Мікрофлора кишечника та її транслокація у внутрішні органи експериментальних тварин із гострим панкреатитом

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

«ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ»

МІКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА ТА ЇЇ ТРАНСЛОКАЦІЯ У ВНУТРІШНІ ОРГАНИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ТВАРИН ІЗ ГОСТРИМ ПАНКРЕАТИТОМ

03.00.07-мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

РОТАР ДІАНА ВІКТОРІВНА

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Буковинському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський державний медичний університет, професор кафедри пропедевтики внутрішніх хвороб, клінічної імунології та алергології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Бірюкова Світлана Василівна, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, професор кафедри клінічної імунології та мікробіології;

доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри мікробіології вірусології, імунології та епідеміології;

Захист дисертації відбудеться « 2 » липня 2010 р. о «13.00» годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

Автореферат розісланий « 31 » травня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 к.мед.н., ст.н.с. Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гострий панкреатит (ГП) залишається актуальною проблемою невідкладної хірургії, що зумовлено неухильним зростанням цієї патології, різноманітністю захворювання за формою, поширеністю і локалізацією некрозу в підшлунковій залозі (ПЗ) і парапанкреатичній клітковині та високою летальністю. ГП перебігає у дві фази (Кондратенко П.Г., Васильев А.А., Конькова М.В., 2008; Adler G., Woehrle H., 2005): перша фаза характеризується вираженим панкреатичним запаленням та (або) некрозом, друга фаза характеризується інфікуванням підшлункової залози.

Незважаючи на досягнуті успіхи в удосконалені патогенетично обгрунтованої інтенсивної терапії, антибіотикотерапії і мініінвазивних методів хірургічного лікування, загальна летальність при деструктивних формах ГП залишається досить високою, коливається в межах 3,9-21% і досягає 80% при інфікованому панкреонекрозі (Павловський М.П., Чикайло А.Т., 2003; Khan G.M., 2005; Chiutu L., 2006).

Бактеріальне інфікування підшлункової залози розглядається як найважливіший прогностичний фактор тяжкості перебігу та летальності при ГП (Гудима Т.М., 2006; Gullo L., 2006; Keim V., 2005). Протягом першого тижня захворювання інфікування тканин ПЗ спостерігається у 25%, другого - у 30% і третього та четвертого - до 60% хворих на ГП.

Одним із основних механізмів інфікування вогнищ некрозу ПЗ вважають транслокацію (міграцію) бактерій із кишечника в ПЗ, мезентеріальні лімфатичні вузли, кров та внутрішні органи (Велигоцкий Н.Н., 2005; Paraskevas S., 2006) у результаті порушення бар'єрної функції слизової оболонки товстої і тонкої кишки, системного і місцевого імунітету. Оскільки в товстому кишечнику містяться патогенні та умовно патогенні мікроорганізми, які виділяються із вогнищ некрозу ПЗ, то кишечник рахується основним джерелом інфікування. Поряд із цим, співвідношення специфічних бактерій, які виділені із вогнищ некрозу ПЗ, не відповідають співвідношенню бактерій в товстій кишці, де переважають анаероби. У пізні терміни захворювання у патологічному матеріалі вже відносно переважають патогенні та умовно-патогенні стафілококи та ентерококи, а потенціальними джерелами інфікування стають вогнища запалення дихальних і сечових шляхів, інфіковані катетери та рефлюкс з дванадцятипалої кишки при її бактеріальній колонізації (Бойко В.В., Доценко Д.Г., 2003; Beger H., 2008; Wilmer G., 2004). Крім того, відсутні науково обґрунтовані докази впливу на бактеріальну транслокацію змін видового складу та популяційного рівня мікрофлори товстої та тонкої кишки при гострому панкреатиті.

Визнання вирішального впливу інфекції на закономірність перебігу і наслідки лікування ГП зумовлює необхідність вивчати патогенез і патофізіологію цього ускладнення, що дасть змогу покращати результати етіотропного та патогенетичного лікування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи кафедри загальної хірургії Буковинського державного медичного університету на тему «Профілактика та комплексне лікування гнійно-септичних ускладнень хірургічної абдомінальної патології», номер держреєстрації 01.07.U004050. Автор провела експериментальне дослідження мікрофлори кишечника та підшлункової залози при гострому панкреатиті.

Тема дисертації затверджена Проблемною комісією МОЗ і АМН України зі спеціальності “мікробіологія” (протокол №43 від 27.09.2006 р.).

Мета і завдання дослідження. Мета - встановити зміни видового складу та популяційного рівня мікрофлори порожнини і слизової оболонки товстої та дистального відділу тонкої кишки та їх вплив на частоту і рівень транслокації патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів у підшлункову залозу й інші (мезентеріальні лімфатичні вузли, тканину селезінки, печінки, нирок, легень, портальну та системну кров, перитонеальну та плевральну порожнини) біотопи при гострому панкреатиті.

Для досягнення поставленої мети вирішували наступні завдання:

1. Встановити стан мікробіоти вмісту порожнини і слизової оболонки товстої та дистальних відділів тонкої кишки в експериментальних тварин з набряковою (помірною) формою гострого панкреатиту.

2. Вивчити зміни якісного та кількісного складу мікрофлори порожнини і слизової оболонки товстої та дистальних відділів тонкої кишки в експериментальних тварин із деструктивною (тяжкою) формою гострого панкреатиту.

3. Дослідити рівень бактеріальної транслокації патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів у тканину підшлункової залози, печінки, селезінки, легень, нирок, мезентеріальні лімфатичні вузли, очеревинну і плевральну порожнини, портальну та системну кров в експериментальних тварин з набряковою та деструктивною формами гострого панкреатиту.

4. Оцінити вплив змін видового складу і популяційного рівня мікрофлори порожнини та слизової оболонки товстої і дистальних відділів тонкої кишки на частоту і рівень транслокації бактерій в підшлункову залозу та деякі інші біотопи організму при гострому панкреатиті.

5. Розробити критерії прогнозування ймовірності інфікування підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті на підставі аналізу змін мікробіоти кишечника.

Об'єкт дослідження: анаеробні та аеробні бактерії та дріжджоподібні гриби роду Candida, що персистують у кишечнику (у вмісті порожнини, приепітеліальної біоплівки слизової оболонки) експериментальних тварин за умов експериментального гострого набрякового та деструктивного панкреатиту.

Предмет дослідження: транслокація патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів із кишечнику в підшлункову залозу, мезентеріальні лімфатичні вузли, портальну та системну кров, тканини печінки, селезінки, легень, нирок, перитонеальну та плевральну порожнини в експериментальних тварин із гострим набряковим та деструктивним панкреатитом.

Методи дослідження: мікробіологічні, морфологічні, гістологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що гострий експериментальний панкреатит супроводжується глибокими змінами якісного та кількісного складу мікробіоти вмісту порожнини та слизової оболонки (мукозної мікрофлори) товстої та дистального відділу тонкої кишки, ступінь яких залежить від тяжкості перебігу панкреатиту.

Експериментально визначені зміни мікробіоти кишечнику, що характеризуються вираженим дефіцитом автохтонних облігатних анаеробних біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій, факультативно анаеробних ентерококів, а також колонізацією порожнини й слизової оболонки товстої та тонкої кишки патогенними (ентеротоксигенними ешерихіями) та умовно патогенними (протеями, едварсієлами, клебсієлами та ін.) мікроорганізмами, які досягають високого популяційного рівня.

Доведено, що при надмірній колонізації слизової оболонки тонкої і товстої кишки патогенними та умовно патогенними бактеріями підвищується проникливість кишкової стінки і відбувається міграція (транслокація) бактерій із просвіту кишки в регіональні мезентеріальні вузли, портальну кров, очеревинну порожнину та внутрішні органи.

Встановлена послідовність та ступінь контамінації мезентеріальних лімфовузлів, портальної крові, очеревинної порожнини, підшлункової залози, печінки, легень залежно від тяжкості перебігу гострого панкреатиту та змін мікрофлори кишечнику.

Експериментально обґрунтований і впроваджений в практику «Спосіб визначення інфікування підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті» (патент України на корисну модель №39097 від 10.02.2009 року).

Практичне значення роботи. Проведені дослідження розширяють уявлення про зміни мікробіоти кишечнику при гострому панкреатиті і вплив цих змін на проникливість слизової тонкої кишки та розвиток бактеріальної транслокації, обґрунтовують доцільність проведення селективної деконтамінації в ранні терміни захворювання для профілактики вогнищ деструкції підшлункової залози.

Встановлені зміни у видовому складі та популяційному рівні мікрофлори порожнини товстої кишки при гострому деструктивному панкреатиті можуть використовуватись як критерії прогнозування інфікування підшлункової залози. У практику впроваджено нововведення «Спосіб визначення інфікування підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті» Реєстр. №391/31/09, Реєстр галузевих нововведень (Випуск 30-31), Київ-2009.- С.238-239.

Основні наукові положення та одержані результати рекомендовані та використовуються у програмах навчання на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології, загальної хірургії, патофізіології Буковинського державного медичного університету, кафедрах мікробіології та вірусології Івано-Франківського національного медичного університету, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Харківського національного медичного університету, Луганського державного медичного університету, Одеського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського

Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, визначення мети, постановка завдань для реалізації мети наукової роботи були здійснені разом із науковим керівником. Автором самостійно апробована методика моделювання гострого набрякового та деструктивного панкреатиту, проведений забір матеріалу, виконане бактеріологічне та мікробіологічне обстеження гомогенатів внутрішніх органів, а також встановлені зміни якісного та кількісного складу мікрофлори вмісту і слизової оболонки товстої та тонкої кишки. Автором самостійно проведений аналіз літератури за темою дисертації, патентно-ліцензійний пошук за 10 років, встановлені та узагальнені одержані результати проведених експериментальних досліджень, обґрунтовані основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації, підготовлені до друку наукові праці.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації доповідалися та обговорювалися на щорічних підсумкових науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу Буковинського державного медичного університету - Чернівці, 2007, 2008, 2009; V національному конгресі анестезіологів України, Київ, 2008; Всеукраїнській науково-практичній конференції «Пробіотики в лікуванні інфекційних хворих», Тернопіль, 2007; Всеросійській науково-практичній конференції “Актуальные вопросы современной медицины”, Новосибірск, 2007; IV всеукраїнській науково-практичній інтернет-конференції «Простір і час сучасної науки», Київ, 2008; ХІІ Конгресі Світової Федерації Українських лікарських товариств, Івано-Франківськ, 2008; Міжрегіональній науково-практичній конференції “Современные аспекты анестезиологии и интенсивной терапии”, Новосибірск, 2008; ХІІ з'їзді товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, Ужгород, 2009; Всеукраїнській науково-практичній конференції «Здобутки клінічної та експериментальної медицини», Тернопіль, 2009.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 19 наукових праць (3 - одноосібно), у тому числі 5 статей (4 журнальні статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України за медичним напрямком), 1 патент України на корисну модель, 1 галузеве нововведення та 12 тез в матеріалах з'їздів та науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 219 сторінках тексту комп'ютерного набору. Вона складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків, практичних рекомендацій, додатків і списку літератури. Робота містить 43 таблиці, які наведені в додатках на 57 стор, ілюстрована 4 рисунками (2 стор.). Список першоджерел включає 198 посилань на 21 стор., серед них 38 кирилицею і 160 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить 1 розділ і 4 підрозділів, в яких стисло викладено сучасні уявлення про значення інфекційного чинника в етіології, патогенезі, перебігу та результатах лікування гострого панкреатиту.

Матеріал і методи дослідження наведено у 2 розділі. Експерименти проведені на 140 самцях безпородних білих щурів масою 200-220 гр. Індукцію ГП і виведення щурів з експерименту проводили відповідно положень Ухвали Першого національного конгресу з біоетики “Загальні етичні принципи експериментів на тваринах” (2001 р.), Конвенції ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовуються в експериментах та інших наукових цілях від 18.03.1986 р., Директиви ЄЕС № 609 від 24.11.1986 р. і наказу МОЗ України № 66 від 13.02.2006 р.

Для моделювання гострого набрякового панкреатиту (ГНП) вводили L-аргінін у дозі 2,5 г/кг, гострого деструктивного панкреатиту (ГДП) - по 2,5 г/кг двічі через 1 годину. Наркоз здійснювали внутрішньочеревинним введенням необхідної кількості 5% розчину кетаміну (50 мг/кг ваги). Евтаназію експериментальних тварин здійснювали у стані глибокого наркозу, шляхом введення надлишкової кількості наркотичного препарату - тіопентал натрію. По 7 щурів кожної групи виводили з експерименту через 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 164 год. Дослідним матеріалом були кусочки підшлункової залози, печінки, селезінки, легень, мезентеріальних лімфатичних вузлів, портальна та системна венозна кров, а також вміст очеревинної та плевральної порожнин. Здійснювали підготовку серійних десятикратних розведень гомогенату дослідного матеріалу в стерильному ізотонічному розчині хлориду натрію. Для дослідження стану мікрофлори кишечника в стерильних умовах видаляли 3 см дистального відділу ободової та здухвинної кишки, які використовували для дослідження порожнинної та мукозної мікрофлори. Екологічний стан мікробіоценозу товстої та тонкої кишки оцінювали за популяційним рівнем (ПР), індексом сталості, показниками частоти виділення та значущості, коефіцієнту кількісного домінування кожного виду мікроорганізмів.

Усі отримані цифрові дані опрацьовані статистично із використанням критеріїв Стьюдента, Фішера, Вілкоксона та хі-квадрат. Різницю між порівнювальними величинами вважали вірогідними при p<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Результати власних досліджень викладено у третьому - шостому розділах. Розвиток експериментального гострого набрякового та деструктивного панкреатиту супроводжується елімінацією з порожнини товстої кишки автохтонних облігатних анаеробних (біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій), та аеробних (ентерококів, аеробних стрептобацил) мікроорганізмів, які в інтактних білих щурів становлять основу мікробної популяції товстої кишки. Через 24 год від початку експерименту ПР біфідобактерій у тварин із ГДП знизився на 3,5 порядки, через 48 год - на 4 порядки, через 72-96 год - 4,5 порядки, а в кінці експерименту (120-а година) спостерігалася повна їх елімінація. Вже через 48 годин розвитку ГДП повністю зникали еубактерії, фузобактерії, ентерококи та аеробні стрептобацили, а концентрація лактобактерій зменшилася вдвічі і залишалася до кінця експерименту на рівні 4,15-4,97 lg КУО/г. Порушення антагоністичної активності фізіологічної популяції анаеробних бактерій створювало сприятливі умови для колонізації та персистенції в порожнині товстої кишки факультативних автохтонних та алохтонних мікроорганізмів. На протязі всього терміну спостереження за щурами з ГДП у порівнянні з інтактними тваринами спостерігалося збільшення ПР клостридій на 3,92-4,47 lg КУО/г, протеїв - на 0,34-2,61 lg КУО/г, стафілококів - на 0,32-1,64 lg КУО/г. Починаючи з 24 год відбувалася колонізація патогенними (ентеропатогенними ешерихіями) та умовно патогенними (клебсієлами та едварсієлами) ентеробактеріями, а з 72 год - дріжджоподібними грибами роду Candida, ПР яких становив 5,78±0,18, 8,17±0,22, 7,94±0,19 та 5,69±0,05 lg КУО/г, відповідно, і утримувався на такому рівні до закінчення експерименту (рис.1). Вміст бактероїдів, пептококу і пептострептококів не зазнавав суттєвих змін.

Рис.1. Динаміка популяційного рівня провідних бактерій просвіту товстої кишки у тварин з експериментальним гострим деструктивним панкреатитом

Зміни мікрофлори порожнини товстої кишки при ГНП мали подібний, але менший в кількісному відношенні характер і через 96-120 год у більшості спостережень спостерігалася стабілізація її складу та тенденція до самовідновлення.

Одночасно зі змінами просвітної мікрофлори товстої кишки суттєві порушення виявлені і в мікробіоті приепітеліальніої біологічної плівки її слизової оболонки. Через 24 год від моделювання захворювання у тварин із ГНП відбувається колонізація слизової оболонки товстої кишки умовно патогенними ентеробактеріями, пептококами, стафілококами, клостридіями, ПР яких досягає мінімального рівня (2,34±0,24-3,23±0,14 lg КУО/г) на фоні практично незмінного кількісного складу автохтонних облігатних бактерій. Починаючи з 72 години формується незначний дефіцит лактобактерій, біфідобактерій, ентерококів та еубактерій, який стабілізується через 96 год. У білих щурів із ГДП розвиваються більш глибокі зміни не тільки видового складу, а також популяційного рівня кожного таксону, що формує мікробіоту слизової оболонки кишечнику. Через 24 годин з моменту моделювання ГДП слизову оболонку заселяють клебсієли, стафілококи, а через 48 годин - пептококи, клостридії, едварсієли, ПР яких досягав високого рівня (3,70±0,18-5,90±0,09 lgКУО/г) (рис. 2).

Рис.2. Динаміка популяційного рівня провідних бактерій слизової оболонки товстої кишки у тварин з експериментальним гострим деструктивним панкреатитом

Після 72-ї години і до кінця експерименту із приепітеліального шару в таких же концентраціях висівалися ентеротоксигенні ешеріхії та дріжджоподібні гриби роду Cаndida.

Результати досліджень мікробіоценозу просвіту тонкої кишки показали, що в інтактних тварин у дистальному відділі видовий склад був майже ідентичним мікробному пейзажу просвіту товстої кишки, хоча концентрація їх у нормі була невелика і знаходилася в межах 5,72±0,32-6,84±0,19 lg КУО/г. Після індукції експериментального ГП в просвіті дистального відділу тонкої кишки суттєво змінюється видовий і кількісний склад мікроорганізмів. Через 24 години від початку ГП прогресивно зменшується ПР майже всіх мікроорганізмів, які формують фізіологічну мікробіоту просвіту тонкої кишки. У тварин із ГНП ПР біфідобактерій і лактобактерій на 72 годину були мінімальними і становили, відповідно, 4,04±0,11 і 4,24±0,19 lg КУО/г і утримувалися на такому рівні до закінчення експерименту. Більш глибокі зміни відбувалися у дослідних тварин із ГДП (табл.1).

Таблиця 1. Видовий склад та популяційний рівень (lg КУО/г) мікрофлори вмісту просвіту тонкої кишки при гострому деструктивному панкреатиті (M±m)

Примітки: К - інтактні тварини, N - кількість виділених штамів, ПР - популяційний рівень, * - р<0,05 у порівнянні з інтактними тваринами, # - р<0,05 у порівнянні з показниками попереднього терміну спостереження

Вже через 24 год перебігу захворювання спостерігається повна елімінація аеробних стрептобацил та еубактерій, через 48 год - ентерококів, через 120 год в просвіті тонкої кишки не визначаються біфідобактерії та лактобактерії. Поступово відбувається надмірна колонізація просвіту тонкої кишки алохтонними та автохтонними факультативними патогенними та умовно патогенними ентеробактеріями (протеями, едварсієлами, клебсієлами, ентеротоксигенними ешерихіями), цитробактером, превотелами, пептококом, пептострептококами та клостридіями, які в даному біотопі за ККД та індексом постійності стають домінантними і досягають високого популяційного рівня (3,89±0,03-4,79±0,15 lg КУО/г).

Розвиток експериментального ГП супроводжується порушенням стану мікрофлори як порожнини тонкої кишки, так і її слизової оболонки. Мікробіота приепітеліальної біологічної плівки слизової оболонки тонкої кишки дослідних тварин із ГНП зазнавала таких же змін як і слизова товстої кишки - протягом 24-72 год спостерігалося прогресування кишкового дисбактеріозу, а після 96 год відбувалася стабілізація видового складу та популяційного рівня автохтонних облігатних біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій, а також патогенних та умовно патогенних ентеробактерій, стафілококів мікробіоти та відмічалася тенденція до її самовідновлення. Під кінець експерименту за ККД та ПР домінантними мікроорганізмами залишаються бактероїди, кишкова паличка, стафілококи, протеї, лактобактерії та клебсієли.

Найбільш глибокі зміни мікробіоти виявлені в приепітеліальній біологічній плівці слизової оболонки тонкої кишки у дослідних тварин із ГДП (табл. 2). Уже через 24 години від початку ГП кількість біфідобактерій та лактобактерій в слизовому шарі зменшилися майже в 30 разів: біфідобактерій з 6,65±0,27 до 4,45±0,15 lg КУО/г, а лактобактерій - із 6,65±0,27 до 4,45±0,15 lg КУО/г (р<0,001). Після 48 год і до кінця експерименту в слизовому шарі не визначалися біфідобактерії, лактобактерії та ентерококи - мікроорганізми, що формують першу лінію захисту слизової оболонки від патогенних мікроорганізмів. Приепітеліальний шар активно заселяють невластиві даному біотопу клостридії, пептокок, пептострептококи, превотели, стафілококи, а також патогенні (ентеротоксигенні ешерихії) та умовно патогенні (едварсієли, протеї, клебсієли) ентеробактерії на високому ПР (4,07±0,07-5,39±0,29 lg КУО/г). У таких умовах не тільки збільшується рівень аеробної популяції, але значно підвищується її агресивні властивості, що дозволяє даній мікрофлорі подолати бар'єр приепітеліального шару тонкої і товстої кишки і здійснювати транслокацію у внутрішнє середовище організму.

бактеріальний гострий деструктивний панкреатит

Таблиця 2. Видовий склад та популяційний рівень (lg КУО/г) мікрофлори слизової оболонки тонкої кишки при гострому деструктивному панкреатиті (M±m)

Примітки: К - інтактні тварини, N - кількість виділених штамів, ПР - популяційний рівень, * - р<0,05 у порівнянні з інтактними тваринами, # - р<0,05 у порівнянні з показниками попереднього терміну спостереження

Після індукції ГП через 6 годин у тварин із деструктивною формою і через 12 годин - із набряковою E.coli із просвіту кишечника проникають у портальну кров і мезентеріальні лімфовузли, а після 24 години у 42,8% спостережень мікроорганізми виділялися із тканин підшлункової залози, очеревинної порожнини і селезінки (рис. 3).

Рис. 3. Частота інфікування внутрішніх органів у тварин з гострим панкреатитом

Після другої доби E.coli в асоціації з S.epidermidis колонізують внутрішні органи і портальну кров у 85,4% тварин із ГНП, однак вже через 72 год контамінація внутрішніх органів суттєво зменшується, а після 96 год відбувається їх повна санація. Популяційний рівень мікрофлори був не високим і становив, відповідно, 3,60±0,60 і 3,26±0,19 lg КУО/г. При деструктивній формі ГП E.coli і S.epidermidis першими колонізували тканин ПЗ уже на 12-у годину експерименту в кількості 2,20±0,17-2,25±0,06 lg КУО/г (табл.3). У подальшому їх ПР підвищувався і досягав критичного рівня (5,34±0,30 lg КУО/г) на 48 годину захворювання. У більш пізні терміни (72 година) тканини ПЗ колонізували патогенні штами ешеріїхії (E.coli HLY+), а через 96 годин - стафілококів (S.aureus), ПР яких підвищився на 168-у годину захворювання до 7,15±0,13 lg КУО/г і 6,35±0,13 lg КУО/г, відповідно. Спектр мікрофлори розширюється, збільшується їх ПР. У тканини ПЗ, а також мезентеріальні лімфовузли, портальну кров, очеревинну порожнину та інші органи проникали K. pneumonia, E.tarda, P.mirabilis, Е.fecalis, частота зустрічання яких складала від 28,6% до 42,9%, а ПР від 5,30±0,30 lg КУО/г в E.coli і 7,80±0,25 lg КУО/г у E.tarda, що перевищували критичний рівень.

Таблиця 3. Видовий склад та популяційний рівень (lg КУО/г) мікрофлори підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті (M+m)

Після 72-ї години тканини ПЗ і мезентеріальних лімфовузлів заселяли B.fragilis і на 168 годину - C.аlbicans. Встановлена пряма залежність прогресивного зростання кількості патогенних та умовно патогенних бактерій у деструктивних тканинах ПЗ від ступеня дисбіотичних змін у просвіті товстої кишки (?2=22,5, р<0,01).

Портальна і системна бактеріємія утримувалася у дослідних тварин із ГДП тільки до 72-ї години експерименту, що свідчило про відновлення функціональної спроможності печінки у знешкодженні патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів. Елімінація бактерій із очеревинної порожнини і селезінки відбувалася впродовж 48-76 годин, а з регіональних мезентеріальних лімфатичних вузлів - більш сповільнено, до 120 год. Патогенні та умовно патогенні бактерії більш тривало персистують у деструктивних тканинах ПЗ, при чому їх ПР після 48-ї години експерименту прогресивно наростає і досягає максимального рівня (7,15±0,13 lgКУО/г ) на 168-у годину, що супроводжувалося нагноєнням вогнищ деструкції ПЗ і утворенням мікроабсцесів у 3 із 7 дослідних тварин з розвитком септичного стану.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено нове науково обґрунтоване теоретичне узагальнення транслокації патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів у підшлункову залозу, мезентеріальні лімфатичні вузли, селезінку, печінку, легені, очеревинну порожнину, портальну та системну кров при експериментальному набряковому та деструктивному панкреатиті, яка виникає в результаті глибоких змін якісного та кількісного складу мікробіоти вмісту порожнини і слизової оболонки (приепітеліальної біологічної плівки) товстої та дистального відділу тонкої кишки.

1. Експериментальний гострий панкреатит супроводжується розвитком дисбактеріозу товстої та дистального відділу тонкої кишки за рахунок дефіциту або елімінації автохтонних облігатних біфідобактерій, лактобактерій, ентерококів, підвищення популяційного рівня умовно патогенних факультативних мікроорганізмів і контамінації кишечника патогенними та умовно патогенними ентеробактеріями, а також дріжджоподібними грибами роду Candida при гострому деструктивному панкреатиті.

2. Ступінь дисбактеріозу порожнин товстої та дистального відділу тонкої кишки прямо залежить від тяжкості гострого панкреатиту. При набряковій формі гострого панкреатиту дефіцит автохтонних облігатних анаеробних бактерій наростає поступово і після 48 годин становить 28-35% показників інтактних тварин, одночасно на 25-35% підвищується популяційний рівень ентеробактерій. У тварин із гострим деструктивним панкреатитом спостерігаються зміни, характерні для ІІІ-ІV ступеня дисбактеріозу - протягом 48-120 годин відбувається прогресивне зменшення вмісту лактобактерій та елімінація еубактерій, аеробних стрептобацил, ентерококів і біфідобактерій, що супроводжується колонізацією біотопу патогенними та умовно патогенними ентеробактеріями та іншими мікроорганізмами.

3. Зміни мікробіоти приепітеліальної біоплівки слизової оболонки товстої кишки характеризуються помірним дефіцитом при набряковій формі та більш значним дефіцитом або повною елімінацією симбіонтів із групи домінантних облігатних автохтонних бактерій (біфідобактерій, лактобактерій, еубактерій, ентерококів) при деструктивній формі гострого панкреатиту. Слизову оболонку активно заселяють ентеробактерії та інші внутрішньопросвітні мікроорганізми, які досягають значного популяційного рівня (3,70±0,18 - 5,36±0,31 lg КУО/г).

4. Колонізаційна резистентність слизової оболонки тонкої кишки при гострому панкреатиті порушується за рахунок глибоких змін мікробіоти приепітеліального шару. У дослідних тварин з набряковою формою захворювання після 24 год відбувається зменшення популяційного рівня біфідобактерій та лактобактерій, а при деструктивній формі з 48 год і до кінця експерименту (120 год) облігатні автохтонні мікроорганізми не визначаються в жодному спостережені. Настає колонізація мукозного шару патогенними та умовно патогенними ентеробактеріями й іншими факультативними та алохтонними мікроорганізмами на високому популяційному рівні (більше 5,00 lg КУО/г), що дозволяє даній мікрофлорі подолати захисний бар'єр приепітеліального шару і здійснювати транслокацію у внутрішні органи.

5. Транслокація (міграція) бактерій із тонкої і товстої кишки в портальну кров і мезентеріальні лімфатичні вузли настає в 14,6% тварин уже через 6 годин від початку захворювання при деструктивній формі гострого панкреатиту і через 12 годин - у тварин із набряковою формою. Транслокація посилюється зі збільшенням терміну спостереження і досягає 100% після 48 год експерименту у тварин із гострим деструктивним панкреатитом.

6. Ешеріхії і епідермальний стафілокок першими проникають у некротичні тканини підшлункової залози, мезентеріальні лімфовузли, внутрішні органи, портальну та системну кров. Після 48-ї години експерименту внутрішні органи тварин із деструктивною формою гострого панкреатиту колонізують патогенні (E. coli Hly+, S. aureus) та умовно патогенні бактерії (K. pneumonia, E. tarda, P. mirabilis), їх популяційний рівень прогресивно зростає і досягає 6,39±0,11 - 7,15±0,13 lg КУО/г через 7 діб спостереження.

7. Вторинна бактеріальна інфекція тканин підшлункової залози, що виникає в результаті транслокації бактерій із порожнини і приепітеліального шару слизової оболонки товстої і тонкої кишки, безпосередньо впливає на перебіг гострого експериментального панкреатиту і розвиток ускладнень. У 42,8% тварин із гострим деструктивним панкреатитом наступило нагноєння вогнищ деструкції підшлункової залози з розвитком сепсису. На підставі аналізу отриманих результатів дослідження бактеріального вмісту порожнини товстої кишки розроблений і впроваджений в практику охорони здоров'я спосіб, який дозволяє прогнозувати інфікування підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті.

Практичні рекомендації

1. Порушення складу кишкової мікрофлори, а саме ступінь дисбактеріозу порожнини товстої кишки при гострому деструктивному панкреатиті доцільно використовувати як критерій діагнозу інфікування підшлункової залози: при І-ІІ ступені дисбактеріозу інфікування відбувається в 70% спостережень умовно патогенними ентеробактеріями та стафілококами, а при ІІІ-ІV ступені - в 96% випадків патогенними та умовно патогенними ентеробактеріями та золотистим стафілококом.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Горченко Д. В. Експериментальний гострий панкреатит / Д. В. Горченко, О. В. Ротар, І. Й. Сидорчук // Клінічна та експериментальна патологія. - 2007. Т. 6, № 1. - С. 78-81. (Здобувачем виконано аналітичний огляд літературних джерел методів моделювання гострого панкреатиту та підготовлена стаття до друку).

2. Ротар Д. В. Бактеріальна контамінація підшлункової залози при гострому панкреатиті / Д. В. Ротар // Буковинський медичний вісник. - 2008. - Т. 12, № 1. - С. 104-109.

3. Ротар Д. В. Бактеріальна контамінація внутрішніх органів при експериментальному гострому панкреатит / Д. В. Ротар // Український журнал хірургії. - 2008. - № 1. - С. 78-85.

4. Ротар В. І. Бактеріальна флора підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті / В. І. Ротар, І. Й. Сидорчук, Д. В. Ротар, В. М. Коновчук, С. Є. Дейнека, О. В. Ротар // Клінічна та експериментальна патологія. - 2008. - Т. 8, № 4 - С. 37-41. (Здобувачем обрана тема роботи, проведено моделювання гострого деструктивного панкреатиту, виконано забір матеріалу, його обробку та проведено мікробіологічне дослідження, зроблено статистичну обробку результатів і підготовлено матеріал до друку).

5. Ротар Д. В. Мікрофлора слизової оболонки дистальних відділів тонкої кишки в експериментальних тварин із гострим деструктивним панкреатитом Д. В. Ротар, І. Й. Сидорчук, С. Є. Дейнека, О. В. Ротар, В. І. Ротар // Вестник клуба панкреатологов. - 2009. - № 4. - С. 46-48. (Дисертантом проведено мікробіологічне дослідження тонкої кишки експериментальних тварин та підготовлено матеріал до друку).

6. Патент № 39097 Україна, МПК Спосіб визначення інфікування підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті / Д. В. Ротар, І. Й. Сидорчук, О. В. Ротар, В. І. Ротар, О. П. Селізар, О. І. Полянський, Р. В. Ротар. - № 39097 ; заявл. 25.06.2008 ; опубл. 10.02.2009, Бюл. № 3. - 6 с. (Дисертантом науково обґрунтовано спосіб, проведено експериментальні дослідження, підготовлено та оформлено заявку на винахід).

7. Спосіб визначення інфікування підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті / Д. В. Ротар, І. Й. Сидорчук, О. В. Ротар, В. І. Ротар, О. П. Селізар, О. І. Полянський, Р. В. Ротар // Реєстр галузевих нововведень № 391/31/09. - Вип. 30 - 31. - Київ, 2009. (Дисертантом науково обґрунтовано спосіб, проведено експериментальні дослідження, підготовлено та оформлено нововведення).

8. Ротар Д. В. Зміни колонізаційної резистентності кишківника при гострому панкреатиті / Д. В. Ротар, І. Й. Сидорчук, О. В. Ротар // Біль, знеболення, інтенсивна терапія. - 2008. - № 2 Д. - С. 256. (Дисертантом виконано моделювання гострого панкреатиту, вивчено зміни мікробіоти кишечника шляхом мікробіологічного дослідження, підготовлено матеріал до друку).

9. Ротар Д. В. Энтеральная недостаточность при остром панкреатите / Д. В. Ротар, В. Н. Коновчук, В. И. Ротар // Сибирский консилиум. - 2008. - № 2. - С. 38. (Здобувачем сформовано мету та завдання, проведено статистичну обробку даних та їх узагальнення).

10. Ротар Д. В. Микрофлора поджелудочной железы при остром панкреатите Д. В. Ротар, И. Й. Сидорчук, А. В Ротар // Сибирский консилиум. - 2008. - № 2. - С. 62. (Здобувачем проведено мікробіологічне дослідження підшлункової залози експериментальних тварин з гострим панкреатитом, оформлено результати, підготовлено матеріал до друку).

11. Ротар О. В. Використання перфторану в інфузійній терапії гострого панкреатиту / О. В. Ротар, В. М. Коновчук, В. І. Ротар, С. О. Акентьєв, Д. В. Ротар // Український хіміотерапевтичний журнал. - 2008. - № 1 - 2. - С. 390-391. (Здобувач брала участь у формуванні мети, проведенні досліджень та підготовці матеріалу до друку).

12. Ротар Д. В. Патофізіологічні аспекти виникнення інфекційних ускладнень гострого деструктивного панкреатиту / Д. В. Ротар, І. Й. Сидорчук,О. В. Ротар // Клінічна хірургія. - 2009. - № 11 - 12. - С. 74. (Здобувачем виконано моделювання експериментального набрякового та деструктивного панкреатиту, підготовлено матеріал до друку).

13. Ротар Д. В. Динаміка інфікування підшлункової залози при гострому панкреатиті / Д. В. Ротар // Пробіотики в лікуванні інфекційних хвороб : всеукр. наук. - практ. конф., 5-6 вер. 2007 р. : тези доповідей. - Тернопіль, 2007. - С. 52.

14. Ротар Д. В. Зміни мікрофлори порожнини товстої кишки експериментальних тварин з гострим панкреатитом середньої тяжкості / Д. В. Ротар, І. Й. Сидорчук // Пробіотики в лікуванні інфекційних хвороб : всеукр. наук.-практ. конф., 5-6 вер. 2007 р. : тези доповідей. - Тернопіль, 2007. - С. 51. (Здобувачем виконано мікробіологічне дослідження вмісту порожнини товстої кишки експериментальних тварин із гострим панкреатитом середньої тяжкості та підготовлено матеріал до друку).

15. Ротар Д. В., Мікрофлора підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті / Д. В. Ротар, І. Й. Сидорчук, О. В. Ротар, В. І. Ротар // 12-й Конгрес світової федерації українських лікарських товариств, 15-18 вересня 2008 р. : тези допов. - Ів.-Франківськ, 2008. - С. 143. (Дисертантом виконано мікробіологічне дослідження підшлункової залози експериментальних тварин із гострим деструктивним панкреатитом, підготовлено матеріал до друку).

16. Ротар Д. В. Стан мікрофлори товстої кишки експериментальних тварин при набряковій формі гострого панкреатиту / Д. В. Ротар // 12-й Конгрес світової федерації українських лікарських товариств, 15-18 вересня 2008 р. : тези допов. - Ів.-Франківськ, 2008. - С. 215-216.

17. Ротар Д. В. Інфікування підшлункової залози при гострому деструктивному панкреатиті / Д. В. Ротар, В. І. Ротар, В. М. Коновчук, О. В. Ротар // Простір і час сучасної науки : матеріали 4-ї наук.-практ. інтернет-конф., 24-26 квіт. 2008 р. - Київ, 2008. - С. 72-73. (Здобувачем виконано мікробіологічне дослідження дослідного матеріалу та написання тексту тез).

17. Ротар Д. В. Мікроекологія порожнини дистального відділу тонкої кишки білих щурів при експериментальному гострому набряковому панкреатиті / Д. В. Ротар // Здобутки клінічної та експериментальної медицини : матеріали всеукр. наук.-практ. конф., 4 черв. 2009 р. - Тернопіль, 2009. - С. 142.

19. Ротар Д. В. Мікроекологія підшлункової залози при гострому панкреатиті Д. В. Ротар, О. В.Ротар, І. Й. Сидорчук // ХІІ з'їзд товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, 25 - 30 травня 2009 р. : тези доповідей. - Ужгород, 2009.- С. 248. (Дисертантом проведено моделювання гострого панкреатиту, мікробіологічне дослідження підшлункової залози експериментальних тварин, підготовлено матеріал до друку).

АНОТАЦІЯ

Ротар Діана Вікторівна. Мікрофлора кишечника та її транслокація у внутрішні органи експериментальних тварин із гострим панкреатитом - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Державна установа «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України». - Харків, 2010.

Встановлено, що експериментальний гострий панкреатит супроводжується розвитком дисбактеріозу товстої та дистального відділу тонкої кишки за рахунок дефіциту або елімінації автохтонних облігатних бактерій, підвищення популяційного рівня умовно патогенних мікроорганізмів та контамінації вмісту кишечника патогенними та умовно патогенними ентеробактеріями.

Доведено, що надмірна колонізація слизової оболонки тонкої та товстої кишки патогенними та умовно патогенними бактеріями підвищує проникливість кишечника і супроводжується транслокацією бактерій в регіональні мезентеріальні вузли, портальну кров, очеревину і внутрішні органи.

Ключові слова: гострий панкреатит, дисбактеріоз кишечника, бактеріальна транслокація.

АННОТАЦИЯ

Ротарь Диана Викторовна. Микрофлора кишечника и её транслокация во внутренние органы экспериментальных животных с острым панкреатитом - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Государственное учреждение «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова АМН Украины». - Харьков, 2010.

Диссертация посвящена изучению механизмов развития гнойно-септических осложнений острого панкреатита. Работа имеет экспериментальный характер, выполнена на 160 белых крысах с использованием аргининовой модели острого панкреатита.

Установлено, что экспериментальный острый панкреатит сопровождается развитием дисбактериоза толстой и дистального отдела тонкой кишки за счет дефицита или элиминации автохтонных облигатных бифидобактерий, лактобактерий, эубактерий, энтерококков, аэробных стрептобацил, увеличения популяционного уровня условно патогенных факультативных клостридий, стафилококков, протея и контаминации содержимого кишечника патогенными (энтеротоксигенными эшерихиями) и условно патогенными (клебсиелами, эдварсиелами) энтеробактериями, а также дрожжеподобными грибами рода Candida.

Степень дисбактериоза содержимого толстой и дистального отдела тонкой кишки прямо зависит от тяжести острого панкреатита. При отёчной форме острого панкреатита дефицит автохтонных облигатных анаэробных бактерий нарастает постепенно и после 48 часов составляет 28-35% показателей интактных животных, одновременно на 35-35% повышается популяционный уровень ешерихий, протея и клебсиел, что соответствует дисбактериозу I-ІІ степени. У животных с острым деструктивным панкреатитом наблюдаются изменения, характерные для ІІІ-ІV степени дисбактериоза - на протяжении 48-120 часов происходит прогрессивное уменьшение содержимого лактобактерий и полная элиминация эубактерий, аэробных стрептобацил, энтерококков и бифидобактерий, что сопровождается колонизацией патогенными и условно патогенными энтеробактериями, бактериями рода Cloctrudium, пептококком, пептострептококками, стафилококками и дрожжеподобными грибами рода Candida, которые по коэффициенту количественного доминирования и индексу значимости приобретают ведущее значение.

Колонизационная резистентность слизистой оболочки тонкой кишки при остром панкреатите нарушается за счет глубоких изменений микробиоты приэпителиального слоя. У животных с отечной формой заболевания после 24 ч происходит уменьшение популяционного уровня бифидобактерий и лактобактерий на 1,5-2,0 lg КУО/г (р<0,05), а при деструктивной форме с 48 ч и до конца эксперимента (120 ч) указанные и другие облигатные автохтонные микроорганизмы не выделяются, что предопределяет колонизацию мукозного слоя патогенными и условно патогенными энтеробактериями, стафилококками, клостридиями, пептококом, пептострептококком, превотелами и дрожжеподобными грибами рода Candida на высоком популяционном уровне, разрешает данной микрофлоре преодолеть защитный барьер приэпителиального слоя и осуществлять транслокацию во внутренние органы.

Доказано, что при чрезмерной колонизации слизистой оболочки тонкой и толстой кишки патогенными и условно патогенными бактериями повышается проницаемость кишечника и происходит миграция (транслокация) бактерий в региональные мезентериальные лимфоузлы, портальную кровь, брюшину и внутренние органы. При остром отёчном панкреатите наступает кратковременная (в 71,4-85,7% наблюдений с 12 до 48 ч, а через 72 ч - существенно снижается) транслокация условно патогенных кишечных палочек, стафилококков и бактероидов в поджелудочную железу, мезентериальные лимфатические узлы, селезенку, печень, брюшную полость и в кровь портальной вены, где эти микроорганизмы оказываются в минимальных количествах. Формирование и развитие экспериментального острого деструктивного панкреатита характеризуется времязависимой бактериальной транслокацией во внутренние органы: наступает через 6 ч в мезентериальные лимфатические узлы и портальную кровь в 14,2% белых крыс, через 12 ч - в поджелудочную железу, брюшинную полость, селезенку, печень, системную кровь и ткань легких в 57,1%, а через 24 ч - в 100% в указанные биотопы и плевральную полость. Популяционный уровень микроорганизмов возрастает до 48 ч и в дальнейшем постепенно уменьшается во всех биотопах, кроме поджелудочной железы, где на протяжении 72-168 ч достигает 7,54 - 7,76 lg КУО/г. Ведущими возбудителями за индексом значимости и коэффициентом количественного доминирования на ранних этапах выступают E. coli и S. epidermidis в ассоциации с энтеробактериями, а на поздних - E. Coli Hly+, S. auereus, K. pneumonia, E. tarda, P. mirabilis в ассоциации с B. fragilis и C. albicans.

Установленные изменения в видовом составе и популяционном уровне микрофлоры просвета толстой кишки при остром деструктивном панкреатите могут использоваться как критерии прогнозирования инфицирования поджелудочной железы.

Ключевые слова: острый панкреатит, дизбактериоз кишечника, бактериальная транслокация.

SUMMARY

Rotar Diana Viktorivna. Intestinal microflora and its translocation in internal organs of experimental animals with acute pancreatitis. - Manuscript.

The thesis for obtaining the academic degree of a candidate of medical science in speciality 03.00.07 - Microbiology - SE «I.I. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the AMS of Ukraine». - Kharkiv, 2010.

The dissertation paper deals with the question of mechanism of development of purulent and septic complications of acute pancreatitis.

It is established, that the experimental acute pancreatitis is accompanied by dysbacteriosis of large and distal part of small bowel as a result of deficiency or elimination of autochtonous obligate bacteria, increasing concentration of conditionally pathogenic microorganisms and contamination of intestine by pathogenic and conditionally pathogenic Enterobacteria sp.

It is proved that excessive colonization of a mucus of large and small bowel by pathogenic and conditionally pathogenic bacteria increases gut permeability and is followed by bacterial translocation in regional mesenteric lymph nodes, portal blood, peritoneal cavity and internal organs.

Key words: acute pancreatitis, intestinal dysbacteriosis, bacterial translocation.

Размещено на Allbest.ur