Біологічні властивості вірусів лікарських рослин

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 578.3+633.88

БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ВІРУСІВ ЛІКАРСЬКИХ РОСЛИН

03.00.06 - вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КОРЕНЄВА АЛІНА АНАТОЛІЇВНА

КИЇВ - 2009



Дисертація є рукописом.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Міщенко Лідія Трохимівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник кафедри вірусології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Щербатенко Іван Степанович, Інститут мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фітопатогенних вірусів

кандидат біологічних наук, доцент Шевченко Жанна Петрівна, Уманський державний аграрний університет, доцент кафедри захисту рослин

Захист дисертації відбудеться “22” вересня 2009 р. о 16 ⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, проспект акад. Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “20” серпня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О. В. Молчанець



АНОТАЦІЯ

Коренєва А. А. Біологічні властивості вірусів лікарських рослин. - Рукопис. вірус лікарський рослина

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Дисертація присвячена дослідженню властивостей вірусів, що уражують лікарські рослини, які вирощуються в Україні. Методом візуальної діагностики виявлено чотири лікарські культури, що мали найвищий відсоток вірусного ураження: женьшень справжній (Panax ginseng C.A.Meуer), подорожник великий (Plantago major L.), валеріана лікарська (Valeriana officinalis L.) та ехінацея пурпурова (Echinacea purpurea (L.) Moench). Показано варіювання ураженості різних рослин, різноманітність симптомів захворювання та наявність домінуючих симптомів на певних культурах.

Експериментально підібрано та опрацьовано оптимальні методики для виділення збудників, за якими вперше отримані високоочищені та концентровані препарати вірусів і встановлена локалізація патогенів у рослинах.

Вивчені біологічні, морфологічні та фізико-хімічні властивості виявлених вірусів. Встановлено молекулярну масу вірусних структурних білків. Показано, що геноми вірусів, які інфікують рослини Panax ginseng, Plantago major та Valeriana officinalis, представлені одноланцюговою РНК. Методом ІФА та електронної мікроскопії доведено, що вірусна хвороба рослин Echinaceа purpurea спричинена вірусом огіркової мозаїки (ВОМ).

Встановлено негативний вплив вірусної інфекції на метаболізм у рослині та кількісний вміст основних біологічно активних речовин у рослинах Panax ginseng та Echinacea purpurea.

Вперше отримано поліклональні кролячі антисироватки до вірусів, виділених з Valeriana officinalis та Panax ginseng, які можуть використовувася для діагностики вірусів методом імуноферментного аналізу.

Ключові слова: вірусні інфекції, діагностика фітовірусів, лікарські рослини, Panax ginseng C.A.Meуer, Plantago major L., Valeriana officinalis L., Echinaceа purpurea L., біологічно активні речовини.



АННОТАЦИЯ

Коренева А. А. Биологические свойства вирусов лекарственных растений. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Диссертация посвящена изучению свойств вирусов, инфицирующих лекарственные растения, которые выращиваются на Украине. Методом визуальной диагностики выявлено четыре лекарственные культуры, которые имели наивысший процент вирусного поражения: женьшень настоящий (Panax ginseng C.A.Meуer), подорожник большой (Plantago major L.), валериана лекарственная (Valeriana officinalis L.) и эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea (L.) Moench.). Показано разнообразие симптомов заболеваний и наличие доминирующих симптомов на каждой культуре.

Экспериментально подобраны и отработаны методики выделения возбудителей, используя которые впервые получены высокоочищеные концентрированые препараты вирусов и установлена локализация патогенов в растениях.

Изучены биологические, морфологические и физико-химические свойства выявленных вирусов. Установлены морфология и локализация вирусов в растениях. Определены молекулярные массы вирусных структурных белков, которые составляют для вируса, выделенного из эхинацеи пурпурной, 26±0,5 кДа, из валерианы лекарственной - 35±0,5 и 41±0,5 кДа, палочковидного вируса женьшеня размером 95±10х15 нм - 23±0,5 кДа. Также установлено, что геномы вирусов, которые инфицируют растения Panax ginseng, Plantago major та Valeriana officinalis, представлены одноцепочной РНК. Методом ИФА и электронной микроскопии доказано, что заболевание растений Echinaceа purpurea вызвано вирусом огуречной мозаики размером 29,5±0,5 нм в диаметре.

Установлено негативное влияние вирусной инфекции на метаболизм растений и количественное содержание основных биологически активних веществ в растениях Panax ginseng и Echinacea purpurea. В инфицированных растениях Panax ginseng содержание углеводов увеличивается на 26-57% в сравнении с контролем, в Echinaceа purpurea количество их уменьшается на 67-86%. Содержание сапонинов в корнях больных растений Panax ginseng уменьшается вдвое по сравнению со здоровыми. В инфицированных растениях Echinaceа purpurea отмечено на 15 % меньше гидроксикоричных кислот и на 16-26% полисахаридов, чем в здоровых.

Впервые получены поликлональные кролячьи антисыворотки к вирусам, выделенным из Valeriana officinalis и Panax ginseng, для использования их в диагностике вирусов методом иммуноферментного анализа.

Ключевые слова: вирусные инфекции, диагностика фитовирусов, лекарственные растения, Panax ginseng C.A.Meуer, Plantago major L., Valeriana officinalis L., Echinaceа purpurea L., биологически активные вещества.



SUMMARY

Koreneva A. A. Biological properties of medicinal plants' viruses. - Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 - virology. - Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kyiv, 2009.

The thesis dedicated to study of virus properties witch infecting medicinal plants growing in Ukraine. Using visual diagnostics method it was found that ginseng (Panax ginseng C.A.Meуer), plantain (Plantago major L.), valerian (Valeriana officinalis L.) and echinacea (Echinacea purpurea (L.) Moench.) are infected more than other medicinal cultures. Variety of disease symptoms and presence of dominant symptoms on some plants is shown.

Experimental techniques for virus isolation are selected and worked up by author. As a result purified and concentrated virus preparations were obtained and localization of viruses in plants is found.

Morphological, biological, chemical and physical properties of isolated viruses are studied. Molecular weight of structural proteins of viruses is investigated. It was shown that genomes of viruses witch infecting Panax ginseng, Plantago major and Valeriana officinalis plants are presented with single strained RNA. Echinaceа purpurea plants infected with cucumber mosaic virus 29,5±0,5 nm in diameter that was proved with electron microscopy method and ELISA.

Negative effect of viruses on the Panax ginseng and Echinacea purpurea plants metabolism and content of biologically active substances is revealed.

For the first time polyclonal rabbit antiserum to viruses isolated from Valeriana officinalis and Panax ginseng plants is received witch could be used for virus diagnostics.

Key words: viral infections, diagnostics of plant viruses, medicinal plants, Panax ginseng C.A.Meуer, Plantago major L., Valeriana officinalis L., Echinaceа purpurea L., biologically active substances.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Більшість лікарських рослин в Україні вирощуються у культурі. Складність культивування пов'язана з вимогами цих рослин до умов вирощування. На відміну від природних фітоценозів, при інтродукуванні, пристосовуючись до умов агроценозів, лікарські рослини стають виснаженими і більш чутливими до фітопатогенів різної природи. Більшість лікарських культур є багаторічними рослинами, що приводить до накопичення інфекції. Це зумовлює прогресуюче зростання концентрації патогенів у рослинах, в тому числі і збудників вірусних захворювань.

Актуальність вивчення вірусів лікарських культур зумовлена тим, що вони становлять серйозну загрозу, так як завдають рослинам подвійної шкоди: викликають суттєве зменшення врожаїв через пригнічений розвиток уражених рослин, а також є причиною значних змін вмісту та складу біологічно активних речовин, що в кінцевому результаті призводить до погіршення якості сировини [Хотин Ю. А., 1974; Бойко А. Л., 1999; Bellardi M. G., 2001; Dikova В., 2006, 2007]. Однак, на сьогодні в Україні існують лише поодинокі повідомлення про вірусні захворювання лікарських рослин [Максименко Л. А. та ін., 1998; Шевченко Т. П., 2001; Сенчугова Н. А., 2003]. Широкомасштабних обстежень плантацій цих рослин в Україні на наявність вірусних захворювань не проводилось. Тому, зважаючи на це, проведення моніторингу вірусних захворювань лікарських рослин в Україні та вивчення біологічних властивостей їх збудників є актуальним.

Відомо, що відбір форм лікарських та ароматичних рослин для залучення у селекційний процес необхідно проводити на основі оцінки стійкості лікарських культур до ураження фітопатогенами та впливу останніх на фізіолого-біохімічні показники сировини. Тому оцінка впливу вірусів на фармацевтичну якість рослинної сировини задля виявлення найбільш шкодочинних із них дасть змогу створити базу даних цих патогенів та розробити програми захисту і практичні рекомендації науково-дослідним установам та господарствам України, що займаються вирощуванням лікарських рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках тематичного плану науково-дослідної роботи кафедри вірусології Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Вивчення екологічних особливостей та біоіндикаторних властивостей різних організмів та їх угруповань в умовах трансформованого середовища для розв'язання проблем біобезпеки України” (реєстраційний номер 06БФ036-04); теми 08ДП 036-17 “Діагностика вірусних інфекцій лікарських рослин та розроблення систем захисту культур від фітопатогенів” згідно договору з МОН України на держзамовлення №ДЗ/287-2008 від 23.05.2008 (№ держреєстрації 0108U006631); проекту Ф 25.5/113-2007 „Гравічутливість системи "вірус - рослина-хазяїн" та її використання для зниження репродукції вірусів” Державного фонду фундаментальних досліджень Міністерства освіти і науки України (№ держреєстрації 0107U009135).

Мета та завдання дослідження. Метою досліджень було провести моніторинг збудників вірусних захворювань лікарських рослин в Україні та вивчити біологічні властивості вірусів.

Для досягнення мети необхідно було виконати наступні завдання:

- обстежити промислові плантації лікарських рослин на наявність вірусних захворювань;

- вивчити розповсюдженість та характер прояву вірусних інфекцій лікарських рослин;

- виділити віруси, що уражують лікарські рослини;

- дослідити біологічні та фізико-хімічні властивості виявлених вірусів;

- визначити шкодочинність вірусів;

- створити тест-системи для діагностики вірусів.

Об'єкт дослідження - віруси, виділені з рослин женьшеню справжнього (Panax ginseng C.A.Meуer), подорожника великого (Plantago major L.), ехінацеї пурпурової (Echinacea purpurea (L.) Moench.), валеріани лікарської (Valeriana officinalis L.).

Предмет дослідження - біологічні, морфологічні, фізико-хімічні, серологічні властивості виділених вірусів.

Методи дослідження. Для вивчення властивостей вірусів використовували наступні методи досліджень: візуальна діагностика; метод біотестування (встановлення природи захворювання); трансмісивна електронна мікроскопія (вивчення морфології та локалізації віріонів); виділення вірусів із рослинного матеріалу; виділення та визначення типів нуклеїнових кислот вірусів; електрофорез (визначення молекулярної маси капсидних білків вірусів та нуклеїнових кислот); імуноферментний аналіз (ідентифікація вірусів та визначення титрів отриманих антисироваток); отримання поліклональних кролячих антисироваток до вірусів, статистичні методи обробки даних.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено обстеження промислових плантацій чотирьох лікарських культур України - Panax ginseng C.A.Meуer, Plantago major L., Echinacea purpurea (L.) Moench., Valeriana officinalis L. на ураженість їх вірусами. Показано варіювання ураженості різних рослин, наявність великої різноманітності симптомів одного й того ж захворювання та наявність домінуючих симптомів на кожній із культур. Вперше виявлені віруси, що інфікують такі лікарські рослини як Panax ginseng C.A.Meуer, Plantago major L., Echinacea purpurea (L.) Moench., Valeriana officinalis L., встановлена локалізація їх у рослинах. В процесі досліджень вивчено біологічні, морфологічні та фізико-хімічні властивості виявлених вірусів. Встановлено негативний вплив вірусної інфекції на метаболізм і кількісний вміст основних біологічно активних речовин у сировині рослин Panax ginseng та Echinacea purpurea.

Практичне значення одержаних результатів. Результати моніторингу ураженості вірусами лікарських рослин представляють інтерес для інтегрованих систем їх захисту в Україні. Експериментально підібрано та опрацьовано оптимальні методики для виділення вірусів, за якими вперше отримані високоочищені та концентровані їх препарати. Отримано високоспецифічні поліклональні кролячі антисироватки до двох вірусів, які можуть застосовуватися в подальшому для діагностики вірусних захворювань таких цінних лікарських культур як Panax ginseng та Valeriana officinalis. Розроблені практичні рекомендації по захисту лікарських культур від вірусних інфекцій. Звільнення рослин Panax ginseng від вірусної інфекції за тривалого кліностатування може бути застосоване для одержання безвірусного посадкового матеріалу в новітніх біотехнологіях. Інформація про зниження біологічно активних речовин у лікарських рослинах під впливом вірусної інфекції може бути використана у технології виготовлення препаратів з рослинної сировини.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Інформаційних пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем експерименту, отримання експериментальних даних та їх попереднє узагальнення автором дисертації здійснено особисто. Формулювання мети і задач дослідження, заключний аналіз, підготовку публікацій за отриманими результатами та представлення їх на наукових конференціях здійснено за участю наукового керівника д.б.н. Л. Т. Міщенко. Здобувачем зібрана та проаналізована наукова література за темою дисертації, розроблені та удосконалені методичні підходи щодо виконання поставленої мети, одержані основні експериментальні дані, узагальнено отримані результати, проведено їх статистичну обробку. В роботах, опублікованих у співавторстві, вірусологічні дослідження за темою дисертації виконані дисертантом особисто, права співавторів не порушені.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень і положення дисертації доповідались та обговорювались на: ІІ-ій Міжнародній науково-практичній конференції ”Екологія: Проблеми адаптивно-ландшафного землеробства” (Івано-Франківськ, 2006); 13-th International Scientific-practice Conference ”Human and nature safety” (Kaunas, Lithuania, 2007); Третьому національному конгресі з біоетики (Київ, 2007); V міжнародній конференції „Біоресурси та віруси” (Київ, 2007); ІІІ Міжнародній конференції ”Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти” (Львів, 2007); Міжнародній науковій конференції ”Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства” (Мінськ, Білорусь, 2007); Міжнародній науковій конференції молодих вчених ”Актуальные проблемы интегрированной защиты растений” (Мінськ, Білорусь, 2007); VII Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів ”Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2007); Міжнародній науково-практичної конференції ”Біорізноманіття: теорія, практика та методичні аспекти вивчення в загальноосвітній та вищій школі” (Полтава, 2008); International Conference ”Responses of Plants to Environmental Stresses” (Elena, Bulgaria, 2008); Науково-практичній конференції „Екологічна безпека сільськогосподарського виробництва” (Київ, 2008); International Conference ”Life in Space for Life on Earth” (Angers, France, 2008); First International Transcaucasus Conference on Plant Pathology (Tbilisi, Georgia, 2008); Третій міжнародній науковій конференції „Відновлення порушених природних екосистем” (Донецьк, 2008); Міжнародній науково-практичній конференції „Біоетика в системі охорони здоров'я і медичної освіти” (Львів, 2009); V міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ біології” (Львів, 2009).

Публікації. Результати досліджень представлені в 26 друкованих роботах, з них 6 статей у профільних вітчизняних та зарубіжних виданнях, затверджених ВАК України, 1 патент, 5 статей у збірниках наукових праць, 14 тез у матеріалах конгресів, з'їздів та конференцій. Права співавторів не порушено.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 152 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень та їх обговорення), висновків, списку використаних джерел, що містить 226 джерел, з них 87 - зарубіжних авторів. Робота ілюстрована 11 таблицями, 59 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів, в яких наведені сучасні дані стосовно значення рослин женьшеню справжнього, подорожника великого, валеріани лікарської та ехінацеї пурпурової, а також вірусних захворювань цих культур і властивостей їх збудників.

Матеріали та методи досліджень

Об'єктом досліджень були віруси, виділені з рослин женьшеню справжнього (Panax ginseng C. A. Meуer), подорожника великого (Plantago major L.), ехінацеї пурпурової (Echinacea purpurea (L.) Moench.), валеріани лікарської (Valeriana officinalis L.).

Методом візуальної діагностики проводили оцінку ураженості рослин та відбирали зразки рослинного матеріалу (листки, стебла, суцвіття, плоди і корені) для подальших досліджень.

Для доведення інфекційної природи захворювань лікарських рослин та вивчення біологічних властивостей вірусів застосовували метод біотестування шляхом механічної інокуляції 13-ти рослин-індикаторів: Datura stramonium L., D. metel L., Nicotiana tabacum L. cv. Samsun, Trapeson, N. glutinosa L., Solanum nigrum L., Chenopodium album L., Chenopodium quinoа Willd., Chenopodium amaranticolor Coste et Reyen., Chenopodium hybridum L., Phaseolus vulgaris L.cv. Pinto, Gomphrena globosa L., Pisum sativum L.

Виділення вірусів із уражених рослин Panax ginseng, Plantago major, Echinacea purpurea, Valeriana officinalis проводили згідно декількох відомих методик у нашій модифікації [Новіков В. К., 1982; Максименко Л. А. та ін., 1998; Brakke M. R., 1990; Tomlinson J. A. et. al, 1959].

Морфологію вірусних часток вивчали методом трансмісивної електронної мікроскопії. Негативне контрастування очищених вірусних препаратів проводили 2% розчином фосфорно-вольфрамової кислоти протягом 2 хв [Салига Ю. Т., 1999]. Препарати досліджували в полі зору електронних мікроскопів JEM 1230 (JEOL, Японія) та ЕМ-125 (Суми, Україна).

Концентрацію вірусних препаратів вимірювали спектрофотометрично при довжинах хвиль 260 нм та 280 нм [Атабеков И. Г., 1981]. Концентрацію білка у вірусних препаратах визначали методом Лоурі-Фоліна за величиною поглинання при довжині хвилі 750 нм [Кучеренко М. Є., 2001].

Для визначення молекулярної маси капсидних білків виділених вірусів проводили електрофорез за Laemmli в 14% поліакріламідному розділяючому та 5% концентруючому гелі з подальшим фарбуванням кумасі блакитним R-250 [Laemmli U. K., 1970]. Застосовували набори стандартних маркерних білків: LMW (кДа) - 66.0, 45.0, 36.0, 29.0, 20.1, 14.2 (“Pharmacia”, Швеція), а також - 66.0, 45.0, 36.0, 29.0, 24.0, 20.0, 14.2, 6.5 кДа (“Sigma”, США). Електрофорез проводили у комерційному апараті для вертикального електрофорезу (“Хійу Каллур”, Латвія) при напрузі 40 мА протягом 1,5 год.

РНК виділяли з очищених суспензій вірусів фенольно-детергентним [Kobayashi Y. O., 2005] та сольовим методом із використанням хлористого літію і сечовини [Хеймс Б., 1987]. РНК вірусів фракціонували горизонтальним електрофорезом у 0,8% агарозному гелі в 0,089 М тріс-боратному буфері, рН 8,0, фарбування здійснювали бромистим етидієм. Визначення типу нуклеїнових кислот вірусів проводили за кольоровими реакціями на вуглеводні компоненти - рибозу і дезоксирибозу. Наявність РНК у вірусних препаратах тестували методом виявлення рибози за допомогою орцину, присутність ДНК - за реакцією дезоксирибози з дифеніламіном у кислому середовищі в присутності ацетальдегіду [Дэвидсон Д., 1987]. Наявність у пробах дволанцюгових нуклеїнових кислот перевіряли за величиною гіперхромного ефекту при довжині хвилі 260 нм [Филиппович Ю. Б., 1975].

Твердофазний імуноферментний аналіз (сендвіч-варіант) проводили у 96-лункових планшетах (“Labsystems”, Фінляндія). В якості антивидових антитіл використовували антикролячі антитіла, кон'юговані лужною фосфатазою (“Dianova”, Німеччина). Результати реакції реєстрували на рідері Termo Labsystems Opsis MR (США) із програмним забезпеченням Dynex Revelation Quicklink при довжинах хвиль 405 / 630 нм. За достовірні приймали значення, що перевищували негативний контроль у три рази.

Поліклональні антисироватки до вірусів отримували шляхом імунізації кролів, яку проводили внутрішньом'язево і підшкірно з повним ад'ювантом Фрейнда та внутрішньовенно з фізіологічним розчином [Гнутова Р. В., 1993]. Концентрація вірусу становила 1 мг/мл при кожному введенні. Титр отриманих сироваток визначали методом непрямого ІФА. В якості контролю слугувала нормальна кроляча сироватка.

Кількісний вміст вуглеводів у рослинах Panax ginseng C. A. Meуer та Echinaceа purpurea (L.) Moench. визначали йодометричним методом [Починок Х. Н., 1976]. Контролем були здорові рослини. Кількісний вміст сапонінів у коренях Panax ginseng визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 498 нм, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин диметиламінобензальдегиду та оцтової безводної кислоти [Государственная фармакопея СССР, 1987]. Дослідження вмісту суми гідрокискоричних кислот у рослинах Echinaceа purpurea здійснювали спектрофотометрично при довжині хвилі 325 нм та вимірювали у перерахунку на цикорієву кислоту та абсолютну суху вагу сировини [Куркин В. А., 1998]. Вміст полісахаридів у рослинах Echinaceа purpurea визначали методом екстракції етиловим спиртом. Кількісний склад полісахаридів вираховували у відсотках у перерахунку на абсолютно суху речовину [Проект ВФС “Трава эхинацеи”, 2000].

Мікрогравітацію моделювали в кліностатах «Цикл-2» і КГ-8 за умов вертикального та горизонтального кліностатування [Патент на корисну модель № 19360, 2006]. Насіння вірусінфікованих рослин женьшеню справжнього у контейнерах поміщали в кліностат. Тривалість кліностатування становила 30 діб. Контролем було насіння хворих рослин женьшеню, яке перебувало у наземних стаціонарних умовах.

Статистичний аналіз експериментальних даних проводили за параметричними критеріями нормального розподілу варіант, стандартне відхилення середніх значень - за загальноприйнятою методикою з використанням комп'ютерної програми управління базами даних MS EXCEL 2000.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Біологічні властивості вірусів

1.1. Симптоми вірусного ураження лікарських рослин. Протягом 2006-2008 рр. нами було проведено обстеження промислових плантацій лікарських рослин науково-дослідних установ України на наявність симптомів вірусної інфекції. При цьому виявлено чотири культури, що мали найвищий відсоток ураження: женьшень справжній (Panax ginseng C. A. Meуer), подорожник великий (Plantago major L.), валеріана лікарська (Valeriana officinalis L.) та ехінацея пурпурова (Echinacea purpurea (L.) Moench.).

Вірусоподібні захворювання на культурі Panax ginseng C.A.Meуer проявлялося переважно у вигляді редукції квітконосу та опадання плодів і зрідка - затримці росту рослин. Найпоширенішими була жовта хлоротична та прижилкова мозаїка, вузьколистість, сильна деформація листкової пластинки. Частка рослин з цими симптомами становила 30 - 65% від їх загальної кількості.

Реакція рослин-індикаторів, інокульованих соком, отриманим із лікарських рослин, свідчить про інфекційну природу виявлених захворювань. Доведенням вірусної етіології виявлених нами захворювань була поява некротичної реакції на лікарських рослинах, заражених соком попередньо інокульованих рослин-індикаторів.

2. Морфологічна характеристика вірусів. Для вивчення морфологічних особливостей вірусів та встановлення їх місця локалізації у рослинах використовували метод електронної мікроскопії. У рослинах Panax ginseng виявлено вірусні частки, локалізовані у різних частинах рослин, зокрема у плодах - нитковидні розміром 1200±20х11-12 нм; у насінні - паличковидні 460±10х11-12 нм. Також у листках - нитковидні частки різного розміру 2360±20х18 нм (рис.5 а), 525±30х11 нм (рис. 5 г), 1200±20х11-13 нм та паличковидні віріони розміром 95±10х15нм (рис.5 б), 190±10х20 нм і 320±15х17 нм (рис.5 в). Крім того, вірусні частки також присутні в кореневій шийці інфікованих рослин женьшеню.

3. Фізико-хімічна характеристика вірусів

3.1. Концентрація вірусних препаратів. З метою отримання концентрованих та очищених препаратів вірусів, що уражують лікарські рослини у роботі було застосовано декілька загальноприйнятих методик виділення вірусів із рослинного матеріалу: Y-вірусу картоплі - за Новіковим В. К. зі співавторами, вірусу смугастої мозаїки пшениці - за Brakke M. K. et. al, вірусу огіркової мозаїки - Tomlinson et. al та Максименко Л. А. і ін.

Проведені нами дослідження показали, що методика Новікова В. К. є ефективною для виділення вірусів із женьшеню справжнього розмірами 2360±20Ч18 нм і 320±20Ч17 нм, а також валеріани лікарської та подорожника великого. Методика Максименко Л. А. і ін. виявилася ефективною для виділення вірусів женьшеню 525±25Ч11 нм та 95±10Ч15 нм, а методика Tomlinson et. al - для вірусу з ехінацеї. Таким чином, у результаті досліджень нами експериментально підібрано та опрацьовано оптимальні методики для виділення вірусів із лікарських рослин, які дали змогу вперше отримати концентровані препарати вірусів, які уражують дані рослини.

3.2. Електрофоретичні дослідження вірусних білків. Для визначення молекулярної маси капсидних білків вірусів, виділених з лікарських рослин, був використаний метод електрофорезу білків у поліакриламідному гелі. Електрофоретичний аналіз капсидного білка вірусу, виділеного з рослин Valeriana officinalis L., показав наявність двох пептидів із молекулярною масою 35±0,5 та 41±0,5 кДа, із надземних органів рослин ехінацеї пурпурової - 26±0,5 кДа, паличковидного вірусу із женьшеню 95±10х15 нм - 23±0,5 кДа з надземної частини женьшеню справжнього; В - препарат вірусу, виділеного з ехінацеї пурпурової

3.3. Властивості нуклеїнових кислот вірусів лікарських рослин. Для визначення типів вірусних нуклеїнових кислот застосовували метод тестування на наявність рибози і дезоксирибози. В результаті було встановлено, що виділені препарати нуклеїнових кислот належать до РНК.

Розділення двох комплементарних ланцюгів РНК при нагріванні супроводжується різким збільшенням поглинання УФ променів препаратом НК (до 40%) - гіперхромний ефект. Проведений нами аналіз показав, що для досліджуваних препаратів РНК цей показник був низьким - до 20%. Таким чином, низький гіперхромний ефект та наявність лише однієї електрофоретичної фракції РНК свідчать про належність досліджуваних вірусів до олРНК-вмісних вірусів рослин.

4. Ідентифікація вірусів. Для ідентифікації виявлених вірусів застосовували метод ІФА. Виходячи з даних літератури та отриманих нами результатів дослідження морфології виявлених вірусів, їх фізико-хімічних властивостей, кола рослин-хазяїв, для проведення ІФА нами було підібрано та протестовано антисироватки до вірусів, що за морфологією подібні до виявлених та є широко розповсюдженими на території нашої країни. В результаті проведених досліджень встановлено, що у листках та насінні ехінацеї пурпурової наявний вірус огіркової мозаїки (ВОМ). Ці дані узгоджуються з літературою та отриманими нами в результаті проведення біотестування, електрофоретичних досліджень капсидного білка вірусу та аналізу нуклеїнової кислоти. Водночас, жодна з досліджуваних антисироваток не прореагувала з вірусами, які були виділені з женьшеню справжнього, валеріани лікарської та подорожника великого. Це може вказувати на те, що виявлені віруси є поки ще неописаними або ж є відомими вірусами з дещо зміненими властивостями внаслідок потрапляння їх у нові рослини-хазяї, тобто у лікарські рослини, що безумовно ускладнює їх ідентифікацію.

5. Вплив вірусної інфекції на якість лікарської сировини. Відомо, що відбір форм лікарських та ароматичних рослин для залучення у селекційний процес необхідно проводити на основі оцінки стійкості лікарських культур до ураження фітопатогенами та їх впливу на фізіолого-біохімічні показники сировини. Вивчення впливу вірусної інфекції на якість сировини, яку отримують з лікарських рослин, що вирощуються на території України, до цього часу не проводилось. Тому оцінка впливу вірусів на кількісний вміст біологічно активних речовин у лікарських рослинах є актуальною.

5.1. Дослідження впливу вірусної інфекції на вміст сапонінів у рослинах

Panax ginseng. Основним показником якості сировини Panax ginseng C. A. Meyer є сапоніни, максимальний вміст яких відмічається у коренях рослин. У результаті досліджень встановлено, що вміст сапонінів у коренях вірусінфікованих рослин женьшеню складає 7,7%, тобто майже вдвічі менше порівняно з контрольними зразками - 12,5%.

За стандартами України така сировина залишається придатною для використання у фармакології (вміст сапонінів у сировині женьшеню справжнього не повинен бути менше 3,5 %). Однак, зважаючи на складність вирощування цієї культури в умовах України, таке суттєве погіршення якості сировини може спричиняти значні економічні збитки.

5.2. Дослідження впливу вірусної інфекції на вміст гідроксикоричних кислот у рослинах Echinaceа purpurea. Головними показниками якості та стандартизації лікарської сировини з рослин Echinacea purpurea (L.) Moench. є похідні гідроксикоричних кислот (ГОКК), серед яких основним компонентом є цикорієва кислота. Виходячи з цього, було вирішено визначити вплив ВОМ на кількісний вміст похідних ГОКК у перерахунку на цикорієву кислоту. Нами з'ясовано, що вірус огіркової мозаїки інфікує рослини ехінацеї пурпурової на плантаціях України та призводить до зменшення суми похідних гідроксикоричних кислот.

Так, проведені нами дослідження показали, що у рослинах ехінацеї пурпурової, інфікованих ВОМ, міститься 2,3% ГОКК, а в контролі цей показник значно вищий і становив 2,7%.

5.3. Дослідження впливу вірусної інфекції на вміст полісахаридів у рослинах Echinaceа purpurea. Вивчення вмісту полісахаридів у рослинах ехінацеї пурпурової, яке проводилось протягом 2006 - 2007 рр., показало, що їх містилося у хворих рослинах значно менше, ніж у здорових. Так, у хворих рослинах ехінацеї, відібраних у 2006 р., кількість полісахаридів становила 5,6 %, що на 2 % нижче порівняно з контролем (7,6%) .

Тенденцію до погіршення якості сировини, яку отримують з уражених рослин, відмічено і в умовах 2007 року. Як бачимо вміст полісахаридів у хворих рослинах знизився на 2 %. Так, у хворих рослин цей показник становив 7,7 %, а у рослин контрольного варіанту - 9,2 %. Відомо, що рослинна сировина ехінацеї, яка містить менше 7% полісахаридів, не відповідає стандарту та не може бути використана у фармацевтичній промисловості. Отже, наші дослідження показують, що інфекція, викликана ВОМ, робить сировину з ехінацеї пурпурової непридатною для використання при виготовленні лікарських препаратів.

Таким чином, проведені нами дослідження з оцінки впливу вірусної інфекції на вміст біологічно активних речовин у вірусінфікованих рослинах женьшеню справнього та ехінацеї пурпурової показали, що кількісний вміст сапонінів у женьшені справжньому та гідроксикоричних кислот і полісахаридів у ехінацеї пурпуровій знижений. Потрібно наголосити, що дослідження виявили суттєве зменшення вмісту полісахаридів у рослинах ехінацеї, інфікованих вірусом огіркової мозаїки, це дає нам можливість стверджувати, що така рослинна сировина не є непридатною для використання її у виробництві лікарських препаратів. Відомо, що відповідно до вимог Державної Фармакопеї України у розробці лікарських препаратів на основі рослинної сировини обов'язковим є тестування її на мікробіологічну чистоту, але водночас вона лише включає перевірку тільки на наявність бактерій та грибів. Тому, зважаючи на отримані нами результати, що показали суттєве зниження біологічно активних речовин у лікарських рослинах під впливом вірусів, вважаємо доцільним включити до існуючих технологій виготовлення лікарських фітопрепаратів перевірку сировини на наявність вірусів.

5.4. Дослідження впливу вірусної інфекції на вміст вуглеводів у рослинах Panax ginseng та Echinaceа purpurea. Нами було встановлено, що вірусна інфекція значно впливає на вміст вуглеводів у рослинах ехінацеї пурпурової. При дослідженні матеріалу, отриманого з різних органів, спостерігалася тенденція до зниження у них кількості вуглеводів. В листках уражених рослин женьшеню справжнього вміст цукрів був вищим порівняно із здоровими рослинами, зокрема моноцукрів - на 26%, сахарози - на 102 %, загальна сума цукрів - на 57%.

З літератури відомо, що накопичення вуглеводів у листках вірусінфікованих рослин обумовлене впливом вірусу на клітини листка і пов'язане із змінами активності ферментних систем, які контролюють взаємоперетворення різних форм вуглеводів [Watson М. А., 1951]. Проведені нами дослідження показали зміну вмісту вуглеводів у вірусінфікованих рослинах женьшеню та ехінацеї, що може призвести до погіршення їх стану, так як ці сполуки є не тільки джерелом енергії рослин, але і вихідним матеріалом для біосинтезу. До того ж рослини стають більш чутливими до зараження патогенами різної етіології, в тому числі і вірусної, що безперечно значно погіршує їх якість як вихідного матеріалу для отримання лікарських препаратів.

6. Отримання поліклональних антисироваток до вірусів. Своєчасна діагностика вірусів є однією з важливих задач у системі захисних заходів. Однак, в Україні повністю відсутні будь-які діагностичні системи для вірусів, що уражують лікарські рослини, а тому нами було здійснено спробу створення їх для подальшої ідентифікації вірусних антигенів методом ІФА. При цьому нами отримано специфічну поліклональну кролячу антисироватку до вірусу, ізольованого з надземної частини рослин валеріани лікарської розміром 530±20 Ч 11 нм з титром 1: 1024 та робочим розведенням1:128.

Таким чином, отримані нами антисироватки можуть використовуватися в подальшому для діагностики вірусних захворювань цінних лікарських культур Panax ginseng та Valeriana officinalis, що дасть змогу уникнути втрат урожаїв цих рослин та зниження біологічно активних речовин у лікарській рослинній сировині.



ВИСНОВКИ

Вперше із лікарських рослин женьшеню справжнього, валеріани лікарської, ехінацеї пурпурової та подорожника великого, що вирощуються в Україні, виділено та досліджено віруси: встановлено їх морфологію і локалізацію, вивчено біологічні та фізико-хімічні властивості, визначено шкодочинність. Головні наукові та практичні результати роботи сформульовано у наступних висновках:

1. Встановлено, що рослини женьшеню справжнього (Panax ginseng) із симптомами мозаїки, вузьколистості та деформації листкової пластинки уражені вірусами, локалізованими у різних частинах рослин:

-- нитковидні розміром 1200±20х11-12 нм - у плодах,

-- паличковидні розміром 460±10х11-12 нм - у насінні,

-- нитковидні розміром 2360±20х18 нм та 525±30х11 нм, а також паличковидні віріони розміром 95±10х15нм і 320±15х17 нм) - у листках та стеблах.

2. У листках рослин подорожника великого (Plantago major) з симптомами мозаїки, зменшення розмірів, сильної деформації та звуження листкової пластинки, виявлено нитковидно-паличковидні віруси розміром 270±10х15 нм.

3. Рослини валеріани лікарської (Valeriana officinalis) з симптомами затримки росту та мозаїки на листках містили нитковидні вірусні частки, які були локалізовані у таких надземних органах рослини як листки і стебла та мали розміри 530±20х11-12 нм. Із кореневої системи цих рослин виділено паличкоподібні віріони розміром 350±15х15 нм.

4. Із надземних органів, а також насіння рослин ехінацеї пурпурової (Echinaceа purpurea), на яких виявлено жовту мозаїку та жовту кільцеву плямистость на листках, шиловидність та скручування листків, редукцію генеративних та вегетативних органів, виділено сферичні вірусні частки діаметром 29,5±0,5 нм, що ідентифіковані як вірус огіркової мозаїки.

5. Позитивна реакція на рибозу в препаратах нуклеїнових кислот вірусів, виділених із Panax ginseng, Plantago major і Valeriana officinalis, та гіперхромний ефект нижче 20 % свідчать про те, що геноми цих вірусів представлені одноланцюговою РНК.

6. В інфікованих вірусами рослинах Panax ginseng вміст цукрів порівняно з неураженими підвищений на 26 - 57%, а у рослинах Echinaceа purpurea він знижений на 67-86%, що свідчить про значний вплив вірусної інфекції на метаболічні процеси у рослинах.

7. Вміст сапонінів у коренях уражених рослин Panax ginseng зменшувався вдвічі порівняно зі здоровими. У інфікованих рослинах Echinaceа purpurea відмічено зменшення гідроксикоричних кислот на 15 % та полісахаридів на 16-26%, що говорить про негативний вплив вірусної інфекції на кількісний вміст біологічно активних речовин.

8. Вперше отримано поліклональні кролячі антисироватки до вірусів, виділених з Valeriana officinalis та Panax ginseng, з титром 1:1024 та 1:512 відповідно і робочим розведенням 1:128, які можуть використовуватися для діагностики вірусів методом імуноферментного аналізу.



ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Коreneva А. Viral diseases of Valeriana officinalis L. / А. Коreneva, L. Mishchenko // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка, випуск „Біологія.” - 2008. - № 51. - C. 28-29.

/ Дисертантом проведено пошук літератури, проведено діагностику вірусних інфекцій та підібрано та опрацьвано методику отримання вірусних препаратів, підготовлено статтю до друку.

2. Коренєва А. Електронно-мікроскопічне дослідження збудників вірусних хвороб Panax ginseng C. A. Meyer / А. Коренєва, Л. Міщенко // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка, випуск „Біологія”. - 2007. - № 49-50. - С. 39-41.

/ Дисертантом визначено ідею роботи, проведено пошук та узагальнено літературні дані. Виконано електронномікроскопічні дослідження вірусів. Підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено особисто.

3. Коренєва А. Діагностика вірусних інфекцій - один із аспектів екологічно безпечної технології вирощування лікарських рослин / А. Коренєва, Л. Міщенко // Агроекологічний журнал. - 2008. - червень. - С. 114-116.

/ Дисертантом проаналізовано літературу, проведено визначення молекулярних мас капсидних білків досліджуваних вірусів, здійснено інтерпретацію отриманих результатів та підготовлено статтю до друку. Спільно обговорено результати.

4. Коренева А. А. Своевременная диагностика вирусных инфекций - важный элемент технологии выращивания лекарственных растений / Л. Т. Мищенко, А. А. Коренева, Л. А. Глущенко // Защита растений: сб. науч. трудов, РУП “Институт защиты растений». - Несвиж: Несвиж. укрупн. тип. - 2008, Вып. 32. - С. 208-215.

/ Дисертантом визначено кількісний вміст біологічно активних речовин у рослинах, проведена обробка результатів. Підготовлено статтю до друку. Висновки зроблено за участі всіх авторів.

5. Коренєва А. А. Виявлення збудників вірусних інфекцій лікарських рослин в Україні / Л. Т. Міщенко, А. А. Коренєва, О. В. Молчанець, А. Л. Бойко // Мікробіологічний журнал. - 2009. - Т. 71, № 3. - С. 65-71.

/ Дисертантом здійснено пошук та узагальнено дані літератури. Проведено діагностику вірусних інфекцій та доведено інфекційну природу захворювань. Підготовлено статтю до друку. Виконано експериментальну частину. Висновки зроблено колективно.

6. Koreneva A. Plant Reaction on the influence of Antistress Substances in Simulated Microgravity / L. Mishchenko, G. Reshetnyk, A. Koreneva // Journal of Gravitational Physiology. - 2008. -Vol. 15, № 1. - P. 185-186.

/ Дисертантом проаналізовано літературу та підготовлено статтю до друку. Здійснено електронномікроскопічні дослідження вірусів.

7. Патент на корисну модель № 19360 Україна, МПК⁵¹ А01G 1/00 А01Н 4/00. Спосіб культивування біологічних об'єктів / Міщенко Л. Т., Остапченко Л. І., Міщенко І. А., Таран С. В., Янішевська Г. С., Коренєва А. А., Бойко А. Л.; власник Київський національний університет імені Тараса Шевченка. - № u 2006 06486 ; заявл. 13.06.06 ; опубл. 15.12.2006, Бюл. № 12.

8. Koreneva A. A. Viral diseases of medicinal herbs in Ukraine / A. A. Koreneva, L. T. Mishchenko, N. M. Gankovych, V. G. Skrypov // Human and nature safety. - Kauno, Republic of Lithuania: Akademija, 2007. - P. 87-91.

9. Коренєва А.А. Виявлення вірусної інфекції в рослин женьшеню / А. А. Коренєва, Л. Т. Міщенко // Матеріали міжнар. науково-практ. конф. „Екологія: Проблеми адаптивно-ландшафного землеробства”, (Івано-Франківськ, 20-22 червня 2006 р.). - Івано-Франківськ: Симфонія форте, 2006. - С. 213-215.

11. Коренева А. А. Мониторинг вирусных инфекций женьшеня в Украине / Л. Т. Мищенко, А. А. Коренева, Е. Г. Жук // Материалы междунар. науч. конф. „Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства”, (Минск, 12 -15 июня 2007 г.). - Минск: Эдит ВВ, 2007 - С. 220-222.

12. Коренева А. А. Изучение вирусного заболевания эхинацеи и его влияния на содержание углеводов в сырье / А. А. Коренева, А. В. Витер, В. В. Горошко, Л. Т. Мищенко // Матер. междунар. конф. „Актуальные проблемы интегрированной защиты растений”, (Прилуки, 24-27 июля 2007 г.). - Минск: Несвиж. укруп. тип., 2007. - С. 122-129.

13. Коренева А. А. Диагностика вирусов лекарственных и цветочно-декоративных культур в лесостепи Украины / Л. Т. Мищенко, Г. С. Янишевская, А. А. Коренева, О. П. Таран, В. В. Тороп, Т. В. Кучинова // Відновлення порушених природних екосистем. - Донецьк, 2008. - С. 384-388.

14. Koreneva А. Improvement of the technologies of the medicinal plants production in Ukraine / L. Glushchenko, A. Koreneva, L. Mishchenko // Responses of Plants to Environmental Stresses. Abstracts (12 - 18 May 2008, Elena, Bulgaria). - Elena, 2008. - p. 64.

15. Koreneva A. Deterioration of Echinacea purpurea and Panax ginseng medicinal material under viral infection / A. Koreneva, L. Mishchenko // Responses of Plants to Environmental Stresses. Abstracts (12 - 18 May 2008, Elena, Bulgaria). - Elena, 2008. - p. 64.

16. Koreneva A. Effect of simulating microgravity on plants resistance to viruses / A. Koreneva, G. Reshetnyk, L. Mishchenko // Responses of Plants to Environmental Stresses. Abstracts (12 - 18 May 2008, Elena, Bulgaria). - Elena, 2008. - p. 65.

17. Koreneva A. Plant reaction on the influence of antistress substances in simulated microgravity / L. Mishchenko, G. Reshetnyk, A. Koreneva // Life in Space for Life on Earth. Abstracts (22 -27 June 2008, Angers, France). - Angers, 2008. - P. 100.

18.Koreneva A. A. Viral infections on cultural plantations of medicinal plants (Plantago major L., Valeriana officinalis L., Panax ginseng C. A. Meyer) in Ukraine / A. A. Koreneva, G. S. Yanishevska, L. T. Mishchenko // First International Transcaucasus Conference on Plant Pathology. Abstracts (25-27 september 2008, Tbilisi, Georgia). - Tbilisi, 2008. - P. 25.

19.Коренєва А. А. Поширення вірусних захворювань в агроценозах лікарських культур Лісостепу України / Н. М. Ганькович, Л. Т. Міщенко, В. В. Горошко, А. А. Коренєва // Біорізноманіття: теорія, практика та методичні аспекти. Мат-ли міжнар. наук.-практ. конф. (7-8 лютого 2008 р., Полтава). - Полтава, 2008. - С. 125-127.

20. Коренєва А. А. Вірусні хвороби женьшеню на території України / А.А. Коренєва // Біоресурси та віруси. Мат-ли V міжнар. конф. (10-13 вересня 2007 р., Київ). - К., 2007. - С. 176.

21.Коренєва А. А. Дослідження впливу вірусної інфекції на якість сировини Echinacea purpurea / А. А. Коренєва // Молодь та поступ біології. Мат-ли V міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів (12-15 травня 2009 р., Львів). - Т. 2. - Львів, 2009. - С. 180-181.

22.Коренєва А. Вплив трансформованого середовища на розвиток рослин, інфікованих вірусами / А. Коренєва, О. Гордєйчик, О. Таран, Г. Янішевська, Л. Міщенко // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти. Мат-ли ІІІ міжнар. конф. (4 - 6 жовтня 2007 р., Львів). - Львів, 2007. - С. 209.

23.Коренєва А. А. Вірусні хвороби женьшеню, валеріани, подорожника та ехінацеї. Їх вплив на якість лікарської сировини / А. А. Коренєва, В. Г. Скрипов, Л. Т. Міщенко // Біологічні дослідження молодих вчених на Україні. Мат-ли VII всеукр. конф. студентів та аспірантів (20-21 вересня 2007 р., Київ). - К., 2007. - С. 37-39.

24.Коренєва А. Вірусні інфекції женьшеню в умовах трансформованого середовища / Л. Міщенко, А. Коренєва // Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти. Мат-ли ІІІ міжнар. конф. (4 - 6 жовтня 2007 р., Львів). - Львів, 2007. - С. 166.

25. Коренєва А. А. Вірусні захворювання Valeriana officinalis L., Plantago major L. і Echinacea purpurea (L.) Moench. в Україні / Л. Т. Міщенко, А. А. Коренєва, Н. М. Ганькович, В. Г. Скрипов, А. В. Вітер // Біоресурси та віруси. Мат-ли V міжнар. конф. (10-13 вересня 2007 р., Київ). - К., 2007. - С. 181.

26.Коренєва А. А. Біоетика та біобезпека в рослинництві / Л. Т. Міщенко, О. П. Таран, А. А. Коренєва, О. В. Молчанець, В. Л. Васильєва // Третій національний конгрес з біоетики. Мат-ли конф. (8-11 жовтня 2007 р., Київ). - К., 2007. - С. 154-155.

26. Коренєва А. А. Біоетика в рослинництві задля здоров'я людини / Л. Т. Міщенко, А. В. Дащенко, А. А. Коренєва // Біоетика в системі охорони здоров'я і медичної освіти. Мат-ли міжнар. наук.-прак. конф. (26-27 березня 2009 р., Львів). - Львів, 2009. - С. 350 -351.

Размещено на Allbest.ru