Структура рослинно-бактеріальних асоціацій у фітосферах представників родів Brassica, Phyllostachys і Fragresia

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

"ІНСТИТУТ ХАРЧОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА ГЕНОМІКИ

НАН УКРАЇНИ"

УДК 579.262:576.6

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

СТРУКТУРА РОСЛИННО-БАКТЕРІАЛЬНИХ АСОЦІАЦІЙ У ФІТОСФЕРАХ ПРЕДСТАВНИКІВ РОДІВ BRASSICA, PHYLLOSTACHYS, FRAGRESIA

Мошинець Олена Володимирівна

Київ-2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України і відділі клітинної біології і анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Косаківська Ірина Василівна Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, старший науковий співробітник відділу фітогормонології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Іутинська Галина Олександрівна Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, заступник директора інституту з наукової роботи, завідувач відділу загальної і ґрунтової мікробіології

доктор біологічних наук, професор Сікура Йосип Йосипович Закарпатський Угорський педінститут ім. Ференца Ракоці II, ректор

Захист відбудеться "27" жовтня 2011 р. о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.254.01 при ДУ "Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України" за адресою: 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а. Факс: (044) 434 3777.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ "Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України" за адресою: м. Київ, вул. Осиповського, 2а.

Автореферат розісланий "26" вересня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук А.І. Ємець

Анотації

Мошинець О.В. Структура рослинно-бактеріальних асоціацій у фітосферах представників родів Brassica, Phyllostachys і Fragresia.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - ДУ "Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України", Київ, 2011.

Дисертація присвячена вивченню структурних особливостей рослинно-бактеріальних асоціацій, які мають місце у фітосферах ріпаку Brassica napus L. та бамбуків родів Phyllostachys і Fragresia. Для більш повного дослідження фітосфери модельних рослин було розроблено метод плівок обростання.

Запропонований метод плівок обростання було досліджено щодо можливості його застосування для адекватного дослідження мікробних і рослинно-мікробних угруповань, сформованих в умовах in situ. Доведено, що ПЕТ плівка, що застосовується у якості штучного субстрату і на поверхні якої формується мікробний і мікробно-рослинний ценоз, є адекватним носієм для прямого та непрямого, тобто через утворення підготовчого шару, обростання мікроорганізмами і рослинно-мікробними асоціаціями. Подальші дослідження показали, що метод плівок обростання як метод відбору зразків вдало комбінується із комплексом структурних технік, а саме мікроскопічних, в тому числі методи світлової, люмінесцентної, конфокальної скануючої і електронної скануючої мікроскопій, і томографічних, а саме метод рентгенівської мікрофокусної комп'ютерної томографії, та молекулярно-генетичних, а саме ПЛР.

Метод плівок обростання разом із класичними мікробіологічними методами було застосовано для дослідження фітосфери B. napus L. як екологічної ніші для бактерій P. fluorescens SBW25. Вперше досліджено характер колонізації бактеріями P. fluorescens SBW25 філосфери B. napus L. за різних умов вологості. Встановлено, що в умовах 100% вологості повітря колонізація поверхні листка відбувається дисперсно, тоді як в умовах кімнатної вологості (~32%) бактерії скупчуються в зонах продихів і вздовж прожилок. Спостерігався взаємозв'язок між ендосферою і філосферою рослин ріпаку. Колонізація едосфери рослин ріпаку бактерією P. fluorescens SBW25 спостерігалась за умов вологої камери при відсутності мікроорганізмів-конкурентів. Також було досліджено динаміку колонізації проростків ріпаку модельною бактерією P. fluorescens SBW25. Встановлено, що модельна псевдомонада колонізує корінці проростків ріпаку, утворюючи волокноподібні колонії вздовж епідермальних клітин і формуючи біоплівки. Колонізація проходить неоднорідно: щільність колоній P. fluorescens SBW25 у зоні насінини найвища й зменшується в напрямку кінчика корінця проростка. рослинний бактеріальний фітосфера

Метод плівок обростання разом із класичними мікробіологічними і сучасними молекулярно-генетичними методами було застосовано для дослідження природної ендофітної популяції рослин бамбуку родів Phyllostachys і Fragresia. Виявлено, що склад ендофітів підземної частини бамбуків більш різноманітний, ніж у надземній частині. У верхній частині стебла, які представлені молодими тканинами, знайдені бактерії в LNA-формі. Мікробіота ендосфери бамбуків, які культивувались в субстраті для росту рослин, виявилася більш різноманітною, ніж в умовах in vitrо. Серед мікрофлори надземної частини бамбуків виявили грампозитивні мікроорганізми родин Bacillaceae і Mycobacteriaceae і некультурабельні мікроорганізми, в той час як серед мікрофлори підземної частини знайдено грампозитивні і грамнегативні бактерії. У бамбуків, які росли в умовах in vitro, знайдені два ізоляти грамнегативних бактерій - Achromobacter sp. і Acinetobacter сalcoaceticus, не виявлені в інших зразках. В ендосфері бамбуку Phyllostachys atrovaginata L. виявлені гіфи грибів, більшість яких була асоційована з бактеріями.

Вперше досліджено ендофітні мікроорганізми бамбуку родів Phyllostachys і Fragresia. Визначено 18 видів ендофітних бактерій бамбуків. Вперше серед ендофітів бамбуків встановлені Agrobacterium/Rhizobium sp., Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, B. mojavensis, Mycobacterium palustre, M. lentiflavum, M. avium complex, M. arosiense, Pseudomonas fuscovaginae, P. fluorescens, Paenibacillus chondroitinus, Microbacterium laevaniformans, Achromobacter sp. і Acinetobacter calcoaceticus.

Ключові слова: рослинно-мікробні взаємовідносини, ризосфера, ендофіти, плівка обростання, методи, біоплівка, P. fluorescens, бамбуки

Мошинец Е.В. Структура растительно-бактериальных ассоциаций в фитосферах представителей представителей родов Brassica, Phyllostachys і Fragresia. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - ГУ "Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины", Киев, 2011.

Диссертация посвящена изучению структурных особенностей растительно-бактериальных ассоциаций, которые имеют место в фитосферах рапса Brassica napus L. и бамбуков родов Phyllostachys и Fragresia. Для более полного исследования фитосферы модельных растений был разработан метод плёнок обрастания.

Были исследованы возможности применения предложенного метода плёнок обрастания для адекватного изучения микробных и растительно-микробных группирований, сформированных в условиях in situ. Показано, что ПЭТ (полиэтилентерефталат) плёнка, которая используется в качестве искусственного субстрата и на поверхности которой формируется микробно-растительный ценоз, является адекватным носителем для прямого и непрямого, то есть посредством образования подготовительного слоя, обрастания микроорганизмами и растительно-микробными ассоциациями. Последующие исследования показали, что метод плёнок обрастания как метод отбора образцов успешно комбинируется с комплексом структурных техник, включая микроскопические, в том числе методы световой, люминесцентной, конфокальной сканирующей и электронной сканирующей микроскопий, и томографические, а именно метод рентгеновской микрофокусной компьютерной томографии, и молекулярно-генетических, а именно ПЦР.

Метод плёнок обрастания вместе с классическими микробиологическими методами был применён для исследования фитосферы B. napus L. Как экологической ниши для бактерий P. fluorescens SBW25. Впервые изучен характер колонизации бактериями P. fluorescens SBW25 филлосферы B. napus L. в условиях разной влажности. Установлено, что в условиях 100% влажности воздуха колонизация поверхности листа происходит дисперсно, в то время как в условиях комнатной влажности (~32%) бактерии группируются в районе устьиц и вдоль жилок. Наблюдалась взаимосвязь между эндосферой и филосферой растений рапса. Колонизация эндосферы растений рапса бактерией P. fluorescens SBW25 наблюдалась в условиях влажной камеры при отсутствии микроорганимов-конкурентов. Также было исследовано динамику колонизации проростков рапса модельной бактерией P. fluorescens SBW25. Установлено, что модельная псевдомонада колонизирует корни проростков рапса, образуя волокноподобные колонии вдоль клеток эпидермиса и формируя биоплёнку. Колонизация проходит неоднородно: плотность колоний P. fluorescens SBW25 в зоне семени наибольшая и уменьшается в направлении кончика корня корешка проростка.

Метод плёнок обрастания вместе с классическими микробиологическими и современными молекулярно-генетическими методами был применён для исследования естественной эндофитной популяции растений бамбука родов Phyllostachys и Fragresia. Показано, что состав эндофитов подземной части бамбуков более разнообразный, чем в надземной части. В верхней части стебля, которая представлена молодыми тканями, обнаружены бактерии в LNA-форме. Микрофлора эндосферы бамбуков, которые культивировались в субстрате для роста растений, оказалась более разнообразной, чем в условиях in vitro. Среди микрофлоры надземной части бамбуков обнаружены грамположительные микроорганизмы семейств Bacillaceae і Mycobacteriaceae и некультурабельные микроорганизмы, в то время как среди микрофлоры подземной части найдены грамположительные и грамотрицательные бактерии. У бамбуков, которые росли в условиях in virto, найдены два изолята грамотрицательных бактерий Achromobacter sp. и Acinetobacter сalcoaceticus, которые не были обнаружены в других образцах. В эндосфере бамбука Phyllostachys atrovaginata L. обнаружены гифы грибов, большинство которых ассоциировано с бактериями.

Впервые исследованы эндофитные микроорганизмы бамбука родов Phyllostachys и Fragresia. Определено 18 видов эндофитных бактерий. Впервые среди эндофитов бамбука определены Achromobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium/Rhizobium sp., Bacillus amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. subtilis, Microbacterium laevaniformans, Mycobacterium arosiense, M. avium complex, M. lentiflavum, M. palustre, Paenibacillus chondroitinus, Pseudomonas fluorescens, P. fuscovaginae

Ключевые слова: растительно-микробные взаимоотношения, ризосфера, эндофиты, плёнка обрастания, методы, биоплёнка, P. fluorescens, бамбуки

Moshynets O. V. The structure of the plant-microbial associations in the phytosphere of some plants belonging to the Brassica, Phyllostachys and Fragresia genera. - Manuscript.

The thesis for the Ph. D. Degree (biology) in speciality 03.00.11 - Cytology, Cell Biology, Histology. - Institute of Food Biotechnology and Genomics of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2011.

The thesis is devoted to the study of the structural features of plant-bacterial associations which occur in the phytosphere of both rapeseed Brassica napus L. and bamboo plants belonging to the Phyllostachys and Fragresia genera, respectively. The PET (polyethylene terephtalate) plastic film sampling method was developed for the comprehensive study of the phytosphere of these model plants.

The PET film sampling method was initially proposed as a development of Cholodny's buried slide method for the in situ examination of microbial and plant-microbial associations in soil. PET films proved to be an adequate substrate, allowing microorganisms to overgrow the surface, and retain plant-microbial associations; this method could also be combined with a battery of other techniques including microscopy and tomography, as well as molecular analyses.

The phytosphere of B. napus L. as a niche for the model rhizosphere bacterium Pseudomonas fluorescens SBW25, was studied using both the PET film sampling method and classical techniques. The colonization of the phyllosphere of rapeseed plants with SBW25 was investigated under different relative humidity levels. Dispersed bacterial colonization was observed at 100% humidity, while bacterial aggregates along leaf veins and near stomata were seen at ambient (~32%) humidity level. An interconnection between the endosphere and phyllosphere was shown. The dynamics and character of the colonization of rapeseed seedlings by SBW25 was also studied. Fiber-like bacterial colonies assembled in biofilms were observed along the epidermal cells of roots. This colonization pattern was heterogeneous with the highest bacterial density found in the seed zone and decreasing densities found towards the root tip.

The same PET film sampling methodology was applied to the study of a natural endophytic population of bamboo plants belonging to the Phyllostachys and Fragresia genera. Underground endophytes were more diverse than the aboveground endophytes. Low nucleic acid (LNA)-content bacteria were detected in the upper part of bamboo columns. Endophytic populations of plants grown in an artificial soil substrate were more diverse than those form in vitro agar-grown plants. Gram-positive bacteria of the Bacillaceae and Mycobacteriaceae families, as well as a variety of unculturable bacteria, were detected in the aboveground samples, while both gram-positive and gram-negative bacteria were found in the underground samples. Achromobacter sp. and Acinetobacter сalcoaceticus were also isolated from in vitro grown plants. In total, 18 endophytic bacterial species identified from bamboos. For some bacteria, including Achromobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium/Rhizobium sp., Bacillus amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. subtilis, Microbacterium laevaniformans, Mycobacterium arosiense, M. avium complex, M. lentiflavum, M. palustre, Paenibacillus chondroitinus, Pseudomonas fluorescens, P. fuscovaginae, this is the first report of their isolation as bamboo endophytes. Finally, fungal hyphae were found in the endosphere of Phyllostachys atrovaginata L. and were frequently associated with bacteria cells.

Key words: plant-microbial interactions; rhizosphere, endophytes, plastic film sampling method, methods, biofilm, P. fluorescens, bamboo

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Рослини та мікроорганізми співіснують впродовж усього життєвого циклу в особливій, неоднорідній екологічній ніші - фітосфері. Фітосферу умовно поділяють на ризосферу - зону впливу кореневої частини рослини на субстрат, ендосферу - тканини рослини, та філосферу - сукупність всіх надземних поверхонь рослини [van Peer et al., 1990].

Мікроорганізми, асоційовані з рослиною, можуть бути шкідливими, нейтральними або корисними, впливати на процеси росту та розвитку, стійкість до негативних впливів довкілля, тощо [van Overbeek., van Elsas, 1995]. Корисні бактерії, які колонізують фітосферу, мають тісний структурний та функціональний зв'язок із рослиною, вони є предметом багатьох мікробіологічних і біотехнологічних досліджень. Їх використовують як препарати, які покращують процеси живлення рослин, як біопротектори у боротьбі з фітопатогенами, а також з метою фіторемедіації забруднених ґрунтів [Sturz et al., 2000; Compant, 2009]. Встановлено, що вплив бактерій на рослини в лабораторних умовах відрізняється від впливу в умовах відкритого ґрунту. Таке явище пояснюють недостатньою колонізацією мікроорганізмами ризосфери, що зумовлено низькою конкурентоспроможністю лабораторних культур [Lugtenberg et al., 2001].

Рослини та мікроорганізми співіснують в умовах особливих хімічних, фізичних та біологічних просторових взаємодій, що значно ускладнює їх вивчення. Класичні методи лабораторного культивування на штучних поживних середовищах з наступним мікроскопічним аналізом, фізіологічне інкубування та молекулярно-генетичний аналіз, що активно впроваджується останніми роками, не дають повної інформації про реальну просторову структуру таких взаємодій через те, що є досить руйнівними [Copley, 2000]. Через таку складність мікробно-рослинних взаємовідносин і значне генетичне різноманіття мікроорганізмів та відсутність універсальних методичних підходів неруйнівного аналізу особливості організації та функціонування мікробних ценозів у фітосфері залишаються практично недослідженими [Copley, 2000; Buckley, Schmidt, 2003]. Тому метою нашої роботи було вивчення особливостей структури асоціації рослин із мікроорганізмами у фітосферах модельних рослин за допомогою як класичних аналітичних методів, так і з використанням запропонованого методу плівок обростання, який є модифікацією методу скелець обростання М.Г. Холодного [Cholodny, 1930; Cholodny, 1934]. Метод плівок обростання базується на інтеграції структурного, цитохімічного та молекулярного аналізів мікробно-рослинних систем в умовах, максимально наближених до умов екологічної ніші [Кордюм та ін., 2008, Мошинец и др., 2011, Moshynets et al., 2011; патент на винахід №84948 "Основа субстрату для відтворення екологічних систем"].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України в рамках науково-дослідної роботи за грантом Державного космічного агентства України "Стабільність ризосферних та ендофітних бактерій, асоційованих з рослиною Arabidopsis thaliana L. Heynh, під впливом факторів космічного польоту" (номер державної реєстрації 0108U004089) та за грантом МОН "Вивчення корелятивних зв'язків між архітектурою мікроценозів та врожайністю аграрних рослин" (номер державної реєстрації 0109U005899).

Мета та завдання дослідження. Головною метою роботи було дослідити рослинно-мікробні системи у фітосферах ріпаку Brassica napus L. та бамбуків родів Phyllostachys і Fragresia, проаналізувати зв'язок між екологічними мікронішами фітосфери та вивчити характер колонізації ендосфери ендофітними мікроорганізмами.

Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:

1. модифікувати метод скелець обростання М.Г. Холодного для прямого неруйнівного дослідження рослинно-мікробних взаємовідносин in situ;

2. дослідити можливості застосування методу плівок обростання для структурно-функціонального аналізу рослинно-мікробних ценозів;

3. вивчити зв'язок між ризо-, ендо- та філосферами ріпаку Brassica napus L. - екологічними мікронішами для бактерій Pseudomonas fluorescens SBW25 із застосуванням класичних підходів і методу плівок обростання;

4. дослідити склад ендофітів бамбуків родів Phyllostachys і Fragresia;

5. дослідити архітектуру ендофітних ценозів бамбуку Phyllostachys atrovaginata L. за допомогою методу плівок обростання.

Об'єкт досліджень: фітосфери ріпаку Brassica napus L. і бамбуків родів Phyllostachys і Fragresia, рослинно-мікробні системи.

Предмет досліджень: взаємозв'язок між ризосферою, ендосферою й філосферою ріпаку; ендофітні мікроорганізми бамбуку.

Методи дослідження: для культивування мікроорганізмів використовували метод культивування на агаризованих і рідких поживних середовищах. Для структурного дослідження архітектури рослинно-мікробних взаємовідносин використовували скануючу електронну мікроскопію (СЕМ), а для структурно-цитохімічного аналізу - метод конфокальної лазерної скануючої мікроскопії (КЛСМ). Структурний аналіз субстрату проводився методом мікрофокусної рентгенівської комп'ютерної томографії (мкКТ). Для визначення видової належності ендофітів бамбуку використовували комплекс молекулярно-генетичних методів: виділення ДНК, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), визначення нуклеотидної послідовності генів рРНК. Для аналізу властивостей поліетилентерефталатної (ПЕТ) поверхні використовували метод спектрофотометрії та метод вимірювання поверхневого натягу.

Наукова новизна одержаних результатів. Для аналізу рослинно-мікробних взаємовідносин in situ на структурному, цитохімічному та молекулярному рівнях розроблено, досліджено та застосовано в експерименті нову модифікацію методу скелець обростання М.Г. Холодного, що базується на використанні поліетилентерефталатних (ПЕТ) плівок як носіїв, на поверхні яких формуються рослинно-мікробні асоціації в умовах ніші.

Вперше завдяки методу плівок обростання встановлено, що Pseudomonas fluorescens SBW25 проявляє високу конкурентну спроможність у перебігу колонізації ризоплану та близьких до ризосфери ріпаку ділянок. Вперше досліджено характер колонізації філосфери та ендосфери ріпаку штамом P. fluorescens SBW25 у різних умовах; встановлено, що бактерії P. fluorescens SBW25 здатні до колонізації ендосфери ріпаку. Встановлено, що клітини P. fluorescens SBW25 колонізують корінці проростків ріпаку, утворюючи волокноподібні колонії вздовж епідермальних клітин і формуючи біоплівки. Колонізація проходить неоднорідно: щільність колоній P. fluorescens SBW25 у зоні насінини найвища й зменшується в напрямку кінчика корінця проростку. Встановлено, що при 100% вологості повітря колонізація поверхні листка носить дисперсний характер, тоді як в умовах кімнатної вологості бактерії скупчуються у зонах продихів та вздовж прожилок.

Вперше досліджено ендофітні мікроорганізми бамбуку родів Phyllostachys і Fragresia. Визначено 18 видів ендофітних бактерій бамбуків. Вперше як ендофіти бамбуків встановлені Achromobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Agrobacterium/Rhizobium sp., Bacillus amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. subtilis, Microbacterium laevaniformans, Mycobacterium arosiense, M. avium complex, M. lentiflavum, M. palustre, Paenibacillus chondroitinus, Pseudomonas fluorescens, P. fuscovaginae. Встановлено, що мікробіота ендосфери підземної частини бамбуків більш різноманітна, ніж мікробіота ендосфери надземної частини. У верхній частині стебла (молодих тканинах) знайдені бактерії в LNA-формі. Мікробіота ендосфери бамбуків, які культивувались в грунтосубстраті, більш різноманітна, ніж в умовах in vitrо. Визначено, що мікробіота надземної частини бамбуків представлена грампозитивними мікроорганізмами родин Bacillaceae і Mycobacteriaceae і некультурабельними мікроорганізмами, в той час як мікробіота підземної частини бамбуків містила грампозитивні й грамнегативні бактерії. У бамбуків, які росли в умовах in vitro, знайдені два ізоляти грамнегативних бактерій - Achromobacter sp. і Acinetobacter сalcoaceticus, які не було виявлено в інших зразках.

Вперше, за допомогою методу плівок обростання, досліджено структуру ендофітних асоціацій рослин бамбуків роду Phyllostachys, виявлені зони внутрішньотканинної локалізації колоній ендофітів.

Практичне значення одержаних результатів. Метод плівок обростання забезпечує неруйнівне інтегроване вивчення рослинно-мікробних систем in situ. Особливість методу полягає у максимальній наближеності характеристик поверхні пластикової плівки, на якій формуються рослинно-мікробні контакти, до граничних поверхонь мікрокосма за умов інкубації плівок в цьому мікрокосмі протягом певного періоду. Це дозволяє вивчати у неруйнівний спосіб структуру рослинно-мікробних систем із одночасним використанням комплексу методик: цитохімії in situ, скануючої електронної мікроскопії, молекулярно-генетичного аналізу. За результатами досліджень отримано патент на винахід №84948 "Основа субстрату для відтворення екологічних систем" (зареєстровано в Державному реєстрі патентів України на винаходи 10.12.2008).

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою здобувача. Дисертантом знайдено та проаналізовано наукову літературу з досліджуваної проблеми, оброблені та проаналізовані отримані результати. Автором особисто проведені досліди з вивчення біологічних властивостей ПЕТ поверхні, здійснена інтродукція та фіксація ПЕТ плівок в ендосфері бамбуку та ризосфері ріпаку, проведені дослідження з використанням методу СЕМ. Аналіз видового складу ендофітів бамбуку проводився спільно з доктором Гіртом Потерсом (кафедра біотехнології, університет міста Антверпен, Бельгія). Модифікація і проведення цитохімічних досліджень in situ здійснювались у співробітництві із старшим науковим співробітником відділу регуляторних механізмів клітин Інституту молекулярної біології і генетики НАН України к.б.н. Шпильовою С.П. на базі Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. МкКТ проводилась разом з доктором Ендрю Спайрсом на базі SIMBIOS центру університету Абертой Данді (Данді, Великобританія). Одержані результати викладені у спільних наукових публікаціях.

Планування основних напрямків роботи та обговорення її результатів проводилось разом з науковим керівником д.б.н., проф. Косаківською І. В. та зав. відділом регуляторних механізмів клітин Інституту молекулярної біології і генетики НАН України д.б.н., чл.-кор. НАН України Кордюмом В.А.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і були представлені на XII конференції Українського ботанічного товариства (Одеса, Україна, 2006); XII Українській конференції по космічним дослідженням (Євпаторія, Україна, 2006); конференції "Мікробні біотехнології" (Одеса, Україна, 2006); "Першому всеукраїнському з'їзді екологів" (Вінниця, Україна, 2006); 4-й школі-семінарі для молодих вчених "Наукові космічні дослідження" (Євпаторія, Україна, 2006); конференції "Актуальні проблеми ботаніки, екології та біотехнології" (Київ, Україна, 2006); III міжнародній студентській конференції "Молодь та поступ в біології" (Львів, Україна, 2007); III міжнародній молодіжній конференції: "Біорізноманіття. Екологія. Адаптація. Еволюція" (Одеса, Україна, 2007); ІХ симпозіумі "Bacterial Genetics and Ecology" (Вернігероде, Німеччина); 2-му конгресі клітинної біології (Київ, Україна, 2007); 10-й щорічній міжнародній конференції "Людина та Космос" (Дніпропетровськ, Україна, 2008); XVI конгресі федерації європейських товариств рослинної біології (Тампере, Фінляндія, 2008); першій міжнародній конференції молодих науковців "Фундаментальні та прикладні дослідження в біології" (Донецьк, Україна, 2009); третій конференції молодих науковців "dedicated to Charles Darwin's 200th Birthday and the 150th Anniversary of the publication of his main book "On the Origin of Species by Means of Natural Selection, or the Preservation of Favoured Races in the Struggle for Life" (Київ, Україна, 2009); четвертій конференції польського товариства експериментальної біології рослин "Experimental Plant Biology. Why not?!" (Краків, Польща, 2009); XVII конгресі федерації європейських товариств рослинної біології (Валенсія, Іспанія, 2010).

Публікації. Результати досліджень за темою дисертаційної роботи викладено у 22 наукових працях, у тому числі 13 статтях у фахових виданнях, 22 тезах у збірниках тез, 1 патенті на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел, який містить 406 найменувань. Робота викладена на 169 сторінках, містить 6 таблиць та 41 рисунок.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень

Модельними об'єктами досліджень були рослини ріпаку (Brassica napus L.) і бамбуків (Phyllostachys humilis, P. atrovaginata, Р. nigra і Fargesia rufa). Використовували рослини, що було отримано в умовах in vitro та в умовах культивування у спеціальній ґрунтосуміші.

Мікроорганізми, що використані у роботі. Штам бактерій Pseudomonas fluorescens SBW25, який було отримано з колекції Рейні П. та Бейлі М. [Rainey, Bailey, 1996]. Мутантний штам P. fluorescens SBW25 WS (P. fluorescens SBW25 wspF S301R) було отримано з колекції Е. Спайрса, цей штам здатен до утворення зморшкуватої (WS) біоплівки на межі рідина-повітря, яка містить міцний целюлозний матрикс. Генетичну модифікацію цього штаму P. fluorescens SBW25 WS-GFP (P. fluorescens SBW25 WS::miniTn7(Gm)PAI/04/03 gfp.ASV-a), клітини якого мали ген зеленого флуоресціюючого білку та були здатні до флуоресценції, мутантний штам P. fluorescens SBW25 ViscA, що не здатен до продукції біосурфактанту віскозину [Nelson et al., 2002], та ще один бактеріальний штам - P. putida KT2440 [De Brujin et al., 2007; Nelson et al., 2002] було отримано з колекції Е. Спайрса. Також використані культури ендофітних бактерій, які були отримані в процесі дослідження.

Методи дослідження. Культивування рослин ріпаку із насіння з простерилізованою поверхнею, інокульованого модельними бактеріями, проводилось як в умовах стерильних камер на мінеральному субстраті - цеоліті, так і в умовах ґрунту. Рослини бамбуків отримували шляхом мікророзмноження. Використовували культивовані in vitro рослини й рослини, які після культивування in vitro були пересаджені в спеціальний субстрат, де росли у відкритих умовах ботанічного саду протягом шести місяців. Мікроорганізми культивували на штучному рідкому або агаризованому поживних середовищах Кінгс Б (KВ). Ендофітні мікроорганізми бамбуків культивували на рідкому або агаризованому колумбійському бульйоні і глюкозному середовищі. Для оцінки рівня бактеріального прикріплення і відкріплення від ПЕТ поверхні, а також кількості адсорбованих до поверхні ПЕТ плівки речовин за умов культивування плівки в суспензії бактерій або в мікрокосмі, використовували забарвлення адсорбованих до плівки бактерій і речовин розчином кристалічного фіолетового з подальшим відмиванням залишків барвнику і елююванням барвнику спиртом та вимірювання концентрації барвника спектрофотометрично.

ПЕТ (поліетилентерефталат) плівку, що використовувалась в роботі, було виготовлено підприємством "ПЛЮС" ЛТД в м. Шостка Сумської області по ТУ У 14023884.001-99. Плівки виготовляли з поліетилентерефталату марки ПЕТФ 8200 "Белпак" (ТУ РБ 01552-001-95) харчового призначення.

Мікроскопічні дослідження зразків біоплівок і сформованих рослинно-мікробних асоціацій проводили із використанням світлової мікроскопічної техніки BIOLAR (PZO, Польща) і МИКМЕД-2 (LOMO, Росія), конфокального лазерного скануючого мікроскопу ZEISS AXIOSCOP-2 Plus (ZEISS, США) із програмним забезпеченням LSM 5 PASCAL (ZEISS, США) і скануючої електронної мікроскопії на мікроскопах Jeol JSM 35C і Jeol JSM 6060LA (Jeol, Японія).

Структурний аналіз субстрату проводився методом мікрофокусної рентгенівської комп'ютерної томографії на томографі Nokon Metrology (Nikon Metrology micro-focus X-ray computed tomography, Японія). Радіограми реконструювали в тривимірну модель за допомогою комп'ютерної програми CTAgent/CTPro (Nikon), після обробки якою дані вносили до програми VGStudio Max для перевірки й переформатування зображення до JPEG файлів.

Молекулярно-генетичні дослідження модельних об'єктів і ендофітних популяцій рослин бамбуків виконувалися комплексом методів. Виділення і депротеінізацію сумарної ДНК із тканин бамбуків проводили за методом [Khanuja et al., 1999]. Екстракцію ДНК із клітин бактерій проводили у лужному буфері за методом [Sambrook et al., 1989]. Ампліфікацію rrs генів бактерій із тотальної ДНК проводили із використанням універсальних праймерів, прямого 25f (5'-AAC TKA AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3') і зворотного 1492r (5'-TAC GGY ТАС СТТ GTT ACG ACT T-3 ') [Han et al., 2009]. ПЛР проводили із використанням набору для ПЛР (Roche, Німеччина) на програмованому ампліфікаторі "LKB-Gene ATAQ Controller" ("GE Healthcare"). Ампліфікацію rrs генів із тотальної бактеріальної ДНК, виділеної з клітин P. fluorescens SBW25 і P. putida KT2440, проводили з допомогою універсальних праймерів, прямого uni-for (5'-TGC CAG CAG CCG CGG TA-3') і зворотного uni-rev (5'-GAC GGG CGG TGT GTA CAA-3') [Altschul et al., 1990], та Тaq PCR Kit with Controls (New England Biolabs, Великобританія) на програмованому ампліфікаторі G-STORM GS1 (Gene Technologies Ltd., Великобританія). Клонування продуктів ПЛР проводили з використанням pGEM T ® Easy вектору (Promega, USA). Виділення плазмідної ДНК здійснювали з використанням набору для виділення плазмідної ДНК (Roche, Німеччина). Визначення нуклеотидної послідовності ПЛР продуктів проводили з використанням специфічних праймерів Т 7 (5'-ТАА TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 ') і SP6 (5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3') з використанням секвенатора Applied Biosystems 3730 (США). Аналіз нуклеотидної послідовності rrs фрагментів проводили за допомогою BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) і бази даних NCBI (США) [Altschul et al., 1990].

Статистично-математична обробка результатів досліджень. Досліди проводили у восьмиразовому повторі. Дані опрацьовували за допомогою програмного пакету Oneway Anova, визначаючи середнє арифметичне, стандартну похибку. Достовірність різниці між варіантами оцінювали за критерієм Стюдента, використовуючи 5% рівень значущості. Дані представлені з урахування стандартної похибки. Різниця між значеннями була проаналізована з використанням Т-тесту за розподіленням Стюдента.

Результати досліджень та їх обговорення

Модифікація методу скелець обростання М.Г. Холодного для дослідження мікроценозів на рівні мікроніші. У нашій роботі метод скелець обростання М.Г. Холодного [Cholodny, 1933] було модифіковано шляхом заміни скла біосумісним полімером - поліетилентерефталатом (ПЕТ). Це термостабільний, пластичний, міцний полімер, прозорий і нетоксичний. Тонкі (до 0,5 см) і невеликі (до 1 см) за розміром плівки за умов вертикального (за вектором зволоження) занурення й щільного прилягання до ґрунтових часточок вдало комбінуються з поровою структурою ґрунту, не порушуючи його водний і газовий режими. Перевагою ПЕТ є його відносна проникність для молекул газів, зокрема, кисню й вуглекислого газу. Саме ці характеристики нового альтернативного носія для прямого формування рослинно-мікробних асоціацій спонукали нас до подальшого аналізу його властивостей.

Прикріплення є початковою стадією у формуванні біоплівки, мікрообростанні поверхні. Було проаналізовано здатність модельних бактерій - псевдомонад P. putida KT2440 до прикріплення та відкріплення від ПЕТ плівок. Для дослідження ефективності колонізації ПЕТ плівок бактерією P. putida КТ 2440 за різних умов було обрано три типи речовини для суспендування, а саме: натрій-фосфатний буфер (рис. 1, А), супернатант (рис. 1, Б), отриманий після культивування бактерій у рідкому середовищі КВ впродовж 12 годин, та стерильне поживне середовище КВ (рис. 1, В).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Прикріплення клітин P. putida КТ 2440, ресуспендованих у натрій-фосфатному буфері (А), супернатанті (Б), поживному середовищі КВ (В) до поверхні ПЕТ плівки. Контроль - натрій-фосфатний буфер (А), супернатант (Б), поживне середовище КВ (В).

Було виявлено, що в натрій-фосфатному буфері найбільш активно прикріплення відбувалося в першу й третю годину, тоді як на другій і четвертій годині інкубації мало місце відкріплення клітин бактерій. Аналогічна хвилеподібна динаміка прикріплення спостерігалася в умовах супернатанту, і з трохи меншими амплітудами в умовах поживного середовища КВ. Такий характер прикріплення бактерій P. putida КТ 2440 до ПЕТ плівок можна пояснити тим, що серед факторів, які впливають на початкові етапи колонізації поверхні (присутність біосурфоктантів, наявність і концентрація поживних речовин, гідродинамічні умови й інше) найменше значення має рельєф поверхні [Jansen, Kohnen, 1995; BoulangeЁ-Petermann et al., 1997; Bos et al., 1999]. Хвилеподібна динаміка прикріплення, яку ми спостерігали в трьох випадках, свідчить про те, що первинні етапи колонізації "голих" поверхонь, які не мають первинного шару, є зворотними. Колонізація тільки із часом набуває незворотного характеру завдяки секреції екзополімерів [Bos et al., 1999].

Ми дослідили площу прикріплення бактерій до плівки і з'ясували, що бактерії прикріплюються на всій поверхні взаємодії суспензії бактерій із ПЕТ (рис. 2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Два шматочки плівки, розміром 1 см 2 після інкубації на їхніх поверхнях впродовж 4 годин 1 см 3 натрій-фосфатного буферу (ліворуч) і суспензії P. putida КТ 2440 (праворуч). Забарвлення кристалічним фіолетовим.

Для вивчення впливу компонентів навколишнього середоваща на здатність бактерій до прикріплення ми дослідили ефективність колонізації ПЕТ плівок бактеріями P. putida КТ 2440 і P. fluorescens SBW25 після преінкубації цих плівок у натрій-фосфатному буфері й поживному середовищі КВ (рис. 3) і в культуральних рідинах штамів P. fluorescens SBW25 та P. fluorescens SBW25 ViscA (рис.4).

Рис. 3. Прикріплення клітин P. fluorescens SBW25, ресуспендованих у натрій-фосфатному буфері, до чистої поверхні ПЕТ плівки (1), до ПЕТ плівки, преінкубованої в поживному середовищі КВ (3) й у натрій-фосфатному буфері (5). Контролі: преінкубація плівок у поживному розчині КВ (2) і натрій-фосфатному буфері (4).

Рис. 4. Прикріплення клітин P. fluorescens SBW25, ресуспендованих у натрій-фосфатному буфері, до поверхні ПЕТ плівки, преінкубованої в культуральних рідинах штамів P. fluorescens SBW25 (2) та P. fluorescens SBW25 ViscA (4). Контролі: преінкубація плівок у супернатанті P. fluorescens SBW25 (1) та P. fluorescens SBW25 ViscA (3).

Преінкубація плівки в поживному середовищі КВ і натрій-фосфатному буфері суттєво не впливала на прикріплення бактерій. Таким чином, буфер (рН 7,4) і поживне середовище фактично не змінюють поверхневі властивості ПЕТ плівки. Подібний ефект спостерігався після інкубації ПЕТ плівок у фільтраті культуральної рідині P. fluorescens SBW25. Преінкубація в культуральній рідині мутантного штаму P. fluorescens SBW25 ViscA, що не здатен продукувати сурфактант віскозин, впливала на здатність бактерій до прикріплення: взаємодія окремих компонентів супернатанту з поверхнею плівки сприяла більш ефективному прикріпленню бактерій. Віскозин, напроти, при взаємодії з ПЕТ поверхнею, призводив до зниження прикріплювальної активності бактерій.

В умовах ґрунту на природних і штучних поверхнях формування підготовчого шару забезпечується самим субстратом, а саме ґрунтовим розчином. Тому для моделювання умов екологічної мікроніші ми застосували стерильну ґрунтову водну витяжку як джерело утворювачів підготовчого шару. Для бактерій P. putida КТ 2440 було виявлено вдвічі вищу спорідненість до ПЕТ поверхні, що інкубувалася в стерильній ґрунтовій витяжці протягом трьох діб, внаслідок чого мала відповідний тридобовий підготовчий шар, ніж до чистої ПЕТ поверхні (рис. 5). Експериментальний підготовчий шар, сформований в умовах ґрунтової витяжки, є аналогічним шару, який формується на граничних поверхнях у ґрунті завдяки адсорбції. Тому процес формування підготовчого шару на ПЕТ плівці, яка знаходиться в ґрунті, є цілком природнім. До складу такого підготовчого шару входять солі, глини й органічні залишки, які модифікують властивості ПЕТ поверхні, створюючи сприятливі умови для прикріплення бактерій.

Рис. 5. Прикріплення клітин P. putida КТ 2440, ресуспендованих у натрій-фосфатному буфері, до поверхні чистої плівки (2), та плівки, преінкубованої в стерильній ґрунтовій водній витяжці (4). Контролі: чиста плівка (1) і плівка із триденним підготовчим шаром, сформованим в умовах ґрунтової водної витяжки (3).

Таким чином, було встановлено, що на ПЕТ поверхні в ґрунті формується підготовчий шар. Утворення підготовчого шару разом із процесом прямого прикріплення бактерій до ПЕТ поверхні розглядається як перший етап колонізації (обростання поверхні мікроорганізмами). Сформований підготовчий шар створює умови для колонізації ґрунтовими мікроорганізмами ПЕТ поверхні. Прикріплення мікроорганізмів безпосередньо до ПЕТ поверхні також є етапом процесу мікрообростання поверхонь, але динаміка прикріплення мікроорганізмів до чистої ПЕТ поверхні не є лінійною, а сам процес колонізації чистої ПЕТ поверхні потребує більше часу. Встановлено, що бактерії, які відкріплялися від ПЕТ плівки при струшуванні в натрій-фосфатному буфері, зберігали життєздатність й утворювали колонії на агаризованому середовищі КВ. Бактерії, які залишалися прикріпленими до ПЕТ поверхні, також культивувались на штучному поживному середовищі.

З метою вивчення можливості формування WS біоплівки в умовах рідкої бактеріальної культури, ПЕТ плівки були розміщені в поживному середовищі, до якого внесли інокулят (культуру P. fluorescens SBW25 WS-GFP, марковану зеленим флуоресціюючим білком GFP). Через 3 дні ми спостерігали утворення WS-біоплівки на поверхні розділу рідина-повітря. Біоплівка знаходилася на поверхні рідини та була прикріплена як до скляних стінок посуду, так і до поверхні ПЕТ плівки. Біоплівка, сформована бактеріями на ПЕТ поверхні в зоні розділу повітряного та рідкого середовищ, досліджувалась на методом КЛСМ (рис. 6, А) та СЕМ (рис. 6, Б). Було встановлено, що на ПЕТ поверхні плівок утворювалась повноцінна WS-GFP біоплівка.

Таким чином, ПЕТ не пригнічував ріст клітин бактерії й не перешкоджав процесу прямого обростання.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Фрагмент біоплівки P. fluorescens SBW25 WS-GFP, сформованої на ПЕТ плівці в зоні розподілу фаз рідина-повітря в результаті тридобового культи-вування клітин P. fluorescens SBW25 WS-GFP у статичному поживному середовищі КВ. А. КЛСМ: зелений колір мають активні P. fluorescens SBW25 WS-GFP клітини; червоний - А Б неактивні й мертві клітини, пофарбовані етідіум бромідом; синій - філаменти целюлозного матриксу, пофарбовані калькофлуором, КЛСМ. Масштаб: 100 мкм; Б. СЕМ: масштаб: 10 мкм.

Рис. 7. Ризосферні мікроценози ріпаку на ПЕТ плівці. Комбінація природної флуоресценції і забарвлення акридін оранжевим і хьокстом, КЛСМ. Масштаб: 10 мкм.

Для підтвердження явища колонізації ПЕТ плівок резидентними мікроорганізмами ґрунту ми дослідили можливість культивування прикріплених до ПЕТ плівок клітин, і кількість КУО (колоній утворюючих одиниць). При культивуванні на агаризованому середовищі КВ ПЕТ плівок, які знаходились у стерильному ґрунті, інокульованому P.fluorescens SBW25, впродовж трьох тижнів, ми отримали колонії Pseudomonas spp. З 1 граму ґрунту було отримано 7 х 106 КУО. З ПЕТ плівки розміром 1 см 2 було отримано 1-2 х 106 КУО. Бактерії Pseudomonas spp. були отримані також при культивуванні ПЕТ плівки (1-2 мм завширшки й довжиною в декілька см) у КВ агарі. Колонізація ПЕТ плівок, які знаходились в ризосфері ріпаку впродовж 3-4 тижнів, ґрунтовими й ризосферними мікроорганізмами вивчалась методом КЛСМ (рис. 7).

З метою візуалізації комплексу просторових контактних взаємодій компонентів еконіші, у якій знаходиться ПЕТ плівка, з поверхнею плівки in situ (без порушення екосистеми), а також для випробовування системи неруйнівного контрою над розташуванням ПЕТ плівки відносно компонентів еконіші, був застосований метод рентгенівської мікрофокусної комп'ютерної томографії. Цей метод структурного аналізу дозволяє отримати просторове відтворення системи у неруйнівний спосіб і проаналізувати щільність її компонентів (рис. 8).

Рис. 8. Рентгенівська мікро-фокусна комп'ютерна томографія зрізу ґрунту. Показано зріз ґрунтової системи, яка містить ПЕТ плівку, у градація сірого кольору (зверху) та у негативному зображені (знизу). На верхньому малюнку більш темний колір відповідає більшій радіаційній щільності та навпаки на нижньому. Масштаб: 1 см.

Наступне завдання поля гал о у вивченні можливості застосування молекулярно-генетичних підходів для аналізу зразків мікробного ценозу на ПЕТ плівці. Оскільки кількість мікроорганізмів на 1 см 2 плівки не є достатньою для виділення й очищення ДНК стандартними методами, ми реалізували альтернативний спосіб підготовки зразку до ПЛР, а саме, провели додаткову п'ятихвилинну інкубацію плівок у буфері для ПЛР. Для проведення ПЛР було обрано штам P. putida КТ 2440, представлений грам-негативними мікроорганізмами з тонкою клітинною стінкою, що сприяє її швидкому руйнуванню й виходу ДНК у розчин.

Для ПЛР використовували праймери до rrs генів усіх прокаріот (Uni for і Uni rev.) Було отримано позитивний результат для всіх досліджуваних зразків: адсорбованих на плівці живих (рис. 9, 3), зневоднених (рис. 9, 4) і фіксованих у формаліні бактерій (рис. 9, 5).

1 2 3 4 5

Рис. 9. Результати прямої ПЛР зі зразками ДНК бактерії P. putida KT2440: 1 - контроль (чиста ДНК із клітин P. putida KT2440); 2 - стерильна ПЕТ плівка; 3 - ДНК прикріплених до ПЕТ плівки бактерій; 4 - ДНК прикріплених до ПЕТ плівки після зневоднення бактерій; 5 - ДНК прикріплених до ПЕТ плівки бактерій після фіксації у формаліні.

Таким чином, метод плівок обростання є адекватним методом прямого дослідження природних мікробних і рослинно-мікробних систем, що дозволяє дослідження у неруйнівний спосіб із використанням комбінації сучасних методів, в тому числі різні типи мікроскопії, цитохімічного аналізу та молекулярно-генетичні методи.

Фітосфера як екологічна ніша взаємодії бактерії P. fluorescens SBW25 із рослинами B.napus L. Для дослідження ризосфери B. napus L. як екологічної ніші для P. fluorescens SBW25 були використані проростки ріпаку, отримані в стерильній герметичній камері з насіння із простерилізованими поверхнями, які інокулювалися модельною бактерією P. fluorescens SBW25 WS-GFP, яка містила ген зеленого флуоресцентного білку, що дозволило спостерігати розташування бактерій безпосередньо під мікроскопом. Через три доби після початку експерименту декілька проростків ріпаку були відібрані для мікроскопічного аналізу. На третій день розвитку проростків поверхню корінця досліджували на КЛСМ без фіксації. Було встановлено, що на першому етапі відбулося стабільне, незворотне прикріплення окремих бактеріальних клітин до поверхні кореня і утворення волокноподібних колоній. Такі колонії частіше локалізувались вздовж ліній контакту епідермальних клітин. В окремих зонах бактерії утворювали нещільні скупчення, де морфологічно можна було розрізнити окремі клітини бактерій (рис. 10).

Рис. 10. Колонізація ризоплану триденного проростка ріпаку бактерією P. fluorescens SBW25 WS-GFP. КЛСМ. Масштаб: 20 мкм.

На сьомий день культивування в замкненій системі рослин ріпаку, інокульованих бактеріямиї P. fluorescens SBW25 WS-GFP, поверхні окремих ризодермальних клітин повністю були вкриті біоплівкою, утвореною бактеріями P.fluorescens SBW25 WS-GFP, у той час як в деяких зонах зберігався волокноподібний ріст (рис. 11).

Рис. 11. Колонізація ризоплану семиденного проростка ріпаку бактерією P. fluorescens SBW25 WS-GFP. КЛСМ. Масштаб: 50 мкм.

Виявлена гетерогенність у розташуванні обумовлена активною й пасивною міграцією бактерій P. fluorescens SBW25 WS-GFP по ризоплану. Вірогідно, що це пов'язано з розбіжністю в швидкостях розмноження бактерій і росту кореня на цьому етапі. Також було виявлено нерівномірне розташування бактерій на ризоплані. Так, більшість бактерій локалізувалась в зоні контакту ризоепідермальних клітин, оскільки саме там утворювалось заглиблення, у якому накопичувалась рідина й поживні речовини. Більш чітко це явище спостерігалось на триденних проростках.

Ефективність колонізації ризосфери бактеріями P. fluorescens SBW25 WS-GFP залежить не лише від їхньої здатності до колонізації ризоплану. Важливе значення відіграє конкурентоспроможність по відношенню до інших представників ґрунтової мікрофлори. Тому, проаналізувавши колонізацію ризосфери ріпаку бактерією P. fluorescens SBW25 WS-GFP і дослідивши характер і динаміку цього процесу за умов відсутності мікроорганізмів - конкурентів, ми провели вивчення просторової архітектури колонізації ризосфери тритижневого ріпаку, вирощеного в ґрунті. Для цього нестерильне насіння було інокульоване суспензією бактерії P. fluorescens SBW25 WS-GFP і висаджене в ґрунт. Для дослідження просторової архітектури колонізації ризосфери ми використовували метод плівок обростання, об'єднавши його з дослідженням на КЛСМ із застосуванням специфічного барвника-реагенту для ДНК (рис. 12).