Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вікові особливості впливу прекондиціонування на зміну скорочувальної функції ізольованого серця та активність ферментів плазматичної мембрани

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вікові зміни серцево-судинної системи значно обмежують адаптаційні можливості старіючого організму. В багатьох експериментальних та клінічних дослідженнях показано, що скоротлива здатність міокарду в старості знижується [Фролькис В.В., Безруков В.В., Кульчицкий О.К., 1994; Коркушко О.В., 2000; Rozenberg S. et al., 2006].

В експерименті на ізольованому серці часто використовується моделювання ішемії з проведенням реперфузії. Під час реперфузії ішемізованого міокарда під впливом кисневого потоку виникає цілий каскад метаболічних зрушень, що приводять до пошкодження структури й функції кардіоміоцитів [Iwai T., 2002].

В останні роки велику увагу дослідників привертає феномен ішемічного прекондиціонування (ІП), суть якого полягає в тому, що короткі епізоди ішемії та реперфузії знижують пошкоджуючий вплив наступної тривалої ішемії та реперфузії [Murry C.E., 1986; Zhu X., 2007].

Після відкриття ендотеліального фактору розслаблення і його ідентифікації як оксиду азоту було проведено багато досліджень, які включають вивчення синтезу NO з L-аргініну, гуморальні й механічні фактори, що контролюють його вивільнення, а також відповіді коронарної циркуляції на інгібування утворення NO [Gattullo D., 1999]. Щодо ролі NO, яку він виконує в механізмі ішемічного прекондиціонування, немає однозначної думки. В багатьох дослідженнях показано, що NO бере активну участь в ІП [Miller M.J., 2001] шляхом активації протеінкінази C [Pagliaro P., 2001] і зниження поглинання Ca²⁺ мітохондріями [Rakhit R.D., 2001]. NO розглядається як тригер класичного прекондиціонування [Lochner A., 2002]. Однак є відомості, які свідчать про те, що інгібування синтезу NO у прекондиціонованих серцях не впливає на захисний ефект ІП [Weselcouch E.O., 1995], ендогенний NO не є основним медіатором ІП [Suematsu Y., 2001], а також не бере участі у механізмі ІП в ізольованому серці кроля [Nakano A., 2000] й у свиней in vivo [Post H., 2000].

Сплеск утворення кисневих радикалів (при реперфузії), які не тільки пошкоджують клітину, в якій продукуються, але й стають небезпечними для тканини, повинен ініціювати програму апоптозу в клітині - продуценті активних форм кисню (АФК) та її найближчому оточенні. Наслідком реалізації такого роду програми буде масова загибель клітин при реперфузії органа оксигенованою кров'ю [Скулачев В.П., 1999]. Тому актуальним питанням є з'ясування можливості застосування речовин, що мають виражені антиоксидантні та антиапоптотичні властивості, для зменшення пошкоджуючої дії ішемії та реперфузії.

Незважаючи на велику кількість досліджень ішемічного прекондиціонування, у віковому аспекті його ефект вивчався в поодиноких роботах [Liu X., 2000; Abete P., 2002]. Більшість досліджень механізмів позитивної дії ІП на відновлення функціонування ішемізованого міокарду проводяться без урахування можливих вікових відмінностей та спрямовані на з'ясування ролі різних факторів у процесах запуску та розвитку ІП [Lu Z. et al., 2007; Faghihi M. et al., 2008]. Але події, що відбуваються з ключовими ферментними системами впродовж всього періоду експерименту, включаючи нормальну перфузію, прекондиціонування, довготривалу ішемію та реперфузію практично не досліджені. Тому становить інтерес дослідження стану системи оксиду азоту за умов прекондиціонування ізольованого серця щурів різного віку, що сприятиме визначенню можливих механізмів ІП. Крім того, одним з найпоширеніших напрямків сучасних наукових досліджень в кардіології є пошук можливих кардіопротекторних агентів, а тому дослідження дії відомого антиапоптотичного фактору - ауринтрикарбонової (ауринтрикарбоксилової) кислоти на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця є надзвичайно актуальними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася згідно плану наукових досліджень лабораторії фізіології Інституту геронтології за темою «Вплив інгібітора апоптозу (ауринтрикарбоксилової кислоти) на вікову динаміку смертності та комплекс молекулярно-біологічних, фізіологічних, імунологічних та морфологічних показників у лабораторних комах (дрозофіл) та ссавців (мишей, щурів)» (№ державної реєстраціії 0199U000648) та «Експериментальне вивчення вікових особливостей впливу нового вазодилататора на серцево-судинну систему» (№ державної реєстраціії 0102U001424).

Мета роботи полягала у дослідженні вікових особливостей впливу ішемічного прекондиціонування на відновлення роботи ізольованого серця щурів після ішемії, з'ясуванні можливої ролі мембрано-пов'язаних ферментів та ферментів системи оксиду азота у механізмі ІП, а також у пошуку можливих кардіопротекторних агентів.

Задачі:

1. Дослідити зміни скорочувальної функції ізольованого серця дорослих та старих щурів після тривалої ішемії під час наступної реперфузії.

2. Встановити вікові відмінності впливу ішемічного прекондиціонування на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця дорослих та старих щурів після ішемії під час реперфузії.

3. Визначити активність Na⁺, K⁺-АТФази сарколеми кардіоміоцитів та з'ясувати можливу роль її змін у механізмі ішемічного прекондиціонування.

4. Визначити зміни активності ферментів системи оксиду азоту, вмісту метаболітів NО в гомогенаті серця та перфузаті, що відтікає, в динаміці під час експерименту та оцінити можливий внесок цих змін у відновлення роботи ізольованого серця щурів різного віку.

5. Дослідити вплив різних концентрацій ауринтрикарбонової кислоти на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця дорослих та старих щурів після тривалої ішемії під час наступної реперфузії.

Об'єкт дослідження: ізольоване серце щурів різного віку.

Предмет дослідження: скорочувальна функція ізольованого серця за умов ішемії та реперфузії.

Методи дослідження: перфузія серця за Лангендорфом; визначення активности Na⁺, K⁺-АТФази та Са²⁺-АТФази у фракції ізольованих мембран кардіоміоцитів; визначення активності cNOS, iNOS, нітратредуктази, аргінази та вмісту сечовини, нітрат-аніону , нітрит-аніону та низькомолекулярних нітрозотіолів (НМНТ) в гомогенаті серця, а також визначення вмісту цих метаболітів, сечової кислоти та неорганічного фосфату P_i в перфузаті.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі визначені вікові відмінності впливу одного циклу ішемічного прекондиціонування на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця у дорослих і старих щурів та встановлено, що одним з можливих механізмів позитивного впливу ішемічного прекондиціонування на постішемічну роботу ізольованого серця дорослих тварин є збереження активності Na⁺, K⁺-АТФази сарколеми кардіоміоцитів.

Вперше досліджено стан системи оксиду азоту за умов перфузії, ішемічного прекондиціонування, ішемії та реперфузії. Встановлено, що прекондиціонування сприяє підвищенню активності конституційних NO-синтаз та зниженню активності індуцибельної NO-синтази, нітратредуктази та аргінази в ізольованому серці дорослих тварин, а у старих викликає зниження активності лише нітратредуктази.

Вперше досліджено і встановлено відмінність впливу різних концентрацій ауринтрикарбонової кислоти на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця щурів різного віку після ішемії.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати про відмінність реагування ізольованого серця щурів різного віку на кардіопротекторні впливи, свідчать про важливість урахування вікових особливостей під час пошуку та розробці нових кардіопротекторних препаратів.

Отримані дані про зміни в системі оксиду азоту при ішемії та реперфузії можуть слугувати додатковим обґрунтуванням для розробки засобів впливу на роботу серця за різних патологічних умов.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором самостійно. Науковий пошук напрямку досліджень та їх обгрунтування проводилися спільно з науковим керівником членом-кореспондентом АМН України професором В.В. Безруковим. Автором самостійно виконані експерименти на ізольованому серці, здійснено визначення активності Na⁺, K⁺-АТФази та Са²⁺-АТФази, проведено статистичну обробку результатів дослідження та їх аналіз. Визначення біохімічних показників, що характеризують стан системи оксиду азоту, проводилося спільно з співробітниками відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В Палладіна НАН України (ст. н.співр. Коцюруба А.В. та інж. І кат. Коркач Ю.П.).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на: IV Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2003); Міжнародній науково-методичній конференції «Формування особистості студентів як майбутніх фахівців лікарської справи, працівників охорони здоров'я та інших соціально-орієнтованих установ у контексті біоетики» (Львів, 2003); V Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2004); VI Міжнародному симпозіумі «Биологические механизмы старения» (Харків, 2004); Міжнародному симпозіумі «Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии» (Гродно, Білорусь 2006); IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); Науковій конференції молодих вчених з міжнародною участю, присвяченій пам'яті академіка В.В. Фролькіса «Біологічні основи розвитку патології пізнього віку» (Київ, 2007).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 10 наукових робіт, в тому числі 3 статті у фахових виданнях та тези 7 доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел. Робота викладена на 135 сторінках, містить 3 таблиці та проілюстрована 28 рисунками.

Основний зміст роботи

серце щур ішемія реперфузія

Матеріали та методи досліджень

Досліди проводилися на щурах-самицях лінії Вістар двох вікових груп: дорослі (6-8 міс) та старі (24-26 міс). Тварини утримувались у віварії на стандартному кормовому раціоні. Під час експерименту тварин наркотизували ефіром. Всього було використано близько 150 щурів.

Для вивчення функції серцевого м'язу була обрана модель ізольованого серця (ІС), яка дозволяє виключити екстракардіальні регуляторні впливи. Коронарну перфузію проводили за методом Лангендорфа. Розчин (склад (у ммоль/л): NaCl - 118,0; KCl - 4,7; MgCl₂-1,0; Na₂HPO₄-1,2; NaHCO₃-25,0; CaCl₂-2,5; глюкоза - 11,0), яким перфузували, був аерований карбогеном (О₂:СО₂=95:5). Об'ємну швидкість коронарного кровотоку (ОШКК) контролювали по об'єму відтікаючої від ІС рідини за 1 хвилину.

Скорочувальну функцію ІС визначали при спонтанному ритмі скорочень. Латексний балончик, з'єднаний за допомогою жорсткого поліетиленового катетеру з датчиком тиску, через надріз у лівому вушці та лівий атріовентрикулярний отвір вводили у порожнину шлуночку та роздували до об'єму, при якому тиск, що розвивався, був максимальним. У подальшому об'єм балончику не змінювали, і, таким чином, ІС скорочувалося у ізоволюмічному режимі.

Використовували дві схеми постановки експерименту - без та з застосуванням ішемічного прекондиціювання (Рис. 1). Згідно схеми без ІП ізольоване серце перфузувалося впродовж 30 хв, потім піддавалося тотальній ішемії протягом 30 хв та реперфузувалося протягом 40 хв. В експерименті з використанням ІП ізольоване серце після 20 хв перфузії піддавалося одному циклу прекондиціонування (5 хв тотальної ішемії з наступними 5 хв реперфузії), після чого піддавалося довготривалій ішемії (30 хв) та реперфузії (40 хв).

Дослідження впливу нової кардіопротекторної сполуки на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця після довготривалої ішемії проводили за першою схемою експерименту, тобто після 30 хв перфузії серця піддавалися 30-хвилинному періоду ішемії, а потім реперфузувалися протягом 40 хв. Ізольовані серця контрольної групи перфузувалися поживним розчином без додавання кардіопротектору. В експериментах по дослідженню впливу ауринтрикарбонової кислоти (АТК) перфузуючий розчин містив АТК в концентраціях 0,01 мкмоль/л, 0,1 мкмоль/л, 1,0 мкмоль/л та 10 мкмоль/л.

Активність Na⁺, K⁺-АТФази та Са²⁺-АТФази визначали у фракції ізольованих мембран кардіоміоцитів, яку отримували, використовуючи методику [Сазонтова Т.Г., 1986]. Про активність Na⁺, К⁺-АТФази та Са²⁺-АТФази судили по накопиченню неорганічного фосфату.

Визначення біохімічних показників, що характеризують стан системи оксиду азоту, проводили спільно з співробітниками відділу молекулярної біології Інституту біохімії ім. О.В Палладіна НАН України (зав. відділом д.б.н. Мінченко О.Г., виконавці - ст. н.співр. Коцюруба А.В. та інж. І кат. Коркач Ю.П.).

Для біохімічного аналізу системи NO серця та перфузат, що відтікав, відбирали після 20 хв перфузії (контроль), 30 хв ішемії та 40 хв реперфузії. В гомогенаті серця визначали активність cNOS, iNOS, нітратредуктази та аргінази, а також вміст метаболітів - сечовини, нітрат-аніону , нітрит-аніону та низькомолекулярних нітрозотіолів (НМНТ). У перфузаті визначали вміст цих же метаболітів, сечової кислоти та неорганічного фосфату P_i.

Результати досліджень та їх обговорення

Вікові особливості відновлювання скорочувальної функції ізольованого серця щурів після ішемії. При вивченні змін частоти серцевих скорочень (ЧСС) у дорослих і старих щурів нами було відзначено, що вихідні значення показника в обох вікових групах вірогідно не відрізнялися: на 10-30 хвилинах досліду у дорослих ЧСС становила 265,4±11,9, а у старих - 254,1±16,2 уд/хв. Після ішемії в серці як дорослих, так і старих тварин частота серцевих скорочень, по досягненні певного рівня на 5 хвилині реперфузії, практично не змінювалася до кінця експерименту. У дорослих ЧСС на 5-10 хвилинах реперфузії становила 237,2±16,8 уд/хв, а на 30-40 хвилинах - 237,3±10,4. У групі старих тварин ЧСС на 5-10 хвилинах реперфузії була 183,1±33,7 уд/хв, на 30-40 хвилинах - 179,4±31,4 (P<0,05). У середньому у дорослих відзначалося зменшення показників на 10,6%, у той час як у старих спостерігалося зниження ритму на 28,6%.

На 10-30 хв експерименту величина об'ємної швидкості коронарного кровотоку (ОШКК) у дорослих складала 9,1±0,7 мл/мг·хв, у старих - 7,7±0,5 мл/мг·хв. Після ішемії й відновлення перфузії в групі дорослих тварин спостерігалося різке підвищення ОШКК на 5-ій хв - 12,2±1,36 мл/мг·хв (на 34,4% у порівнянні з доішемічними значеннями) й подальше поступове зниження показників до 7,0±0,4 мл/мг·хв на 30-40 хв реперфузії. В серці старих щурів показники ОШКК, досягши на 5-10-ій хв реперфузії вихідних значень (7,9±0,7 мл/мг·хв), протягом реперфузії знизилися на 17% - до 6,2±0,3 мл/мг·хв.

Аналізуючи зміни показників максимального тиску Р_max, що розвивається лівим шлуночком ізольованого серця у дорослих і старих щурів, слід зазначити приблизно однакові вихідні значення в обох вікових групах: 82,5±7,5 мм рт. ст. - у дорослих й 72,0±12,8 мм рт. ст. - у старих. Характер динаміки змін Р_max під час реперфузії відрізнявся у дорослих і старих щурів. Р_max у дорослих тварин, досягши на 5-ій хвилині реперфузії величини, що перевищує вихідні значення на 12,3%, протягом наступних 35 хв повільно й рівномірно падає. Починаючи з 88,5±8,3 мм рт. ст. на 5-10 хв реперфузії, значення Р_max знижуються до 73,5±7,58 мм рт. ст. на 30-40 хв. У серці старих тварин відновлення Р_max після 30 хвилин ішемії відбувається по-іншому. Протягом перших 5-10 хв після відновлення перфузії максимальний тиск лівого шлуночка досягає лише 42,0±19,5 мм рт. ст. (60% від початкових значень). На 20 хв реперфузії Р_max підвищується до 60,8±9,8 мм рт. ст., а потім дещо знижується, складаючи на 30-40 хв 53,3±8,3 мм рт. ст. (P<0,05 у порівнянні з початковими значеннями), тобто 81,1% від вихідних значень.

При аналізі змін показників швидкості наростання тиску ізольованого серця щурів різного віку було відзначено, що на початку експерименту значення +dP/dt у дорослих тварин становили 2172,8±150,0 мм рт. ст./с, а у старих показники були нижче - 1565,3±207,8 мм рт. ст./с (p<0,05 у порівнянні з дорослими тваринами). Характер відновлення швидкості наростання тиску після тривалої ішемії був подібним у групах старих і дорослих тварин. В обох вікових групах постішемічні показники +dP/dt, досягши найвищих значень на 5-ій хв реперфузії, протягом подальшого періоду мали відносно стабільні значення. Так, у дорослих щурів величина +dP/dt на 5-ій хв реперфузії складала 1321,5±224,3 мм рт. ст./с, на 20-ій - 1271,3±170,3 мм рт. ст./с, на 30-40-ій - 1126,5±149,3 мм рт. ст./с. У групі старих тварин після відновлення перфузії значення +dP/dt були такими: на 5-ій хв - 1060,5±241,5 мм рт. ст./с, на 20-ій хв - 945,0±201,0 мм рт. ст./с, на 30-40-ій - 862,5±190,5 мм рт. ст./с. Отже, в ізольованому серці як дорослих, так і старих щурів показники +dP/dt після ішемії не відновлювалися до початкових значень (P<0,05).

При старінні найбільш помітно змінюються показники, що характеризують розслаблення міокарда. Вихідні величини швидкості падіння тиску відрізнялися в серці дорослих і старих щурів. На початку досліду значення - dP/dt у дорослих тварин становили 1289,3±112,5 мм рт. ст./с, у старих - 984,8±102,8 мм рт. ст./с (p<0,05 у порівнянні з дорослими щурами). Під час реперфузії значення - dP/dt в обох вікових групах також не відновлювалися до початкових значень та змінювалися практично однаково - спостерігалося поступове зниження показників з 579,8±143,3 мм рт. ст./с у дорослих й 612,8±165,8 мм рт. ст./с у старих на 5-10 хвилині до 455,3±82,5 мм рт. ст./с й 408,0±72,0 мм рт. ст./с на 30-40 хв у дорослих і старих відповідно (P<0,05 у порівнянні з початковими значеннями). Хоча абсолютні величини показників - dP/dt у серці дорослих і старих щурів під час реперфузії були майже однаковими, ступінь зниження швидкості падіння тиску щодо вихідних величин у них відрізнялася. Так, у дорослих тварин значення - dP/dt наприкінці реперфузії були знижені на 63,5% відносно доішемічних значень, у старих - на 55,6%.

Як свідчать отримані нами результати, тривала тотальна ішемія призводить до вірогідного зниження максимального тиску, що розвивається лівим шлуночком ізольованого серця під час реперфузії в групі старих тварин, не впливаючи при цьому на зміну P_max у дорослих. Найбільш чутливими до 30-хвилинної ішемії в обох вікових групах є показники +dP/dt й - dP/dt, які характеризують швидкість скорочення й розслаблення міокарда, - і у дорослих, і у старих тварин під час реперфузії відзначаються вірогідно більш низькі значення цих швидкісних показників.

Вплив одного циклу ішемічного прекондиціонування на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця дорослих і старих щурів після ішемії під час реперфузії. У дорослих щурів в обох експериментальних групах після відновлення перфузії значення ЧСС дещо не досягали доішемічних величин і протягом реперфузії залишалися майже на досягнутому рівні. У групі без застосування ІП значення ЧСС досягали 90% від вихідних величин, а в групі із застосуванням - 80%.

У старих тварин спостерігався неоднозначний вплив ІП на відновлення показників ЧСС під час реперфузії після тотальної ішемії. В 30% дослідів з використанням ІП під час реперфузії було відзначене перевищення початкових значень на 15% (P<0,05 у порівнянні з групою без ІП). В 70% дослідів з використанням ІП значення ЧСС під час реперфузії практично не відрізнялися від значень ЧСС у групі без застосування прекондиціонування. У групі без ІП показники складали 70% від вихідних значень, у групі з ІП - 80-85%.

Показники ОШКК під час реперфузії після тривалої ішемії в серці дорослих та старих тварин обох експериментальних груп достовірно не відрізнялися.

За характером відновлення максимального тиску, що розвиває лівий шлуночок, після одного циклу ІП і тривалої ішемії у групі дорослих тварин можна було виділити дві підгрупи. У 60% проведених дослідів значення P_max відновлювалися й змінювалися протягом реперфузії так само, як і в групі без застосування прекондиціонування. Досягши на 5-ій хв 116% від вихідних значень, із часом величина P_max поступово знижувалася до 88-90% наприкінці експерименту. На відміну від попередньої підгрупи, в 40% дослідів на ізольованому серці дорослих тварин застосування ІП приводило до перевищення значень P_max під час реперфузії щодо вихідних величин. На 5-ій хв реперфузії показники P_max були на 48% вище початкових, а на 30-40-ій хв перевищували вихідні значення на 18-27% (P<0,05 у порівнянні із групою без ІП).

Як і у дорослих, в серцях старих щурів помітних відмінностей у величинах показників P_max під час прекондиціонування не спостерігалося, але після тотальної ішемії за особливостями відновлення P_max можна було виділити дві підгрупи. У 45% дослідів із застосуванням ІП зміни показників P_max після ішемії відрізнялися від показників P_max у непрекондиціонованому серці тільки протягом перших 10 хвилин реперфузії. Потім до кінця експерименту значення P_max в цих дослідах з використанням ІП практично не відрізнялися від ішемічного контролю - на 30-40-ій хв реперфузії P_max знизилося до 72-84% щодо вихідних величин. У 55% експериментів на старих серцях було відзначене підвищення реперфузійних значень P_max після використання ІП. Так, на 5-ій хв реперфузії величина внутрішньошлуночкового тиску становила 121% від початкових значень і до кінця експерименту на 30-ій й 40-ій хв була 104 й 102% відповідно.

Відновлення показників швидкості наростання внутрішньошлуночкового тиску після ішемії в групі дорослих тварин із застосуванням ІП мало неоднозначний характер. Під час реперфузії в одній частині експериментів спостерігалося помітне поліпшення показників +dP/dt, а в іншій - відсутність будь-якого позитивного ефекту. У 40% дослідів під час реперфузії після тотальної ішемії відзначалося підвищення показників +dP/dt щодо вихідних значень. На 5-ій хв реперфузії величина швидкості наростання тиску перевищувала доішемічні значення на 36% і до кінця досліду залишалася на цьому ж рівні з невеликими коливаннями. В іншій частині дослідів з використанням ІП (60%) після тотальної ішемії величина й динаміка значень +dP/dt під час реперфузії була такою ж, як у групі без застосування ІП. В ізольованому серці старих щурів ішемічне прекондиціонування не мало позитивного впливу на відновлення показників швидкості наростання тиску після тривалої ішемії.

В ізольованому серці дорослих тварин ішемічне прекондиціонування в одній частині дослідів позитивно впливало на відновлення показників - dP/dt після тривалої ішемії, а в іншій такого ефекту не спостерігалось. В 40% дослідів під час реперфузії після тотальної ішемії спостерігалося значне перевищення показників - dP/dt щодо вихідних значень. У середньому значення - dP/dt було на 50% вище, ніж на початку експерименту. В іншій же частині дослідів, що складала 60%, під час реперфузії після тривалої ішемії різниці між групами із застосуванням ІП і без нього не спостерігалося. У старих тварин ішемічне прекондиціонування не мало позитивного впливу на відновлення швидкості падіння тиску в лівому шлуночку ізольованого серця після тривалої ішемії.

Відомо, що активність Na⁺, K⁺-АТФази міокарду з віком знижується. Дослідження Na⁺, K⁺-АТФази (Табл. 1.) показало, що величина активності цього ферменту в ізольованому серці старих тварин після 30 хвилин перфузії на 25% нижче, ніж у серці дорослих (P<0,05). Отримані результати узгоджуються з такими, що були отримані в нашій лабораторії раніше [Берук О.В., 1998]. На фоні реперфузії після 30 хвилин тотальної ішемії зниження активності Na⁺, K⁺-АТФази сарколеми КМЦ дорослих і старих щурів становило 52% (P<0,01) і 47% (P<0,01) відповідно в порівнянні з контролем. Зниження базальної активності ферменту в результаті застосування ІП перед тотальною ішемією було значно менше - у дорослих тварин на 26% (P>0,05) і старих на 33% (P<0,01). В ізольованому серці дорослих тварин ІП підвищувало відновлення активності Na⁺, K⁺-АТФази в порівнянні з активністю ферменту в серцях, що не піддавалися ІП, в яких активність була набагато нижче вихідного рівня (Табл. 1). Отримані результати свідчать про те, що ІП ефективніше знижує негативний вплив тотальної ішемії на рівень активності Na⁺, K⁺-АТФази сарколеми кардіоміоцитів ізольованого серця дорослих тварин, ніж старих.

Вплив ішемічного прекондиціонування на зміну активності Na⁺, K⁺-АТФази сарколеми кардіоміоцитів щурів різного віку після ішемії й реперфузії.

Зниження активності Na⁺, K⁺-АТФази під час ішемії приводить до підвищення внутрішньоклітинної концентрації натрію, що, у свою чергу, знижує активність обміну внутрішньоклітинного кальцію на позаклітинний натрій (Na⁺/Ca²⁺-обмінник) [Rьegg J.C., 1986]. Таким чином, іони кальцію накопичуються у внутрішньоклітинному середовищі й перешкоджають адекватному розслабленню й подальшому скороченню серцевого м'яза. Збереження активності Na⁺, K⁺-АТФази в сарколемі кардіоміоцитів у серцях дорослих щурів, які спочатку були піддані одному циклу ІП, вочевидь, запобігає зниженню активності Na⁺/Ca²⁺-обмінника й, таким чином, може сприяти відновленню скорочувальної функції ізольованого серця після тривалої тотальної ішемії. Можна припустити, що менша здатність ізольованого серця старих тварин до функціонального відновлення пов'язана зі зниженням активності Na⁺, K⁺-АТФази сарколеми кардіоміоцитів, що розвивається протягом тривалого періоду ішемії.

Вплив ішемічного прекондиціонування на зміну показників метаболізму NO в ізольованому серці дорослих і старих щурів. Вихідний рівень активності досліджуваних ферментів відрізнявся у дорослих і старих щурів.

Активність cNOS у старих нижче, ніж у дорослих, у той час як iNOS і нітратредуктази вище, а активність аргінази практично однакова у тварин обох вікових груп.

Під час ішемії й реперфузії, яким не передував цикл прекондиціонування, в ізольованому серці щурів обох вікових груп спостерігається підвищена активність iNOS, а активність конститутивних форм NOS (нейрональної та ендотеліальної) - знижена. Збільшується також використання L-аргініну аргіназою, що сприяє генерації супероксиду замість оксиду азоту, або одночасній їх генерації усіма ізоферментами NOS, що в свою чергу створює умови для утворення пероксинітриту. Крім того, активізується так званий реутилізаційний шлях синтезу оксиду азоту під дією нітратредуктаз.

Після застосування ІП наприкінці ішемії в серці дорослих тварин рівень активності cNOS й iNOS не відрізняється від цих же показників у непрекондиціонованій групі. Але активність нітратредуктази й аргінази вірогідно нижче, у порівнянні із групою без ІП. Після реперфузії в групі з використанням ІП активність конститутивних форм NOS була значно вище, а активність iNOS знизилася, у порівнянні із групою без нього. Значення активності нітратредуктази й аргінази в аналогічних умовах були вірогідно нижче в групі із застосуванням ІП.

В серці старих тварин після ішемії було відзначене помітне зниження активності cNOS у порівнянні з вихідними величинами, а після реперфузії активність не відрізнялася в обох експериментальних групах і не досягала доішемічних значень. Активність iNOS і наприкінці ішемії, і наприкінці реперфузії була дещо нижче в ІП-групі, ніж у групі без ІП. Нітратредуктаза після ішемії в старих серцях, на відміну від дорослих, у прекондиціонованій групі активувалася більше, ніж у групі без ІП, а наприкінці реперфузії в групі з ІП її активність була нижче, ніж у групі без ІП. Активність аргінази серця старих щурів у цих же умовах досліду змінювалась аналогічно дорослим - підвищувалась в групі без ІП і знижувалась в групі з ІП.

На Рис. 3 показані зміни вмісту деяких метаболітів у гомогенаті серця дорослих і старих щурів обох експериментальних груп. Вміст сечовини, що є продуктом аргіназної реакції, характеризує як інтенсивність самої цієї реакції, так і процеси транспорту сечовини через плазматичну мембрану. Сечовина, що є хелатором вільного заліза, у низьких концентраціях виявляє антиоксидантні властивості за рахунок поглинання OHя, що утворюється у фентонівській реакції. Крім того, сечовина є інгібітором ресинтезу аргініну в орнітиновому (орнітин-цитрулін-аргіниносукцинат-аргінин) і цитруліновому (цитрулін-аргіниносукцинат-аргінин) циклах. Обидва цикли мають місце в кардіоміоцитах і відіграють важливу роль, забезпечуючи субстратом переважно iNOS. У високих концентраціях, що утворюються під час ішемії й реперфузії, сечовина може мати кардіотоксичний вплив.

У дорослих тварин в групі із застосуванням ІП вміст сечовини в гомогенаті серця наприкінці реперфузії вірогідно нижче у порівнянні з непрекондиціонованою групою. У старих тварин спостерігається значне зниження вмісту сечовини в порівнянні з контролем в обох експериментальних групах як після ішемії, так і після реперфузії. Більш високий вміст у гомогенаті серця дорослої групи з ІП може свідчити про обмеження утворення пероксинітриту. У групі без ІП зниження вмісту нітрат-аніону може відбуватися як у результаті утворення токсичного ОNOO^-, так і за рахунок інтенсивної утилізації нітрату нітратредуктазою з утворенням NO. У старих тварин вихідна кількість нітрат-аніону в гомогенаті серця була вірогідно нижче, ніж у дорослих. В обох експериментальних групах старих щурів в умовах ішемії й реперфузії спостерігається незначне зниження вмісту . У дорослих же після ішемії відзначається помітне зменшення кількості нітрат-аніону в обох експериментальних групах, а після реперфузії в групі з ІП вміст вірогідно вище, ніж у групі без ІП. Утворення низькомолекулярних нітрозотіолів (в основному це нітрозильований глутатіон) відбувається за участю пероксинітриту, і, таким чином, є показником інтенсивності його утворення.

Як видно на Рис. 3, в ізольованому серці дорослих і старих щурів під час ішемії й реперфузії має місце значне зниження рівня НМНТ у період ішемії, і, навпаки, їхнє підвищення після реперфузії.

Як відомо, нітрозотіоли є депо оксиду азоту, і значне зниження рівня їхнього вмісту під час ішемії може свідчити про інтенсивний процес звільнення NO у цей період. Підвищення вмісту НМНТ після реперфузії може свідчити про інгібування цього процесу, або про інтенсифікацію утворення нітрозотіолів. Оскільки НМНТ в основному представлені нітрозильованим глутатіоном, зниження кількості НМНТ у період ішемії може свідчити про деяке зростання рівня неокисленого глутатіону в період інтенсивної генерації вільних радикалів, що має адаптивне захисне значення під час ішемії.

Перед ішемією вміст НМНТ у серці дорослих щурів був вірогідно нижче, ніж у старих. Наприкінці ішемії кількість нітрозотіолів була знижена й відновлювалася до вихідних значень до кінця реперфузії в обох експериментальних групах дорослих тварин. Достовірна різниця вмісту НМНТ між групами з ІП і без ІП спостерігалася тільки після ішемії. У старих щурів після ішемії кількість НМНТ у групі із застосуванням прекондиціонування була вірогідно вище, ніж у групі без ІП, а після реперфузії спостерігалося протилежне - вміст нітрозотіолів у групі з ІП був вірогідно нижче, ніж у групі без його використання.

Отже, простеживши деякі шляхи метаболізму оксиду азоту в ізольованому серці в умовах ішемії й реперфузії із застосуванням ІП і без нього, можна стверджувати, що одним із механізмів кардіопротекторної дії прекондиціонування є його вплив на функціонування системи NO. Достовірне зниження активності iNOS, нітратредуктази й аргінази у дорослих після застосування ІП призводить до зменшення утворення токсичних кількостей NO, знижуючи тим самим імовірність утворення ONOO^-, а також сприяє більшій доступності L-аргініну для сNOS. У старих тварин вірогідно знижується активність тільки нітратредуктази, активність iNOS й аргінази виявляє лише тенденцію до зниження. Аналізуючи вміст метаболітів у гомогенаті серця й перфузаті, можна зробити висновок, що інгібування синтезу сечової кислоти (а отже, і супероксиду, необхідного для утворення ONOO^-) вказує на можливий механізм кардіопротекторної дії ІП, що полягає в пригніченні генерації супероксиду й високих концентрацій NO (iNOS і нітратредуктазою), що зумовлює обмеження утворення токсичного пероксинітриту в кардіоміоцитах в умовах ішемії й реперфузії. Значна вікова відмінність вихідного рівня ключових ферментів метаболізму NO, а також недостатня інтенсивність зміни їхньої активності після ІП може пояснювати виявлену раніше відсутність сприятливого впливу ІП на відновлення скорочувальної функції серця старих тварин.

Вікові особливості впливу ауринтрикарбонової кислоти на відновлення скорочувальної функції ізольованого серця. Пошкодження, що розвиваються в результаті ішемії, відбуваються не тільки при самій ішемії, але й при наступній реперфузії. Провідна роль в пошкоджуючій дії реперфузії належить активним формам кисню. Сплеск утворення кисневих радикалів, які не лише пошкоджують клітину, в якій продукуються, але й стають небезпечними для тканини, повинен ініціювати програму апоптоза в клітині-продуценті оксирадикалів та її найближчому оточенні. Наслідком реалізації такої програми буде масова загибель клітин при реперфузії органу оксигенованою кров'ю. Наявні відомості про ауринтрикарбонову кислоту, її антиапоптотичні та антиоксидантні властивості дозволяють припустити, що її застосування може виявитися перспективним для підвищення стійкості тканин і органів до впливу таких стресорних факторів, як, наприклад, ішемія.

Зміни скорочувальної функції ізольованого серця щурів обох вікових груп під час реперфузії не відрізнялися в контрольній групі та у групі, в якій використовувалася концентрація АТК 0,01 мкмоль/л. Перфузія розчином, що містив АТК у концентрації 10 мкмоль/л, погіршувала роботу серця після ішемії. АТК у концентраціях 0,1 мкмоль/л та 1,0 мкмоль/л викликала неоднозначні зміни реперфузійних значень показників роботи ізольованого серця.

Частота серцевих скорочень у контрольній групі дорослих тварин після ішемії під час реперфузії знижувалася на 7,6%, у групі «АТК 0,1 мкмоль/л» ЧСС знижувалася на 1,4% (P<0,05 у порівнянні з контролем), у той час як у групі «АТК 1,0 мкмоль/л» спостерігалося зниження ЧСС на 5,1%. В ізольованому серці старих тварин у зміні ЧСС не було виявлено достовірної різниці між експериментальними групами, хоча спостерігалася помітна тенденція до зменшення зрушення. Так, у контрольній групі старих тварин ЧСС знижувалася на 11,8%, у групі «АТК 0,1 мкмоль/л» - на 5%, а в групі «АТК 1,0 мкмоль/л» - на 2,2%.

Об'ємна швидкість коронарного кровотоку в контрольній групі дорослих тварин знижувалася на 20,5%, старих - на 21%. У групах «АТК 0,1 мкмоль/л» й «АТК 1,0 мкмоль/л» в ізольованому серці дорослих тварин ОШКК знижувалася на 16,7% й 18,9% відповідно. У старих тварин ОШКК знижувалася на 30,7% у групі «АТК 0,1 мкмоль/л» і на 23,9% у групі «АТК 1,0 мкмоль/л».

Тиск, що розвивається лівим шлуночком Р_max ізольованого серця дорослих щурів під час реперфузії після ішемії, знизився на 12,8%, у групі «АТК 0,1 мкмоль/л» показник Р_max знижувався на 5,7%, а у групі «АТК 1,0 мкмоль/л» було відзначене зниження Р_max на 33,9% (P<0,05 у порівнянні з контролем). В контрольній групі старих тварин внутрішньошлуночковий тиск знижувався на 30,4%. Присутність у перфузуючому розчині АТК у концентрації 0,1 мкмоль/л привела до таких змін: Р_max в 60% дослідів збільшувався на 11,9% (P<0,05 у порівнянні з контролем), а в 40% випадків знижувався на 32,4%; у групі «АТК 1,0 мкмоль/л» показники Р_max знизилися на 32,2%.

Швидкість наростання тиску у контрольній групі дорослих тварин після ішемії під час реперфузії знижувалася на 16,9%. АТК у концентрації 0,1 мкмоль/л призвела до зниження +dP/dt на 24,8%, у той час як у групі «АТК 1,0 мкмоль/л» спостерігалося підвищення +dP/dt на 0,1% (P<0,05 у порівнянні з контролем). В ізольованому серці старих тварин +dP/dt у контрольній групі знижувалася на 34,8%, у групі «АТК 0,1 мкмоль/л» - на 52,6% (P<0,05 у порівнянні з контролем), а в групі «АТК 1,0 мкмоль/л» - на 33,7%.

Швидкість падіння тиску у контрольній групі дорослих тварин після ішемії під час реперфузії знижувалася на 26,2%. У групі «АТК 0,1 мкмоль/л» спостерігалося зниження - dP/dt на 10,7% (P<0,05 у порівнянні з контролем), у той час як у групі «АТК 1,0 мкмоль/л» - dP/dt знижувалася на 20,4%. В ізольованому серці старих тварин - dP/dt у контрольній групі знижувалася на 50,1%, у групі «АТК 0,1 мкмоль/л» - на 53,1% а в групі «АТК 1,0 мкмоль/л» - на 27,4% (P<0,05 у порівнянні з контролем).

В ізольованому серці дорослих тварин АТК в концентрації 0,1 мкмоль/л викликала помітні позитивні зрушення показників Р_max й - dP/dt, у той час як у старих в різних групах мала різноспрямовану дію на Р_max і значно погіршувала +dP/dt. АТК у концентрації 1,0 мкмоль/л у дорослих тварин поліпшувала тільки +dP/dt, а у старих - - dP/dt.

Очевидно, завдяки антиоксидантним й антиапоптотичним властивостям АТК, кількість вільних радикалів, що утворюються під час реперфузії, було значно зниженою, а отже, зменшилася й кількість елімінованих кардіоміоцитів, що вплинуло на зміну скорочувальної функції міокарда після ішемії.

Висновки

1. Тривала тотальна ішемія ізольованого серця викликає більш виражені зміни сили серцевих скорочень і його ритму у старих тварин і майже однаковою мірою зменшує швидкісні показники діяльності серця в обох вікових групах.

2. В ізольованому серці дорослих тварин ішемічне прекондиціонування не впливає на відновлення показників частоти серцевого скорочення та коронарного кровотоку, але у 40% дослідів сприяє підвищенню силових та швидкісних показників під час реперфузії після тривалої ішемії.

3. В ізольованому серці старих тварин прекондиціонування у третині експериментів викликає підвищення реперфузійних значень ритму серця і його сили скорочень, і не впливає на відновлення швидкісних показників та коронарного кровотоку.

4. Одним з механізмів, що призводить до відновлення швидкісних показників скорочувальної функції ІС під час реперфузії в прекондиціонованих серцях дорослих щурів, є збереження активності Na⁺, K⁺-АТФази плазматичних мембран кардіоміоцитів.

5. Прекондиціонування призводить до достовірного підвищення активності конституційних NO-синтаз та вірогідно знижує активність індуцибельної NO-синтази, нітратредуктази та аргінази наприкінці реперфузії в ізольованому серці дорослих щурів, тоді як у старих сприяє достовірному зниженню активності лише нітратредуктази.

6. Оптимальними для відновлення роботи ізольованого серця щурів після ішемії є концентрації ауринтрикарбонової кислоти (АТК) 0,1 мкмоль/л та 1,0 мкмоль/л. Зменшення концентрації АТК на порядок не впливає на роботу серця, а збільшення погіршує її.

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Бадова Т.А. Возрастные особенности влияния ишемического прекондиционирования на восстановление сократительной функции изолированного сердца крыс и активность Na⁺, K⁺-АТФазы / Т.А. Бадова, О.В. Соколова, В.В. Безруков // Проблемы старения и долголетия. - 2003. - №2. - С. 142-148. (Дисертант - проведення експериментів, статистична обробка результатів, літературний пошук, підготовка до друку).

2. Бадова Т.А. Влияние ауринтрикарбоновой кислоты на восстановление сократительной функции изолированного сердца крыс разного возраста / Т.А. Бадова, В.В. Безруков // Проблемы старения и долголетия. - 2004. - №4. - С. 494-501. (Дисертант - проведення експериментів, статистична обробка результатів, літературний пошук, підготовка до друку).

3. Возрастные особенности влияния ишемического прекондиционирования изолированного сердца крыс на метаболизм NO / Т.А. Бадова, В.В. Безруков, Ю.П. Коркач [та ін.] // Проблемы старения и долголетия. - 2006. - №4. - С. 291-300. (Дисертант - проведення експериментів, літературний пошук, підготовка до друку).

4. Бадова Т.А. Влияние ишемического прекондиционирования на восстановление сократительной функции и активность Na⁺, K⁺-АТФазы изолированного сердца крыс разного возраста: тези доповідей IV Української конференції молодих вчених, присвяченої пам'яті академіка В.В. Фролькіса, (Київ, 24 січня 2003). - Київ, 2003. - 273 с.

5. Бадова Т.О. Методика ізольованого серця: біоетичні аспекти використання: матеріали міжнародної науково-методичної конференції [«Формування особистості студентів як майбутніх фахівців лікарської справи, працівників охорони здоров'я та інших соціально-орієнтованих установ у контексті біоетики»], (Львів, 6-7 березня 2003). - Львів, 2003. - 237 с.

6. Бадова Т.А. Влияние ауринтрикарбоновой кислоты (АТК) на восстановление сократительной функции и активность Na⁺, K⁺-АТФазы и Са²⁺-АТФазы кардиомиоцитов изолированного сердца крыс разного возраста: тези доповідей V Української конференції молодих вчених, присвяченої пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 23 січня 2004). - Київ, 2004. - 218 с.

7. Бадова Т.А. Влияние ауринтрикарбоновой кислоты (АТК) на восстановление сократительной функции и активность Са²⁺-АТФазы кардиомиоцитов изолированного сердца крыс разного возраста: тезисы VI Международного симпозиума [«Биологические механизмы старения»] (Харків, 26-29 травня 2004). - Харків, 2004. - 103 с.

8. Бадова Т.А., Паливода К.О., Коркач Ю.П. [та ін.] Роль окислительного (de novo) и восстановительного (salvage) путей синтеза NO в кардиопротекции при прекондиционировании сердца животных разного возраста: материалы международного симпозиума [«Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии»] (Гродно, 28-29 вересня 2006). - Гродно, Білорусь, 2006. - 315 с. (Дисертант - проведення експериментів, літературний пошук, аналіз отриманих результатів).

9. Бадова Т., Доломан Л., Паливода К. [та ін.] Роль оксиду азоту в біохімічних механізмах кардіопротекції за дії інтервальної та хронічної гіпоксії, пре- і пост - кондиціонування у тварин різного віку: матеріали IX Українського біохімічного з'їзду (Харків, 24-27 жовтня 2006). - Харків, 2006. - 204 с. (Дисертант - проведення експериментів, літературний пошук, аналіз отриманих результатів)

Размещено на Allbest.ru