Бактеріальні хвороби томату і біологічне обґрунтування заходів обмеження їхнього розвитку

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ

І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

УДК 632+633.842

06.01.11 - фітопатологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

БАКТЕРІАЛЬНІ ХВОРОБИ ТОМАТУ І БІОЛОГІЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ЗАХОДІВ ОБМЕЖЕННЯ ЇХНЬОГО РОЗВИТКУ

Черненко Євген Петрович

Київ - 2009



Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Національному університеті біоресурсів і природокористування України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Гвоздяк Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, доцент Слюсаренко Олександр Миколайович, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова, професор кафедри ботаніки

кандидат біологічних наук Огородник Любов Євгенівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, старший науковий співробітник кафедри біохімії

Захист відбудеться “30” жовтня 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.02 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус №3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус №4, к. 28

Автореферат розісланий “29 ” вересня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради М.С. Мороз



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Томат - одна з найпоширеніших цінних овочевих культур у світі, обсяги споживання якої постійно зростають. В Україні томату належить одне із провідних місць у забезпеченні населення високовітамінними продуктами харчування.

Томати мають високі смакові якості. Достиглі плоди містять цукри (3,5-8,0%), мінеральні речовини, органічні кислоти (переважно яблучну і лимонну), різні вітаміни (В, В1, В2, С, Р та ін.) і провітамін А (каротин), на який особливо багаті жовтоплідні та оранжеві сорти. У плодах томату міститься 0,95% білка, 3,5-4,0% вуглеводів, 27 мг/кг вітаміну С, солі калію, натрію, кальцію, магнію, заліза, фосфору, сліди йоду. Томати є основною сировиною для консервної промисловості, становлячи дві третини загальної кількості овочів, які переробляються на консервних заводах.

Основні параметри якості томату визначаються багатьма показниками, в тому числі агрокліматичними умовами вирощування, сортами і стійкістю проти захворювань. Отриманню високих та якісних урожаїв цієї культури перешкоджають хвороби. На рослинах паразитують гриби, віруси і бактерії. Найбільшу увагу дослідники приділяють грибним захворюванням, проти яких рекомендовано широкий спектр пестицидів. Серед хвороб, що уражують томат, особливе місце посідають бактеріальні хвороби, які завдають значної шкоди рослинам як у відкритому, так і закритому ґрунті. Вони спричинюють їх масове відмирання, особливо в тепличних умовах. Незважаючи на це і сьогодні бракує даних щодо поширення збудників бактеріальних хвороб, передусім карантинних, у польових і тепличних умовах, їхніх диференціальних ознак, які необхідні для ідентифікації, а також відсутні методи, які б обмежили їх шкідливість і нанесення ними збитків у рослинництві. Навіть у «Переліку пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні» (2006), немає відомостей стосовно препаратів проти бактеріальних хвороб томату.

Тому нині актуальним є дослідження збудників бактеріальних хвороб томату, підбір швидких і надійних методів діагностики патогенів, а також засобів захисту рослин. Значущість вирішення цих проблем і обумовила актуальність досліджень та вибір теми дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в Національному університеті біоресурсів і природокористування України (НУБіП України) на кафедрі фітопатології ім. акад. В. Ф. Пересипкіна відповідно до наукової теми «Роль факультативних і сапротрофних паразитів в етіології патологічного процесу рослин, біологічне обґрунтування заходів обмеження їх розвитку» (державний реєстраційний номер 0103U003420, 2003 - 2007 рр.), у відділі фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (ІМВ НАН України) згідно із планом науково-дослідних робіт за бюджетними темами «Дослідження фітопатогенних бактерій фітоценозу та їх генопротекторних, мутагенних та протипухлинних властивостей» (державний реєстраційний номер 0101U009312, 2002-2006 рр.), «Екологічна роль фітопатогенних бактерій у формуванні збалансованих агрофітоценозів» (державний реєстраційний номер 0107U002577, 2007-2011 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було: виявити та ідентифікувати збудники бактеріальних хвороб томату, теоретично обґрунтувати та підібрати засоби обмеження їхнього поширення і шкідливості.

Відповідно до мети досліджень ставилися наступні завдання:

- вивчити бактеріальні хвороби томату у відкритому та закритому ґрунті, виявити типи бактеріальних захворювань, відібрати зразки;

- виділити з уражених тканин томату ізоляти бактерій і довести причетність їх до патогенезу;

- вивчити фенотипові властивості виділених патогенних ізолятів з метою видової ідентифікації патогенів;

- дослідити гетерогенність патогенних ізолятів за низкою ознак;

- встановити придатність для ідентифікації жирнокислотного складу клітинних ліпідів збудників бактеріозів томату, ізольованих нами, та колекційних штамів;

- визначити вплив умов культивування на жирнокислотний склад збудника бактеріального раку томату;

- дослідити чутливість ізольованих та колекційних штамів збудників бактеріозів томату до деяких пестицидів;

- вивчити антагоністичні властивості епіфітної та ендофітної мікрофлори насіння томату щодо фітопатогенних бактерій;

- дослідити взаємовідношення між фітопатогенними бактеріями, виділеними з уражених рослин томату;

- вивчити придатність пробіотиків для обмеження розвитку фітопатогенних бактерій.

Об'єкт дослідження. Бактеріальні хвороби томату в закритому та відкритому ґрунті, штами збудників бактеріальних захворювань, ізольовані нами та отримані з колекції відділу фітопатогенних бактерій ІМВ НАН України, а також рослини та насіння томату.

Предмет дослідження. Патогенні, морфологічні, культуральні, фізіологічні та хемотаксономічні властивості збудників бактеріозів томату; їхні взаємовідношення між собою і з ендофітами та епіфітами; бактерії-антагоністи патогенів; чутливість патогенів до пестицидів.

Методи дослідження. В роботі використано фітопатологічні, мікробіологічні та хімічні методи. Проведено фітосанітарне обстеження насаджень томату; мікробіологічний аналіз відібраних зразків уражених рослин; виділено чисту культуру збудника; визначено патогенність та агресивність виділених ізолятів, культуральні, морфологічні, біохімічні, хемотаксономічні властивості збудників, здатність патогенів утворювати пігменти, засвоювати вуглецьувмісні сполуки в середовищі; досліджено спектр жирних кислот ліпідів клітин бактерій; запропоновано методи визначення антагоністичних взаємовідношень між ними; виділено епіфітну та ендофітну мікрофлору з насіння томату, розроблено методи визначення чутливості фітопатогенних бактерій до пестицидів.

Наукова новизна отриманих результатів. У сучасних умовах вирощування томату в Україні виявлено такі бактеріальні збудники захворювань: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Ralstonia solanacearum. Серед них уперше в Україні описано збудник бактеріального в'янення томату - R. solanacearum, який є небезпечним для багатьох культур. На томаті у відкритому ґрунті найбільш поширений є X. campestris pv. vesicatoria, а в закритому - C. michiganensis subsp. michiganensis та R. solanacearum.

За фенотиповими ознаками виділені нами ізоляти були ідентичні до описаних у різних регіонах світу. Однак вони виявилися відмінними за здатністю споживання вуглецьувмісних речовин у межах, характерних для виду. бактеріальний томат патогенний пробіотик

Уперше визначено профілі клітинних жирних кислот збудників бактеріозів томату, які є стабільними за різних умов культивування, доведено надійність цих параметрів для ідентифікації ізолятів.

Уперше встановлено антагоністичний вплив ендофітної й епіфітної мікрофлори насіння томату на фітопатогенні бактерії, а також перспективність практичного їх використання.

Розширено перспективи використання хімічних пестицидів: фунгіцидів, гербіцидів, інсектицидів і акарициду - для обмеження шкідливості бактеріозів томату.

Практичне значення отриманих результатів. Виділені високоагресивні штами збудників бактеріозів томату можуть бути використані для тестування стійкості нових сортів.

Для швидкої і надійної ідентифікації фітопатогенних бактерій рекомендовано використовувати жирнокислотний склад клітинних ліпідів.

Оскільки в «Переліку пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні» не наведено дані стосовно бактерицидних властивостей фунгіцидів щодо збудників бактеріозів томату, рекомендовано розширити їхній спектр застосування.

Зважаючи на високу антибактеріальну активність ізольованих антагоністів, їхній позитивний вплив на проростання насіння томату, який зберігається упродовж двох років, штами Б1 - Б8 рекомендовано для подальшого випробовування з метою виробництва екологічно безпечного поліфункціонального препарату з бактерицидною і фітостимулювальною дією.

Особистий внесок здобувача полягає в доборі й аналізі наукової літератури за темою дисертації, в плануванні та проведенні дослідів, особистому виконанні представлених у роботі експериментальних досліджень, проведенні статистичного оброблення результатів та підготовці публікацій до друку. Дисертантом виділено збудники бактеріальних захворювань із різних частин ураженої рослини, проведено зараження тест-рослин, одержано й проаналізовано результати експериментів, оформлено дисертаційну роботу, сформульовано висновки і запропоновано науково-обґрунтовані пропозиції виробництву.

Визначення завдань дослідження, узагальнення та обговорення експерементальних результатів проводилися разом із науковим керівником.

Цінні поради під час виконання експериментальної роботи отримував від співробітників ІМВ НАН України: кандидатів біологічних наук: С.М. Мороз, Л.М. Яковлевої, Л.М. Ващенко, Л.А. Пасічник і С.В. Лапи, співробітників Інституту овочівництва та баштанництва Української академії аграрних наук канд. біол. наук В.В. Скляревської, В.Л. Черненко та С.А. Лисака.

Автор висловлює їм щиру вдячність за неоціненну допомогу.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені для обговорення на звітних засіданнях кафедри фітопатології ім. акад. В.Ф. Пересипкіна НУБіП України, а також на міжнародних наукових конференціях: “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія” (Київ, 4 - 6 жовтня 2005 р.), “Мікробні біотехнології” (Одеса, 11 - 15 вересня 2006 р.); Іnternational scientific conference “S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology” (Yalta, October 8 - 12, 2007); VI Всеукраїнській науковій конференції студентів та молодих вчених “Біологічні дослідження молодих вчених в Україні” (Київ, 21 - 22 вересня 2006 р.); Всеукраїнській науковій конференції молодих учених та спеціалістів “Сучасні методи захисту рослин від шкідливих організмів” (Київ, 2 - 5 жовтня 2006 р.); I міжнародній конференції молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 21 - 23 листопада 2006 р.); міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Шевченківська весна” (Київ, 2 - 3 березня 2007 р.); III міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 23 - 27 квітня 2007 р.); міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих учених “Екологізація сталого розвитку агросфери і ноосферна перспектива інформаційного суспільства” (Харків, 3 - 5 жовтня 2007 р.); II міжнародній конференції молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 19 - 21 листопада 2007 р.); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників “Молодь та сучасні проблеми мікробіології і вірусології” (Київ, 27 - 28 листопада 2007 р.); IV міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 7 - 10 квітня 2008 р.); ХІІ з'їзді товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Ужгород, 25-30 травня 2009 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 17 наукових робіт, із них 5 статей - у фахових виданнях, 12 тез доповідей на наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 180 сторінках комп'ютерного тексту, включає вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, чотири розділи результатів досліджень, а також “Заключення” та “Висновки”. Список використаних джерел містить 229 посилань, з яких 133 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступній частині розкрито актуальність теми, сформульовано завдання, при вирішенні яких досягається мета досліджень. Обґрунтовано наукову новизну і практичне значення результатів роботи.

Огляд літератури

На підставі узагальнених даних літератури висвітлено історичний стан досліджень з поширення бактеріозів томату. Проаналізовано дані літератури щодо біологічних, морфологічних, фізіологічних, біохімічних властивостей фітопатогенних бактерій - збудників бактеріальних хвороб томату. Узагальнені дані стосовно стану вивчення можливості використання хімічних і біологічних препаратів у системі захисту томату від хвороб бактеріальної природи.

На основі аналізу сучасної української та іноземної літератури показано актуальність теми дисертаційної роботи та визначено доцільність проведених досліджень.

УМОВИ ТА МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дисертаційну роботу виконано в Національному університеті біоресурсів і природокористування України на кафедрі фітопатології ім. акад. В.Ф. Пересипкіна та у відділі фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Матеріали та об'єкти досліджень

Матеріалом для досліджень були зразки насіння та уражені рослини томату, які відібрані нами в різні фази розвитку з тепличних господарств Київської (Совки, Пуща-Водиця), Харківської (Інститут овочівництва та баштанництва (ІОБ УААН) і Херсонської областей, а також із Автономної Республіки Крим і дослідних полів Київської дослідної станції, ІОБ УААН Харківської області та дослідної польової ділянки ІМВ НАН України.

Об'єктом дослідження були ізольовані нами та отримані з колекції відділу фітопатогенних бактерій ІМВ НАНУ штами збудників бактеріальних захворювань томату:

бактеріального раку - Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith 1910) Davis et al. 1984 - 16 колекційних (102 ,13а, 14, 7741, 7744, 7748, 7905, 7934, 7960, 7961, 8240, 8504, Тл-3, Тк-5, Совки-1, Херсон) та 5 виділених нами (2п, 3, 3-1, 20, 64);

чорної бактеріальної плямистості - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Doidge 1920) Dye 1978 - 14 колекційних (9, 7598, 7604, 7736, 7742, 7743, 7766, 7768, 7790, 7798, 7861, 7862, 8506, 8250) та 9 виділених нами (7, 17, 39, 41, 44, 48, 55, 66, 76);

бактеріального в'янення - Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al. 1996 - 2 колекційних (9049=УКМ В-1109Т, 9081=УКМ В-1110) та 7 виділених нами (1-1, 1-2, 2-3, Re 2-3, 3-2, 4, 5-4);

крапчастості плодів - Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe 1933) Young et al. 1978 - 2 колекційних (8290, 140R=9167);

некрозу серцевини стебла - Pseudomonas corrugatа Roberts and Scarlett 1981 - 3 колекційних (9070, 9069, 9071);

бактерії-антагоністи - 2 колекційні відділу антибіотиків ІМВ НАНУ (УКМ В-5017, УКМ В-5137) та 10 виділених нами (Б-1, Б-2, Б-2(1), Б-3, Б-4, Б-5, Б-6, К-1, А, К).

Фітопатологічні та мікробіологічні методи аналізу уражених рослин та насіння томату

У виробничих умовах (поле, теплиця) візуально відзначали загальний стан росту рослин і типи захворювання за зовнішніми та внутрішніми (зрізи) ознаками (симптоми) наземних частин і коренів. Для лабораторного аналізу відбирали уражені рослини, групуючи їх за симптомами.

Пошук патогену проводили на межі ураженої та здорової тканин. Маленькі шматочки ураженої тканини після промивання, розтирали до гомогенного стану і висівали на пластинки картопляного агару (КА) в чашках Петрі. Кількість аналізованих зразків з кожного типу ураження становила 10. Сформовані колонії описували і відсівали на КА для подальшого вивчення їхніх патогенних та фенотипових ознак. Крім цього, насіння і шматочки уражених тканин розкладали на поверхні пластинок КА (метод обростання). Бактеріальну масу, яка виросла, аналізували (Бельтюкова та ін. 1968).

Енергію проростання та схожість насіння вивчали в чашках Петрі на фільтрувальному папері з ватною підложкою.

Патогенність виділених ізолятів в лабораторних і польових умовах визначали шляхом штучного зараження стебел, листків та плодів томату з 9-ї по 12-у годину методом уколу через краплю водної суспензії клітин бактерій з титром 1108 кл/мл або за допомогою Пастерівської піпетки. Як контроль використовували стерильну водогінну воду. Повторність дослідів 3-5 разова (Бельтюкова та ін. 1968).

Реакцію надчутливості (РН) листків тютюну вивчили шляхом ін'єкцій суспензій бактерій титром 105 - 107 під епідерміс (Klement et al. 1990).

Морфологію колоній описували на 3 - 4-ту добу за їхнього росту на КА. Морфологію вегетативних клітин та спор вивчали за допомогою світлового мікроскопа.

Нерозчинні у воді пігменти визначали за інтенсивністю кольору колоній, розчинні - за здатністю дифундувати до поживного середовища: м'ясопептонний бульйон (МПБ), желатин, молоко, Кінг Б та КА.

Установлення здатності засвоювати органічні сполуки як єдиного джерела вуглецю проводили на мінеральному середовищі Омелянського з водним індикатором - бромтимоловим синім (Бельтюкова та ін. 1968, Кучеренко 1967).

Здатність бактерій до росту в анаеробних умовах визначали у разі культивування їх на глюкозі під стерильним вазеліновим маслом.

Для виявлення протеолітичних ферментів використовували середовища з білком (желатин, знежирене молоко, МПБ). Протопектинази виявляли - розкладом шматочків картоплі; амілазу - за розщепленням крохмалю на КА. На МПБ відзначали здатність бактерій розщеплювати білок до індолу за Морелі та сірководню за Морісом. Редукцію нітратів до нітритів тестували за допомогою реактиву Грісса.

Спектр жирних кислот (ЖК) у клітинах досліджували за допомогою методу газорідинної хроматомас-спектроскопії. Для гідролізу бактеріальних клітин, їхніх ліпідів і метилювання ЖК бактеріальну масу витримували у 1,5 % -му розчині Н2SO4 в метанолі в запаяних ампулах протягом однієї години при температурі 80 °С. Метилові ефіри ЖК екстрагували двічі сумішшю діетиловий ефір - гексан (1:1). Підготовлені зразки аналізували в хроматомас-спектрометричній системі Agilent 6800N/5973 inert. Колонка HP-5МS (довжиною 30м та внутрішнім діаметром 0,25мм) з використанням нерухомої фази 5%-вого фенілметилполісилоксану товщиною 0,25 мм. Газ носій гелій (1 мл/хв), температура термостату 150 -250 °С, підвищення температури 4 °С на хвилину. Температура випарювача 250 °С. Детектор мас-спектрометричний, температура інтерфейсу 250 °С. Метилові ефіри ЖК ідентифікували за часом утримання їх порівняно зі стандартами. Як стандарти застосовували метилові ефіри ЖК фірми «Supelco». Вміст ЖК визначали за допомогою програмного забезпечення Agilent ChemStation.

Взаємовідношення між мікроорганізмами вивчали методом відстроченого антагонізму на КА (Егоров 1965).

Для виділення епіфітів насіння збовтували у стерильній водогінній воді, суспензію висівали на пластинки КА. Для виділення ендофітної мікрофлори поверхню насіння стерилізували 16,5 %-м розчином Н2О2, після чого його розтирали і висівали на пластинки КА і інкубували 4 доби.

Чутливість фітопатогенних бактерій до пестицидів виявляли за інтенсивністю росту на КА з доданими до нього пестицидами в різних дозах.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

При обстеженні томатів у відкритому ґрунті виявлено домінування симптомів чорної бактеріальної плямистості, а у закритому - бактеріального раку та в'янення. У відкритому ґрунті найчастіше траплялися хворі рослини із симптомами, які найчіткіше виявлялись на листках і плодах. На листках спостерігали коричневі крапочки (1-2 мм), які були оточені хлоротичними ореолами. Одиничні крапочки зустрічались переважно на краю листкової пластинки та поблизу жилок. При масовому ураженні майже вся поверхня листка набувала хлоротичного забарвлення. Часом уражена площа збільшувалась, утворюючи великі плями (рис. 1а). Листки набували коричневого забарвлення, а згодом чорніли, засихали, але не опадали. Рослини поступово відмирали.

Із листків зараження переходило на плоди. На них спостерігалося два типи некрозів: одні були припіднятими над поверхнею, а другі - плоскими (рис. 1 б, в). У першому випадку майже вся поверхня плодів вкривалася припіднятими дрібними шершавими коричнево-чорними плямами з діаметром 1 - 3 мм, які також зливались, утворюючи плями неправильної форми (рис. 1 б). У другому випадку плями коричневого кольору, розташовані у площині поверхні плоду, мали навколо себе водянисті облямівки, які зливалися з облямівками інших плям (рис. 1 в). З обох типів ураження було ізольовано бактерії X. campestris pv. vesicatoria.

Із уражених тканин листків і плодів ми виділили 98 ізолятів, з яких 72 виявилися патогенними. На листках і плодах вони утворювали типові симптоми чорної бактеріальної плямистості.

Для ідентифікації збудників вивчали їхні фенотипові властивості, які порівнювали з колекційними штамами. Установлено, що виділені ізоляти ідентичні колекційним штамам, які попередньо ідентифікували як X. campestris pv. vesicatoria (табл. 1).

Видову належність виділених ізолятів було підтверджено даними щодо складу ЖК (рис. 2). У клітинах X. campestris pv. vesicatoria виявлено 14 ЖК. Серед них домінували прямоланцюгові: ненасичена цис-9-гексадеценова (С16:1 цис 9, 38-44 %) та насичена гексадеканова (С16:0, 20-30 %) кислоти; а також розгалужені: 13-ізо-метилтетрадеканова (і-С15:0, 5-13 %), антеізо-12-метилтетрадеканова (а-С15:0, 3-8 %), ізо-15-метилгексадеценова (і-C17:1 9c, 0-20 %) кислоти.

Виділені нами штами за ЖК складом подібні до колекційних, виділених у різних країнах світу. Слід відзначити, що незалежно від походження, спостерігається штамова гетерогенність за цією ознакою. Різницю між штамами було виявлено в співвідношенні між ЖК. Це свідчить про високу надійність їхнього використання для ідентифікації. За наявністю розгалужених ЖК у складі клітинних ліпідів X. campestris pv. vesicatoria відрізняється від таксономічно близьких видів фітопатогенів роду Pseudomonas, які паразитують на томатах (табл. 2). Водночас у обох видів домінують С16:1 цис 9 та С16:0 ЖК, що вказує на їхню систематичну спорідненість.

У закритому ґрунті масове захворювання томату спричинюють Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis та Ralstonia solanacearum - збудники бактеріального раку (БРТ) та бактеріального в'янення томату (БВТ).

У літературі описані симптоми БРТ - ураження судин, що призводить до в'янення, “пташине око” на плодах та плями на листках. У теплицях України домінує також ураження судин - найшкідливіша форма БРТ і дуже рідко зустрічаються симптоми на плодах. Поява зовнішніх симптомів в'янення на початку плодоношення виявляється спочатку куртинно, але швидко набуває масового характеру. Початок інфекції починається з кореневої шийки або на різній від неї віддалі (до 4 - 6 м) (рис. 3). Найімовірніше, що в першому випадку інфекцію занесено з насінням, а у другому - вона обумовлена перезараженням.

У корені, кореневій шийці і прикореневій надземній частині виявлено почорніння судин (рис. 3 а, б), одностороннє почорніння судин при розрізі стебла (рис. 3 в, г), одностороннє в'янення.

Із різних уражених органів рослин ізолювали бактерії, які на КА утворювали круглі опуклі колонії з рівним краєм, які були непрозорими жовтими, краплевидними і не слизистими. Відсіяно 117 ізолятів, із них патогенними були 98 ізолятів, з яких 20 вивчено більш детально.

Для ідентифікації ізолятів вивчали їхні фізіолого-біохімічні властивості, які порівнювали з колекційними штамами. Установлено, що штами C. michiganensis subsp. michiganenis здебільшого використовують манозу (95 %) глюкозу (85 %), та цитрат натрію (90 %), а також розріджують желатин (95 %). Усі досліджені штами зумовлюють зсідання молока з утворенням характерного жовтого кільця. 70 % “українських” штамів здатні ферментувати галактозу, 55 % - освітлювати лакмусове молоко. Арабінозу з виділенням кислоти використовують 40 %, лактозу і мальтозу - 25 і 20 % штамів з України. Вони не утворюють індол та H2S, не редукують нітратів, не споживають сахарозу, меліцитозу, дульцитол, сорбітол і манітол. Відповідно до цих властивостей штами C. michiganensis subsp. michiganensi згрупували у шість кластерів (рис. 4). До окремих кластерів увійшли штами, які були різними за місцем і часом виділення.

За ЖК-складом виділені ізоляти виявились подібними до колекційних штамів. Основні ЖК клітинних ліпідів штамів C. michiganensis subsp. michiganensis належать до розгалужених насичених кислот: антеізо 12-метилтетрадеканова (a-C15:0, 44 - 68%), антеізо 14-метилгексадеканова (a-C17:0, 2 - 32%) та ізо 14-метилпентадеканова (і-C16:0, 6 - 38%) кислоти, а також прямоланцюгові - гексадеканова (С16:0, 1 - 18%).

Однак за ЖК-складом штами були гетерогенними. Їх ми згрупували у 6 кластерів, які відмінні за співвідношенням а-С15:0/а-С17:0 та і-С16:0/С16:0 (табл. 3). Вмістом С18:1 (25%) колекційний штам 8240 відрізняється від інших, через що потребує додаткових досліджень.

В окремих експерементах встановлено незмінний якісний склад ЖК у клітинах збудника бактеріального раку томату, вирощених за різних умов культивування, а саме: температури, поживних речовин, тривалості інкубації. Змінюється лише кількісне співвідношення між ЖК.

Таким чином, нами виявлено БРТ, виділено й ідентифіковано збудника C. michiganensis subsp. michiganensis.

У теплиці Криму, де в стадії плодоношення загинули всі рослини, причиною було інфікування їх Ralstonia solanacearum. На зрізах стебла чітко виявляється покоричневіння флоеми і серцевини та сіро-білий каламутний бактеріальний ексудат (рис. 5). Проаналізовано 108 зразків. На КА постійно виростали однотипні колонії, які в чистій культурі були відмінними від колоній C. michiganensis subsp. michiganensis. З понад 10000 таких колоній тільки 6 були жовтопігментнованими, які, однак, не викликали зараження рослин томату. Із колоній, які домінували, відібрано 12 ізолятів, здатних спричинювати захворювання томату та плодів перцю за типом бурих гнилей. За здатністю уражувати томати, картоплю та перець виділені ізоляти віднесено до 3-ї раси.

Для встановлення видової належності виділених ізолятів і реізолятів дослідили їхні морфологічні, фізіологічні, біохімічні властивості та склад ЖК. Виявлено, що вони є аеробами, оксидазо-, каталазо- і тирозиназо-позитивними, редукують нітрати, облігатні аероби, не утворюють індолу з білків, і левану із сахарози.

Кислоту без газу утворюють на 3-5-й день культивування із фруктози та глюкози (тільки аероби), сахарози, целобіози, лактози, мальтози і гліцеролу, але не з інуліну, саліцину, дульцитолу, манітолу і сорбітолу. За цими характеристиками ізоляти ідентифіковано як R. solanacearum біовар 2.

Оскільки на томатах виявлені штами різних збудників, то ми вивчили їхні взаємовідношення методом відстроченого антагонізму.

В дослідах використано 45 штамів, поставлено 1255 варіантів тестів, серед яких виявлено лише 7 антагоністичних і 3, які стимулювали ріст. Тобто, одержані in vitro дані свідчать, що штами збудників бактеріозів томатів родів Xanthomonas, Clavibacter, Pseudomonas та Ralstonia взаємно толерантні.

На сьогодні засоби захисту томату від бактеріальних хвороб дуже обмежені. Тому нами перевірена чутливість збудників бактеріозів до пестицидів, які дозволені до застосування на культурі для обмеження розвитку інших патогенів (табл. 4). Установлено, що фунгіциди, залежно від природи діючої речовини, виявляють різну антибактеріальну активність щодо збудників бактеріозів томату. Фунгіциди, у складі діючої речовини яких є манкоцеб або гідроокис міді, активно пригнічують збудників бактеріальних захворювань томату.

Бактерицидна дія фунгіцидів не однакова для різних видів фітопатогенних бактерій. Найменш чутливий до дії фунгіцидів є фітопатоген P. syringae pv. tomato. Фунгіциди Пенкоцеб, Ридоміл Голд, Чемпіон, Ацидан і Татту, гербіцид Ураган форте, а також біофунгіцид Мікосан В можна рекомендувати для захисту томату від збудників бактеріозів. Вивчені гербіциди слабо пригнічують ріст фітопатогенних бактерій, а інсектициди й акарициди зовсім не впливають на розвиток фітопатогенів бактеріозів томату. Використання хімічних пестицидів призводить до пригнічення біологічної активності ґрунтів і сповільнює природне відновлення родючості.

Тому необхідно знижувати такі пестицидні навантаження на довкілля. З цією метою все більше привертають увагу мікроорганізми - антагоністи фітопатогенів. Особливої уваги останнім часом набув біологічний контроль патогенів із використанням спороутворюючих бактерій роду Bacillus.

Нами проведений пошук біологічних засобів захисту рослин томату. Вивчали антагоністичну активність відомих пробіотиків проти фітопатогенних грибів, основними інгредієнтами яких є бактерії Bacillus amyloliquefaciens УКМ 5017 та Bacillus subtilis УКМ 5137. Обидва препарати діють на штами збудників бактеріальних хвороб томату вибірково. Вони є перспективними для використання як засобів захисту, але недостатніми для пригнічення всіх основних бактеріальних збудників хвороб томату. Зважаючи на це, ми провели пошук антагоністів до фітопатогенів серед епіфітної та ендофітної мікрофлори насіння. Серед 230 ізолятів епіфітної мікрофлори 7 були активними антагоністами і не виявляли фітотоксичної дії (табл. 5, 6). Серед 175 ендофітів виявили 2 штами антагоністів, активність яких була однаковою з антагоністами-епіфітами

ВИСНОВКИ

1. Серед основних збудників бактеріозів томату в Україні виявлено: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, який викликає бактеріальний рак томату, Xanthomonas campestris pv. vesicatoria - чорну бактеріальну плямистість томату та Ralstonia solanacearum - бактеріальне в'янення томату. Останній в умовах закритого ґрунту виявлено в Україні вперше.

2. Найчастіше у відкритому грунті зустрічається X. campestris pv. vesicatoria, який знижує товарну якість плодів, а в закритому - C. michiganensis subsp. michiganensis, що спричинює масове відмирання рослин.

3. Відзначена гетерогенність ізолятів за патогенними, фізіологічними, біохімічними та хемотаксономічними ознаками, що не виходить за межі виду, описані в літературі.

4. Доведено істотне таксономічне значення профіля жирних кислот загальних клітинних ліпідів та співвідношення між ними у збудників бактеріозів томату, які є стабільними за різних умов культивування бактерій: температури, віку, складу середовища.

5. Установлено, що між збудниками бактеріальних хвороб томату відсутній антагонізм в разі культивування їх на КА.

6. Установлено антагоністичну активність епіфітної та ендофітної мікрофлори до збудників бактеріозів томату та вибірковість їхньої дії. Так, найчутливішими виявилися штами C. michiganensis subsp. michiganensis та X. campestris pv. vesicatoria, найменш чутливими - P. syringae pv. tomato, P. corrugatа та R. solanacearum.

7. Для обмеження розвитку бактеріальних хвороб томату серед епіфітної та ендофітної мікрофлори виділено перспективні штами-антагоністи, активність яких не змінюється під час зберігання.

8. Доказано пригнічення росту X. campestris pv. vesicatoria, C. michiganensis subsp. michiganensis при застосуванні пробіотиків на основі Bacillus amyloliquefaciens УКМ 5017 та Bacillus subtilis УКМ 5137. Однак вони виявилися неактивним до P. syringae pv. tomato і P. corrugata.

9. У зв'язку з вибірковою дією пробіотиків на окремі штами та види патогенів доцільно використовувати їх комплексно.

10. Установлено, що антагоністична активність Bacillus subtilis до грамнегативних бактерій починається від першої доби росту, тоді як до грампозитивних - із 5 - 7.

11. Установлено гетерогенність популяції штамів патогену за чутливістю до антагоністів, що слід враховувати під час відбору та застосування пробіотиків на практиці.

12. Пестициди, залежно від природи діючої речовини, виявляють неоднакову антибактеріальну активність щодо різних видів фітопатогенних бактерій. Фунгіциди, до складу діючої речовини яких входить манкоцеб або гідроокис міді, пригнічують збудників бактеріальних захворювань томату.

13. Фунгіциди Пенкоцеб, Ридоміл Голд, Чемпіон, Ацидан і Татту, гербіцид Ураган форте, а також біофунгіцид Мікосан В можна рекомендувати для захисту томату від збудників бактеріозів.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гвоздяк Р.І. Взаємовідношення між збудниками бактеріозів томатів / Р.І. Гвоздяк, Л.М. Яковлева, Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Вісн. держ. агроекологічного у-ту. - 2005. - № 2. - С. 168 - 173. (Ідея, проведення дослідів, написання статті).

2. Черненко Є.П. Проти бактеріозів томату / Є.П. Черненко, С.М. Мороз, Л.М. Яковлева, Р.І. Гвоздяк // Карантин і захист рослин. - 2006. - № 12. - С. 10 - 11. (Ідея, проведення дослідів, обговорення та написання статті).

3. Гвоздяк Р.І. Антагоністична активність бацил щодо збудників бактеріальних хвороб томата / Р.І. Гвоздяк, Є.П. Черненко, С.М. Мороз, Л.М. Яковлева // Карантин і захист рослин. - 2007. - № 12. - С. 15 - 17. (Ідея, проведення дослідів, узагальнення даних).

4. Мороз С.М. Фенотипові ознаки штамів Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, виділених із різних екологічних ніш / С.М. Мороз, Є.П. Черненко, Л.М. Яковлева, Р.І. Гвоздяк // Вісн. Харківського нац. у-ту - 2008. - Вип. 1. - С. 34 - 39. (Проведення дослідів, участь в узагальненні даних та оформлення статті).

5. Гвоздяк Р.І. Етіологія масового захворювання томатів у господарствах України / Р.І. Гвоздяк, С.М. Мороз, Л.М. Яковлева, Є.П. Черненко // Мікробіол. журн. - 2009. - 71, № 5. - С. 33-40. (Проведення дослідів, участь в узагальненні даних та оформлення статті).

6. Гвоздяк Р.І. Взаємовідношення між збудниками бактеріозів пасльонових / Р.І. Гвоздяк, Л.М. Яковлева, Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Міжнародна наукова конференція “Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Алелопатія.” Тези доповідей. 4-6 жовтня 2005, м. Київ. К.:"Альфа-Прайм", - С. 39. (Проведено дослідження, проаналізовано й узагальнено експериментальні дані, зроблено висновки).

7. Черненко Є.П. Вибіркова дія біопрепаратів на основі Bacillus sp. на збудників бактеріальних захворювань томатів / Є.П. Черненко, Л.М. Яковлева, С.М. Мороз, С.В. Лапа // Мікробні біотехнології: Міжнар. наук. конф., 11 - 15 вересня 2006 р.: тези доповідей - Одеса, 2006. - С. 106. (Проведено дослідження, проаналізовано й узагальнено експериментальні дані, зроблено висновки).

8. Черненко Є.П. Вплив умов культивування на жирнокислотний склад Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Біологічні дослідження молодих вчених в Україні: матеріали VI Всеукр. наук. конф. студентів та аспірантів 21 - 22 вересня 2006 р. - Київ, 2006. - С. 76 - 77. (Здійснено планування експерименту, проведено дослідження, узагальнено результати, зроблено висновки).

9. Черненко Є.П. Чутливість збудників бактеріозів томату до хімічних засобів захисту рослин / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Сучасні методи захисту рослин від шкідливих організмів: Всеукр. наук. конф. молодих учених та спеціалістів, 2 - 5 жовтня 2006 р.: тези доповідей - Київ, 2006. - С. 47 - 48. (Планування експерименту, проведення досліджень, проаналізовано та узагальнено дані).

10. Черненко Є.П. Жирнокислотний склад загальних клітинних ліпідів колекційних і свіжоізольованих штамів Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Біологія: від молекули до біосфери: І Міжнар. конф. молодих учених, 21-23 листопада 2006 р. тези доповідей - Харків, 2006. - С. 52. (Здійснено планування експерименту, проведено дослідження, узагальнено результати, зроблено висновки, оформлено публікацію).

11. Черненко Є.П. Фізіолого-біохімічні особливості свіжоізольованих і колекційних штамів Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, виділених в Україні / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Шевченківська весна: матеріали між нар. наук.-практ. конф. студентів, аспірантів, 2 - 3 березня 2007 р. - Київ, 2007. - С. 80 - 82. (Проведено дослідження, узагальнено експериментальні дані, зроблено висновки, оформлено матеріали до друку).

12. Черненко Є.П. Жирнокислотний склад загальних клітинних ліпідів колекційних і свіжоізольованих штамів Xanthomonas campestris pv. vesicatoria / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Молодь та поступ біології: ІІІ міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів, 23-27 квітня 2007 р. тези доп.- Львів, 2007. - С. 98 - 82. (Планування експерименту, збір літературних даних і їх аналіз, проведення досліджень, проаналізовано та узагальнено дані).

13. Черненко Є.П. Антагоністична активність ендофітних бактерій відносно збудників бактеріозів томата / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Екологізація сталого розвитку і ноосферна перспектива інформаційного суспільства: Матеріали Міжнародної наукової конференції, аспірантів і молодих учених 3 - 5 жовтня 2007 р. - Харків, 2007. - С. 246. (Планування експерименту, збір літературних даних і їх аналіз, проведення досліджень, узагальнено експериментальні дані, зроблено висновки, оформлено матеріали до друку).

14. Gvozdyak R.I. Depending of fatty acid content of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis lipidis on culture conditions / R.I. Gvozdyak, S.M Moroz, E.P.Chernenko, A.M Ostapchuk. // S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology International scientific conference October 8-12, 2007 - Yalta,2007. - P. 45. (Планування експерименту, проведення досліджень, проаналізовано та узагальнено дані).

15. Черненко Є.П. Ralstonia solanacearum раса 3 біовар 2 в тепличному господарстві Криму / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Біологія: від молекули до біосфери: матеріали ІІ міжнар. конф. молодих учених 19-21 листопада 2007 р. - Харків, 2007. - С. 370- 372. (Здійснено планування експерименту, проведено дослідження, узагальнено результати, зроблено висновки, підготовлено матеріали до друку).

16. Черненко Є.П. Жирнокислотний склад клітинних ліпідів епіфітів - антагоністів бактеріальних патогенів томату / Є.П. Черненко, С.М. Мороз // Молодь і поступ біології: ІV міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів 7-10 квітня 2008 р. тези доп. - Львів, 2008. - С. 98 - 82. (Проведено дослідження, проаналізовано й узагальнено експериментальні дані, зроблено висновки).

17. Мороз С.М., Моніторинг бактеріальних захворювань томату в Україні / С.М. Мороз, Р.І. Гвоздяк, Л.М. Яковлева, Є.П. Черненко // ХІІ з'їзд товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського: Тези доповідей. 25-30 травня 2009 р., м. Ужгород / Нац. акад. наук України, М-во освіти і науки України та ін.; укл. Авдєєва Л.В. та ін. - Ужгород: ВАТ «Патент», 2009. - С. 319. (Проведено дослідження, проаналізовано й узагальнено експериментальні дані, зроблено висновки).



Черненко Є.П. Бактеріальні хвороби томату і біологічне обгрунтування заходів обмеження їхнього розвитку. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 06.01.11 - фітопатологія. - Національний університет біоресурсів і природокористування України, Київ 2009.

Дисертація присвячена вивченню бактеріальних хвороб томату та їхніх збудників у відкритому і закритому ґрунті в Україні. Встановлено, що серед бактеріальних хвороб у відкритому ґрунті домінує чорна бактеріальна плямистість, а в закритому - бактеріальний рак томату та бактеріальне в'янення; останнє в теплицях України виявлено вперше.

Виділені з уражених тканин фітопатогенні бактерії за патогенними, морфологічними, фізіологічними, біохімічними властивостями та профілем ЖК у клітинах ідентичні з колекційними.

Уперше доведено надійність спектра клітинних жирних кислот при ідентифікації X. campestris pv. vesicatoria, C. michiganensis subsp. michiganensis, R. solanacearum. При цьому слід відзначити стабільність складу ЖК за різних умов культивування, змінюється лише співвідношення між ними. Установлено толерантне взаємовідношення між патогенами in vitro. Патогени чутливі до епіфітних та ендофітних сапротрофів, передусім до представників роду Bacillus. Серед останніх виділено перспективні штами для подальшого вивчення їх, як пробіотиків. Розширений спектр дії дозволених пестицидів відносно фітопатогенних бактерій. Ефективними в обмеженні росту патогенів є досить широко застосовані у рослинництві фунгіциди (Ефатол, Пенкоцеб, Ридоміл Голд, Чемпіон, Ацидан і Татту), а також біофунгіцид Мікосан В, гербіцид (Ураган форте).

Ключові слова: рослини томату, бактеріальні хвороби томату, фітопатогенні та сапрофітні бактерії, пробіотики, пестициди.



Черненко Е.П. Бактериальные болезни томата и биологическое обоснование мероприятий ограничения их развития. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. - Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев 2009.

Диссертация посвящается изучению бактериальных болезней томата и их возбудителей в открытом и закрытом грунте в Украине. Установлено, что среди бактериальных болезней в открытом грунте доминирует черная бактериальная пятнистость, а в закрытом - бактериальный рак томата и бактериальное увядание. Возбудитель последнего в теплицах Украины изолирован впервые.

Выделенные из пораженных тканей фитопатогенные бактерии за патогенными, морфологическими, физиологическими, биохимическими свойствами и ЖК-профилем клеток идентичны с коллекционными. В тоже время, штаммы одного вида гетерогенны по некоторым фенотипическим признакам, в основном это касается их агрессивности и способности усваивать некоторые гидрокарбонаты.

Впервые доказана надежность спектров жирных кислот клеток для идентификации X. campestris pv. vesicatoria, C. michiganensis subsp. michiganensis, R. solanacearum. Их состав постоянен при разных условиях культивирования, изменяется только соотношение между ними. Так в клетках C. michiganensis subsp. michiganensis, выросших на разных средах, при разных температурах, и в разные фазы роста преобладали разветвленные насыщенные ЖК.

Установлено толерантное взаимоотношение между патогенами in vitro. Однако в условиях in vіvо эти взаимоотношения могут меняться.

Патогены чувствительны к эпифитным и эндофитным сапротрофам, особенно к представителям рода Bacillus. Среди последних выделены перспективные штаммы для последующего изучения в качестве пробиотиков. Расширен спектр действия разрешенных пестицидов относительно фитопатогенных бактерий. Эффективными являются фунгициды (Эфатол, Пенкоцеб, Ридомил Голд, Чемпион, Ацидан и Татту), а также биофунгицид Микосан В, гербицид (Ураган форте).

Ключевые слова: растения томата, бактериальные болезни томата, фитопатогенные и сапрофитные бактерии, антагонизм между бактериями, пестициды.



Chernenko E.P. Bacterial diseases of tomato and biological substantiation of actions of their restriction development - the manuscript.

The dissertation to obtain of a scientific degree of Cand. of Biol.Sci. in speciality 06.01.11 - phytopathology. - National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv 2009.

The dissertation deals with study of bacterial diseases of tomato and its activators in the open and closed ground in Ukraine. It is established that black bacterial spotted dominates in an open ground among bacterial diseases, and in closed - a bacterial cancer of a tomato and bacterial withering, the last is isolated for the first time in hothouses of Ukraine. The phytopathogenic bacteria isolated from amazed fabrics according to pathogenic, morphological, physiologic, biochemical properties and fatty-acid profile of cages are identical to the collection.

For the first time the reliability of spectra of cellular fat acids is proved at X. campestris pv. vesicatoria, C. michiganensis subsp. michiganensis, R. solanacearum. Their structure is constant under different conditions cultivations, the parity between them varies only.

The tolerant mutual relation between patogen in vitro is established. Patogeny are sensitive to epiphytic and endophytes saprotrophytic, especially to representatives of sort Bacillus. Among the last are isolated perspective cultures for the subsequent study in quality probiotic. The spectrum of action of the resolved pesticides concerning phytopathogenic bacteria is expanded. Effective are fyngycides (Efatol, Penkotseb, Ridomil Gold, Champion, Atsidan and Tattu), and also biophyngycide Mikosan B, herbicide (Yragan forte).

Keywords: tomato plants, tomato bacterial diseases, antagonism between bacteria, pesticides, phytopathogenic and saprophytic bacteria.

Размещено на Allbest.ru