Порівняльна характеристика структурних компонентів зоо- та фітопатогенних рабдовірусів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

Автореферат

Дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Порівняльна характеристика структурних компонентів зоо- та фітопатогенних рабдовірусів

03.00.06 - Вірусологія

Сабірова Тетяна Юріївна

КИЇВ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Дисертація виконана у відділі проблем інтерферону і імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного.

Науковий керівник: доктор біологічний наук, професор, член-кореспондент НАН України Співак Микола Якович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу проблем інтерферону і імуномодуляторів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Щербатенко Іван Степанович, провідний науковий співробітник відділу фітопатогенних вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Клестова Зинаїда Сергіївна, завідуюча відділу організації та координації науково-дослідницьких робіт Інституту ветеринарної медицини української академії аграрних наук.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Родина Rhabdoviridae об'єднує віруси, які уражають безхребетних, хребетних і рослини, що призводить до важких наслідків для здоров'я людини, агрокультури та екології живої природи [Hogenhout S.A., 2003]. Фіторабдовіруси включають цілий ряд економічно важливих патогенів. Один з них вірус кучерявої карликовості картоплі (ВККК), який є найбільш вивченим рабдовірусом рослин на теренах України, що визнано вірусологами СНД [Тарасевич Л. М., 1987]. Необхідність дослідження зоопатогенних рабдовірусів, які входять до роду Lyssaviruses (вірус сказу ВС) та роду Vesiculoviruses (вірус везикулярного стоматиту ВВС), пояснюється тим, що ці віруси небезпечні для людини, свійських та хижих тварин [Tordo N., 2005].

З огляду на вище сказане, важливим загально-біологічним аспектом вивчення рабдовірусів є порівняльний аналіз властивостей структурних компонентів, в результаті якого отримується інформація про взаємозв'язки між спорідненими вірусами. Дослідження молекулярно-біологічних характеристик зоо- та фітопатогенних рабдовірусів є актуальним як з точки зору фундаментальної науки, стосовно еволюції та походження цих вірусів, так і з практичної точки зору, розробки нового класу діагностикумів для визначення циркулюючих в Україні рабдовірусів.

Новий підхід до створення діагностичних препаратів відкриває виявлене нами явище антигенної спорідненості між структурними білками ВККК, ВВС та ВС. Ґрунтуючись на результатах серологічної спорідненості між фіто- та зоопатогенними рабдовірусами, доцільно дослідити можливість створення тест-системи на основі імуноферментного аналізу для індикації антитіл до ВС. Біотехнологія таких препаратів має неоціненні переваги: безпечність, простота, мінімальні матеріальні витрати у порівнянні з традиційними підходами.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконана згідно планів комплексної теми відділу проблем інтерферону і імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України “Вивчення геноміки та протеоміки мікроорганізмів для створення штамів-пробіотиків, продуцентів лікарських засобів, агробіопрепаратів; дослідження структурно-функціональної організації вірусних геномів та автономних генетичних елементів”, підрозділу “Використання глікопротеїнів зоо- та фіторабдовірусів в якості ініціаторів апоптозу трансформованих клітин тварин”, державний реєстраційний номер 0107U011129 (роки 2007-2011).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є вивчення в порівняльному аспекті структурних компонентів зоо- та фітопатогенних рабдовірусів, на моделі ВВС, ВС та ВККК. Для досягнення поставленої мети виконувалися наступні задачі:

- визначити білковий склад рабдовірусів (ВВС, ВККК);

- визначити жирнокислотний склад зоо- та фітопатогенних рабдовірусів;

- ідентифікувати моносахариди в складі ВВС та ВККК;

- дослідити лектинову активність ВККК та вплив вірусної інфекції на лектинову активність в листях Nicotiana rustica;

- вивчити антигенну спорідненість рабдовірусів ВВС, ВС та ВККК:

- вивчити можливість інактивації in vitro ВВС антитілами до фіторабдовірусу ВККК;

- дослідити можливість використання фіторабдовірусу ВККК для індикації антитіл, специфічних до ВС.

Об'єкт дослідження - зоопатогенні рабдовіруси везикулярного стоматиту і сказу, фітопатогенний рабдовірус кучерявої карликовості картоплі.

Предмет дослідження - структурні компоненти зоо- та фітопатогенних рабдовірусів ВВС, ВС та ВККК.

Методи дослідження - вірусологічні, імунологічні, молекулярно-біологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено антигенна спорідненість між рослинним рабдовірусом ВККК та рабдовірусами, що уражують людину та тварин ВВС та ВС.

В роботі вперше показана здатність антитіл до фіторабдовірусу ВККК і зоопатогенного рабдовірусу ВС нейтралізувати інфекційну активність ВВС in vitro.

Показана можливість використання рабдовірусу ВККК для індикації антитіл, специфічних до ВС, на основі непрямого варіанту імуноферментного аналізу.

В роботі вперше проведено порівняльне вивчення біохімічного складу рабдовірусів тварин та рослин. Визначено жирнокислотний та моносахаридний склад рабдовірусів: ВККК та ВВС. Знайдено унікальні і загальні жирні кислоти та моносахариди в кожному з них.

Практичне значення отриманих результатів. Робота відноситься до галузі фундаментальної вірусології, яка стосується трактування властивостей структурних компонентів зоо- та фітопатогенних рабдовірусів. Одержані дані антигенного споріднення структурних білків ВККК, ВВС та ВС знайдуть застосування в біотехнології, зокрема стосовно одержання імунологічних реагентів (антигенів, специфічних сироваток), і можуть бути використані в серологічних тестах з метою виявлення вірусів з родини Rhabdovіrіdae в різних еукаріотичних об'єктах, що буде сприяти розвитку нових перспективних напрямків у біотехнології, а також доповнить знання з екології та еволюції вірусів.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто у відділі проблем інтерферону і імуномодуляторів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Всі дослідження проведені за безпосередньою участю здобувача. Особисто здобувачем проведено огляд та аналіз джерел наукової літератури за темою дисертації, виконання експериментальних досліджень та інтерпретації їх результатів, формулюванні наукових висновків, статистичну обробку отриманих результатів.

Здобувачем особисто проведено дослідження морфології вірусу кучерявої карликовості картоплі, виділено та напрацьовано препарат вірусу ВККК, проведено дослідження молекулярної маси білків вірусів ВККК та ВВС, отримано антисироватку до ВККК, проведено серологічні дослідження по встановленню антигенної спорідненості білків ВККК, ВВС та ВС, досліджено гемаглютинуючу активність білків ВККК.

У процесі виконання ряду досліджень науково-консультативну допомогу надавали: к.б.н. Л.Ф. Діденко, к.б.н. Н.М. Жолобак, З.М. Олевинська, д.б.н. Л.Д. Варбанець, к.б.н. О.С. Броварська, к.б.н. В.Н. Васильєв (НДІ мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України), к.б.н. Н.І. Грабченко, к.б.н. Л.О. Ганова (АТЗТ НВК “Діапрофмед”), які є співавторами статтей.

Аналіз результатів, їхнє узагальнення й інтерпретацію, підготовку публікацій за результатами досліджень здійснено разом із ст.н.с. к.б.н. Діденко Л.Ф.

Планування головних напрямків роботи, формування основних положень і висновків дисертації здобувачем проведено під керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи д.б.н., чл.-кор. НАНУ, проф. Співака М.Я.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на Х з'їзді товариства мікробіологів України (Одеса, 2004 р.); установчому з'їзді українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.); четвертій міжнародній конференції “Bioresources and viruses” (Київ, 2004 р.); конференції молодих вчених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (Ужгород, 2005 р.); конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2005р.); засіданні товариства мікробіологів України (Київ, 2006 р.); 10-тій Пущинській школі - конференції молодих вчених “Біологія - наука XXI століття” (Росія, Пущино, 2006 р.); міжнародній науковій конференції “Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006 р.); конференції молодих вчених “Медико-біологічні та соціальні проблеми сучасної людини” (Придністров'я, Тирасполь, 2007 р.); міжнародній конференції молодих вчених та студентів “Modern problems of microbiology and biotechnology” (Одеса, 2007 р.); п'ятій міжнародній конференції “Bioresources and viruses” (Київ, 2007 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 статей в фахових наукових журналах та 7 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 150 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 12 таблицями та 25 рисунками, складається із вступу, розділів: огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати досліджень, який включає 2 розділи власних досліджень, узагальнення результатів, висновків та списку літературних джерел, який містить 270 найменування, у тому числі 198 зарубіжних авторів.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури розглядаються основні властивості рослинних та тваринних вірусів, які відносяться до родини Rhabdoviridae. Ця група вірусів має важливі наслідки для здоров'я людини, агрокультури, і екології живої природи. Загальний огляд містить класичні і сучасні дані про екологію рабдовірусів, патологію, відносини з переносниками і таксономію. Особливу увагу приділено дослідженням з біології, біохімії, реплікації і взаємодії рабдовірусів та їх господарів. Організація геному і структура компонентів рабдовірусів представлені як для недавно секвенованих нуклео- і циторабдовірусів так і для модельних рабдовірусів тварин, які відносяться до видів лісса- та везикуловірусів. В окремому розділі описані структурні компоненти, детерміновані геномом клітини такі, як ліпіди та вуглеводи. Описані можливості для майбутніх досліджень, практичного використання та перспективи застосування рабдовірусів.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Для накопичення вірусу кучерявої карликовості картоплі (ВККК) використовували рослини махорки (Nicotiana rustica), які інокулювали механічним способом. Листя з яскраво вираженими симптомами захворювання використовували для виділення вірусу, з використанням ПЕГ-6000. Вірус везикулярного стоматиту (ВВС) виділяли з інфікованої культури клітин тестикул поросяти (напрацьованої у відділі проблем інтерферону і імуномодуляторів) за методом Dalton та Rose (Dalton & Rose, 1993). В роботі використовували фіксований вірус сказу (вакцину антирабічну „Внуково-32”). Контроль чистоти очищених вірусних препаратів проводили за допомогою спектрофотометричного аналізу на приладі Specord (Німеччина) при довжині хвилі 260 нм.

Виділення нуклеокапсидних білків рабдовірусів здійснювали модифікованим методом De та Banerijee (De & Banerijee, 1984).

Вивчення поліпептидного складу структурних білків рабдовірусів здійснювали за допомогою електрофорезу в 10 % ПААГ за методом Laemmli (Laemmli, 1970). Як білки-маркери використовували: цитохром С (12300 Да), міоглобін (16949 Да), карбонік-ангідразу (30000 Да), овальбумін (42700 Да), альбумін (66250 Да), овотрансферин (78000 Да). Фіксація і фарбування гелю проводилися за загальноприйнятою методикою (Asselin & Zaitlin, 1978).

Дослідження морфології вірусних частинок рабдовірусів проводили на електронному мікроскопі марки JEM-100 (JEOL, Японія) при інструментальному збільшенні 20 - 120 тис з напругою прискорення 80 Кв. Препарати для електронної мікроскопії готували методом негативного контрастування.

Антигенну спорідненість рабдовірусів досліджували методом подвійної імунодифузії в гелі по Ouchterlony (Ouchterlony, 1968). Для виявлення антигенно спорідненних білків був використаний метод імуноблотингу. Вірусні білки після електрофорезу в поліакриламідному гелі переносили на нітроцелюлозу фірми Schleicher and Schuell з розміром пор 0,45 мкм. Електроперенос здійснювали приладом Semi - Dry Elektroblotting Units (Fisher Bioblock Scientific) для переносу при 150 мА, 40 - 50 V протягом 1,5 годин.

Перехресну віруснейтралізуючу активність антитіл до рабдовірусів рослин, тварин та людини, щодо зоорабдовірусної інфекції (на моделі ВВС) in vitro вивчали за допомогою реакції вірусної нейтралізації. В реакції нейтралізації використовували сироватки до ВВС і до ВККК. За титр антитіл досліджуваної сироватки приймали те її розведення, яке стримує розвиток ЦПД вірусу в 50 % заражених клітин культури. Облік результатів проводили при мікроскопії під інвертованим мікроскопом. Активність сироватки оцінювали за пригніченням цитопатичної дії тест-вірусу.

Дослідження можливості використання фіторабдовірусу ВККК для індикації антитіл специфічних до вірусу сказу проводили за допомогою непрямого варіанту імуноферментного аналізу. При оптимізації параметрів постановки непрямого варіанта ІФА для індикації антитіл до вірусу сказу основна увага була приділена визначенню наступних параметрів реакції:

- тип полістиролового планшету (Maxi Sorp чи Poly Sorp);

- інкубаційного буферного розчину (1М Tris-HCl б/р, рН 7,38 чи 0,05М карбонатний б/р, рН 9,2);

- сенсибілізуючої дози антигенів для покриття мікроплат (5 чи 10 мкг/мл);

- робочого розведення кон'югату (1/50 000, 1/100 000 чи 1/200 000).

Для визначення кількісного і якісного складу жирних кислот використовували 10 мг вірусного препарату, який вносили в 3 мл 1,5 % хлористого ацетилу на метанолі і проводили гідроліз при температурі 100 °С в запаяних ампулах протягом 4 год. Метилові ефіри жирних кислот екстрагували тричі гексаном (по 3 мл). Гексанову фракцію відбирали та висушували на вакуумному випарнику. Аналіз метилових ефірів жирних кислот проводили на хроматомасспектрометричній системі “Agilent 6890N/5973 inert”. Використовували колонку HP-5MS довжиною 30 м, внутрішнім діаметром 0,25 мм, товщиною фази 0,25 мкм, при температурному режимі 150 250 єС і градієнті температури 4 єС/хв, газ-носій гелій, швидкість потоку через колонку 1,2 мл/хв. Температура випарника з розділенням потоку 1:100. Як стандарт використовували суміш метилових ефірів жирних кислот (Supelco, США).

Визначення моносахаридів у складі рабдовірусів проводили методом хроматомасспектрометрії. Для ідентифікації нейтральних моносахаридів препарати гідролізували 2Н HCL протягом 5 годин при 100 єС, а потім досліджували у вигляді ацетатів поліолів на хроматомасспектрометричній системі “Agilent 6890N/5973 inert”, колонка РВ 225 ms 30 м Ч 0,25 мм Ч 0,25 мкм, газ-носій гелій, потік через колонку 1 мл/хв. Температура випарника 250 єС, інтерфейсу -280 єС, термостата -220 єС (режим ізотермічний). Пробу вводили з діленням потоку 1:100. Ідентифікацію моносахаридів проводили шляхом порівняння часу утримування ацетатів поліолів досліджуваних зразків і стандартних, а також з використанням комп'ютерної бази даних Chemstation. Кількісне співвідношення індивідуальних моносахаридів визначали у відсотках до суми площ всіх піків моносахаридів. Для визначення аміносахаров 1 мг вірусного препарату гідролізували 6 H HCL протягом 20 годин при 100 єС. Гідролізат центрифугували, нейтралізували і випаровували під вакуумом. Визначали аміносахара на аналізаторі амінокислот KLA (Hitachi, Японія), використовуючи колонку (0,9 Ч15 см) з катіонітом “Octіon 0803” в натрій - цитратному буфері рН 5,28 при 55 єС.

Визначення лектинової активності вірусних препаратів. Для екстрагування розчинних лектинів 0,5 г рослинного матеріалу розтирали з ацетоном та багаторазово відмивали, звільняючись від присутності пігментів, потім гомогенізували в 5 мл 0,05 HCl, постійно перемішуючи протягом 1 години при 4^°С, та центрифугували при 10000 g 20 хвилин. Осад відмивали половинним від вихідного об'єму кислоти, після чого супернатанти об'єднували. Після нейтралізації 1 М Na-фосфатним буфером (рН 7,4) супернатант центрифугували при 10000 g протягом 10 хвилин та використовували для подальшого аналізу. Екстракцію розчинних лектинів проводили по Луцику (Луцик, 1980). Активність лектинів визначали методом аглютинації трипсинізованих еритроцитів барана. Титр лектинів характеризувався максимальним розведенням чи мінімальною концентрацією його в розчині, при якому спостерігалася аглютинація еритроцитів. Активність лектинів (Р) розраховували за формулою: Р=1/А, де А - мінімальна кількість білку, здатна викликати аглютинацію еритроцитів. Отримання еритроцитів барана та їх трипсинізацію проводили за методом Луцика (Луцик з співав., 1980).

Визначення вуглеводної специфічністі вірусних лектинів та рослинного матеріалу, ураженого рабдовірусами. Для визначення природи вуглеводу, який взаємодіє з лектином в пробірки вносили по 0,05 мл розчину вуглеводу, 0,05 мл робочого розчину лектинів та залишали на 15 хвилин при кімнатній температурі. Потім в пробірку вносили 0,05 мл 2 % суспензії еритроцитів, інкубували 60 хв та враховували аглютинацію еритроцитів. В контрольну пробірку замість розчину вуглеводу додавали буфер, на якому готували 2 % розчин еритроцитів. В контрольній пробірці та в пробірках з вуглеводами, які не взаємодіяли з лектином відмічалася аглютинація еритроцитів. Відсутність аглютинації в пробірках свідчить про блокування активного центру лектину вуглеводом, тобто про взаємодію даного вуглеводу з лектином. Кінцева концентрація вуглеводу в реакційній суміші складає 0,2 М, що являється достатнім для виявлення навіть слабко взаємодіючих з лектином вуглеводів. Для виявлення мінімальної концентрації вуглеводу, пригнічуючої реакцію гемаглютинації, готували серію послідовних розведень активного вуглеводу.

Розрахунки проводились за допомогою ІВМ РС з використанням пакету програмних засобів Microsoft Office-2003. Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами варіаційної статистики з вирахуванням середніх арифметичних величин (X), їх середньоквадратичного відхилення (S_Х) і середньоквадратичної похибки (m).

РОЗДІЛ 3. СТРУКТУРНИЙ АНАЛІЗ ЗОО- ТА ФІТОПАТОГЕННИХ РАБДОВІРУСІВ

Одержані вірусні препарати ВККК та ВВС аналізували спектрофотометричним методом на спектрофотометрі „Specord” при довжині хвилі 230 - 290 нм. Спектр поглинання очищених вірусних препаратів в УФ - світлі мав характерний максимум при довжині хвилі 260 нм, однак мінімум при - 245 нм був згладжений, що свідчить про наявність вуглеводів у вірусних препаратах. При електронно-мікроскопічному дослідженні виділених вірусів ВВС та ВККК показано, що вірусні частинки мають кулевидну форму розмірами для ВВС: 141 - 150 Ч 80 8 нм (рис. 1); а для ВККК 145 Ч 75 6 нм; Іноді зустрічаються ВККК бациловидної форми розмірами 240 - 280 Ч 75 7, що співпадає з літературними даними (рис. 2). Сферичні, кулевидні та поліморфні частинки, які спостерігалися в препаратах з нативного соку рослин, з'являлися в результаті руйнування бациловидних частинок.

Рис. 1. Вірус везикулярного стоматиту

Рис. 2. Вірус кучерявої карликовості картоплі

Поліпептидний склад ВККК містив білки з такими молекулярними масами: 128, 94, 66, 56, 43 та 29 кДа. Тоді як ВВС має структурні білки з наступними молекулярними масами: 130, 80, 66, 59, 43, 27 кДа. Тобто електрофоретичним аналізом показано, що деякі структурні білки цих рабдовірусів мають близькі за значенням молекулярні маси (рис. 3).

Перш за все мажорні білки з мол. масами 43 та 56 - 59 кДа. Ці білки переважають у кількісному співвідношенні і скоріш за все вони являються основним білком нуклеокапсиду (N). Цей білок представляв особливий інтерес оскільки він, як відомо, являється перехресно реагуючим комплементфіксуючим антигеном.

Рис. 3. Електрофореграми структурних білків ВККК та ВВС

1-ВККК;

3- ВВС;

2,4- маркери.

Досліджено якісний і кількісний вміст моносахаридів у складі глікопротеїнів рабдовірусів, що репродукуються в рослинних клітинах (ВККК) та в клітинах тварин (ВВС). В оболонкових структурах рабдовірусів ВККК і ВВС були виявлені моносахариди, склад яких варіював залежно від певного вірусу (таб. 1).

Таблиця 1.

Вмісту моносахаридів ВККК, ВВС, визначених методом хроматомасспектрометрії

Моноцукри (% до суми площі піків)	ВККК	ВВС
Глюкоза	35,0	21,0
Маноза	23,8	58,5
Галактоза	12,3	3,8
Арабіноза	10,0	2,7
Рамноза	9,7	-
Фукоза	8,6	3,7
Х1	-	10,34

При ідентифікації моносахаридів у складі ВККК нами встановлено, що домінантними моноцукрами у складі ВККК є глюкоза (35 %), маноза (23,8 %) та галактоза (12,3 %). Крім того, знайдені - арабіноза (10 %), рамноза (9,7 %) та фукоза (8,6 %). Дещо інший склад моносахаридів був знайдений у вуглеводному компоненті вірусу везикулярного стоматиту. Він розподілявся таким чином: маноза (58, 5%), глюкоза (21 %), Х₁ (10,34 %), галактоза (3,8 %), фукоза (3,7%), арабіноза (2,7 %).

При порівнянні моносахаридного складу ВККК, та ВВС встановлено, що найвищий вміст глюкози (35 %) був зареєстрований для ВККК. На відміну від цього у ВВС вміст цього моносахариду становив - 21 %. За вмістом у складі ВККК глюкоза займає перше місце, друге у ВВС. Арабіноза наявна у ВККК - 10,4 % та у складі ВВС - 2,7 %. У ВВС найбільший відсоток складає маноза - 58,5 %, цей моносахарид є у ВККК - по кількості вона займає друге місце (23,8 %). Також у цих двох вірусів наявна фукоза, її вміст складає 8,6 % у ВККК, 3,7 % у ВВС. Також у досліджуваних вірусів присутня галактоза: 3,8 % у ВВС, 12,3 % у ВККК. Рамноза присутня у ВККК, її вміст становить 12,3%.

Деякі відмінності якісного і кількісного складу моносахаридів досліджуваних оболонкових рабдовірусів пояснюється тим, що рабдовіруси повсюдно поширені в природі. Вони вражають людину, тварин, риб і рослини. А їх поверхневі глікопротеїни, включають вуглеводи клітинного походження, які беруть участь в морфогенезі вірусів.

У досліджуваних вірусах, разом з моносахаридами, знайдені також і аміносахариди - глюкозамін і галактозамін. Кількість останнього превалювала по відношенню до глюкозаміну: для ВККК в 8,75 раз і ВВС в 1,6 рази.

Проведена робота показала наявність ідентичних моносахаридів у складі рослинних та тваринних рабдовірусів, що є важливим, оскільки відомо, що вуглеводи зв'язані з поверхневим вірусним білком, який формує пепломери. Ці пепломери зв'язуються безпосередньо з рецепторами клітини хазяїна.

Ідентифікація моносахаридів показала, що фіторабдовіруси та рабдовіруси хребетних в ряді випадків мають ідентичні моносахариди, що, мабуть, відображує єдину еволюційну програму розвитку цих вірусів.

Відомо, що поверхневий білок G рабдовірусів глікозильований, не має ферментативної активності та має властивість аглютинувати еритроцити. Ці ознаки характерні для класу білків - лектинів. Оскільки у рабдовірусів поверхневий білок G глікозильований та має здатність аглютинувати еритроцити, то їх карбогiдратнi залишки, в свою чергу, можуть розпізнаватися іншими лектинами, що показано при лектинскринiнгу фіторабдовірусів вipycy жовтої карликовості картоплі та плямистої карликовості баклажан. Виходячи з цього, за допомогою методу аглютинації трипсинізованих еритроцитів барана визначали активність лектинів.

В результаті проведених досліджень, встановлена гемаглютинуюча активність розчинної фракції структурних білків ВККК. З'ясувалося, що мінімальна кількість білку, яка здатна викликати аглютинацію еритроцитів барана, складала для ВККК 6,8 мкг/мл. Ймовірно, таким структурним білком ВККК є оболонковий глікопротеїн G, що визначає перспективу його використання у сфері застосування лектинів.

Для визначення вуглеводної специфічності білків ВККК тестували такий набір вуглеводів: L-фукоза, Д-галактоза, N-ацетил-Д-галактозамін, Д-глюкоза, Д-маноза, N-ацетил-Д-глюкозамін, нейрамінова кислота. Вуглеводна специфічність до поверхневих білків ВККК в значному ступені виявилася у ацетилглюкозаміну та нейрамінової кислоти.

При інфікуванні рослин N. rustica ВККК відбуваються зміни лектинової активності в динаміці розвитку вірусної інфекції (рис. 4). На першу добу після інфікування в заражених ВККК листях відзначалося збільшення лектинової активності в порівнянні зі здоровими рослинами N. rustica. На 7 та 14 добу після інфікування спостерігається спад, а на 21 добу знову спостерігається збільшення рівня лектинової активності, потім відмічається різкий спад та знову підйом. Зменшення лектинової активності в листках рослин, інфікованих ВККК, корелює із зменшенням кількості білків 30 та 75 кДа. На 14-21 добу після інфікування значно збільшується вміст білку 30 кДа. Зміна лектинової активності в інфікованих вірусами рослинах може бути обумовлена конформаційними перебудовами молекул білку, які відповідають за доступність вуглеводзв'язуючих центрів та зміною кількості цього білку, обумовлених вірусною інфекцією. Крім того, при інфікуванні патогенами в клітинах рослин активуються системи захисту, які призводять до експресії генів.

При цьому відбувається уповільнення синтезу одних білків та підсилення утворення інших, що виявляється в зміні лектинової активності. Можна припустити, що збільшення активності на 21, 35 та 42 добу свідчить про накопичення вірусних глікопротеїнів - лектиноподібних білків. На користь цього свідчать дані про те, що максимум накопичення бациловидного вірусу ВККК спостерігається через 25 45 добу, що підтверджуються нашими дослідженнями - за допомогою імуноблотингу при використанні сироватки до ВККК виявлені білки 43, 36 та 29 кДа, кількість яких збільшилася від 21 доби (час прояву симптомів) до 42 доби спостереження (рис. 5).

Ми констатуємо той факт, що на 14 та 28 добу після інфікування відмічається зменшення лектинової активності з наступним її збільшенням. Можливо, це визначається конформаційними перебудовами молекул білку в цей період часу, в ході яких змінюється доступність вуглеводзв'язуючих центрів.

Таким чином, при інфікуванні ВККК рослин Nicotiana rustica змінюється поліпептидний склад рослинних клітин, які проявляють лектинову активність. У складі ВККК виявлені білки, які мають гемаглютинуючу активність. Скоріш за все, такими можуть бути поверхневі глікопротеїни G, що обумовлює перспективу використання його в сфері застосування лектинів.

Рис. 4. Динаміка активності розчинних лектинів (% від контролю) в листках N. rustica при інфікуванні рабдовірусом ВККК:

по осі абсцис - кількість діб після зараження;

по осі ординат - активність лектинів, % від контролю.



Рис. 5. Імуноблотинг лектинів, віділених з Nicotiana rustica, з використанням сироватки до ВККК:

1 лектини здорової N. rustica;

2 лектини N. rustica, зараженої ВККК (на 21 добу);

3 лектини N. rustica, зараженої ВККК (на 42 добу);

4 маркери.

рабдовірус інфекція антитіло пектиновий

Фіто- та зоопатогенні рабдовіруси мають багато спільних властивостей щодо структурної організації віріонів і функціональної активності структурних компонентів, в тому числі і ліпідів. Віріони рабдовірусів містять від 15 до 25 % ліпідів. В основному ліпіди представлені нейтральними ліпідами та фосфоліпідами (55 - 50 %), стеролами і гліколіпідами (35 - 40 %). Ліпіди рабдовірусів представляють значний інтерес перш за все тим, що вони є невід'ємним структурним компонентом рабдовірусів, що формує бішарову оболонку віріонів і беруть участь в морфогенезі вірусів. Виходячи з цього, доцільно, в порівняльному аспекті дослідити ліпіди у складі рабдовірусів рослин - вірусу кучерявої карликовості картоплі (ВККК) і зоопатогенного рабдовірусу везикулярного стоматиту (ВВС).

В структурі досліджених вірусів ВККК і ВВС були знайдені і ідентифіковані жирні кислоти, якісний і кількісний склад яких розподілився таким чином (таб. 2).

Жирнокислотний склад ВККК і ВВС містив пальмітинову (56,3 % та 22,9 %), олеїнову (17,18 % та 13,8 %) та стеаринову (26,5 % та 14,16 %) жирні кислоти відповідно. В обох випадках кількісний вміст пальмітинової кислоти був домінуючим. В складі оболонок ВВС відмічено вміст холестеролу (28,32 %), лінолевої (18,1 %) та пальмітоолеїнової кислот (2,7 %).

При порівнянні жирнокислотного складу фітопатогенного рабдовірусу ВККК і зоопатогенного рабдовірусу ВВС виявлено, що кількісне співвідношення жирних кислот, таких як пальмітинова, стеаринова, олеїнова, лінолева, значно варіюють.

Таблиця 2.

Порівняння ліпідного складу фіторабдовірусу ВККК та зоопатогенного ВВС

Жирні кислоти (% до суми площі піків)	ВВС	ВККК
Холестерол	28,32
Пальмітинова	22,9	56,31
Стеаринова	14,16	26,56
Олеїнова	13,8	17,18
Лінолева	18,1
Пальмітоолеінова	2,7

Пальмітинова кислота в значній кількості зустрічається як у фітопатогенного вірусу ВККК (56,31 %), так і у зоопатогенного вірусу ВВС (22,9 %). Відмічена відсутність лінолевої кислоти у ВККК та наявність її в значній кількості (18,1 %) у ВВС.

Нейтральна ліпідна фракція, що містить холестерол, знайдена в значній кількості у ВВС (28 %), тоді як рабдовірус ВККК не містив холестеролу, хоча відомо, що мембрани вищих рослин містять декілька видів стеринів, в тому числі і холестерол.

В цілому жирнокислотний склад фіторабдовірусу ВККК і зоопатогенного рабдовірусу ВВС містив насичені і ненасичені жирні кислоти. При порівнянні жирнокислотного складу ВККК і ВВС знайдені унікальні і загальні жирні кислоти в кожному з них. Це свідчить про схожість структурної організації фіто- і зоорабдовірусів, а деякі невідповідності у складі жирних кислот відображають відмінності між мембранами рослинних і тваринних клітин, з яких виділені віруси.

РОЗДІЛ 4. ІМУНО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ СТРУКТУРНИХ БІЛКІВ ЗОО- ТА ФІТОПАТОГЕННИХ РАБДОВІРУСІВ

Дослідження антигенної спорідненості рабдовірусів людини та тварин ВВС, ВС та фітопатогенного рабдовірусу ВККК. Для проведення імунодифузних тестів використовували антисироватку до ВККК, титр якої відповідав 1:4 - 1:32, що свідчить про низьку імуногенність антигенів ВККК.

Титри сироваток до нуклеокапсиду ВС, до цілих віріонів ВС та ВВС відповідали - 1: 16 32, 1:32 та 1:16.

В результаті дифузії антигенів та антитіл у гелі утворився комплекс антиген-антитіло з двома вірусами (рис. 6.). Комплекс осідав у вигляді нерозчинного преципітату, що в нашому випадку свідчить про спорідненість антигену ВККК і антигену ВВС. Вони мають серологісно споріднені антигенні детермінанти.

Необхідно відмітити, що контрольна сироватка, а також сироватки до інших груп рослинних вірусів (таких як, ВТМ, а також Х-, У-, М-, S-, F- віруси картоплі) з рабдовірусами ВККК і ВВС не реагували. Отже, в результаті проведеної реакції подвійної імунодифузії в гелі при використанні сироватки, одержаної до ВККК, виявлена антигенна спорідненість між фітопатогенним ВККК і зоопатогенним рабдовірусом ВВС.

Для проведення порівняльного імунохімічного дослідження антигенної спорідненості рабдовірусів був використаний метод імуноблотингу. Методом імуноблотингу після фракціонування вірусних білків в ПААГ, при використанні сироватки до ВККК виявлені антигеноспоріднені білки близько 43 кДа у складі ВВС, ВС та ВККК, які по молекулярним масам скоріш за все відповідають внутрішнім нуклеокапсидним білкам (рис. 7). Необхідно звернути увагу на той факт, що крім нуклеокапсидного білку ВВС (43 кДа) також проявив антигенну спорідненість структурний білок з молекулярною масою 27 кДа. На підставі отриманих значень молекулярної маси він може бути віднесений до нуклеокапсидного білку NS або мембранного білку М.

Рис. 6. Реакція імунопреципітації в 1 % агарозному гелі:

1- сироватка до ВККК;

2- ВККК;

3- ВВС;

4- контроль - нормальна сироватка.

Рис. 7. Імуноблот білків ВККК, ВС та ВВС з використанням сироватки, одержаної до ВККК:

1- Маркери;

2- ВККК;

3- ВС;

4- ВВС.

В наших дослідах антигенну спорідненість, виходячи із значень їх молекулярних мас, проявили внутрішні білки рабдовірусів, а не поверхневі. Можливо внутрішні білки відіграють найважливішу роль в експресії вірусного геному. На користь цього свідчать експериментальні дані Harmon і Samers, які показали, що моноспецифічні антисироватки до нуклеокапсидних білків L і NS, інгібують транскрипцію ВВС in vitro.

Виходячи із спільної структури рабдовірусів та їх окремих фізико - хімічних параметрів структурних компонентів і чіткого антигенного споріднення деяких білків рабдовірусів: рослин (ВККК) та хребетних (ВВС), було проведено вивчення можливісті інактивації репродукції ВВС в культурі клітин (ПТП), антитілами до фіторабдовірусу ВККК.

Для з'ясування здатності антитіл до ВККК нейтралізувати інфекційну активність ВВС in vitro, в реакції нейтралізації використовували препарат вірусу (ВВС) раніше стандартизований та кількісно відтитрований в робочій дозі 100ТЦД50. Тобто, для зараження клітин обрана одна інфікуюча доза вірусу, титр якого попередньо виявляли при обліку по ЦПД.

Гомологічна сироватка викликала 100 % нейтралізацію вірусу в розведенні 1:16 після 15 та 60 хв інкубації з ВВС, а після 30 хв контакту в розведенні 1:8. Розвиток характерного ЦПД у 50 % заражених клітин спостерігали в розведенні 1:64 при 15 хв контакту, в розведенні 1:128 при 30 хв контакту та в розведенні 1:256 при 60 хв інкубації специфічних антитіл з вірусом. Гетерологічна сироватка (антитіла до ВККК) в розведенні 1:32 стримували розвиток вірусу у більш ніж 50 % заражених клітинах при 15, 30 та 60 хв контакту.

Різницю в кількості неінфікованих клітин в присутності антитіл (Іім) та при контрольному зараженні без антитіл (Ік) виражає індекс нейтралізації.

Зміна індексу нейтралізації специфічних антитіл проти ВВС і специфічних антитіл проти ВККК в залежності від часу інкубації та розведення сироватки представлена на рис. 8.

Рис. 8. Залежність індексу нейтралізації гомологічної (1) та гетерологічної сироваток (2) проти ВВС від часу інкубації та розведення сироваток:

по осі абсцис - розведення сироваток;

по осі ординат - індекс нейтралізації.

Приведені дані по порівнянню індексу нейтралізації проти ВВС гомологічною (сироватка до ВВС) та гетерологічною (сироватка до ВККК) сироватками свідчать, що обидві сироватки проявляють нейтралізуючу активність проти ВВС. Але гомологічна сироватка має вищий індекс нейтралізації ніж гетерологічна на 25 - 30 %, це говорить про більш специфічне зв'язування ВВС з гомологічними антитілами. Однак рівень інгібіції ЦПД ВВС гетерологічними антитілами до рослинного рабдовірусу ВККК залишався значним. Ефективність інгібіції ЦПД ВВС антитілами до ВВС та ВККК відрізняються в залежності від часу контакту, розведення сироватки з вірусом до їх внесення в моношар перещеплюваних клітин.

Імунологічними дослідженнями показано антигенне споріднення структурних білків ВС та ВВС. Виходячи з цього було цікаво порівняти здатність антитіл до зоопатогенного вірусу ВС нейтралізувати інфекційність рабдовірусу ВВС в культурі клітин. В роботі використовували: гомологічну сироватку до ВВС (сир-ка до ВВС); гетерологічні сироватки до сумарних нуклеокапсидних білків L, NS, N ВС; сироватка до окремого білка N ВС та до цілого віріону ВС. Контролем слугувала нормальна сироватка кроля.

В порівнянні з гомологічною сироваткою, яка у всіх досліджених розведеннях викликала практично 100 % нейтралізацію ВВС, сироватка до цілого ВС викликала 50 % затримку репродукції ВВС у розведенні 1:32 та 1:64 (в залежності від часу попередньої інкубації - 30 та 60 хв.). Антитіла до сумарних нуклеокапсидних білків та N білка нуклеокапсиду ВС виявляли стабільну, незалежну від часу попередньої інкубації, вірус нейтралізуючу активність. Важливо відмітити, що 50 % затримку репродукції ВВС у розведенні 1:32 (такому ж, як і сироватка до цілого ВС) викликала сироватка до мажорного нуклеокапсидного N білка, тоді як антитіла до сумарних нуклеокапсидних білків проявили аналогічну дію тільки у розведенні 1:16.

Отже, при вивченні перехресної віруснейтралізуючої активності антитіл специфічних до структурних білків рослинного рабдовірусу ВККК та рабдовірусу хребетних ВС щодо ВВС в умовах in vitro була показана здатність антитіл до ВККК нейтралізувати інфекційну активність ВВС в перещеплюваній культурі тваринних клітин (ПТП), враховуючи отримані показники динаміки імуноактивації та індексу нейтралізації (гомологічними та гетерологічними антитілами). Причиною цього явища може бути спільність компонентів вірусів, які належать до однієї родини рабдовірусів.

Можливість використання фіторабдовірусу ВККК для індикації антитіл специфічних до вірусу сказу. Визначення кращих умов постановки непрямого варіанту імуноферментного аналізу для індикації антитіл до вірусу сказу показало, що краща сорбція антигену ВККК спостерігалася на плашці - Maxi Sorp. При виборі концентрації антигену важливо відмітити, що в концентрації антигену 5 мкг/мл і 10 мкг/мл показники оптичної щільності фактично однакові. Цей факт говорить про те, що вже при концентрації антигенів 5 мкг/мл спостерігається максимум сорбції. Оптимальним буферним розчином для розведення антигену ВККК є 1 М Tris-HCl (рН 7,38) при порівнянні з 0,05 М карбонатним б/р, (рН 9,2) він показав найменші показники фонового фарбування. В якості кон'югату використовували білок А золотистого стафілококу, мічений пероксидазою хрону в розведенні - 1/200 000. Результати реакції враховували на рідері при л= 450 нм.

При постановці основного досліду було використано в якості досліджуємих антитіл - сироватку до ВС. Як контроль виступала нормальна сироватка кроля. В якості антигенів використовували віріони сказу та ВККК і препарати нуклеокапсидних білків цих двох вірусів з молекулярною масою 43-47 кДа, які були перевірені електрофоретичним аналізом (рис. 9).

Рис. 9. Електрофореграма нуклеокапсидних білків ВККК та ВС

Для сенсибілізації поверхні лунок полістиролових мікропланшетів Maxi Sorp використовували по 0,1 мл у концентрації 5 мкг/мл білку, розведений 0,01 М фосфатно-буферним розчином рН 7,2-7,4 з 0,1 М NaCl. Імобілізацію антигену на поверхні лунок здійснювали протягом 12-16 годин при температурі +4°С. Антиген який не зв'язався з поверхнею полістиролу відмивали 1 М Tris-HCl, рН 7,38. У лунки з адсорбованим антигеном вносили по 0,1 мл специфічної до ВС (позитивної), контрольної (негативної) в розведеннях. Для кількісного визначення антитіл у сироватках їх титрували методом дворазових розведень на 1М Tris-HCl. Ретельно перемішували протягом 5-7 секунд і інкубували в термостаті 1-1,5 години при +37°С. Потім 5 разів планшети відмивали від антитіл, що незв'язалися.

При якісній постановці реакції (відповідь “є” або “ні”) постановку здійснювали аналогічно, але сироватки не титрували, а ставили не менш трьох повторних дослідів у разведеннях. У відмиті лунки вносили по 0,1 мл кон'югату, в якості якого використовували білок А золотистого стафілококу, мічений пероксидазою хрону в розведенні - 1/200 000. Інкубували 1-1,5 години при 37°С і відмивали лунки мікропланшет. Потім додавали 0,1 мл субстратної суміші (0,15 % розчин діамінобензидіна з 0,03 % перекисом водню). Після фарбування продукту ферментативної реакції, через 60 хвилин реакцію зупиняли внесенням у кожну лунку по 0,05 мл 5 Н HCl і вимірювали оптичну щільність на рідері при довжині хвилі 450 нм, або оцінювали реакцію візуально по колірній шкалі (рис. 10 та 11).

Рис. 10. Індикація антитіл специфічних до ВС методом ІФА за допомогою препаратів цілих вірусів ВККК та ВС.

Рис. 11. Індикація антитіл специфічних до ВС методом ІФА за допомогою препаратів нуклеокапсидних білків ВККК та ВС.

Показники відгуку сироватки до ВС на рівні, який не перевищує 0,4 не є досить значними, але при порівнянні отриманих Новіцькою (2004) даних при розробці тест-системи на основі імуноферментного аналізу для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові тварин позитивним сигналом вважалися показники ОЩ в діапазоні 0,220 0,344 ±0,18. Таким чином нами показана здатність досліджуваних антигенів нуклеокапсидних білків ВККК та ВС зв'язуватися з антитілами сироватки до ВС. Але при створенні діагностичної тест-системи для індикації ВС краще використовувати в якості антигену не препарати нуклеокапсидних білків, а препарат цілого віріону ВККК.

Результати наших досліджень свідчать про можливість використання фіторабдовірусу ВККК для індикації антитіл специфічних до ВС. Отримані нами результати знайдуть застосування в біотехнології лікувально-профілактичних препаратів та діагностичних засобів для виявлення вірусів з родини Rhabdovіrіdae, що буде сприяти розвитку нових перспективних біотехнологій.

ВИСНОВКИ

1. Одержано нові результати стосовно властивостей структурних компонентів фіторабдовірусу ВККК та рабдовірусів хребетних ВВС і ВС. Показано спільність морфології віріонів ВККК та ВВС, білкового, моносахаридного та жирнокислотного складу. Досліджено біологічні, фізико-хімічні, імунологічні властивості цих збудників, що сприяє розумінню процесів розвитку та еволюції рабдовірусів та є перспективним для розробки нових біотехнологій, спрямованих на створення антивірусних препаратів.

2. З'ясовано поліпептидний склад очищених вірусних препаратів рослинного рабдовірусу ВККК та тваринного рабдовірусу ВВС. Виявлено антигенно споріднений білок з молекулярною масою 43 кДа в складі структурних білків ВККК, ВВС та ВС.

3. Встановлено здатність антитіл до рослинного рабдовірусу ВККК і зоопатогенного рабдовірусу ВС нейтралізувати інфекційну активність рабдовірусу везикулярного стоматиту in vitro.

4. Показано можливість використання фіторабдовірусу ВККК для індикації антитіл, специфічних до вірусу сказу, на основі непрямого варіанту імуноферментного аналізу.

5. З'ясовано якісний і кількісний жирнокислотний склад рабдовірусів ВККК та ВВС. У складі обох вірусів ідентифіковано пальмітинову, стеаринову та олеїнову жирні кислоти. ВВС також містить лінолеву та пальмітоолеїнову жирні кислоти та холестерол.

6. Визначено моносахаридний склад ВККК та ВВС. Домінуючими моносахарами для обох вірусів виявилася маноза та глюкоза.

7. Встановлено, що в складі структурних білків ВККК є білки, які мають гемаглютинуючу активність. При інфікуванні рослин Nicotiana rustica ВККК змінюється поліпептидний склад рослинних клітин, які проявляють лектинову активність.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мандріка Т. Ю. Нейтралізуюча активність антитіл до рослинного рабдовірусу ВККК, щодо зоорабдовірусної інфекції на моделі ВВС в системі in vitro / Т. Ю. Мандріка, Н. М. Жолобак, З. М. Олевинська, Л. Ф. Діденко, М. Я. Співак // Вісник Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка. - 2005. - №44. - С. 23-25. (Здобувачем самостійно проведено виділеня препарату вірусу ВККК, отримано антисироватку до ВККК, проведено серологічні дослідження по встановленню антигенної спорідненості білків ВККК, ВВС та ВС, підготовлена стаття до друку).

2. Дяченко Н. С. Перехресна віруснейтралізуюча активність сироватки до зоо- і фітопатогенним рабдовірусів / Н. С. Дяченко, М. Я. Співак, Л. Ф. Діденко, Н. М. Жолобак, Т. Ю. Мандріка, З. М. Олевинська, Н. Й. Пархоменко, Л. О. Максименко // Імунологія та алергологія. - 2004. - №3. - С. 37-41. (Здобувачем самостійно проведено напрацювання препарату вірусу ВККК, отримано антисироватку до ВККК, проведено дослідження перехресної спорідненості ВККК, ВВС та ВС).

3. Діденко Л. Ф. Ліпідний склад зоо- і фітопатогенних рабдовірусів / Л. Ф. Діденко, М. Я. Співак, Л. Д. Варбанець, Т. Ю. Мандріка, О. С. Броварська // Доповіді Національної академії наук України. - 2006. - №2. - С. 153-156. (Здобувачем особисто виділено та напрацьовано препарат вірусу ВККК, та підготовлена стаття до друку).

4. Мандріка Т. Ю. Лектинова активність в листях Nicotiana rustica, інфікованих рабдовірусами / Т. Ю. Мандріка, О. Б. Серденко, Н. І. Грабченко, С. Г. Козьмін, Л. Ф. Діденко, М. Я. Співак // Вісник Ужгородського Унівірситету. Серія біологія. - 2005. - №18. - С. 149-152. (Здобувачем особисто проведено дослідження морфології вірусу кучерявої карликовості картоплі, виділено та напрацьовано препарат вірусу ВККК, досліджено гемаглютинуючу активність білків ВККК).

5. Мандріка Т. Ю. Характеристика бациловидного вірусу плямистості аїру / Т. Ю. Мандріка, О. Б. Серденко, Л. Ф. Діденко, Л. Д. Варбанець, О. С. Броварська, В. М. Васильєв, М. Я. Співак. // Мікробіологічний журнал. - 2007. - Т. 69, - №5. - С. 49-58. (Здобувачем особисто проведено дослідження молекулярної маси білків вірусів ВККК та ВВС, отримано антисироватку до ВККК, проведено серологічні дослідження по встановленню антигенної спорідненості білків ВККК, ВВС та ВС, досліджено гемаглютинуючу активність білків ВККК та підготовлена стаття до друку).

6. Сабірова Т. Ю. Можливість використання фіторабдовірусу ВККК для індикації антитіл специфічних до вірусу сказу / Т. Ю. Сабірова, Л. Ф. Діденко, Л. О. Ганова, М. Я. Співак // Імунологія та алергологія. - 2007. - №3. - С. 49-51. (Здобувачем особисто проведено оптимізацію постановки непрямого варіанту імуноферментного аналізу та підготовлена стаття до друку).

7. Didenko L.F. Monosaccharides composition of rhabdoviruses / L. F. Didenko, L. D. Varbanets, T. Y. Sabirova, O. B. Serdenko, N. Ja. Spivak // Мікробіологія і біотехнологія. - 2008. - №1, - С. 18-22. (Здобувачем особисто виділено та напрацьовано препарат вірусу ВККК, та підготовлена стаття до друку).

8. Жолобак Н. М. Реакція нейтралізації вірусу везикулярного стоматиту в системі in vitro антитілами до вірусу сказу / Н. М. Жолобак, Т. Ю. Мандріка, З. М. Олевинська, Л. Ф. Діденко, Н. С. Дяченко, Л. О., Максименко Н. Й. Пархоменко, М. Я. Співак // Тези доповідей Х з'їзд товариства мікробіологів України. - Одеса, - 2004. - С. 356.

9. Мандріка Т. Ю. Вивчення перехресної віруснейтралізуючої активності фіто- та зоопатогенних рабдовірусів / Т. Ю. Мандріка, Л. Ф. Діденко, Н. Й. Пархоменко, Л. О. Максименко, М. Я. Співак // Установчий з'їзд українського товариства клітинної біології. - Львів, - 2004. - С. 260.

10. Мандріка Т. Ю. Лектинова активність листків Nicotiana rustica, інфікованих рабдовірусами / Т. Ю. Мандріка, О. Б. Серденко, Н. І. Грабченко, Л. Ф. Діденко, М. Я. Співак // Тези доповідей наукової конференції молодих учених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології”. - Ужгород, - 2005. - С. 81.

11. Мандрика Т. Ю. Свойства структурных компонентов фито- и зоопатогенных рабдовирусов / Т. Ю. Мандрика, Л. Ф. Диденко, Н. Я. Спивак // Тезисы докладов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых “биология - наука XXI века”. - 2006. - С. 30.

12. Mandrika T. Monosaccharides composition of rhabdoviruses / T. Mandrika, O. Serdenko, T. Koretnikova, L. Didenko, L. Varbanets, N. Spivak // Book of abstracts the young scientists' and students' international scientific conference “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology”. - Odesa, - 2007. - P. 171.

13. Сабирова Т. Ю. Моносахаридный и жирнокислотный состав фиторабдовирусов - вируса кучерявой карликовости картофеля и вируса крапчатости аира / Т. Ю. Сабирова, О. Б. Серденко, Л. Ф. Диденко, Л. Д. Варбанец, Н. Я. Спивак // Тезисы докладов 11-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых “биология - наука XXI века”. - 2007. - С. 158.

14. Sabirova T. Ju. Possibility of the use phytorabdovirus PCDV for indication of antibodies of specific to rabies virus / T. Ju. Sabirova, L. F. Didenko, L. A. Ganova, N. Ja. Spivak // Book of abstracts 5 International conference “Bioresources and viruses”. - Kyiv, - 2007. - P. 84.

АНОТАЦІЯ

Сабірова Т.Ю. Порівняльна характеристика структурних компонентів зоо- та фітопатогенних рабдовірусів. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. -Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2010.

Дисертація присвячена дослідженню структурних компонентів рабдовірусів. Об'єктами досліджень є фітопатогений рабдовірус кучерявої карликовості картоплі (ВККК) та віруси, що вражають людину та тварин вірус везикулярного стоматиту (ВВС) і сказу (ВС).

При порівнянні поліпептидного складу цих рабдовірусів показано, що вони мають близькі за значенням молекулярні маси. Виявлено серологічно споріднений білок з молекулярною масою 43 кДа в складі структурних білків ВККК, ВВС та ВС.

Виходячи з результатів імунологічних досліджень по виявленню антигенної спорідненності структурних білків фіторабдовірусу ВККК та рабдовірусу хребетних ВВС, було визначено здатність антитіл, специфічних до ВККК, нейтралізувати інфекційність ВВС в культурі перещеплюваних клітин тварин. Отримані дані свідчать про перспективу досліджень щодо застосування фіторабдовірусу ВККК для діагностики рабдовірусів хребетних. Показана можливість використання фіторабдовірусу ВККК для індикації антитіл специфічних до ВС, на основі непрямого варіанту імуноферментного аналізу.

Крім того, ВККК та ВВС, як і інші рабдовіруси, в своїй структурі містять вуглеводи і ліпіди. Хімічна організація яких повністю визначається клітинними ферментами, що забезпечують синтез, перенесення і приєднання відповідних компонентів. Ідентифікація вуглеводів і ліпідів показала, що фіто- і рабдовіруси людини та тварин у ряді випадків містять деякі ідентичні вуглеводи і жирні кислоти, що, можливо, відображає єдину еволюційну програму розвитку цих вірусів.

Ключові слова: рабдовіруси, білки, ліпіди, вуглеводи.

Сабирова Т.Ю. Сравнительная характеристика структурных компонентов зоо- и фитопатогенных рабдовирусов. -Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.06 - вирусология. -Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена исследованию структурных компонентов рабдовирусов. Объектами исследований является фитопатогеный рабдовирус курчавой карликовости картофеля (ВККК) и вирусы, поражающие человека и животных вирус везикулярного стоматита (ВВС) и бешенства (ВБ).

Исследование растительных и животных рабдовирусов в сравнительном аспекте представляет значительный интерес исходя из их схожей структурной организации, морфологических признаков и функциональных особенностей их структурных компонентов. Исходя из этого, проводили сравнительное изучение структурных компонентов: белков, липидов и углеводов рабдовирусов ВККК и ВВС.