелектричної проникності () сперми бугаїв-плідників проводилося в області дисперсії діелектричної проникності вільної води на довжині хвилі = 7,56 мм (f = 37,7 ГГц) з використанням вимірювальної лінії Р 1-39 та вимірювальної кювети з робочим об'ємом (5,2 мм х 2,6 мм х 0,05 мм). У ході експерименту реєструвався розподіл електричного поля стоячої хвилі у хвилеводі шляхом сканування зонду вздовж щілини вимірювальної хвилеводної лінії, при цьому вимірюваними параметрами були зміщення мінімуму стоячої хвилі - ДL, мм та зміна ширини подвоєного мінімуму стоячої хвилі - ДХ, мм; параметри L, та X в обраному діапазоні товщин зразків пропорційні та відповідно.

Джерелом зовнішньої дії був HCN-лазер (Камєнєв Ю. Ю., 1999), робоча частота випромінювання якого була f = 0,89 ТГц, потужність лазера становила 1,5 мВт/см 2.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням параметричних методів статистичного аналізу. Оцінку вірогідності розходжень між статистичними вибірками здійснювали за критерієм Стьюдента (t-критерій). Оцінку однорідності розподілу і його відповідність нормальному проводили на основі показників дисперсії та середньоквадратичного відхилення.

У третьому та четвертому розділах викладено результати дослідження та їх обговорення, відповідно. Показана можливість застосування НВЧ-діелектрометрії для оцінки якості свіжоодержаної сперми, контролю рівня мікрофлори сперми бугаїв-плідників, а також аналізу рухливості сперміїв при лазерній експозиції.

В експерименті було показано, що нативна сперма бугаїв-плідників з різною активністю й концентрацією сперміїв має відмінності по (рис. 3).

Рис. 3. Індивідуальні значення , активність та концентрація нативної сперми бугаїв-плідників

З метою підвищення життєздатності сперміїв на етапах їх низькотемпературної обробки була досліджена гідратація еякулятів у присутності кріопротекторних середовищ, які традиційно використовуються для фортифікації плазматичної мембрани клітин. При додаванні жовткового кріопротекторного середовища у всіх досліджуваних зразках сперми показник рівномірно знижувався, що свідчило про збільшення кількості зв'язаної води на макромолекулах мембрани сперміїв, а також, імовірно, про підвищення кріорезистентності, що є наслідком взаємодії компонентів кріопротекторного середовища зі структурами мембрани.

Внесення до еякуляту з жовтковим кріопротекторним середовищем безжовткового, згідно Харківській технології кріоконсервації, приводило до збільшення кількості вільної води, при цьому спостерігалося вирівнювання значень для всіх зразків (рис. 4).

Рис. 4. Індивідуальні значення сперми бугаїв-плідників у контрольній групі зразків (білі стовпчики) і при внесенні жовткового (сірі стовпчики, р < 0,001) та жовткового з безжовтковим (сірі стовпчики, р < 0,05) кріопротекторних середовищ

В експериментах з дослідження рівня контамінації мікрофлорою сперми були використані водні розчини ампіциліну та гентаміцину, які традиційно застосовуються в Харківській технології санації сперміїв при кріоконсервації. Показано, що внесення гентаміцину (с = 25 мкг/мл) в сперму бугаїв-плідників викликало більші варіації як в еякулятах різних бугаїв, так і в еякулятах одного бугая різного взяття, чим при добавлянні розчину ампіциліну (с = 100 ОД). В еякулятах бугаїв-плідників у присутності водних розчинів антибіотиків спостерігалося в обох випадках збільшення кількості зв'язаної води по відношенню до контрольних зразків.

З метою дослідження впливу субміліметрових хвиль на спермії бугаїв сперму опромінювали на протязі 5, 10, 20 хвилин (f = 0,89 ТГц). У серії експериментів показано, що активність сперміїв при терагерцевому опроміненні збільшувалася при 5-хвилинній експозиції, що супроводжувалося збільшенням кількості зв'язаної води, при експозиції 20 хвилин активність зменшувалася, як показано на прикладі сперми бугая Цезар (1 взяття) (рис. 5). Додавання ампіциліну в жовткове середовище з подальшим лазерним опроміненням сперми приводило до поступового зменшення активності сперміїв, а додавання гентаміцину приводило до збільшення активності сперміїв бугаїв при 5-хвилинній експозиції сперми. Одночасна оцінка гідратації показала збільшення кількості зв'язаної води при витримуванні сперми під джерелом лазерного опромінення.

Рис. 5. Зміна активності та сперми бугая Цезар (1 взяття) при терагерцевому опроміненні:

- нативна сперма; - в присутності ампіциліну; - в присутності гентаміцину; - значення нативної сперми; - значення сперми в присутності ампіциліну; - значення сперми в присутності гентаміцину (стандартна похибка 0,5 бали для всіх експериментальних точок)

НВЧ-діелектрометрія може знайти застосування при розробці біотехнологій збереження репродуктивної функції сперміїв, тому що дає можливість оцінювати функціональну повноцінність сперміїв на етапах підготовки сперми до кріоконсервації з метою прогнозування кріорезистентності .

З метою можливості застосування НВЧ-діелектрометрії в біотехнології синтезу органічних речовин були проведені експерименти з вивчення діелектричних параметрів і гідратації культури клітин E.coli в присутності антибіотиків різного механізму дії. На рисунку 6 представлені дані щодо зміни стану водної компоненти клітинної системи E.coli за параметром L в процесі росту культури в присутності розчину ампіциліну різної концентрації.

Рис. 6. Зміна параметру L в 1-, 2-, 3-, 4-добових культурах E. coli в присутності ампіциліну різної концентрації

Показано, що гідратація клітин E.coli змінюється як при дії ампіциліну різної концентрації, так і в залежності від віку культури. Найбільша кількість вільної води спостерігалася при дії ампіциліну найнижчої концентрації на 1-, 2-добові культури. Збільшення кількості зв'язаної води було характерно для 1-, 2-, 3-, 4-добових культур E. coli в присутності ампіциліну в концентрації с = 65 мкг/мл. Розчини стрептоміцину та левоміцетину тієї ж концентрації викликали менш виражені зміни кількості зв'язаної води, що, можливо, пов'язано з їх дією на цитоплазматичні структури бактерій (рис. 7).

Рис. 7. Зміна параметру L добових культур E. colі в присутності антибіотиків різного механізму дії. (За "0" прийнято значення контролю, що представляє собою водні розчини левоміцетину, стрептоміцину й ампіциліну різної концентрації)

На одноклітинних водоростях проведено дослідження їх діелектричних характеристик у присутності розчинів гетероауксину, а також ампіциліну та левоміцетину. Встановлено, що клітини мікроводоростей різного систематичного положення, які вирощувалися в ідентичних умовах, мають видову специфічність гідратного оточення, при цьому параметри діелектричної проникності відрізнялися в залежності від стаціонарної та логарифмічної фаз росту (таблиця 1).

Таблиця 1. Характеристика культур мікроводоростей за параметрами гідратації

Назва	Стадія росту	Зміна параметру L по відношенню до води, мм	Зміна параметру Х по відношенню до води, мм
Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk.	Лог.	-0,014 ? 0,005	0,01 ? 0,005
Chlamydomonas reinhardtii Dang.	Стац.	0,026 ? 0,005	0,03 ? 0,005
Chlorella vulgaris Bejer.	Лог.	-0,007 ? 0,005	0,005 ? 0,005
Scenedesmus quadricauda Turp.	Лог.	0,003 ? 0,005	0,005 ? 0,005

У присутності гетероауксину в суспензіях зелених водоростей спостерігалося з ростом концентрації фітогормону збільшення кількості зв'язаної води, а в суспензії синьо-зеленої водорості Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk., навпаки, збільшення кількості вільної води (рис. 8).

Рис. 8. Зміна параметру L суспензії мікроводоростей у присутності гетероауксину різної концентрації (№1 - Chlamydomonas reinhardtii Dang., №2 - Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk., №3 - Chlorella vulgaris Bejer. (*, **, *** - значення параметру L для водних розчинів гетероауксину в концентраціях 1, 50 і 100 мг/л відповідно)

Дослідження впливу антибіотиків на культури мікроводоростей при використанні концентрацій антибіотиків, що діяли тільки на мікробне оточення водоростей, а також концентрацій, що пригнічували ріст водоростей і проявляли свою дію як бактерициди, показало, що за діелектричними параметрами можна відрізняти ефекти дії на мікробне оточення та на водорості (рис. 9). Цей процес по-різному відбувався на світлі та в темряві.



Рис. 9. Зміна параметру L суспензій мікроводоростей у присутності ампіциліну (через 3 години та через 24 години після взаємодії). №1 - Chlamydomonas reinhardtii Dang., №2 - Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk., №3 - Chlorella vulgaris Bejer

За параметрами комплексної діелектричної проникності показано, що в присутності ампіциліну вміст вільної води збільшувався як у різних видів, так і при витримуванні культур на протязі 24 годин в режимі освітлення - темрява. При концентрації антибіотику с = 909 мкг/мл у всіх досліджених культурах мікроводоростей при витримуванні їх на протязі 24 годин спостерігалося збільшення вмісту вільної води в суспензіях. У присутності антибіотику концентрацією с = 1515 мкг/мл в культурі Chlamydomonas reinhardtii Dang., на відміну від інших, спостерігали збільшення кількості зв'язаної води.

Зміна гідратації культур мікроводоростей у присутності левоміцетину була менш значною, ніж ампіциліну, хоча при концентраціях антибіотику с = 50 мкг/мл та с = 200 мкг/мл в культурах зелених водоростей при витримуванні в режимі освітлення - темрява на протязі доби спостерігали збільшення вмісту вільної води. В культурі Microcystis aeruginosa Kuetz. em Elenk. збільшення кількості вільної води виявлялося при с = 200 мкг/мл.

Результати досліджень показали, що характер зміни гідратації мікроводоростей у присутності біологічно-активних речовин та при дії антибіотиків дають можливість спостерігати за динамікою процесів їх життєдіяльності. Це дозволить апаратурно, без руйнування клітин, проводити оцінку функціонального стану мікроводоростей, розробляти технології вирощування та контролювати життєдіяльність мікроводоростей в біореакторах для інтенсифікації процесів синтезу білкового матеріалу.

З метою оцінки гідратного оточення клітин крові при комбінованій дії біологічних речовин, що традиційно використовуються в клінічній медицині, було проведено аналіз зміни параметру L в суспензіях еритроцитів та тромбоцитів. Аналіз експериментальних даних показав, що в суспензії еритроцитів у присутності адреналіну спостерігали збільшення кількості зв'язаної води, а в суспензії тромбоцитів, навпаки, - вільної води, хоча при одночасній дії адреналіну та простагландину Е 2 в обох випадках виявляли збільшення кількості зв'язаної води

Ці експерименти підтвердили відомі дані щодо модулюючого ефекту простагландину Е 2, який був запропонований як тестовий на суспензії еритроцитів для диференціації різних патологічних станів при розвитку серцево-судинних захворювань (Малая та ін., 1992), а також на суспензії тромбоцитів, як чутливий тест не лише для диференціації різних груп хворих, що відрізняються перебігом хвороби і підбором доз препаратів при лікуванні, але й для ранньої діагностики схильності до гіпертонічної хвороби в групі здорових осіб (Сидоров, 2000). У присутності стероїдного гормону дексаметазону, а також адреналіну як в суспензії еритроцитів, так і в суспензії тромбоцитів спостерігали збільшення кількості вільної води

Шляхом оцінки зміни гідратного оточення на суспензіях еритроцитів і тромбоцитів було показано, що водний екстракт ехінацеї пурпурової проявляє такий же ефект, як і простагландин Е 2, нівелюючи вплив адреналіну, що супроводжувалося збільшенням кількості зв'язаної води. При дії дексаметазону подібний ефект спостерігався лише на еритроцитах, в той час як в суспензії тромбоцитів збільшувався вміст вільної води.

В експериментах з дослідження комбінованого впливу на біологічні об'єкти терагерцевого лазерного та міліметрового випромінювань були використані суспензії еритроцитів та плазма крові. Терагерцеве та міліметрове випромінювання були промодульовані по амплітуді, при цьому терагерцеве випромінювання вводилося у міліметрового хвилеводний тракт. Вибір частот модуляції обумовлювався відомими експериментальними даними щодо можливих біорезонансних частот (Кольцов Ю.В. та ін., 1999), вибором "чистих" вікон з білим шумом зі спектру електромагнітного фону в лабораторії, а також технічними можливостями модулятора.

На плазмі крові показано, що електромагнітний відгук від білків при комбінованому впливі модульованого терагерцевого (f = 465 ± 5 Гц) та міліметрового випромінювань (f = 485 Гц) склав у середньому 1 дБ; при частоті модуляції міліметрового випромінювання (f = 63 Гц) електромагнітний відгук підвищився і склав 2,0-2,5 дБ. Одночасно з опроміненням реєструвалася зміна гідратного оточення білкових структур за параметром діелектричної проникності L, мм.

За відсутності модуляції міліметрового випромінювання електромагнітний відгук білків плазми крові був незначний і становив 0,3-0,5 дБ.

На суспензіях еритроцитів показано, що найбільш виражений електромагнітний відгук мав місце при комплексному впливі терагерцевого випромінювання з частотою модуляції лазера f = 462 Гц і частотою модуляції міліметрового f = 63Гц при 2-хвилинній експозиції, який склав 3 дБ

При витримуванні тієї ж суспензій еритроцитів під лазером на протязі п'яти та десяти хвилин спостерігали зменшення електромагнітного відгуку, який становив 2 та 1 дБ відповідно. При вибраних режимах експозиції, як і у випадку з білками плазми, спостерігалося збільшення вмісту зв'язаної води. При модуляції лише частотами терагерцевого випромінювання, які становили f = 77 Гц, f = 290 Гц, f = 483 Гц, електромагнітний відгук суспензії еритроцитів становив лише 0,3-0,5 дБ.

Таким чином, електромагнітний відгук суспензії еритроцитів та білків плазми при дії терагерцевого випромінювання підсилювався при одночасній дії модульованого міліметрового випромінювання. При цьому в міліметровому діапазоні радіохвиль, а саме в області дисперсії діелектричної проникності вільної води, можна контролювати зміну гідратації клітин та білкових макромолекул при дії лазерного випромінювання.

Висновки

У дисертаційній роботі розв'язано актуальну наукову задачу дослідження електромагнітного відгуку біооб'єктів на комплексний вплив хвиль субміліметрового та міліметрового діапазонів, а також вивчено гідратне оточення біооб'єктів при дії біологічних реагентів, які викликають зміну комплексної діелектричної проникності біологічного матеріалу, що реєструється в міліметрового діапазоні радіохвиль.

1. Обґрунтовано застосування міліметрових, субміліметрових радіохвиль і їх комбінації для дослідження електромагнітного відгуку таких біооб'єктів, як суспензії еритроцитів, тромбоцитів, плазми крові, мікроводоростей, E.coli та сперми бугаїв-плідників за аналізом стану вільної - зв'язаної води за параметрами комплексної діелектричної проникності.

2. Вперше показано, що одночасний вплив модульованого міліметрового випромінювання (f = 63 Гц) і модульованого лазерного терагерцевого випромінювання (f = 465 Гц) на білки плазми крові і суспензії еритроцитів приводить до збільшення кількості зв'язаної води. Даний ефект збільшення гідратації біологічних структур залежить від часу експозиції.

3. Вперше показано, що дія лазерного терагерцевого випромінювання (f = 0,89 ТГц) на сперму бугаїв-плідників приводить до зниження гідратації біологічних структур, що супроводжується зменшенням рухливості статевих клітин. Даний ефект залежить від часу експозиції.

4. Результати досліджень, проведених на суспензіях еритроцитів і тромбоцитів, свідчать про те, що параметри діелектричної проникності можуть служити інструментарієм для вивчення гідратації клітин у присутності розчинів адреналіну, простагландину Е 2, дексаметазону та ехінацеї пурпурової з метою з'ясування фармацевтичного впливу комбінації цих препаратів.

5. Вперше за параметрами комплексної діелектричної проникності на культурі E.colі показано, що антибіотик, який впливає на мембрану клітин (ампіцилін), викликає більші зміни вмісту вільна - зв'язана вода, ніж антибіотики, що впливають на цитоплазматичні структури бактерій (стрептоміцин, левоміцетин), причому із збільшенням концентрації антибіотиків (з 6,5 до 65 мкг/мл) кількість зв'язаної води збільшується. За параметрами комплексної діелектричної проникності показано, що присутність у культурах мікроводоростей розчину ампіциліну (с = 909 мкг/мл) викликає збільшення кількості вільної води при витримуванні культур протягом 24 годин у режимі освітлення - темрява.

Таким чином, результати експериментів дозволяють рекомендувати для використання еякуляти із середніми показниками активності та концентрації сперміїв у біотехнології кріоконсервації сперми як більш оптимальні. Рекомендується використовувати HCN-лазер з потоком енергії 1,5 мВт/см 2 з робочою частотою терагерцевого випромінювання f = 0,89 ТГц для підвищення рухливості сперміїв в кріоконсервації, а також у медицині при нефармацевтичному лікуванні патологічних станів організму.

Основні публікацій за темою дисертації

1. Паршикова Т.В. Використання КВЧ-діелектрометрії для оцінки фізіологічного стану мікроводоростей / Т.В. Паршикова, Т.Ю. Щеголєва, В.Г. Колесніков, Н.В. Древаль // Вісник КНУ ім. Т. Шевченка. Сер. Біолог. науки. - 2003. - №39-41. - С. 80-82. (приймала участь в проведенні експерименту, обробці та обговоренні отриманих експериментальних даних).

2. Древаль Н.В. Анализ ключевых механизмов систем регуляции клеток для разработки экспресс-тестов индивидуальных особенностей организма при популяционных исследованиях / Н.В. Древаль, Т.Ю. Щеголева, В.Г. Колесников, Э.Н. Будянская, Л.Ф. Зюбанова // Експериментальна і клінічна медицина.- 2004.- №1.- С. 89-93. (приймала участь у підготовці біологічних об'єктів, виконанні експерименту, обробці та обговоренні отриманих даних, щодо ключових механізмів регуляції клітин, а також у підготовці роботи до друку).

3. Щеголева Т.Ю. Альтернативные экспериментам in vivo методологические подходы в решении медико-биологических и фармакологических задач с использованием диэлектрометрии в миллиметровом диапазоне радиоволн / Т.Ю. Щеголева, В.Г. Колесников, Н.В. Древаль // Биологический вестник.- 2000.- Т. 4, № 1-2.- С. 127-134. (приймала участь у підготовці оглядового матеріалу, підготовці об'єктів та проведені експерименту, разом із співавторами взяла участь в обговоренні результатів та написанні статті.)

4. Древаль Н.В. Использования радиофизических методов миллиметрового и терагерцевого диапазонов в сельском хозяйстве / Н.В. Древаль // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини.- 2007.- Ч. 1.- Вип. 14 (39).- С. 142-147.

5. Колесников В.Г. Взаимодействие макромолекулярных структур эритроцитов с электромагнитным излучением терагерцевого диапазона радиоволн / В.Г. Колесников, Н.В. Древаль, А.К. Кондакова [и др.] // Дерматологія та венерологія.- 2007.- №2 (36).- С. 9-15. (приймала участь у постановці експерименту, підготовці біологічного матеріалу, проведенні експерименту щодо комбінованої дії хвиль міліметрового та терагерцевого діапазонів, обговоренні та оформлені наукового матеріалу).

6. Древаль Н.В. Розробка методу для контролю рівня мікрофлори сперми бугаїв із застосуванням міліметрового та субміліметрового діапазонів радіохвиль / Н.В. Древаль, С.Ю. Рубан, Ю.Ю. Камєнєв, В.Г. Колесніков // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини.- 2006.-Ч. 1.- Вип. 13 (38).- С. 148-155. (приймала участь у постановці та проведенні експерименту, самостійно провела дослідження контролю контамінації мікрофлорою сперми, взяла участь в обговоренні та аналізі отриманих результатів, підготувала роботу до друку).

7. Щеголева Т.Ю. Сравнительный анализ молекулярных механизмов действия эхинацеи на клетки крови и спермы / Т.Ю. Щеголева, В.Г. Колесников, Н.В. Древаль // Вісник Полтавської державної аграрної академії.- 2003.- №1-2.- С. 110-116. (провела дослідження, разом з співавторами обґрунтувала механізми дії ехінацеї, підготувала роботу до друку).

8. Древаль Н.В. Использование метода КВЧ-диэлектрометрии для изучения фаз роста клеток Е.coli / Н.В. Древаль, Т.Ю. Щеголева, В.Г. Колесников, А.П. Белозоров, Е.И. Милютина // Радиофизика и электроника.- 2001.- Т. 6, № 2-3.- С. 341-344. (прийняла участь у постановці експерименту, самостійно підібрала та обґрунтувала вибір біологічних реагентів, підготувала роботу до друку).

9. Пат. 17488, МПК А 61 N 5/02. Cпосіб визначення впливу на біологічний об'єкт / Древаль Н.В., Колесников В.Г., Каменев Ю.Е., Филимонова А.А.; заявитель и патентообладатель Институт радиофизики и электроники им. А.Я. Усикова НАН Украины.- заявл. 05.05.2006; опубл. 15.09.2006, Бюл. №9. (разом із співавторами брала участь у підготовці біологічного матеріалу, розробці апаратурного комплексу).

10. Древаль Н.В. Анализ молекулярных механизмов действия экстракта эхинацеи пурпурной на клетки крови для создания новых биотехнологий / Н.В. Древаль, Т.Ю. Щеголева, В.Г. Колесников // С эхинацеей в третье тысячелетие: междунар. научная конференція 7-11 июля: Тез. докл.- Полтава, 2003.- С. 168-172.