Кріоконсервування тромбоцитів донорської крові людини у багатокомпонентних кріозахисних середовищах

Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Богданчикова Оксана Анатоліївна

УДК: 612.111.7:615.014.41.

КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ТРОМБОЦИТІВ ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ ЛЮДИНИ У БАГАТОКОМПОНЕНТНИХ КРІОЗАХИСНИХ СЕРЕДОВИЩАХ

03.00.19 - кріобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук

Компанієць Антоніна Михайлівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріопротекторів, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Жегунов Геннадій Федорович,

Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри хімії та біохімії, м. Харків.

доктор медичних наук, професор

Шепітько Володимир Іванович,

Вищий державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна академія”, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології, м. Полтава

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук, професор Розанов Л. Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Довгострокове зберігання тромбоцитів донорської крові в життєздатному, функціонально повноцінному стані дотепер лишається однією з актуальних задач сучасної трансфузіології [Лебедева Е.А., и др., 2000, Матвеев С.А., и др., 2000, Mohanty D. 2009]. В клінічній практиці тромбоцити є не тільки дуже важливим і затребуваним компонентом донорської крові для трансфузій, але й одним з найбільш складних у сенсі своєчасного і адекватного забезпечення ним лікувальних установ [Schiffer C.A., et al, 2001, Головкина Л.Л., и др., 2003, Brand A. et al, 2006, Sullivan M.T. et al, 2007].

Найбільш перспективним методом довгострокового, продовж декількох років, зберігання тромбоцитів є їх кріоконсервування [Reid T.J. et. al, 1999, Gao D.Y. et.al, 1999, Wautier J.L. 2002, Dijkstra-Tiekstra M.J. et. al, 2003]. кріозахисний низькотемпературний тромбоцит консервування

При розробці методів кріоконсервування та довгострокового зберігання тромбоцитів при низьких температурах головна увага дослідників була сконцентрована на виборі кріопротектора і створенні на його основі ефективного кріоконсерванта. В якості кріопротекторів при заморожуванні тромбоцитів вивчені різні речовини, що відносяться до типу проникаючих [Schiffer C.A. et. al, 1983, Arnaud F.G. et. al, 1990, Компаниец А.М., 1992] і непроникаючих сполук [Sputtec A. et. al, 1987], проте найбільш придатний рівень кріопротекторної дії визначено лише для диметилсульфоксиду (ДМСО) [Valery R.C., et. al, 2005, Balint B. et. al, 2006], диметилацетаміду (ДМАЦ) [Аграненко В.А., и др., 1987, Компаниец А.М., и др., 1987], гліцерину [Arnaud F.G. et. al, 1990,] та 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) [Arnaud F.G. et. al, 1990, Kompaniets A.M. et. al, 1999], на основі яких були розроблені методи заморожування тромбоцитів. Кріоконсервування тромбоцитів з 5-6% ДМСО у плазмі забезпечує найбільший рівень збереження тромбоцитів і, за думкою ряду авторів, є «золотим стандартом» їх низькотемпературного консервування [Dijkstra-Tiekstra M.J. et. al, 2003, Valery R.C., et. al, 2005, Balint B. et. al, 2006]. Однак кріоконсервовані тромбоцити, в тому числі під захистом ДМСО, не знайшли широкого застосування у лікувальній практиці через їх низьку терапевтичну ефективність, яка становить близько 30% від рівня терапевтичної дії свіжовиділених тромбоцитів [Khuri S. F. et. al, 1999, Valeri C.R. et. al, 2002].

Аналіз існуючих багато чисельних публікацій дозволяє дійти висновку, що можливість оптимізації методів кріоконсервування тромбоцитів за рахунок використання у кріозахисному середовищі лише одного кріопротектора практично себе вичерпала [Азовская С.А., 1995, Lozano M. et. al, 2000].

Останнім часом увагу дослідників привернула можливість удосконалення методів кріоконсервування біологічних об'єктів шляхом використання середовищ, що містять кілька кріопротекторних сполук. Цей підхід дозволив досягти певного успіху при заморожуванні гемопоетичних клітин кордової крові [Liu K. et. al, 2004], гепатоцитів [Петренко Ю.О., 2006] і сперматозоїдів [Линник Т.П., и др., 2003]. Визначена доцільність використання комбінації ДМАЦ і 1,2-ПД при заморожуванні тромбоцитів [Компанієць А.М., та ін., 2006].

Отже, створення багатокомпонентних за складом кріоконсервантів, у тому числі з використанням комбінацій кріопротекторів у кріозахисних середовищах є актуальним і перспективним напрямком вирішення проблеми кріоконсервування тромбоцитів, що потребує детального дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі кріопротекторів Інституту проблем кріобіології і кріомедицини (ІПКіК) НАН України в рамках науково-дослідної теми “Вивчення закономірностей кріозахисної дії та токсичних властивостей багатокомпонентних середовищ на основі нових кріопротекторів рядів поліолів і амідів при кріоконсервуванні клітин і загальному охолодженні організму гомойотермних тварин” (шифр 2.2.6.30, № державної реєстрації 0106U002166.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - визначення кріозахисних властивостей багатокомпонентних середовищ, що містять комбінації кріопротекторів рядів амідів і поліолів, на етапах кріоконсервування тромбоцитів донорської крові людини.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Розробити склад середовищ на основі використання різних комбінацій аміду (ДМАЦ) і поліолів (гліцерин, оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації n=5 (ОЕГ_n=5) і 1,2-ПД), визначити їх фізико-хімічні властивості та характер впливу на функціональні властивості тромбоцитів на етапі експозиції.

2. За показниками функціональних властивостей кріоконсервованих клітин - агрегації, реакції на гіпотонічний шок (РГШ) та ретракції оцінити кріозахисні властивості розроблених середовищ для визначення розчинів, що є найбільш ефективними при заморожуванні тромбоцитів.

3. Дослідити вплив режимів заморожування тромбоцитів з комбінованими середовищами ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/1,2-ПД та ДМАЦ/ОЕГ_n=5 на збереження клітин і показники їх функціональної повноцінності.

4. Провести порівняльний аналіз результатів кріоконсервування тромбоцитів під захистом середовищ, що містять комбінації ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/1,2-ПД та ДМАЦ/ОЕГ_n=5, і розчинів окремих кріопротекторів ДМАЦ, 1,2-ПД, гліцерин, ОЕГ_n=5 та ДМСО.

Об'єкт дослідження - збереження функціональних властивостей тромбоцитів донорської крові людини.

Предмет дослідження - тромбоцити донорської крові людини.

Методи дослідження - гематологічні методи визначення функціональних властивостей тромбоцитів, кріоконсервування з різними швидкостями охолодження, біохімічні методи визначення продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) - гідроперекисей ліпідів (ГПЛ), основ Шифа (ОШ) та активностей антиокислювальних ферментів - глутатіонредуктази (ГР) і глутатіонпероксидази (ГП), фізико-хімічні методи визначення динамічної в'язкості і поверхневої активності, світлова мікроскопія, статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше експериментально обґрунтовано новий підхід до створення середовищ для низькотемпературного консервування тромбоцитів, який базується на використанні у кріозахисному розчині комбінації двох кріопротекторів, що належать до різних класів хімічних сполук - амідів і поліолів. Вперше визначено значно більші показники функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування з комбінованими середовищами, що містять суміш ДМАЦ з гліцерином, 1,2-ПД чи ОЕГ_n=5, у порівнянні з окремими розчинами кріопротекторів, а також ДМСО. Встановлено, що поєднання двох кріопротекторів у середовищі не призводить до потенціювання або збільшення його загальної цитотоксичності; до того ж визначено її корегування: наприклад, зменшення пригнічуючого впливу ДМАЦ на агрегацію та РГШ, і активуючого - 1,2-ПД. Комбінація двох кріопротекторів у середовищах надає можливість знизити концентрацію окремих сполук і в той же час використовувати їх у ефективній сумарній концентрації при заморожуванні тромбоцитів. Вперше експериментально доведена можливість неконтрольованого заморожування тромбоцитів при застосуванні комбінованих середовищ, за умов відсутності переохолодження і тривалості плато кристалізації протягом 0,75-2,125 хв.

Вперше визначена пряма достовірна кореляція між показниками функціональної повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів (кількість клітин, АДФ-індукована агрегація, РГШ) і динамічною в'язкістю кріозахисних середовищ.

Практичне значення отриманих результатів. Визначені кріозахисні властивості комбінованих середовищ дозволяють рекомендувати їх для подальшого використання при розробці методів низькотемпературного консервування і довгострокового зберігання тромбоцитів донорської крові людини з метою наступного клінічного застосування. Важливе значення для загальної практики має визначена в роботі можливість використання неконтрольованого охолодження зразків тромбоцитів у парах рідкого азоту. Це робить процедуру заморожування концентрату тромбоцитів (КТ) більш доступною і значно здешевлює її. Теоретично обґрунтована і експериментально доведена доцільність використання багатокомпонентних кріозахисних середовищ при заморожуванні тромбоцитів, що у подільшому може сприяти розробці технологій довготермінового консервування КТ для низькотемпературних банків крові.

Особистий внесок здобувача. Висунуті на захист положення і результати отримані дисертантом особисто, проведено їх статистичну обробку, аналітичний огляд літератури за темою дисертації. Дисертантом самостійно за консультативної участі наукового керівника д.м.н. Компанієць А.М. проаналізовані отримані результати, зроблені узагальнення і сформульовані висновки. В опублікованих спільно зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає в наступному:

- у роботах [1, 2] - в виділенні тромбоцитів з одиниць донорської крові людини і статистичній обробці результатів;

- у роботах [3, 4, 8, 11] - в розробці складу багатокомпонентних середовищ, дослідженні функціональних властивостей тромбоцитів на етапі експозиції та після кріоконсервування;

- у роботах [5, 6] в експериментальному дослідженні впливу режимів заморожування тромбоцитів з багатокомпонентними середовищами на функціональні властивості і процеси ПОЛ мембран тромбоцитів;

- у роботі [7] - в експериментальному дослідженні впливу глюкози і сахарози на кріозахисну дію комбінованого кріоконсерванту, визначенні функциональної активності кріоконсервованих тромбоцитів;

- у роботах [9, 10] - в приготуванні середовищ до експериментів з визначення фізико-хімічних властивостей середовищ та фазової поведінки кріобіологічної системи і статистичній обробці результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на конференціях молодих вчених ІПКіК «Холод в біології та медицині» (Харків, 2008, 2009 рр.); міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні проблеми гематології та трансфузійної медицини» (Львів, 2010 р.); науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2010 р.); VII міжнародній науково-практичній конференції «Актуальные вопросы биологической физики и химии» (Севастополь, 2011 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей, з яких 5 - в наукових фахових виданнях, 5 тез доповідей, 1 патент на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Матеріал викладено на 176 сторінках друкованого тексту, з яких 149 сторінок основного змісту, і проілюстровано 15 таблицями і 32 рисунками. Дисертаційна робота містить такі розділи: вступ, огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати власних досліджень і їх обговорення, узагальнення, висновки і бібліографічний список, який викладено на 27 сторінках і включає 260 джерел, в тому числі 164 іншомовних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Матеріалом досліджень були тромбоцити, заготовлені у вигляді КТ, які отримані зі стандартної дози консервованої донорської крові методом диференційованого центрифугування з лейкотромбоцитарного шару [Аграненко В.А. и др., 1991]. Донорську кров до процедури виділення КТ зберігали протягом 8-10 годин при температурі 20°С. Після виділення до проведення експериментальних досліджень КТ зберігали протягом 12-16 годин при 22±2єС в режимі постійного перемішування зі швидкістю 2 об/хв.

У роботі використані кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, гліцерин, ОЕГ_n=5 очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. Всі розчини кріопротекторів готували ex tempore на плазмі.

Фізико-хімічні властивості розчинів кріопротекторів вивчені за динамічною вґязкістю методом [Рачинский Ф.Ю., и др., 1982] та поверхневою активністю на межі розподілу фаз вода - н-октанол рефрактометричним методом [Воюцкий С.С., 1982].

Для визначення цитотоксичності середовищ здійснювали експозицію тромбоцитів з розчинами, що містили комбінації ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГ_n=5, 1,2-ПД/гліцерин і 1,2-ПД/ОЕГ_n=5 (співвідношення 1:1) у 5, 10 і 15% початковій сумарній концентрації. Час експозиції становив 15, 30 і 60 хв. Додатково проводили 30 хв експозицію тромбоцитів з 10% ДМСО, ДМАЦ і 1,2-ПД.

При заморожуванні тромбоцитів досліджено середовища наступного складу: ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГ_n=5, 1,2-ПД/гліцерин і 1,2-ПД/ОЕГ_n=5 (співвідношення 1:1) у 5, 10 і 15% сумарній концентрації. Досліджувані середовища повільно при постійному перемішуванні додавали до зразків КТ у співвідношенні 1:1, час експозиції до заморожування становив 15, 30 і 60 хв. Проведено дослідження кріозахисної дії середовищ ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГ_n=5 після сумісного і послідовного способів введення розчинів кріопротекторів до зразків КТ. Сумісний спосіб передбачав додавання середовища, що містило комбінацію двох кріопротекторів, наступну 30 хв експозицію і заморожування, послідовний - додавання 10% розчину 1,2-ПД, гліцерину або ОЕГ_n=5, експозицію протягом 20 хв, наступне додавання 10% розчину ДМАЦ, додаткову експозицію 10 хв і заморожування.

При заморожуванні тромбоцитів з ДМАЦ/ОЕГ_n=5 було досліджено вплив 5% глюкози або цукрози на функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів. Для визначення ефективності комбінованих середовищ паралельно здійснювали заморожування тромбоцитів з 10% розчинами ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, гліцерином і ОЕГ_n=5 після 30 хв експозиції.

Заморожування зразків здійснювали у полімерних контейнерах (30Ч100 мм, об'єм 10 мл) на основі фторопласту. Проводили контрольоване і неконтрольоване заморожування тромбоцитів: за допомогою програмного заморожувача, з використанням лабораторної моделі заморожувача (в парах рідкого азоту при температурі -40…-45?С та -188… -193?C), а також занурюванням у рідкий азот (-196?C). Зміни температури реєстрували диференційною мідь-константановою термопарою, яку розташовували у геометричному центрі охолоджуваного зразка. Відігрів здійснювали на водяній бані (37?С) до зникнення твердої фази. Кількість клітин у зразках визначали за допомогою світлового мікроскопу методом [Ронин В.С., 1983]. Перед визначенням показників функціональних властивостей тромбоцитів, інтенсивності ПОЛ мембран тромбоцитів та активності антиокислювальних ферментів, як на етапі експозиції, так і після розморожування зразків видаляли кріопротектори методом [Пат. № 15014 Україна, 2006].

Функціональні властивості тромбоцитів на етапах кріоконсервування оцінювали за агрегацією [Born G.V.R., 1962], РГШ [Компаниец А.М., 1992] та ретракцією [Компаниец А.М., 1992]. Агрегацію тромбоцитів визначали після введення індукторів АДФ (200Ч10^-6М) чи колагену (6,7Ч10^-3М), РГШ - після додавання Ѕ об'єму дистильованої води до суспензії тромбоцитів (3±0,5Ч10⁵ клітин/мкл) шляхом реєстрації зміни оптичної густини на аналізаторі плазми крові. Ретракцію визначали після 60 хв інкубації суспензії тромбоцитів (1Ч10⁵ клітин/мкл) з 5% СаCl₂. Вимірювання здійснювали при 37±0,5?C. Отримані показники обчислювали у % по відношенню до контролю. Контролем в усіх експериментах були показники відповідних функціональних властивостей тромбоцитів, виділених з донорської крові людини.

Інтенсивність ПОЛ мембран тромбоцитів визначали за вмістом ГПЛ спектрофотометричним методом [Asakawa J., 1980] та ОШ флуориметричним методом. Активність ГП визначали методом [В.З.Ланкин, 1981], ГР - за методом [А.М.Герасимов, 1976].

Для визначення вмісту залишкової концентрації кріопротекторів у кріоконсервованих зразках тромбоцитів після видалення кріопротекторів використовували метод [Пат. №52876 Україна, 2011], що ґрунтується на вимірюванні показника заломлення досліджуваних розчинів за допомогою рефрактометра.

Статистичний аналіз результатів проводили за допомогою програмного пакету «Statgraphic plus for Windows» версія 5.1 з використанням критерію Манна-Уітні.

Результати досліджень та їх обговорення

Розробка кріозахисних середовищ на основі комбінацій кріопротекторів та дослідження їх ефективності при низькотемпературному консервуванні тромбоцитів. В основі розробки нових кріозахисних середовищ для ефективного заморожування тромбоцитів було використано принцип сполучення двох кріопротекторів. Для реалізації цього підходу були використані кріопротектори: ДМАЦ, 1,2-ПД, гліцерин і ОЕГ_n=5. Їх вибір зумовлений наступним: 1) на основі ДМАЦ і гліцерину розроблені методи кріоконсервування тромбоцитів, що використовуються у клінічній практиці; 2) для 1,2-ПД і ОЕГ_n=5 розроблено методи кріоконсервування тромбоцитів, що пройшли доклінічні випробовування; 3) ефективність ДМАЦ, 1,2-ПД, гліцерину і ОЕГ_n=5 при заморожуванні тромбоцитів подібна ДМСО, при цьому дані кріопротектори є менш токсичними як для клітин, так і для організму реципієнта [Азовская С.А., 1995]. На основі відібраних кріопротекторів розроблено склад середовищ: ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГ_n=5, 1,2-ПД/гліцерин та 1,2-ПД/ОЕГ_n=5, проведено визначення їх фізико-хімічних властивостей, комплексну оцінку цитотоксичності та кріозахисних властивостей при заморожуванні тромбоцитів.

З переліку фізико-хімічних властивостей були досліджені динамічна в'язкість і поверхнева активність. Перша характеристика надає уявлення про взаємодію кріопротектора з водою, а друга - моделює його здатність адсорбуватися на поверхні клітинної мембрани. За значеннями вивчених характеристик (табл. 1) найбільша динамічна в'язкість визначена для ДМАЦ, тоді як в'язкість розчинів поліолів: 1,2-ПД, гліцерину та ОЕГ_n=5 була нижчою.

Таблиця 1

Фізико-хімічні властивості 5% розчинів кріопротекторів

Кріопротектор	Динамічна в'язкість, Пз	Поверхнева активність, ерг/см2
ДМАЦ	18,835	2,456
1,2-ПД	17,905	2,676
гліцерин	17,770	1,072
ОЕГn=5	18,401	0,844
ДМАЦ/1,2-ПД	20,359	2,594
ДМАЦ/гліцерин	20,337	1,305
ДМАЦ/ОЕГn=5	20,358	1,419

Динамічна в'язкість комбінованих середовищ була більшою за показники для розчинів окремих кріопротекторів, що може свідчити про збільшення їх здатності до взаємодії з водою. При цьому показники динамічної в'язкості комбінованих середовищ - ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5 були близькими за значенням.

Найбільші значення поверхневої активності визначено для 5% розчинів 1,2-ПД, ДМАЦ і середовища, що містить їх комбінацію, ДМАЦ/1,2-ПД; даний показник для 5% ОЕГ_n=5 і гліцерина був значно нижче. При поєднанні ДМАЦ з гліцерином або ОЕГ_n=5 (5% сумарна концентрація) значно збільшується загальна здатність середовищ взаємодіяти з компонентами мембран порівняно з 5% розчинами гліцерину або ОЕГ_n=5.

Аналіз показників динамічної в'язкості і поверхневої активності розчинів окремих кріопротекторів (ДМАЦ, 1,2-ПД, гліцерин та ОЕГ_n=5) і комбінованих середовищ (ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5) дозволяє дійти висновку, що останні характеризуються більшою здатністю взаємодіяти з водою.

Вплив комбінованих середовищ на тромбоцити на етапі експозиції оцінювали за показниками їх функціональних властивостей: ступінь агрегації, індукованої АДФ та колагеном, і РГШ (рис. 1). Ці параметри є інформативними і адекватними критеріями, які не прямо характеризують збереження гемостатичної функції тромбоцитів і їх здатність циркулювати у кров'яному руслі після переливання.

Рис.1. Функціональні властивості тромбоцитів після експозиції з комбінованими середовищами: а - ДМАЦ/1,2-ПД, б - ДМАЦ/гліцерин, в - ДМАЦ/ОЕГ_n=5, г - 1,2-ПД/гліцерин, д - 1,2-ПД/ОЕГ_n=5; - 15 хв експозиція, - 30 хв експозиція, - 60 хв експозиція.

Примітка. * - відмінності достовірні відносно контролю, р<0,05.

Для дослідження цитотоксичності було проведено визначення показників функціональних властивостей тромбоцитів після 15, 30 і 60 хв експозиції з 5, 10 та 15% середовищами ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГ_n=5, 1,2-ПД/гліцерин та 1,2-ПД/ОЕГ_n=5.

Встановлено, що після 15 і 30 хв експозиції тромбоцитів з 5 та 10% комбінованими середовищами не відбувається змін агрегаційної активності і осморегулюючої функції тромбоцитів: агрегація та РГШ не відрізняються від показників контролю (рис.1). Таким чином, комбіновані середовища ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГ_n=5, 1,2-ПД/гліцерин та 1,2-ПД/ОЕГ_n=5, що містять 5 і 10% сумарну концентрацію кріопротекторів, не виявляють цитотоксичної дії по відношенню до тромбоцитів за умови, що тривалість експозиції складає не більше 30 хв.

Після експозиції з 15% середовищами (для всіх варіантів комбінацій кріопротекторів) і 60 хв експозиції визначено суттєве зниження досліджуваних показників функціональної повноцінності тромбоцитів. Отже, використання 15% комбінованих середовищ і часу експозиції 60 хв є не доцільним.

Порівняльне дослідження цитотоксичності 10% комбінованих середовищ і 10% розчинів окремих кріопротекторів дозволило визначити, що останні чинять більш значний вплив на показники агрегації та РГШ тромбоцитів (рис.2). Так 10% ДМАЦ і ДМСО знижують агрегаційну активність і РГШ, а 10% 1,2-ПД - активує агрегацію, показники РГШ при цьому знижуються. Тоді як для 10% комбінованих середовищ, наприклад ДМАЦ/1,2-ПД, не встановлено пригнічуючої дії, притаманної для ДМАЦ, і активуючої - для 1,2-ПД.

Рис. 2. Функціональні властивості тромбоцитів після експозиції з 10% комбінованими середовищами і 10% розчинами окремих кріопротекторів.

Примітка. * - Відмінності достовірні відносно контролю, р<0,05.

Таким чином, поєднання двох сполук у комбінованих середовищах не призводить до посилення несприятливої дії на тромбоцити, що свідчить про відсутність потенціювання цитотоксичності окремих кріопротекторів у середовищах. Зокрема, це пояснюється зменшенням концентрації кожного кріопротектору у складі комбінованих розчинів, хоча при цьому зберігається загальна 10% концентрація сполук.

Скринінг кріозахисних властивостей комбінованих середовищ показав, що за кількістю клітин і функціональними властивостями кріоконсервованих тромбоцитів кріозахисна дія 10 та 15% середовищ 1,2-ПД/гліцерин і 1,2-ПД/ОЕГ_n=5 є низькою (рис.3). Високі показники збереження тромбоцитів отримано після їх заморожування під захистом комбінованих середовищ ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин і ДМАЦ/ОЕГ_n=5: кількість тромбоцитів, їх агрегаційна, ретрактильна активності і РГШ свідчать про наявну кріозахисну дію даних середовищ (рис. 3). Отримані дані свідчать про ефективність комбінацій кріопротекторів, що відносяться до різних класів хімічних сполук - аміди (ДМАЦ) і поліоли (1,2-ПД, гліцерин і ОЕГ_n=5).

Рис. 3. Кількість і функціональні властивості тромбоцитів після кріоконсервування з комбінованими середовищами в залежності від складу та концентрації кріопротекторів.

Примітки: * - відмінності достовірні відносно 10%, р<0,05; # - відмінності достовірні відносно 15%, р<0,05.

Визначено, що 10% сумарна концентрація кріопротекторів у середовищах ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5 є найбільш ефективною (рис. 3).

За результатами проведених досліджень не встановлена залежність показників функціональних властивостей тромбоцитів після експозиції від досліджених фізико-хімічних властивостей середовищ. Проте після кріоконсервування визначена пряма достовірна кореляція між показниками кількості тромбоцитів (р=0,0068), їх агрегації, індукованої АДФ (р=0,0106), РГШ (р=0,0011) і динамічною в'язкістю середовищ.

Дослідження ступеня видалення кріопротекторів зі зразків кріоконсервованих тромбоцитів дозволили визначити, що кріопротектори, які входять до складу 10% середовища ДМАЦ/ОЕГ_n=5, практично повністю видаляються з суспензії тромбоцитів після їх відмивання (табл. 2). Тоді як видалення ОЕГ_n=5 або комбінації 1,2-ПД/ОЕГ_n=5 значно ускладнене, про що свідчать їх залишкові концентрації у відмитих тромбоцитах.

Таким чином встановлено, що додавання ДМАЦ до середовища, що містить ОЕГ_n=5, сприяє найбільш повному видаленню кріопротекторів з суспензії тромбоцитів.

Таблиця 2

Розподіл кріопротекторів (%) у зразках кріоконсервованих тромбоцитів після їх видалення (М±S, n=3)

Кріопротектори	Супернатант	Відмиті тромбоцити
ОЕГn=5	2,39±0,16	2,61±0,16
1,2-ПД/ОЕГn=5	1,36±0,16	3,64±0,16
ДМАЦ/ОЕГn=5	4,8±0,16	0,2±0,16

Кріозахисні властивості комбінованих середовищ при кріоконсервуванні тромбоцитів за різними режимами заморожування. Засобами зменьшення кріопошкоджень тромбоцитів при заморожуванні разом з кріоконсервантом є також оптимальний режим заморожування. Аналіз даних літератури свідчить, що не існує певних вимог до режиму заморожування тромбоцитів. Використовують як неконтрольоване заморожування з нереґульованими швидкостями охолодження у морозильних камерах або парах рідкого азоту, так і контрольоване - з реґульованими швидкостями у програмних заморожувачах. За різних умов заморожування швидкість охолодження варіює від 1 до 35?C/хв.

Скринінг кріозахисних властивостей комбінованих середовищ при заморожуванні тромбоцитів дозволив визначити ефективність комбінацій кріопротекторів ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5 у 10% сумарній концентрації - ці середовища і були відібрані для подальших досліджень. В проведених експериментах охолодження зразків здійснювали шляхом неконтрольованого заморожування контейнерів в парах рідкого азоту при температурі -188…-193?C.

Наступним етапом досліджень було визначення показників функціональної повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від умов охолодження: неконтрольоване заморожування з повільними і відносно високими швидкостями охолодження, заморожування шляхом занурювання у рідкий азот, контрольоване заморожування з використанням програмного заморожувача; аналіз термограм процесу охолодження за цих умов.

Аналіз термограм охолодження модельних кріобіологічних систем при контрольованому заморожуванні (режим 1), та неконтрольованому при температурі -40…-45?C (режим 2), -188…-193?C (режим 3) свідчить, що режим 1 забезпечує швидкість 1,3-3?C/хв, ступінь переохолодження складає 4,3?C, тривалість плато кристалізації - 10,5±1 хв; режим 2 - забезпечує повільні швидкості 1-3?С/хв, переохолодження до 1,2?C, плато кристалізації 11-20 хв; режим 3 - відносно високі швидкості охолодження 12-25?С/хв, переохолодження не було зареєстровано, тривалість плато кристалізації скорочувалась до 0,75-2,125 хв (рис. 4).

При занурюванні зразків у рідкий азот (режим 4) швидкість охолодження становила близько 210?С/хв.



Рис. 4. Термограми охолодження 5% розчинів ДМСО (А) та ДМАЦ/ОЕГ_n=5 (Б) за різними режимами заморожування.

Після кріоконсервування тромбоцитів під захистом 10% ДМСО, ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5 визначено високе збереження кількості клітин у зразках, яке не залежало від режиму заморожування (рис. 5). Показники функціональних властивостей тромбоцитів після заморожування зразків за режимом 4 були дуже низькими та свідчать про значні втрати і пошкодження тромбоцитів при заморожуванні шляхом занурювання у рідкий азот.

Рис. 5. Кількість і функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів у залежності від режиму заморожування.

Примітки: * - відмінності достовірні відносно режиму 1, р<0,05; # - відмінності достовірні відносно режимів 1, 2, 3, p<0,05.

При заморожуванні тромбоцитів за режимами 1, 2 і 3 ефективність комбінованих середовищ визначена як при використанні програмного контрольованого заморожування (режим 1), так і неконтрольованого (режим 2 і 3). Проте найбільш високі показники функціональних властивостей тромбоцитів визначені при їх заморожуванні за режимом 3 (рис. 5). Отримані резульати збереженості функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів заморожених за різними режимами підтверджені і узгоджуються з вмістом ГПЛ, ОШ і активностей ГР та ГП.

Аналіз отриманих даних вказує на те, що результат кріоконсервування тромбоцитів під захистом комбінованих середовищ суттєво залежить від ступеня позаклітинного переохолодження та тривалості плато кристалізації. Локальне охолодження поверхні контейнера, яке відбувається при неконтрольованому заморожуванні у парах рідкого азоту -188… -193?C (режим 3) забезпечує швидке проходження плато кристалізації за 0,75-2,125 хв та відсутність переохолодження. При кріоконсервуванні тромбоцитів з середовищем ДМАЦ/1,2-ПД високі показники їх функціональної повноцінності можуть бути отриманими і за режимом 1. Для ДМСО більш прийнятним є заморожуваня з повільними реґульованими (режим 1) та нереґульованими (режим 2) швидкостями, при цьому важливим є забезпечення тривалості плато кристалізації протягом 10-20 хв.

Оптимізація умов кріоконсервування тромбоцитів з комбінованими кріозахисними середовищами. Аналіз показників функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від часу їх експозиції з комбінованими середовищами - 15, 30 і 60 хв - свідчить про важливе значення тривалості експозиції для загального результату кріоконсервування тромбоцитів (рис. 6).



Рис. 6. Кількість та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів в залежності від часу експозиції до заморожування.

Примітки: * - відмінності достовірні відносно 30 хв, р<0,05; # - відмінності достовірні відносно 60 хв, р<0,05.

Меньші показники агрегації та РГШ тромбоцитів, що були заморожені після 15 хв експозиції, порівняно з відповідними показниками для клітин, заморожених після 30 хв, в очевидь, є наслідком недостатнього часу взаємодії тромбоцитів з кріопротекторами у середовищі. Тоді як за 60 хв експозиції поглиблюється несприятлива цитотоксична дія середовищ на тромбоцити, що проявляється низькими показниками їх функціональних властивостей після заморожування. Згідно з результатами наших досліджень 30 хв експозиція є оптимальним інтервалом часу, за який відбувається «адаптація» тромбоцитів до тимчасових транзиторних гіпер- і гіпотонічних ефектів, що виникають при додаванні розчинів кріопротекторів до біологічних об'єктів.

Завданням наступного етапу роботи було визначення впливу сумісного і послідовного способів додавання розчинів кріопротекторів, що входять до складу комбінованих середовищ, на результат кріоконсервування тромбоцитів з комбінованими середовищами ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5. Встановлено, що збереженість показників кількості клітин, агрегації, РГШ, ретракції, вмісту ОШ та ГПЛ мембран кріоконсервованих тромбоцитів не залежала від способу додавання розчинів кріопротекторів перед заморожуванням: отримані відмінності показників були не достовірними і різноспрямованими. Отже, ускладнення процедури кріоконсервування тромбоцитів за рахунок послідовного додавання кріопротекторів є не доцільним.

Згідно з літературними даними, поширеним засобом підвищення кріозахисної дії середовищ для заморожування тромбоцитів є додавання вуглеводів (Тромбокріодмац, TromboSol, тощо). В наших дослідженнях введення глюкози та сахарози до складу комбінованих кріозахисних середовищ виявилося не доцільним. Так, при введенні глюкози або сахарози до 10% комбінованого середовища ДМАЦ/ОЕГ_n=5 було визначено суттєве зниження його кріозахисної дії: показники агрегації, індукованної АДФ та колагеном, РГШ тромбоцитів, кріоконсервованих з 10% ДМАЦ/ОЕГ_n=5+5% глюкоза та 10% ДМАЦ/ОЕГ_n=5+5% сахароза були достовірно нижчі (р<0,05) за відповідні показники після заморожування під захистом 10% ДМАЦ/ОЕГ_n=5 (рис. 7).

Рис. 7. Функціональні властивості тромбоцитів, що були кріоконсервовані з ДМАЦ/ОЭГ_n=5, в залежності від додавання вуглеводів до середовища.

Примітка. * - Відмінності достовірні відносно 10% ДМАЦ/ОЭГ_n=5, р<0,05.

При введенні глюкози до 5% ДМАЦ/ОЕГ_n=5 кріозахисна дія середовища збільшувалась, але лишалась нижчою за 10% ДМАЦ/ОЕГ_n=5. Тоді як, після додавання сахарози до комбінованого середовища 5% ДМАЦ/ОЕГ_n=5 його кріозахисна дія знижувалась.

Дослідження кріозахисної дії розроблених середовищ і розчинів кріопротекторів, які входять до їх складу, дозволило встановити, що застосування комбінованих середовищ ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5 при заморожуванні тромбоцитів в 1,5-2 рази підвищує збереженість показників їх функціональних властивостей - агрегації, РГШ і ретракції, порівняно із застосуванням розчинів окремих кріопротекторів, в тому числі і ДМСО (рис. 8).

Рис. 8. Кількість та функціональні властивості тромбоцитів після кріоконсервування під захистом розчинів окремих кріопротекторів (група 1) та комбінованих середовищ (група 2).

Примітки: * - відмінності достовірні відносно ДМСО, р<0,05; # - відмінності достовірні відносно відповідного розчину кріопротектора, р<0,05.

За визначеними показниками функціональної повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів досліджені 10% середовища розмістилися у порядку зростання їх кріозахисної дії наступним чином: ОЕГ_n=5 < гліцерин < 1,2-ПД < ДМАЦ < ДМСО < ДМАЦ/1,2-ПД < ДМАЦ/гліцерин < ДМАЦ/ОЕГ_n=5.

Найбільш високі результати кріоконсервування тромбоцитів отримано при використанні середовища, що містить комбінацію проникаючого аміду - ДМАЦ і кріопротектора змішаного типу ряду поліолів ОЕГ_n=5. Після заморожування зразків тромбоцитів в парах рідкого азоту (-188…-193?C): зберігалось 95±5% клітин, показник АДФ-агрегації становив 56±10%, РГШ - 70±12%, ретракції тромбоцитарного згустку - 86±10%.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі на підставі теоретичного аналізу стану проблеми і експериментальних досліджень обґрунтований новий підхід до створення кріозахисних середовищ для заморожування тромбоцитів, оснований на використанні комбінації двох кріопротекторів, що належать до різних рядів хімічних сполук - амідів і поліолів. Визначені кріозахисні властивості комбінованих середовищ різного складу при заморожуванні тромбоцитів у порівнянні з розчинами окремих кріопротекторів, проведена кількісна оцінка збереження функціональної повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів за комплексом тестів in vitro.

1. Розроблені кріозахисні середовища для заморожування тромбоцитів на основі комбінації ДМАЦ з кріопротекторами 1,2-ПД, гліцерином або ОЕГ_n=5. Встановлено, що поєднання у кріозахисному середовищі двох кріопротекторів (ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин, ДМАЦ/ОЕГ_n=5) приводить до значного підвищення збереженості функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів (АДФ- і колаген-індукована агрегація, РГШ, ретракція) у порівнянні з використанням окремих розчинів цих кріопротекторів.

2. Встановлено, що комбінація кріопротекторів ДМАЦ, 1,2-ПД, гліцерин та ОЕГ_n=5 в середовищах в різних варіантах не призводить до потенціювання або посилення їх цитотоксичної дії на тромбоцити на етапі експозиції. Експозиція тромбоцитів протягом 15 і 30 хв з комбінованими середовищами, що містять 5 і 10% сумарні концентрації кріопротекторів, не змінювала показники функціональних властивостей тромбоцитів.

3. Вперше показано, що поєднання кріопротекторів у середовищах корегує їх цитотоксичність, зокрема, знижує пригнічуючу дію ДМАЦ на агрегацію та осморегулюючу властивість тромбоцитів, а також зменшує активуючу дію 1,2-ПД на агрегацію.

4. Експериментально доведена можливість застосування неконтрольованого заморожування тромбоцитів з комбінованими кріозахисними середовищами. Встановлене найбільш високе збереження тромбоцитів при заморожуванні з нерегульованою, відносно високою швидкістю охолодження (12-25°С/хв) за умов відсутності переохолодження (не реєструвалося) і тривалості плато кристалізації протягом 0,75-2,125 хв.

5. Встановлено важливе значення фактора тривалості експозиції тромбоцитів з комбінованими середовищами для загального результату їх кріоконсервування. Експериментально доведено, що 30 хв експозиція є оптимальним інтервалом часу, протягом якого відбувається адаптація тромбоцитів до осмотичних ефектів, що виникають при додаванні розчинів кріопротекторів.

6. Вперше визначена пряма достовірна кореляція між такими показниками повноцінності кріоконсервованих тромбоцитів, як кількість клітин (р=0,0068), агрегації, індукованої АДФ (р=0,0106), РГШ (р=0,0011) і динамічною в'язкістю кріозахисних середовищ.

7. Встановлено виражену мембраностабілізуючу дію кріозахисних середовищ ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5, про що свідчить низький вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів мембран тромбоцитів. Показано, що відносно стабільний рівень процесів вільнорадикального окислення в значній мірі забезпечується збалансованою дією антиоксидантних ферментів глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази для всіх режимів заморожування.

8. Визначені високі і стабільні показники функціональної повноціності кріоконсервованих тромбоцитів при використанні середовища, що містить комбінацію проникаючого ДМАЦ і кріопротектора змішаного типу ОЕГ_n=5, свідчать про найбільш високий рівень кріозахисних властивостей цього середовища і перспективність його використання при розробці технології довгострокового зберігання тромбоцитів при низьких температурах.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування / А.М. Компанієць [та ін.] // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16, № 2. - С. 182 - 191.

2. Вплив кінетики охолодження на результати кріоконсервування тромбоцитів крові людини / О.В. Книш, Т.М. Гуріна, О.А. Богданчикова [та ін.] // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”, випуск 33. - К.: Нора-друк, 2006. - С. 113-118.

3. Богданчикова О.А. Замораживание тромбоцитов в криозащитных средах, содержащих различные комбинации криопротекторов / О.А. Богданчикова, Т.М. Гурина, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т. 18, № 1. - с. 109-113.

4. Богданчикова О.А. Криоконсервирование тромбоцитов. I. Разработка криоконсервантов на основе комбинаций криопротекторов и исследование их эффективности / О.А. Богданчикова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии. - 2009. - Т. 19, № 3. - с. 324-337.

5. Богданчикова О.А. Криоконсервирование тромбоцитов. 2. Эффективность криоконсервантов на основе комбинаций криопротекторов при различных режимах замораживания / О.А. Богданчикова, В.А. Киреев, А.Т. Ходько, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии. - 2010. - Т.20, №4. - с. 443-451.

6. Богданчикова О.А. Влияние режимов замораживнаия на криоконсервирование тромбоцитов человека под защитой многокомпонентных криопротекторных сред / О.А. Богданчикова, А.М. Компаниец // Проблемы криобиологии. - 2009. - Т. 19, №2. - с. 222.

7. Богданчикова О.А. Вплив вуглеводів на ефективність комбінованих кріоконсервантів при заморожуванні тромбоцитів / О.А. Богданчикова, А.М. Компаниец // Юв. міжнар. наук.-практичн. конф. «Актуальні проблеми гематології та трансфузійної медицини», 27-28 травня 2010р.: тези доп. - Львів, 2010. - С. 39-40.

8. Компаниец А.М. Криоконсервирование тромбоцитов с криозащитными растворами, содержащими комбинации криопротекторов / А.М. Компаниец, О.А. Богданчикова // Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», 6-7 октября 2010г.: тезисы докл. - Киров, 2010. - С. 108.

9. Богданчикова О.А. Физико-химические свойства растворов криопротекторов, их взаимосвязь с цитотоксичностью и криозащитной эффективностью на этапах криоконсервирования тромбоцитов донорской крови человека / О.А. Богданчикова, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец // VII Международная научно-техническая конференция «Актуальные вопросы биологической физики и химии», 26-30 апреля 2011 р.: тезисы докл. - Севастополь, 2011. - С. 263-265.

10. Фазовая диаграмма системы вода + ОЭГ(_n=5) + ДМАЦ в диапазоне температур -150°Сч0°С / А.В. Зинченко [и др.] // VII Международная научно-техническая конференция «Актуальные вопросы биологической физики и химии», 26-30 апреля 2011 р.: тезисы докл. - Севастополь, 2011. - С. 256-268.

11. Патент № 61471 UA Україна, МПК №А01N 1/02. Спосіб кріоконсервування концентрату тромбоцитів / Грищенко В.І., Компанієць А.М., Богданчикова О.А.; заявник і патентовласник ІПКіК НАН України. - Заявл. 24.11.2010; опубл. 25.07.2011, Бюл. № 14.

АНОТАЦІЇ

Богданчикова О.А. «Кріоконсервування тромбоцитів донорської крові людини у багатокомпонентних кріозіхисних середовищах». - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2011.

Дисертаційна робота присвячена розробці багатокомпонентних середовищ для заморожування тромбоцитів донорської крові людини, дослідженню їх фізико-хімічних властивостей, цитотоксичності і кріозахисної дії.

Експериментально обґрунтовано новий підхід до створення кріоконсервантів для заморожування тромбоцитів на основі комбінацій кріопротекторів, що належать до різних рядів - амідів і поліолів. Розроблені комбіновані середовища ДМАЦ/1,2-ПД, ДМАЦ/гліцерин та ДМАЦ/ОЕГ_n=5, використання яких значно підвищило збереженість функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування порівняно з застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Доведена можливість неконтрольованого заморожування тромбоцитів з комбінованими середовищами.

Ключові слова: кріоконсервування, тромбоцити, функціональні властивості, багатокомпонентні кріозахисні середовища, комбінація кріопротекторів, режими заморожування.

Богданчикова О.А. «Криоконсервирование тромбоцитов донорской крови человека в многокомпонентных криозащитных средах». - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2011.

Диссертационная работа посвящена разработке многокомпонентных сред для замораживания тромбоцитов, исследованию их физико-химических свойств, цитотоксичности и криозащитного действия.

Экспериментально обоснован новый подход к созданию криоконсервантов для замораживания тромбоцитов на основе использования в криозащитных средах комбинации криопротекторов, относящихся к разным рядам химических соединений - амидам и полиолам.

Разработаны среды на основе комбинации ДМАЦ с криопротекторами 1,2-ПД, глицерин или ОЭГ_n=5. Проведенные исследования показали, что сочетание двух криопротекторов в криозащитной среде значительно повышает сохранность функциональных свойств криоконсервированных тромбоцитов (АДФ- и коллаген-индуцированная агрегация, РГШ, ретракция) в сравнении с результатами использования для замораживания растворов отдельных криопротекторов.

Показано, что сочетание криопротекторов ДМАЦ, 1,2-ПД, глицерин или ОЭГ_n=5 в различных вариантах не усиливает цитотоксичность этих сред для тромбоцитов на этапе экспозиции. Впервые установлено, что сочетание криопротекторов в среде не приводит к суммированию или потенциированию их цитотоксичности, а в определенной степени коррегирует ее: например, снижает подавляющее действие ДМАЦ на агрегацию и РГШ, а также уменьшает активирующее действие 1,2-ПД на агрегацию тромбоцитов.

Установлена возможность неконтролированного замораживания тромбоцитов с комбинированными криозащитными средами в парах жидкого азота при температуре -188…-193?C. Експериментально разработан режим замораживания тромбоцитов с нерегулируемой скоростью охладжения (12-25єС/мин), отсутсвием переохлаждения и длительностью плато кристаллизации 0,75-2,125 мин, использование которой достоверно повышает сохранность криоконсервированных тромбоцитов по комплексу критериев in vitro.

Показано важное значение для результатов криоконсервирования тромбоцитов фактора длительности экспозиции с комбинированными средами, установлено оптимальное время их взаимодействия.

Впервые установлено наличие прямой достоверной корреляции между показателями функциональных свойств тромбоцитов после криоконсервирования и динамической вязкостью криозащитных сред.

Экспериментально установлено наиболее выраженное криозащитное действие для среды, содержащей проникающий ДМАЦ и криопротектор смешанного типа ОЭГ_n=5 в 10% суммарной концентрации, при замораживании в парах жидкого азота (-188…-193?C).

Ключевые слова: криоконсервирование, тромбоциты, функциональные свойства, многокомпонентные криозащитные среды, комбинация криопротекторов, режимы замораживания.

Bogdanchikova O.A. «Cryopreservation of blood human platelets in multicomponent cryoprotective media». - Manuscript.

The thesis for obtaining scientific degree of the candidate of biological sciences in specialty 03.00.19 - cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2011.

The thesis covers of multicomponent media treatment for donor's blood platelet freezing, studying of its physical-chemical properties, cytotoxicity and cryoprotective efficacy.

Experimentally justified a new approach to cryopreservatives creation for platelets freezing used on cryoprotectants combination in cryoprotective media, which belonging to different series amides and polyols. It was designed combined media DMAC/1,2-PD, DMAC/glycerol and DMAC/OEG_n=5 the use of which has increased the platelets functional properties safety after cryopreservation compared to using each of the cryoprotectants separately. It was proved possibility of uncontrolled freezing of platelets with combined media.

Key words: cryopreservation, platelets, functional properties, multicomponent cryoprotective media, cryoprotectors combination, freezing regimens.

Автор висловлює щиру подяку співробітникам відділу кріопротекторів; к.б.н. Гуріній Т.М., старшому науковому співробітнику відділу ДЗБО при НТ ІПКіК НАН України; Кірєєву В.О., провідному інженеру відділу НТК ІПКіК НАН України; к.б.н. Нікітченку Ю.В., старшому науковому співробітнику, зав. відділом біофізики онтогенезу мембран та біоенергетики Інституту біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за консультативну і технічну допомогу при виконанні окремих розділів дисертаційної роботи.

Размещено на Allbest.ru