Адаптивні властивості водоростей за дії іонів металів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГІДРОБІОЛОГІЇ

УДК (528.26:577.12):574.64

АДАПТИВНІ ВЛАСТИВОСТІ ВОДОРОСТЕЙ ЗА ДІЇ ІОНІВ МЕТАЛІВ

03.00.17 - гідробіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

БОДНАР Оксана Ігорівна

Київ 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільському національному педагогічному університеті імені Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Клоченко Петро Дмитрович, Інститут гідробіології НАН України, завідувач відділу екологічної фізіології водяних рослин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Арсан Орест Михайлович, Інститут гідробіології НАН України, завідувач відділу екотоксикології;

кандидат біологічних наук, доцент Ольхович Ольга Петрівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, доцент кафедри фізіології та екології рослин.

Захист відбудеться “ 03 ” березня 2009 р. о 11⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.213.01 в Інституті гідробіології НАН України за адресою: 04210, м. Київ, просп. Героїв Сталінграда, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гідробіології НАН України (04210, м. Київ, просп. Героїв Сталінграда, 12).

Автореферат розісланий “ 30 ” січня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Гончаренко Н. І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Мікроводорості завдяки своїй ролі в трофічному ланцюзі значною мірою визначають біопродукційні характеристики водойм і є основою функціонування та життєзабезпечення гідробіоценозів. Метаболічна активність мікроводоростей, що лежить в основі їх продуктивності, визначається різними чинниками, серед яких важливу роль відіграють іони металів. Вони здатні проявляти високу біологічну активність щодо гідробіонтів, спричиняючи стимулюючий або інгібуючий вплив не тільки безпосередньо на певні ланки метаболізму і процеси в окремому організмі, а й модифікувати популяційні та біопродукційні процеси у гідроекосистемах загалом (Патин, Морозов, 1981; Мур, Рамамурти, 1987; Гандзюра, 2002). Разом з тим, окремі метали є необхідними компонентами мінерального живлення і в невеликих кількостях проявляють високу фізіологічну активність та виконують роль активаторів біохімічних і фізіологічних процесів (Villares, 2001; Коженкова, 2006). Особливістю іонів металів є те, що в певних концентраціях вони здійснюють стимулюючу біологічну дію як мікроелементи, а за досягнення критичних рівнів накопичення токсично впливають на гідробіонтів і стають щодо них стресорним чинником (Ладогина, Осокина, 1987; Ипатова, Дмитриева, 2006).

Проблема токсичної дії важких металів на водні рослини досліджується давно. На сьогодні напрацьовано чималий матеріал, який узагальнено в багатьох роботах (Ochiai, 1995; Pawlic-Skowronska, Skowronski, 1996; Саванина и др., 2001; Микрякова, 2002; Пасічна, 2002; Горбатюк, 2006). Разом з тим для мікроводоростей, які водночас є як окремою клітиною, так і цілісним організмом, практично відсутні систематизовані дані щодо їх структурно-функціональних адаптацій до розчинних у воді металів. Недостатньо з'ясованими є також причини видоспецифічності та індивідуальної чутливості водоростей до впливу іонів металів, частково вивчені детоксикаційні механізми та шляхи адаптації водяних рослин до концентрацій мікроелементів, що перевищують фізіологічні потреби. Дослідження такого характеру дають можливість з'ясувати не тільки метаболічні особливості представників окремих таксонів водоростей у забрудненому сполуками металів водному середовищі, а й спрогнозувати інтенсивність розвитку, динаміку і співвідношення їх популяцій у гідробіоценозах, що загалом позначиться на структурно-функціональному стані водойм та формуванні якості води.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в межах держбюджетної тематики Міністерства освіти і науки України “Токсикоспецифічні адаптації гідробіонтів та водних екосистем до іонів важких металів і їх регуляція” (№0101U000303) та “Молекулярні адаптації гідробіонтів до токсикантів та розробка системи критеріїв оцінки якості води і рівня токсичності у водних екосистемах”(№ 0104U000766).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було вивчення особливостей енергетичного та азотного обміну, а також їх адаптивних перебудов у клітинах прісноводних водоростей за дії іонів цинку та свинцю.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- дослідити особливості енергетичного та азотного метаболізму у водоростей різного систематичного положення (Cyanophyta, Chlorophyta, Bacillariophyta) в нормі та за дії іонів Zn²⁺ і Pb²⁺;

- з'ясувати кінетику проникнення іонів металів у клітини водоростей;

- вивчити специфіку накопичення іонів цинку та свинцю клітинами досліджуваних водоростей;

- розкрити механізми формування енергетичного забезпечення адаптацій водоростей до дії іонів Zn²⁺ та Pb²⁺;

- дослідити адаптивні реакції азотного обміну та його ферментативного забезпечення у водоростей за дії іонів Zn²⁺ та Pb²⁺;

- з'ясувати особливості комплексної фізіолого-біохімічної відповіді водоростей на дію іонів цинку та свинцю.

Об'єкт дослідження: механізми адаптації водоростей до дії іонів металів. іон цинк свинець водорость

Предмет дослідження: енергетичний та азотний метаболізм у прісноводних водоростей та їх ростові реакції на дію іонів Zn²⁺ та Pb²⁺.

Методи дослідження: загальноприйняті методи культивування водоростей; спектрофотометрія при визначенні активності ферментів; атомно-адсорбційна спектрофотометрія при визначенні вмісту металів; люмінесцентна мікроскопія для оцінки фізіологічного стану водоростей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено суттєві відмінності енергетичного та азотного метаболізму у представників синьозелених, зелених і діатомових водоростей у нормі та за дії іонів Zn²⁺ і Pb²⁺. З'ясовано, що зниження інтенсивності енергетичних процесів та азотного обміну в умовах впливу досліджуваного стресового чинника відбувається в послідовності: Bacillariophyta > Cyanophyta > Chlorophyta.

Встановлено, що формування адаптивних систем захисту клітин водоростей до дії іонів цинку та свинцю здійснюється шляхом структурно-функціональних перебудов ключових ланок енергетичного та азотного метаболізму.

В експериментах показано, що для представників Cyanophyta та Chlorophyta небезпечною є концентрація іонів цинку і свинцю 2,0 і 0,06 мг/дм³ (що відповідає рівню 2 ГДК) і вище, тоді як в клітинах Bacillariophyta біологічна дія реєструється при вмісті металів у воді понад 5,0 мг/дм³ для іонів Zn²⁺ та 0,15 мг/дм³ - для іонів Pb²⁺, що дорівнює 5 ГДК за санітарно-токсикологічними нормами.

Встановлені особливості накопичення іонів цинку та свинцю, а також кінетичні характеристики їх проникнення в клітини досліджуваних гідробіонтів, пов'язані з таксономічною належністю водоростей, концентрацією іонів металу та тривалістю їх дії.

З'ясовано, що цинк зумовлює менший негативний вплив на водорості, ніж свинець, що підтверджено змінами інтенсивності функціональних систем та фізіологічним станом їх клітин.

Вперше експериментально встановлено, що найчутливішими до дії іонів цинку та свинцю є представники зелених водоростей, а найстійкішими - діатомових. Синьозелені водорості займають при цьому проміжне положення.

Практичне значення одержаних результатів. Досліджені ланки енергетичного та азотного метаболізму в клітинах водоростей за дії іонів металів є підставою для розкриття тонких фізіолого-біохімічних механізмів адаптації гідробіонтів до зміни іонного складу водного середовища та встановлення рівня толерантності і стійкості первинних продуцентів до впливу важких металів. Виявлені особливості адаптивних реакцій водоростей можуть бути використані при розробці рекомендацій щодо оцінки рівня токсичності водного середовища, яка спричинена іонами цинку і свинцю.

Розкриті механізми адаптації водоростей сприятимуть розробці методів біомоніторингу водного середовища, а також прогнозуванню розвитку популяцій водоростей у гідроекосистемах.

Результати дослідження можуть бути використані при викладанні навчальних курсів з гідробіології, екології, водної токсикології та фітомоніторингу для студентів вищих навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація базується на результатах експериментальних робіт, одержаних авторкою особисто. Здобувачка самостійно обґрунтувала мету та основні завдання досліджень, підготувала огляд літератури, підібрала та освоїла необхідні методики, опрацювала й узагальнила отримані експериментальні дані, а також сформулювала висновки; особисто або у співавторстві підготувала до друку наукові праці, в яких викладені основні положення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднені на IХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); ІV з'їзді Гідроекологічного товариства України (Курортне, 2005); IV та V Всеукраїнських конференціях студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених в Україні” (Київ, 2006, 2007); ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2007); Міжнародній науковій конференції “Сучасні проблеми біології, екології та хімії” (Запоріжжя, 2007); ХІ Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология - наука ХХІ века”, (Росія, Пущино, 2007); ХІІІ Міжнародній школі - конференції молодих вчених “Биология внутренних вод” (Росія, Борок, 2007).

Публікації. Результати дисертації викладено у 15 роботах, із них 6 - у фахових виданнях, решта - в матеріалах конференцій та з'їздів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, шести розділів, узагальнення, висновків, списку літератури, що містить 293 назви (з них 127 джерел іноземними мовами), і додатку. Робота ілюстрована 52 рисунками і 22 таблицями. Загальний обсяг рукопису становить 197 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МЕХАНІЗМИ АДАПТАЦІЇ ВОДОРОСТЕЙ ДО ДІЇ ЧИННИКІВ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА (огляд літератури)

Наведено аналіз наявної у фаховій вітчизняній та зарубіжній літературі інформації щодо природних фізико-хімічних чинників водного середовища (іонний склад води, кисень, світло, температура, рН) та регуляції ними метаболізму переважно в одноклітинних водоростей. Розглянуто вплив іонів металів на зміни в анатомії, морфології, фізіології та метаболізмі у водоростей. Констатовано, що іони металів зумовлюють суттєві перетворення та модифікації в обміні речовин у водоростей, що мають видоспецифічний і концентраційно-залежний характер. Акцентується увага на теоретичних і практичних аспектах з'ясування механізмів метаболічної адаптації водних рослин до підвищених концентрацій іонів металів у водному середовищі.

ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об'єктами лабораторних досліджень були альгологічно чисті культури зелених (Desmodesmus communis (Hegew.) Hegew. IBASU-A 371 (=Scenedesmus quadricauda (Turp.) Brйb.), синьозелених (Anabаena cylindrica Lemm. HPDP-1) та діатомових (Navicula atomus (Nдg.) Grun. ACKU 12-02) водоростей. Синьозелені та зелені водорості вирощували на середовищі Фітцджеральда в модифікації Цендера і Горема №11 (Методи …, 1975) при температурі 22-25⁰С та освітленні лампами денного світла (2500 лк протягом 16 год/добу). Діатомову водорість культивували на середовищі Болда (Beakes et al., 1988) при температурі 16-18⁰С за дії природного світла (північна експозиція).

В експериментальних умовах в культури водоростей, на відміну від контрольних зразків, додавали водні розчини солей ZnSO₄·7H₂O та Pb(NO₃)₂ (кваліфікація “чда”) у розрахунку на кількість іонів Zn²⁺ - 1,0 мг/дм³, 2,0 та 5,0 мг/дм³ і Pb²⁺ - 0,03мг/дм³, 0,06 та 0,15 мг/дм³, що відповідає 1, 2 і 5 ГДК за санітарно-токсикологічними показниками шкідливості (Алтунин, Белявцева, 1993). Інкубацію культур водоростей з солями металів проводили протягом 15-ти діб, а відбір зразків біомаси здійснювали на початку досліду (через 2 години після внесення металу в культуральне середовище) і на 1, 3, 5, 10 та 15 добу.

З метою з'ясування розвитку токсичного ефекту досліджували накопичення водоростями цинку і свинцю при підвищених концентраціях їх іонів у водному середовищі. Вміст металів в озоленому азотною кислотою матеріалі визначали на атомно-адсорбційному спектрофотометрі Selmi С-115 М. Кількість акумульованих водоростями іонів цинку і свинцю розраховували в мкг металу на 1 г сухої маси водоростей. Величини енергії активації (E_акт) визначали за допомогою графічного методу Ареніуса, константи Міхаеліса (К_м) та максимальної швидкості поглинання металів (V_мах) клітинами водоростей - методом подвійних зворотних величин у координатах Лайнуівера-Берка (Диксон, Уэбб, 1982).

Загальну АТФ-азну активність у клітинах водоростей визначали відповідно до методики (Dang et al., 2000), активність сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1) - згідно з (Методы…, 1982), цитохромоксидази (КФ 1.9.3.1) - за допомогою методу (Straus, 1954), глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) - згідно з (Софьин и др., 1984) та глутамінсинтетази (КФ 6.3.1.2) - з урахуванням методичних вказівок (Евстигнеева и др., 1980). Вміст білків визначали за Лоурі (Lowry et al., 1951). Контроль рН здійснювали за допомогою іономіра ЭВ-74; вміст кисню у культуральному середовищі встановлювали універсальним киснеміром АЖА-101М; амонійний азот визначали колориметричним методом (Лурье, 1984).

Загальну кількість клітин у культурах зелених та діатомових водоростей визначали методом прямого підрахунку в камері Горяєва і виражали в млн. кл/см³. Співвідношення живих і мертвих клітин (в %) встановлювали за допомогою люмінесцентного мікроскопа МЛД-1 (Методы..., 1975).

Одержані дані опрацьовані методами варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента (Лакин, 1990).

НАКОПИЧЕННЯ ТА МЕХАНІЗМИ ПРОНИКНЕННЯ ІОНІВ МЕТАЛІВ У КЛІТИНИ ВОДОРОСТЕЙ

Проникнення іонів металів у клітини водоростей та їх розподіл в клітині зумовлюється багатовекторністю біологічної складової цих процесів та їх модуляцією екологічними, фізіологічними та біохімічними чинниками.

Встановлено, що для синьозеленої водорості A. сylindrica вміст цинку в клітинах після двох годин інкубації збільшувався у 24 рази (при 1 ГДК) та у 40 і 56 разів - при 2 і 5 ГДК (порівняно з контролем). У клітинах зеленої водорості D. communis за дві години інкубації кількість металу порівняно з його вмістом у контрольній культурі зросла майже в 35 разів за дії Zn²⁺ у концентрації 1 ГДК та у 50 та 74 рази - за концентрації 2 і 5 ГДК. На завершення експерименту (15-та доба) вміст цинку в клітинах A. сylindrica збільшився порівняно з контролем у 108, 140 та 226 разів відповідно для 1, 2 і 5 ГДК, що становить для всіх варіантів концентрацій в середньому 4-разове зростання кількості металу відносно першого визначення.

Для зеленої водорості D. communis на 15-ту добу експерименту вміст цинку в клітинах зріс (відносно контролю) у 68, 108 та 173 рази за дії металу на рівні 1, 2 і 5 ГДК відповідно.

Щодо N. аtomus, то кількість цинку в її клітинах після 2-х годин інкубації збільшилася порівняно з контролем майже у 35 разів за дії металу при концентрації 1,0 мг/дм³ та у 168 разів - за концентрації 5,0 мг/дм³, тоді як на 15-ту добу вміст Zn²⁺ у клітинах діатомеї зріс відповідно у 50 та 300 разів.

Принагідно зазначити, що за дії свинцю в концентрації 1 ГДК після двох годин експозиції вміст іонів Pb²⁺ у клітинах A. cylindrica був майже в 6 разів, у D. communis - у 75, а в N. аtomus - у 13 разів більшим порівняно з контрольними значеннями. Для вищих концентрацій свинцю (2 і 5 ГДК) вимірювані показники відповідно становили: для A. cylindrica - 8 і 15, для D. communis - в 130 і 237, для N. аtomus - 48 разів (для варіанта з 5 ГДК).

На завершення досліду (15-та доба) кількість металу в клітинах A. cylindrica виявилася більшою (порівняно з контролем) у 36 разів за дії металу на рівні 1 ГДК, у 52 - для 2 ГДК і у 86 разів - для 5 ГДК. У клітинах зеленої водорості D. communis вміст металу на 15-ту добу експерименту збільшився порівняно з першим визначенням лише в 1,2 - 1,9 разу. Зокрема, за дії свинцю в концентраціях 1, 2 і 5 ГДК кількість металу в клітинах зросла порівняно з контролем відповідно у 95, 211 та 460 разів. У клітинах діатомової водорості за період від початку експозиції і до 15 доби кількість свинцю збільшилася порівняно з контрольним варіантом майже у 14 разів - за дії металу на рівні 1 ГДК та у 62 рази - при 5 ГДК.

Отже, максимальне поглинання іонів цинку та свинцю досліджуваними водоростями відбувається у перші години після внесення металів у середовище за дії всіх концентрацій. Накопичення цинку відбувається інтенсивніше, ніж свинцю, що насамперед обумовлено фізіологічним значенням металу як мікроелемента і його меншою токсичністю для водоростей (Горюнова и др., 1996).

Кінетичний аналіз отриманих даних показав, що поглинання іонів цинку та свинцю є концентраційно залежним процесом. На його початкових стадіях має місце швидке поглинання металів з насиченням, після чого проникнення Zn²⁺ та Pb²⁺ у клітину відбувається повільніше. Вивчення часової динаміки поглинання показало, що протягом перших трьох діб цей процес має лінійний характер (табл. 1). Поглинання іонів Zn²⁺ клітинами всіх досліджуваних водоростей відбувається аналогічно. К_м є однаковою для різних видів, а максимальна швидкість - відмінною у часовому вимірі. Це свідчить про те, що іони цинку зв'язуються з клітинними стінками водоростей і ймовірними переносниками за неконкурентним типом. Можливо у результаті змін просторової структури молекул мембран будуть змінюватися їх структурно-каталітичні властивості (Мецлер, 1990).

Таблиця 1

Кінетичні показники накопичення Zn²⁺ і Pb²⁺ клітинами А. cylindrica, D. communis та N. аtomus

Щодо іонів Pb²⁺, то їх поглинання клітинами D. communis і N. atomus відбувається за іншим механізмом, оскільки максимальна швидкість є однаковою для різних часових показників, а K_м - різними. Це свідчить про конкурентний тип взаємодії, який зумовлює зв'язування іонів свинцю в активних центрах переносників, що спричиняє різний механізм проникнення іонів металу при коротких і довготривалих експозиціях. Ймовірно, що на початку відбувається подолання фізіолого-біохімічного бар'єра та лавиноподібне проникнення металу через іонні канали внаслідок їх відкриття чи руйнування. Наростання концентраційного градієнта іонів Pb²⁺ з обох боків мембрани призводить до послаблення бар'єрної функції мембрани та подальшої акумуляції металу. Розраховані Е_акт зв'язування іонів Zn²⁺ і Pb²⁺ клітинами водоростей та проникнення крізь клітинну мембрану свідчать про те, що цей процес протягом перших трьох діб є слабко енергозалежним і, можливо, підпорядковується фізико-хімічним факторам регуляції та здійснюється шляхом дифузії (Варфоломеев, Гуревич, 1999).

Відомо, що важливу роль у підтриманні гомеостазу клітин, зокрема в процесах транспорту іонів та молекул різних сполук через біологічні мембрани, відіграють АТФ-азні системи (Kaaden, Gimmler, 1989). Нами встановлено, що досліджувані метали практично однаково впливають на АТФ-азну активність клітин (рис. 1). Іони цинку та свинцю з моменту їх внесення у середовище суттєво (на 60%) пригнічували активність загальної АТФ-ази. Щодо Zn²⁺, то їх інгібуючий вплив на фермент зникає швидше, ніж за дії Pb²⁺. Так, зокрема, за дії цинку АТФ-азна активність починає зростати з третьої доби, тоді як за дії свинцю - тільки з десятої доби експозиції.

Загалом можна відзначити, що інгібування іонами Zn²⁺ і Pb²⁺ АТФ-аз клітин зелених водоростей зумовлене інтенсивним накопиченням металів дифузійним шляхом.

ПРОЦЕСИ ЕНЕРГООБМІНУ У ВОДОРОСТЕЙ ЗА ДІЇ ІОНІВ МЕТАЛІВ

Ефективність функціонування метаболічних систем в організмі гідробіонтів є одним із найбільш показових критеріїв успішності формування стратегій виживання у токсичному середовищі. Враховуючи велику кількість ферментів, що беруть участь у генеруванні енергії в клітині, ми дослідили ті з них, які є ключовими у циклі трикарбонових кислот та електронно-транспортному ланцюгу - відповідно сукцинатдегідрогеназу (СДГ) та цитохромоксидазу (ЦО).

У табл. 2 наведені значення активності СДГ та ЦО для досліджуваних водоростей за нормальних фізіологічних умов культивування (контроль) та їх окремі статистично вірогідні зміни за дії іонів Zn²⁺ і Pb²⁺. Відзначимо, що найнижча активність ферментів є у A. сylindrica, що, на нашу думку, обумовлено прокаріотичною будовою клітин синьозеленої водорості, насамперед, відсутністю сформованих органел, зокрема, мітохондрій. Оскільки трансформація енергії можлива тільки у структурованих системах, то у клітинах бактерій та ціаней гетерогенність розподілу клітинних компонентів неспроможна забезпечити високий рівень механізмів регуляції ферментних систем. Отримані показники щодо активності досліджуваних ферментів у D. communis і N. аtomus співвідносяться з їх складнішою організацією.

При з'ясуванні динаміки активності СДГ в клітинах A. сylindrica встановлено, що за дії іонів цинку на рівні 1,0 мг/дм³ протягом перших трьох діб експерименту вона практично не відрізнялася від контрольних значень. Із середини інкубації водорості активність ферменту поступово зростала і в кінці експерименту була вищою майже на 35% порівняно з контролем. При додаванні в середовище цинку на рівні 2,0 мг/дм³ активність СДГ клітин A. сylindrica знизилася одразу ж після внесення металу, але на завершення експерименту вона була на 30% вищою, ніж в контролі. Максимальна концентрація іонів цинку (5,0 мг/дм³) призводила до інгібуючого ефекту щодо СДГ синьозеленої водорості.

Таблиця 2

Активність ферментів енергетичного обміну у A. cylindrica, D. communis і N. atomus за дії іонів Zn²⁺ та Pb²⁺, (M ± m; n = 5 )

Примітка. 1 - A. cylindrica, 2 - D. communis, 3 - N. atomus; "--" - не визначали.

Щодо зеленої водорості D. communis, то для неї мінімальна кількість цинку у середовищі культивування стимулювала активність СДГ на 32-38% протягом першої доби, тоді як з третьої і до п'ятої доби експозиції реакційна здатність ферменту знизилася майже на 20%, проте до кінця досліду клітини водорості відновлювали активність СДГ. Треба відзначити, що для D. communis вплив цинку на рівні 2 ГДК був аналогічним до дії 1 ГДК. При максимальній концентрації металу (5 ГДК) спостерігалося інгібування активності ферменту.

Динаміка активності СДГ у діатомової водорості N. аtomus за дії мінімальної концентрації іонів цинку (1,0 мг/дм³) була аналогічною до такої в A. сylindrica. Дещо інша картина помічена при максимальній концентрації іонів Zn²⁺: якщо на початку досліду спостерігалося зростання активності ферменту, то в подальшому (до п'ятої доби) вона зменшувалася. Проте надалі реакційна здатність ферменту поступово збільшувалася.

У дослідах щодо впливу іонів свинцю на функціонування СДГ в клітинах водоростей встановлено, що активність ферменту на початку досліду в A. сylindrica значно стимулюється за дії іонів металу в усіх концентраціях. Для клітин зеленої водорості D. communis зміни активності досліджуваного ферменту відбувалися за схемою, в якій практично відсутня різниця між впливом мінімальної і максимальної концентрації свинцю. Щодо активності СДГ у N. аtomus, то стимулювання діяльності зазначеного ферменту спостерігалося за максимальної концентрації токсиканту, тоді як пригнічення - при мінімальному вмісті свинцю.

Аналіз отриманих даних свідчить про те, що вплив іонів цинку на активність цитохромоксидази синьозеленої водорості A. сylindrica загалом був інгібуючий при всіх досліджуваних концентраціях. При з'ясуванні особливостей впливу іонів Zn²⁺ на функціонування ЦО у зеленої водорості D. communis встановлено, що вони стимулюють активність ферменту в усіх досліджуваних концентраціях: 1,0 мг/дм³, 2,0 і 5,0 мг/дм³. За дії іонів цинку активність цитохромоксидази клітин діатомової водорості N. аtomus змінювалася незначно.

Характерною рисою впливу іонів свинцю на цитохромоксидазу в клітинах A. сylindrica є інгібування ферменту незалежно від внесеної кількості металу. Активність цитохромоксидази у зеленої водорості D. communis за дії іонів Pb²⁺ підвищувалася при 1 і 2 ГДК, тоді як при 5 ГДК реєструвалося її інгібування. Зазначимо, що для N. аtomus токсичність свинцю стосовно цитохромоксидази, як і у випадку сукцинатдегідрогенази, була більшою при 1 ГДК, ніж при 5 ГДК. Це свідчить про складну специфіку концентраційної залежності дихальних процесів у клітинах діатомової водорості.

Отже, на підставі одержаних даних можна стверджувати, що деструктивного впливу на функціонування циклу трикарбонових кислот цинк і свинець у всіх досліджуваних концентраціях не здійснювали, оскільки активність СДГ практично відновлювалася до контрольних фізіологічних значень. Можна з певною вірогідністю стверджувати про наявність активації функціонування циклу трикарбонових кислот як іонами цинку, так і свинцю, що може бути первинною стресорною відповіддю на наявність в клітині іонів зазначених металів.

Досліджувані метали загалом пригнічують кінцеву ланку енергетичного метаболізму в синьозеленої водорості A. сylindrica. Разом із цим вони виявляють переважно стимулюючу або регуляторну дію на активність цитохромоксидази у D. communis та N. аtomus. Зростання активності цитохромоксидази у зазначених видів водоростей, очевидно, пов'язане із збільшенням енерговитрат організму на детоксикацію іонів металів.

МЕТАБОЛІЗМ АЗОТУ у водоростей ЗА ДІЇ ІОНІВ МЕТАЛІВ

В екологічному метаболізмі водойм водорості відіграють важливу роль, оскільки їх клітини здатні ефективно засвоювати різні форми неорганічного, органічного та молекулярного азоту (Клоченко, 2002). Для включення азоту в клітинні органічні сполуки необхідне його перетворення в іон амонію. Разом з тим вільний аміак є отруйним для клітин, тому він не накопичується, а відразу ж використовується для біосинтезу амінокислот, амідів та білків. Відомо, що у рослин, в тому числі у водоростей, функціонує декілька систем зв'язування аміаку, серед яких найефективнішими є глутаматдегідрогеназний і глутамінсинтетазний шляхи (Syrett, 1981; Кретович, 1987).

У табл. 3 наведені значення активності НАДН-глутаматдегідрогенази (НАДН-ГДГ), НАДФН-глутаматдегідрогенази (НАДФН-ГДГ) і глутамінсинтетази (ГС) у кожного з досліджених видів водоростей при фізіологічних умовах культивування (контроль) та їх окремі статистично вірогідні показники за дії іонів Zn²⁺ та Pb²⁺.

Таблиця 3

Активність ферментів азотного обміну у A. cylindrica, D. communis і N. atomus за дії іонів Zn²⁺ та Pb²⁺, (M ± m; n = 5 )

Примітка. 1 - A. cylindrica, 2 - D. communis, 3 - N. atomus; "--" - не визначали.

Результати наших досліджень свідчать про те, що у клітинах синьозеленої водорості A. cylindrica присутні обидві форми глутаматдегідрогенази, які активно реагують на наявність у середовищі іонів цинку. За дії іонів Zn²⁺ активність НАДФН-залежної форми ГДГ була вищою, ніж активність НАДН-ГДГ.

Дія іонів цинку на клітини зеленої водорості D. communis загалом зумовлювала подібний вплив на обидві форми глутаматдегідрогенази. Так, зокрема, внесення іонів Zn²⁺ у концентрації 1,0 мг/дм³ стимулювало активність ферменту. Впродовж наступних трьох діб за дії всіх концентрацій іонів металу спостерігалося зниження активності обох форм ферментів. Починаючи з другої половини експозиції, величини активності як НАДН-ГДГ, так і НАДФН-ГДГ наближалися до контрольних значень і залишалися незмінними для 2 ГДК або збільшувалися для 1 ГДК. Максимальна концентрація іонів цинку зумовлювала незначне інгібування активності обох форм ферментів.

Дослідження глутаматдегідрогеназної активності в A. cylindrica за дії різних концентрацій іонів Pb²⁺ показали, що у більшості випадків, як і за дії Zn²⁺, активність НАДФН-залежної ГДГ була вищою, ніж активність НАДН-ГДГ.

Аналіз особливостей впливу іонів свинцю на клітини зеленої водорості D. communis показав, що вони зумовлювали загальний стимулюючий ефект на активність НАДН- та НАДФН-залежних глутаматдегідрогеназ. Це узгоджується з отриманими результатами щодо високої активності сукцинатдегідрогенази, оскільки активність дезамінуючої НАДН-ГДГ забезпечує цикл трикарбонових кислот достатньою кількістю б-кетоглутарату, який є його важливим інтермедіатом.

Відсутність результатів щодо активності ГДГ у N. atomus, очевидно, зумовлена її низькими значеннями в зв'язку з незначною концентрацію основного субстрату - іонів амонію.

Аналізуючи отримані дані, можна відзначити, що іони цинку стимулювали активність глутамінсинтетази A. cylindrica в усіх досліджуваних концентраціях. Найбільш помітно це було за мінімального вмісту іонів Zn²⁺, які призвели до зростання активності ГС (на 70%) протягом перших трьох діб. Надалі спостерігали її зниження, а з п'ятої доби і до кінця експерименту реакційна здатність ферменту була практично близькою до контролю. Дослідженнями показали, що мінімальний вміст іонів цинку (1,0 мг/дм³) зумовлював у D. communis зростання ГС на 25% протягом першої доби. В подальшому значення були близькими до контрольних і лише на останньому етапі відзначалося значне збільшення активності, яке перевищувало контрольне майже на 45%. За дії іонів цинку в діатомової водорості N. atomus істотного інгібуванням активності ГС не помічали. Спостерігали лише незначне зниження активності ферменту за дії максимальної концентрації металу.

При дослідженні впливу іонів свинцю на ГС у A. cylindrica встановлено, що зміни активності ферменту мають характер, подібний до інтоксикації середовища іонами цинку, а у випадку D. communis у загальному спостерігалася стимулююча дія. При з'ясуванні особливостей асиміляції амонію в глутамінсинтетазній реакції у N. atomus за дії іонів свинцю виявлено, що ГС, як і у випадку з цинком, практично не піддавалася токсичній дії металу: ні мінімальна (0,03 мг/дм³), ні максимальна (0,15 мг/дм³) концентрація іонів Pb²⁺ не впливали на активність ферменту.

Отже, отримані дані свідчать скоріше про регулюючий вплив іонів цинку на азотний метаболізм синьозелених і зелених водоростей, ніж токсичний, оскільки змін деструктивного характеру під час наших досліджень не виявлено. Обидві форми глутаматдегідрогенази протягом періоду культивування водоростей відновлювали активність, а перебіг каталізуючих ними реакцій був на рівні фізіологічної норми. Щодо іонів свинцю, то його інгібуючий вплив на цей фермент азотного обміну у водоростей був більш помітним, особливо у високих концентраціях, що, можливо, є наслідком пошкодження та перебудов клітинних структур, з якими пов'язана локалізація глутаматдегідрогенази.

Одним із проявів впливу як цинку, так і свинцю на водорості у досліджуваному діапазоні концентрацій є, здебільшого, зростання активності глутамінсинтетази на початкових етапах дії іонів та пригнічення ферменту під дією накопиченого глутаміну і впливу підвищеної кількості іонів металів - в подальшому.

РОСТОВІ РЕАКЦІЇ ВОДОРОСТЕЙ НА ДІЮ Іонів МЕТАЛІВ

Стійкість водоростей передусім пов'язують з виживанням популяції у присутності токсичних речовин в летальних концентраціях. Основними параметрами при цьому є зміни як загальної кількості, так і співвідношення живих і мертвих клітин.

Експериментальні дослідження показали, що за мінімальної концентрації цинку (1 ГДК) кількість клітин в культурі зеленої водорості D. communis практично відповідала контрольному показнику упродовж перших п'яти діб. Далі відзначалося поступове зниження загальної кількості клітин, яка наприкінці експозиції була на 7% меншою порівняно з контрольними показниками, тоді як за вмісту іонів Zn²⁺ 2 ГДК - на 28%. Разом із цим у діатомової водорості N. аtomus спостерігали стимулюючий вплив концентрації металу на рівні 1 ГДК упродовж всього досліду. Принагідно зазначимо, що максимальний вміст іонів цинку у середовищі на завершення експозиції спричиняв зменшення кількості клітин зеленої водорості (порівняно з контролем) на 45%, тоді як для діатомової - лише на 13%.

Щодо іонів свинцю, то за його дії на рівні 1 і 2 ГДК протягом перших трьох діб відзначали стимулювання розмноження клітин D. communis, а далі, як і для цинку, спостерігалося поступове зменшення загальної кількості клітин у культурі. У випадку N. аtomus мінімальний вміст свинцю (1 ГДК) зумовлював на 15-ту добу зменшення кількості її клітин порівняно з контролем лише на 12%. За дії металу на рівні 5 ГДК кількість клітин D. communis на завершення експозиції стала в 2,1 разу, а N. аtomus - в 1,4 разу меншою, ніж у контрольному варіанті. Очевидно, це пов'язано з тим, що за дії нижчих концентрацій вплив іонів металів компенсується внутрішніми захисними механізмами клітин водоростей, тоді як за вищого вмісту такий захист є малоефективним, що підтверджується також іншими дослідженнями (Дмитриева, 2006). Не виключено, що альгостатичний ефект може бути зумовлений як пригніченням поділу клітин водоростей, так і їх високою смертністю.

Важливим моментом нашого дослідження було з'ясування ступеня виживання клітин водоростей D. communis і N. аtomus за дії іонів Zn²⁺ і Pb²⁺. Аналізуючи отримані дані, можна відзначити, що мінімальна концентрація цинку (1 ГДК) у середовищі практично не впливала на життєздатність зеленої та діатомової водоростей, оскільки частка живих клітин зменшилася відповідно лише на 3,1% і 1,2% відносно контрольних показників, тоді як за дії цинку на рівні 2 ГДК кількість живих клітин у D. communis була нижчою вже на 7,0%. Разом із тим іони Zn²⁺ у кількості 1 та 2 ГДК упродовж перших діб зумовлювали навіть зростання частки живих клітин D. communis, що узгоджується зі збільшенням загальної кількості клітин. Найбільше впливала на показники життєздатності клітин максимальна концентрація цинку (5 ГДК), яка спричиняла упродовж всього періоду експозиції поступове зменшення частки живих клітин як у D. communis, так і у N. аtomus. Так, на 15-ту добу досліду їх було відповідно на 14 і 10% менше, ніж у контролі.

Щодо дії свинцю на фізіологічний стан клітин водоростей, то він переважно зумовлював загальну токсичну дію. Крім того, його інгібуючий ефект збільшувався з підвищенням концентрації іонів металу у водному середовищі. Одночасно відзначимо, що вміст нижчих концентрацій свинцю спричиняв на D. communis помітніший вплив, ніж на N. аtomus. Так, на 15-ту добу досліду живих клітин у культурі D. communis порівняно з контролем було на 8 і 17% менше за дії 1 та 2 ГДК відповідно, тоді як частка живих клітин N. аtomus упродовж всієї експозиції при вмісті свинцю 1 ГДК зменшилася тільки на 3%. Варто також зазначити, що концентрація свинцю 5 ГДК зумовлювала значний інгібуючий ефект на розмноження як зеленої, так і діатомової водоростей, що співвідноситься із зниженням загальної кількості клітин в обох випадках. Так, упродовж усього періоду експозиції частка живих клітин зменшилася на 27% у культурі D. communis та на 16% - у культурі N. аtomus порівняно з контрольними значеннями. Разом з тим, на відміну від діатомеї, в якої процес відмирання був поступовим, у зеленої водорості цей показник знижувався переважно упродовж першої половини досліду, що теж співвідноситься із динамікою загальної кількості клітин.

Отже, виявлені зміни у характері росту водоростей є видоспецифічними. Насамперед це зумовлено найбільшим ступенем акумулювання цинку і свинцю клітинами D. communis, які в подальшому і спричиняють в них структурні та функціональні перебудови, що супроводжуються зменшенням темпів розмноження та відмирання водорості. Щодо N. аtomus, то передусім треба відзначити її специфічну будову, і, відповідно, фізіологічні та біохімічні властивості. Очевидно, наявність у діатомеї зовнішньої оболонки, яка містить кремнієві сполуки, значно підвищує її стійкість і захищає клітину від негативних зовнішніх чинників.

УЗАГАЛЬНЕННЯ

Підсумовуючи результати досліджень, можна зазначити, що синьозелена водорість A. cylindrica, яка є прокаріотичним організмом, характеризується найнижчими показниками активності ферментів енергетичного обміну порівняно з еукаріотами D. communis i N. atomus, в яких ферменти локалізовані у клітинних органелах. Активуючий ефект низьких концентрацій іонів цинку та свинцю на СДГ водоростей можна пояснити підвищенням загальної метаболічної активності рослинних організмів і детоксикацією іонів металів у їх клітинах, тоді як інгібуючий ефект підвищених концентрацій металів, очевидно, пов'язаний із зв'язуванням активних центрів білків і виснаженням системи енергозабезпечення.

Іони Zn²⁺ та Pb²⁺ виявляють переважно стимулюючу або регуляторну дію на активність цитохромоксидази зеленої та діатомової водоростей, оскільки вона до кінця експозиції практично відновлювалася до контрольних фізіологічних значень. Зростання активності цитохромоксидази (на 10 - 40%) у зазначених водоростей пов'язане зі збільшенням енерговитрат організму на детоксикацію іонів металів та, можливо, із забезпеченням енергією фізіологічних відповідей і певних адаптивних реакцій клітин на підвищення рівня токсикантів у середовищі. В даному випадку це проявляється через стимулювання ферменту при низьких концентраціях металів та шляхом складної регуляції його активності при сублетальних концентраціях.

Належної уваги заслуговує той факт, що зниження активності цитохромоксидази відбувається на фоні підвищення активності СДГ і навпаки. Очевидно, що відсутність спряження між функціонуванням цих ферментів пояснюється співвідношенням відновлених і окиснених нуклеотидів НАДН/НАД⁺, яке виступає основним регулятором цитратного циклу (Мецлер, 1990). Отже, за високої активності цитохромоксидази для запобігання вичерпання відновленого НАДН активність циклу Кребса знижується і відповідно гальмується активність дегідрогеназ. Низька активність цитохромоксидази сприяє активації циклу трикарбонових кислот з метою регенерування пулу НАДН⁺ і, як наслідок, активність СДГ зростає (Мусил и др., 1984). Це може бути одним із важливих шляхів раціонального використання внутрішньоклітинних енергетичних ресурсів та формування адаптивних механізмів, особливо у стресових умовах.

Відомо (Кретович, 1987), що у мікроорганізмів НАДН-ГДГ є катаболічним ферментом і відповідає переважно за процеси дезамінування, а НАДФН-ГДГ - анаболічним і відповідає за амінування. Зареєстроване експериментально підвищення у досліджуваних водоростей активності НАДФН-ГДГ за дії низьких концентрацій іонів цинку та свинцю зумовлене, найімовірніше, використанням вільних амінокислот у синтезі адаптивних захисних білків - металотіонеїнів та фітохелатинів, а відсутність визначальної ролі НАДФН-ГДГ в A. cylindrica та D. communis свідчить про неефективність зв'язування аміаку цим шляхом.

На особливу увагу заслуговують дані, які засвідчують провідну роль глутамінсинтетази в асиміляції амонію в досліджуваних видів водоростей. У жодному із варіантів дослідів нами не виявлено деструктивного впливу іонів металів на функціональну активність ГС, що, можливо, обумовлено складною будовою ферменту та його тонкою регуляцією, що не дозволяє зробити однозначного висновку про зміни її активності у клітинах водоростей.

У табл. 4 наведено узагальнені ефекти щодо впливу іонів цинку та свинцю на активність ферментів енергетичного та азотного обміну та ймовірність формування адаптивних процесів на тлі змін і перебудов метаболічних систем у клітинах водоростей.

Отже, аналіз отриманих даних дозволяє стверджувати, що за дії іонів досліджуваних металів найчутливішою ланкою у природних угрупованнях водоростей будуть саме зелені водорості, тоді як діатомові довше зберігатимуть нормальну функціональну активність. Зазначене, безперечно, може віддзеркалитись на сукцесійних і продукційних процесах водойм загалом.

Висновки

Рівень енергетичного та азотного метаболізму в досліджених прісноводних водоростей за нормальних фізіологічних умов характеризується загальними принципами, однак є видоспецифічним і спрямованим на реалізацію стратегій адаптації кожного окремого виду до умов існування, що підтверджується реакціями на дію підвищених концентрацій Zn²⁺ і Pb²⁺ у водному середовищі, зокрема, супроводжується їх накопиченням в клітинах, змінами у функціонуванні основних метаболічних систем та активацією компенсаторних систем, спрямованих на зменшення несприятливого впливу.

Акумуляція досліджуваних металів є видоспецифічним процесом і залежить від його природи та біологічної ролі в клітині (організмі). Накопичення цинку та свинцю спостерігається за дії всього діапазону концентрацій, причому іони Zn²⁺ акумулюються активніше, ніж іони Pb²⁺. Зелені водорості порівняно із синьозеленими та діатомовими характеризувалися більшим ступенем накопичення як Zn²⁺, так і Pb²⁺. Прямої залежності між вмістом металу у воді та його накопиченням клітинами водоростей не встановлено, що, очевидно, пов'язано з високою спорідненістю іонів металів до білків і зв'язуванням їх на мембранах.

Проникнення іонів цинку в клітини водоростей здійснюється неконкурентно, тоді як для іонів свинцю характерним є як пасивне (дифузійне проникнення), так і активне транспортування, кінетика якого змінюється зі зростанням концентрації Pb²⁺ у водному середовищі.

Іони цинку та свинцю, які надійшли в клітини водоростей, зумовлюють адаптивну відповідь їх енергетичного та азотного метаболізму, однак не спричиняють деструктивного впливу на активність ферментних систем.

Адаптивні перебудови метаболізму за участю АТФ-аз, сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази, глутаматдегідрогенази та глутамінсинтетази в умовах дії іонів Zn²⁺ і Pb²⁺ мають фазовий характер, що проявляється у зміні активності залежно від концентрації металів і виду водоростей.

Енергетичні системи клітин водоростей за дії іонів цинку генерують необхідну для забезпечення адаптивних процесів кількість енергії, що здійснюється шляхом активування НАДН- та НАДФН-глутаматдегідрогеназ, які залучаються до функціональних змін амінокислот як енергетичних субстратів. При цьому існує активація глутамінсинтетази, яка ефективно зв'язує аміак, за рахунок чого підтримується гомеостаз рослинного організму.

Фітотоксичність іонів свинцю значною мірою пов'язана зі зниженням активності ферментних систем енергетичного та азотного обміну в клітинах водоростей як за рахунок безпосередньої дії на ферменти, так і внаслідок опосередкованого впливу на синтез АТФ і забезпечення енергією АТФ-залежних ферментів зв'язування аміаку.

Діатомові водорості є більш стійкими до дії металів, що зумовлено ефективнішим мембранним контролем та меншою чутливістю їх енергетичного і особливо азотного метаболізму до наявності в середовищі іонів Zn²⁺ та Pb²⁺.