Мінливість будови плоду та квітки Arabidopsis thaliana (l.) Heynh. під впливом мутантних алелів генів clv1 та ap1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ

СЕЛЕКЦІЙНО-ГЕНЕТИЧНИЙ ІНСТИТУТ - НАЦІОНАЛЬНИЙ ЦЕНТР НАСІННЄЗНАВСТВА ТА СОРТОВИВЧЕННЯ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Мінливість будови плоду та квітки

Arabidopsis thaliana (l.) Heynh. Під впливом мутантних алелів генів clv1 та ap1

03.00.15 ? генетика

Медвідь ОЛЬГА МИХАЙЛІВНА

Одеса - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біології рослин Луганського національного аграрного університету, м. Луганськ

Науковий керівник: доктор біологічних наук

старший науковий співробітник

ЧЕЧЕНЄВА Тетяна Миколаївна,

Національний університет біоресурсів і природокористування України

Кабінету Міністрів України,

завідувач кафедри молекулярної

генетики та біобезпеки

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

ВОЛКОВ Роман Анатолійович,

Чернівецький національний університет ім. Ю. Федьковича, завідувач кафедри молекулярної генетики та біотехнології

кандидат біологічних наук, доцент,

старший науковий співробітник

СІЧНЯК Олександр Львович,

Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова,

доцент кафедри генетики і молекулярної біології

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження генетичного контролю онтогенезу квітки та плоду є актуальною науковою проблемою генетики рослин. В арабідопсиса Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) установлено ряд генів, що контролюють фенотипові ознаки квітки та плоду рослин. Провідними серед них є структурні гени CLAVATA1 та APETALA1. Генетичний контроль якісних та кількісних ознак розвитку квітки і плоду під впливом означених генів та їх рецесивних мутантних алелів clv1-1 та ap1-1, характер взаємодії генів вивчено недостатньо.

Самозапильний вид Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. з родини Brassicaceae є провідним модельним об'єктом сучасної генетики рослин, завдяки секвенованому та невеликому за розміром геному (2n=10), короткому періоду вегетації, високій насіннєвій продуктивності, який в умовах лабораторії можна культивувати незалежно від сезону. За використання сучасних методів молекулярної генетики та генетичної інженерії арабідопсис є джерелом генів при створенні цінного вихідного матеріалу для селекції рапсу, рису, лимону, інших культурних рослин (Norico, 2003; Радчук, Блюм, 2005; Shimizu, 2005; Sandhu, 2009).

Дотепер картовано лише близько 500 структурних генів арабідопсиса. Групи зчеплення та сайти більшості генів на генетичній карті не визначено, що спричиняє труднощі при здійсненні генетичного аналізу фенотипових ознак та картуванні генів (Ежова, 2003). Тому актуальним є отримання полімутантних гомозиготних за рецесивними алелями ліній, що марковані якомога більшою кількістю зчеплених і незчеплених генів з відомою локалізацією, фенотипи яких легко візуально діагностувати на різних етапах онтогенезу. Виділені лінії доцільно використовувати для розширення можливостей генетичного аналізу та досліджень у напрямі функціонування геному арабідопсиса.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження за темою дисертаційної роботи виконувались протягом 2005-2008 рр. у межах науково-дослідної роботи кафедри біології рослин Луганського національного аграрного університету (ЛНАУ) «Синтез і вивчення полімаркерних ліній арабідопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)», номер державної реєстрації 0108U010056.

Мета і завдання дослідження. Метою досліджень було вивчення генетичних механізмів регулювання розвитку квітки і плоду арабідопсиса під впливом рецесивних мутантних алелів за картованими генами clv1 та ap1 на рівні органів і рослини в цілому, з урахуванням взаємодії між цими генами.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:

- провести морфо-біологічний аналіз будови квіток та плодів мутантних ліній за рецесивними алелями clv1-1, ap1-1 та ap1-3;

- дослідити характер сумісної дії генів clv1 та ap1 на органи квітки та плоду;

- створити гомозиготні лінії за трьома, п'ятьма та сьома рецесивними генами за всіма групами зчеплення арабідопсиса за участі досліджуваних рецесивних алелів;

- дослідити молекулярно-генетичні особливості організації геному мутантних ліній за алелями er-1, clv1-1, ap1-1.

Об'єкт дослідження - генетичний контроль структури квітки та плоду мутантних ліній Arabidopsis thaliana.

Предмет дослідження - вплив мутантних алелів генів clv1 та ap1 на кількісні та якісні ознаки квітки та плоду Arabidopsis thaliana.

Методи дослідження: гібридологічний, порівняльно-морфологічний, RAPD- аналіз, статистичний.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше встановлено, що фенотиповим проявом алеля clv1-1 (булавоподібний плід) є три-чотиригніздий плід, що розкривається трьома-чотирма стулками - коробочка. Доведено, що мутантний ген clv1 призводить до збільшення кількості насіння в плоді на 30% порівняно з ефектом гену er.

Виявлено плейотропний ефект дії рецесивного алеля ap1-1 (безпелюсткова квітка) на чашолистки, пелюстки, тичинки та плодолистки, який призводить до зменшення середніх значень цих органів. Підтверджено, що зниження температури повітря спричиняє диференційну модифікаційну мінливість структури квіток рослин лінії за алелями ap1-1, er-1. Доведено, що алель ap1-3 суттєво змінює будову квітки: зменшує кількість чашолистків, тичинок та призводить до повної відсутності пелюсток, має плейотропний ефект.

На основі проведеного RAPD- аналізу встановлено відмінність в організації геному ліній арабідопсиса NW20, N28, N45 та Lug228. Найбільш генетично подібними є мутантна лінія за рецесивними генами clv1-1,er-1 та гомозиготний трирецесив за алелями ap1-1,clv1-1,er-1.

Шляхом ступінчатої гібридизації, добору фенотипів в F₃ та розмноження, отримано нові три-, пента- та гептамутантні рецесивні лінії. Нова полімутантна тест-лінія Lug62 за генами ap1-1,bp-1,clv1-1,dis2-1,er-1,gl1-1,tfl1-2 маркована трьома зчепленими рецесивними алелями за самою великою 1 хромосомою та одним рецесивним алелем за 2, 3, 4 та 5 хромосомами гаплоїдного набору.

Практичне значення отриманих результатів. Виділені лінії Arabidopsis thaliana, що марковані трьома, п'ятьма та сьома рецесивними генами, значно спрощують роботу щодо збереження колекцій мутантних ліній арабідопсиса у порівнянні з мономутантними лініями: одну лінію технічно легше підтримувати, ніж три або сім вихідних ліній. Полімутантні лінії доцільно використовувати для генетичного аналізу арабідопсиса методами молекулярної генетики та генетичної інженерії.

Видано каталог генетичної колекції арабідопсиса Луганського НАУ «Lugansk Arabidopsis Seed Stock Center» з описом кожної лінії. Каталог призначений для планування та проведення наукових експериментів щодо картування генів, мутагенезу, генетичної інженерії з використанням нових полімутантних ліній арабідопсиса.

Результати роботи використовуються у навчальному процесі при викладанні курсу генетики для студентів вищих навчальних закладів III-IV рівнів акредитації.

Особистий внесок здобувача полягає в розробці планів експериментів, проведенні всіх досліджень, аналізі та узагальненні результатів, статистичній обробці матеріалів і підготовці до друку наукових статей. Частка особистої участі дисертанта в публікаціях зі співавторами складає 20-80%.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень за темою дисертації доповідались на XII з'їзді Українського ботанічного товариства (Одеса, 2006); міжнародній конференції «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007); VIII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавілова (Алушта, 2007); Х конференції молодих дослідників «Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики та біотехнології» (Київ, 2007); IV міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2008); III міжнародній конференції молодих вчених «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2008); міжнародній науково-практичній конференції «Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008); міжнародній науковій конференції «Синтетична теорія еволюції: стан, проблеми, перспективи» (Луганськ, 2009).

Публікації. За результатами досліджень, представлених в дисертації, опубліковано 17 наукових праць, з них 10 статей в фахових виданнях, затверджених ВАК України, 1 стаття в іноземному виданні, 1 каталог та 5 тез доповідей матеріалів наукових конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі списку умовних позначень та скорочень; вступу; п'яти розділів: огляд літератури, матеріали і методи досліджень, власні дослідження (3 розділи) та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів; висновків; списку використаних джерел наукової літератури (187 найменувань, з них 78 - іноземних). Роботу викладено на 120 сторінках тексту, включає 18 таблиць, 24 рисунка.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

АРАБІДОПСИС ЯК ОБ'ЄКТ ГЕНЕТИЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ГЕНЕРАТИВНИХ ОРГАНІВ РОСЛИН

(огляд літератури)

В огляді літератури наведено узагальнені дані про Arabidopsis thaliana як модельний об'єкт сучасної генетики рослин. Детально розглянуто механізм генетичного контролю розвитку квітки та плоду арабідопсиса. Окремий розділ присвячений міжнародним центрам зразків та генетичній номенклатурі A. thaliana.

Матеріали та методи досліджень

В дослідженнях використано лінії, насіння яких було отримано з Ноттінгемського центру зразків арабідопсиса у Великій Британії (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, NASC) (Seed List, 1994) та лінії, створені в Луганському національному аграрному університеті. Вихідні димутанти отримані на генетичній основі лінії Landsberg erecta, які у гомозиготному стані є носіями алеля er-1. Загальну характеристику ліній за фенотиповими ознаками з наявною локалізацією мутацій за групами зчеплення наведено в табл. 1.

Таблиця 1

Лінії Arabidopsis thaliana, використані в роботі

Дослідження проводили в лабораторії світлокультури ЛНАУ. Для яровизації насіння витримували в холодильній камері протягом 5 діб при температурі 4-6^оС. Далі до посіву пророщували його при кімнатній температурі. Ґрунтосуміш містила 4 частини ґрунту, 2 частини піску і 1 частину торфу. Освітлення було цілодобове і складало 4000-7000 люкс (Петров, 1973; Соколов, 2003). Оптимальною для культивування рослин арабідопсиса є температура 18-22⁰С. Вплив температури на органи квітки вивчали при +22⁰С та + 10⁰С.

Для отримання нових ліній арабідопсиса проводили гібридизацію наявних ліній, з подальшим індивідуальним добором рослин в поколіннях, що розщеплюються. Кастрацію та примусову гібридизацію здійснювали за допомогою мікроскопу (МБС-1) з бінокулярною насадкою. Генетичний аналіз успадковування будови квітки та форм плоду виконували в F₂, обсяг вибірки в дослідах складав 196-392 рослини. Механізми генетичного контролю розвитку квітки та плоду визначали шляхом порівняльно-морфологічного аналізу ди- та тримутантних ліній з вихідною лінією Landsberg erecta. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції визначали коефіцієнти генетичної подібності досліджуваних ліній. В роботі використано 17 RAPD-праймерів з довільною нуклеотидною послідовністю.

Для обробки кількісних ознак будови квіток та плодів використовували методи математичної статистики (Доспехов, 1985; Лакин, 1990). Обчислення проводили на персональному комп'ютері за програмами, розробленими на кафедрі біології рослин ЛНАУ (Соколов, 2001) та за допомогою пакету програм системи STATISTICA для Windows (Боровиков, 2003). Взаємодію генів за кількістю органів квітки визначали через розрахунок достовірності епістатичного відхилення i^ab та його статистичної похибки s_i^ab (Сыч, 2002).

Мінливість будови квітки та плоду під впливом мутантних алелів генів clv1 та ap1

Квітка та плід A. thaliana екотипу Landsberg (La0) та мутантної лінії Landsberg erecta. У результаті проведених досліджень доведено, що будова квітки та плоду лінії La0 та мутантної лінії Landsberg erecta (за алелем er-1) подібні. В La0 квітка складається з 4 чашолистків, 4 білих пелюсток, 6 тичинок і 2 зрощених плодолистків (карпел) (рис. 1.1). У рослин екотипу La0 за кількістю органів квітки практично не спостерігається різноманітність. Плід лінії La0, що розвивається із зав'язі маточки, є стручком - сухим двогніздим плодом, що розкривається двома стулками. Насіння прикріплене до перегородки в плоді. Стручки не вкриті волосками, голі. Плоди направлені криво догори. Верхівка стручка гострувата. Плодоніжки приблизно однієї довжини зі стручками.

Будова квітки лінії за рецесивним алелем clv1-1 (булавоподібний плід). В ході проведення експерименту встановлено, що квітка гомозиготної лінії за генами clv1-1, er-1 повна. Вона утворена 4 чашолистками, 4 пелюстками, в середньому 6 тичинками та маточкою з 4 зрощених карпел (рис. 1.2). За наявності у генотипі алеля clv1-1 у два рази збільшується кількість карпел і на 4% - кількість тичинок. Спостерігається тенденція до збільшення кількості чашолистків. Загалом, алель clv1-1 - алель-підсилювач майже всіх ознак (плюс-алель). Його вплив на різні ознаки (число чашолистків, тичинок та карпел) є наслідком плейотропної дії гена clv1.

Формування плодів під впливом рецесивного алеля clv1-1. У лінії N45 плід - нетиповий стручок. Незвичайний сухий плід формується із зав'язі, утвореної 3-4 карпелами, відповідно і плід розкривається 3-4 швами. Важливою відмінністю плодів є їх особлива форма, схожа на булаву. У верхній частині він зазвичай розширений та поступово звужується донизу (до плодоніжки). Дивовижною особливістю плоду мутантної лінії за генами clv1-1, er-1 є утворення всередині нього ще однієї маточки. Таким чином, нами вперше встановлено, що плід у особин генотипу clv1-1clv1-1er-1er-1 - три-чотиригнізда коробочка, що розкривається 3-4 стулками, а не стручок, як систематики вважали раніше. Збільшене число гнізд у плодів лінії N45 забезпечило утворення більшої кількості насіння в ньому, що дає можливість припустити його інтерес для селекції рослин родини Brassicaceae.

Вплив рецесивного алеля ap1-1 (безпелюсткова квітка) на формування квітки. На основі результатів, отриманих при вивченні будови квітки лінії N28 та вихідної лінії NW20, встановлено, що алель ap1-1 у гомозиготному стані значущо зменшує середнє фенотипове значення кількості чашолистків, майже повністю виключає формування пелюсток та зменшує кількість тичинок (рис. 1.3).

Формула квітки екотипу La0 - Ca₄Co₄A₆G₍₂₎, у квіток лінії за алелями ap1-1,er-1 вона чітко відмінна: Ca_(0-6)Co_(0-3)A_(3-7)G₍₂₎. Пуп'янок у лінії безпелюсткова квітка, еректоїдне стебло внаслідок зменшення ширини чашолистків виглядає незвично. Органи квітки (пелюстки, тичинки і маточка) висовуються назовні за межі чашолистків та стирчать в різні боки. Відмічено, що після цвітіння чашолистки зберігаються довше. Відсутність пелюсток у квітках димутантної лінії за рецесивними алелями ap1-1,er-1 робить їх зручними для проведення гібридизації. Плід під впливом алеля ap1-1, що розвивається із зав'язі маточки, є стручком - сухим двогніздим плодом, що розкривається двома стулками.

Рецесивний алель ap1-1 впливає на три органи квітки: на чашолистки, пелюстки і тичинки. Твердження про те, що мутації гена ap1 не впливають на тичинки (Krizek, 1999, 2000), є помилковими. Ця помилка спричиняє необґрунтоване віднесення apetala1 до генів класу A (в межах так званої ABC моделі генетичного контролю розвитку квітки), тобто до тих, що специфічно впливають тільки на розвиток чашолистків та пелюсток. Загалом, рецесивний алель ap1-1 призводить до зменшення кількості майже всіх органів квітки, має місце плейотропна дія гена ap1.

Будова квітки димутантної лінії N6163 за алелями ap1-3,er-1 (безпелюсткова квітка, еректоїдне стебло). Порівняльні дослідження квіток димутантних ліній N28 та N6163 показали, що алель ap1-3 в гомозиготному стані значно зменшує середні фенотипові значення кількості чашолистків, майже повністю виключає формування пелюсток та зменшує кількість тичинок. За результатами досліджень можна стверджувати, що на всі досліджені ознаки квітки алель ap1-3 впливав сильніше, ніж алель ap1-1. Віднесення ap1-3 до так званих слабких (weak) алелів (за літературними даними) нами не підтверджено. Таким чином, доведено, що алель ap1-3, як і алель ap1-1, є сильним алелем з плейотропним ефектом.

Прояв дії алеля ap1-1 в залежності від температури. Згідно з літературними даними температура модифікує процес утворення пелюсток (Seed List, 1994). Нами було встановлено, що зниження температури викликає у рослин лінії N28 зменшення кількості чашолистків, збільшує кількість пелюсток і не впливає на кількість тичинок. У зв'язку з цим відмітимо, що кількість плодолистків у квітках рослин з рецесивним алелем ap1-1 практично константна і дорівнює двом. Зменшення кількості чашолистків компенсується збільшенням кількості пелюсток. В результаті, сумарна кількість органів квітки не змінюється, тобто спостерігається наявність диференційного модифікуючого впливу температури на формування органів квітки.

Створення гомозиготних полімутантних ліній арабідопсиса за картованими рецесивними генами

Тримутантна лінія за генами, що зумовлюють ознаки безпелюсткова квітка, булавоподібний плід, еректоїдне стебло (ap1-1, clv1-1, er-1). Для створення тримутантної лінії за картованими рецесивними генами ap1-1, clv1-1, er-1 були використані батьківські лінії булавоподібний плід, еректоїдне стебло (N45) та безпелюсткова квітка, еректоїдне стебло (N28). Рецесивний аллель clv1-1 в гомозиготному стані обумовлює утворення три-чотиригніздої коробочки. Фенотип лінії за рецесивними генами ap1-1,er-1: пелюстки зазвичай відсутні, еректоїдне стебло. За умов незалежного успадковування ознак, розщеплення в F₂ відбувалося би з урахуванням двох мутантних генів ap1 та clv1 за схемою дигібридного схрещування 9:3:3:1. Генотип + - AP1AP1clv1-1clv1-1er-1er-1, генотип > - ap1-1ap1-1CLV1CLV1er-1er-1. Генотип F₁ від схрещування батьківських ліній - AP1ap1-1CLV1clv1-1er-1er-1. У F₁ спостерігали повне домінування ознак дикого типу (ap1-1<AP1, clv1-1<CLV1), тому всі особини F₁ мали квітки з пелюстками, плоди - стручки. Оскільки вихідні лінії гомозиготні за рецесивним алелем er-1, всі рослини мали еректоїдне стебло, далі розщеплення розглядається без участі гена er.

Але слід зауважити, що гени ap1 та clv1 зчеплені. З цієї причини в F₂ буде спостерігатися відхилення від незалежного розподілу. Ген ap1 розташований в локусі 99 першої хромосоми. Ген clv1 теж розташований в першій хромосомі, локус 110 (Ежова, 2003). Відстань між цими генами складає 11 сМ, тобто відсоток кросинговера між ними рівний ~ 11. Розщеплення буде йти за нижче наведеною схемою.

Далі розщеплення та частоти генотипів в F₂ розглянемо за решіткою Піннета

Внаслідок кросинговеру рослини з генотипами ap1-1CLV1AP1clv1-1, AP1CLV1AP1clv1-1, AP1CLV1ap1-1CLV1, AP1CLV1AP1CLV1 мають фенотип квітки з пелюстками, плід стручок; з генотипами AP1clv1-1AP1clv1-1, ap1-1clv1-1AP1clv1-1 - квітки рослин з пелюстками, плід коробочка; з генотипами ap1-1CLV1ap1-1CLV1, ap1-1clv1-1ap1-1CLV1 - квітки рослин без пелюсток, плід стручок; з генотипом ap1-1clv1-1ap1-1clv1-1 - квітки рослин без пелюсток, плід коробочка.

Для встановлення очікуваної частоти рослин генотипу ap1-1ap1-1clv1-1clv1-1er-1er-1 провели теоретичні розрахунки. Встановили, що частота рослин в F₂ складає 0,3% (3 рослини з 1000). Виділити мутантну лінію за рецесивними алелями ap1-1, clv1-1, er-1 в F₂ дуже складно, внаслідок необхідності дослідити завеликий обсяг вибірки. З вибірки у 196 рослин F₂ зібрали насіння: з 14 рослин фенотипу «квітки з пелюстками, плоди - коробочки» (генотип AP1-clv1-1clv1-1) та 14 рослин фенотипу «квітки без пелюсток, плоди - стручки» (генотип ap1-1ap1-1CLV1-). Достовірність розщеплення в F₂ була оцінена за критерієм ч² (табл. 2).

Таблиця 2

Розщеплення в поколінні F₂ за генами AP1 та CLV1

Порівнюючи ч² із ч ²_st, встановили, що ч ² > ч ²_st. Отже, гіпотеза про розщеплення у відношенні 9:3:3:1 в F₂ не підтверджується. Зібране насіння вказаних вище фенотипів культивували окремо, загальний обсяг вибірки 392. У F₃ розщеплення було виявлено в 5 сім'ях рослин. Таким чином в результаті проведеної гібридизації та добору в F₃ було отримано тримутантну лінію за рецесивними алелями ap1-1,clv1-1,er-1 (Lug228). Фенотип рослин - безпелюсткова квітка, булавоподібний плід, еректоїдне стебло (рис. 2.1). Фенотипові ознаки лінії Lug228 легко ідентифікуються на ранніх етапах онтогенезу та зберігаються упродовж вегетаційного періоду.

Створена тримутантна лінія за генами ap1-1,clv1-1,er-1 представляє як теоретичний, так і певний практичний інтерес. Розташовані в першій хромосомі алелі ap1-1 та clv1-1 виявляють зчеплення майже зі всіма генами цієї хромосоми. Присутність алеля ap1-1 призводить до утворення суцвіття тирсу рослин арабідопсиса, таким чином збільшуючи кількість плодів на них. Наявність алеля clv1-1 призводить до утворення більшої кількості насіння в плоді, ніж у NW20 (табл. 3). Загальна кількість насіння з рослин лінії Lug228 достовірно більше ніж з рослин лінії NW20, розмір насінин ідентичний.

Таблиця 3

Кількість насіння мутантних ліній NW20 та Lug228

Пояснення: різниця значуща при ***p<0,001

Імовірно, отриману лінію з рецесивними генами ap1-1, clv1-1, er-1 можна буде запропонувати для використання в селекційній практиці з метою збільшення кількості насіння сільськогосподарських рослин род. Brassicaceae за допомогою методів генетичної інженерії.

Взаємодія мутантних алелів clv1-1 та ap1-1 в регуляції розвитку квітки та плоду трирецесиву за алелями ap1-1, clv1-1, er-1. У результаті проведених досліджень встановлено, що у квіток лінії Lug228 кількість чашолистків приблизно на один менша, пелюстки в більшій частині квіток відсутні, кількість тичинок та плодолистків на два більше порівняно з квітками рослин лінії NW20 (еректоїдне стебло). Таким чином, спостерігається складний прояв дії зчеплених генів на органи квітки в порівнянні з димутантними лініями. За ознаками «кількість чашолистків» та «кількість пелюсток» тримутантної лінії Lug228 взаємодія генів не виявлена. За ознакою «кількість тичинок» виявлена позитивна взаємодія генів (рецесивний надепістаз, ap1-1 < clv1-1); за кількістю плодолистків спостерігається негативний неповний епістаз (clv1-1 < ap1-1).

Пентарецесив за генами ap1-1,bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 (безпелюсткова квітка, вкорочені квітконіжки та плодоніжки, булавоподібний плід, еректоїдне стебло, розеткові листки та стебло без трихом). Для створення лінії за п'ятьма рецесивними мутантними генами ap1-1,bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 використовували два тетрарецесиви за різними комбінаціями генів ap1-1, bp-1, er-1, gl1-1 (Lug35) та bp-1, clv1-1, er-1, gl1-1 (N9542) (Сігідіненко, 2008). Лінія за картованими рецесивними генами ap1-1,bp-1,er-1,gl1-1 отримана раніше шляхом ступінчатої гібридизації та добору за використання двох трирецесивів за мутантними алелями ap1-1,er-1,gl1-1 та bp-1,er-1,gl1-1 (Медведь, 2008).

Оскільки гени ap1 та clv1 тісно зчеплені між собою, в F₂ буде спостерігатися відхилення від незалежного розподілу. За нашими розрахунками частота рослин лінії за рецесивними алелями ap1-1,bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 в F₂ складає 0,3% (3 рослини з 1000). Виділити цю лінію в F₂ дуже складно, внаслідок необхідності дослідити завеликий обсяг вибірки. Краще та надійніше виділити лінію за рецесивними алелями ap1-1,bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 в F₃. квітка мутантний генетичний молекулярний

В результаті проведеної гібридизації та добору було отримано мутантну лінію за п'ятьма рецесивними алелями ap1-1,bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1. Рослини цієї лінії мають такий фенотип: безпелюсткова квітка, вкорочені квітконіжки та плодоніжки, булавоподібний плід, еректоїдне стебло, розеткові листки та стебло без трихом (рис. 2.2). Пентарецесиву присвоєно номер Lug43 за каталогом LASSC ЛНАУ. Фенотипові ознаки лінії Lug43 легко ідентифікуються без застосування збільшувальних приладів та зберігаються упродовж усього вегетаційного періоду. Мутантна лінія Lug43 з двома зчепленими рецесивними картованими генами ap1-1 та clv1-1 по першій групі зчеплення є зручною для генетичного аналізу за найдовшою першою хромосомою (122сМ). У цього пентарецесиву наявні маркери 2, 3 та 4 хромосом. Маркер по п'ятій хромосомі відсутній. Тому виникла необхідність створити полімутантну лінію арабідопсиса з маркерами за всіма п'ятьма групами зчеплення.

Полімутантна лінія за рецесивними алелями ap1-1,bp-1,clv1-1,dis2-1,er-1,gl1-1,tfl1-2 (безпелюсткова квітка, вкорочені квітконіжки та плодоніжки, булавоподібний плід, нерозгалужені, вкорочені трихоми, еректоїдне стебло, розеткові листки та стебло без трихом, закрите суцвіття). Шляхом ступінчатої гібридизації та добору отримано нову полімутантну лінію, марковану одним рецесивним мутантним алелем по другій, третій, четвертій і п'ятій хромосомам та трьома рецесивними мутантними алелями по першій хромосомі гаплоїдного набору (ap1-1,bp-1,clv1-1,dis2-1,er-1,gl1-1,tfl1-2). Для створення гептарецесиву використовували виділені нами наступні полімутантні лінії за рецесивними картованими генами: bp-1,clv1-1,dis2-1,er-1,tfl1-2 (Lug44) та ap1-1,bp-1,clv1-1,er-1,gl1-1 (Lug43). Лінія за картованими рецесивними генами bp-1,clv1-1,dis2-1,er-1,tfl1-2 отримана раніше шляхом ступінчатої гібридизації та добору за використання трирецесиву за мутантними алелями bp-1,dis2-1,er-1 та тетрарецесиву за генами bp-1,clv1-1,er-1,tfl1-2 (Медведь, 2009).

У F₂ розщеплення відбувається за тетрагібридною схемою, оскільки в ньому беруть участь чотири гени (ap1, dis2, gl1 і tfl1). Далі розщеплення розглядається без участі гена er. Згідно нашим розрахункам, очікувана частота рослин генотипу ap1-1ap1-1bp-1bp-1clv1-1clv1-1dis2-1dis2-1gl1-1gl1-1tfl1-2tfl1-2 в F₂ складає 1/256. З 196 рослин в F₂ відібрано 2 рослини з генотипом ap1-1ap1-1bp-1bp-1clv1-1clv1-1DIS2-gl1-1gl1-1tfl1-2tfl1-2. Насіння з цих рослин було висаджене та утворило дві сім'ї (обсяг вибірки 60). Розщеплення спостерігалося лише у першій сім'ї. Таким чином, в F₃ було виділено нову полімутантну лінію за картованими генами ap1-1,bp-1,clv1-1,dis2-1,er-1,gl1-1,tfl1-2 (рис. 2.3). Гептарецесиву присвоєно номер Lug62 за каталогом генетичної колекції арабідопсиса LASSC ЛНАУ.

Локалізацію фенотипових маркерів за групами зчеплення і сайтами полімутантної лінії за рецесивними алелями ap1-1,bp-1,clv1-1,dis2-1,er-1,gl1-1,tfl1-2 показано на рис. 3. Жирною лінією позначені ті частини хромосом, гени яких виявляють зчеплення з відповідними маркерами. Розташовані в першій хромосомі алелі ap1-1, clv1-1 і dis2-1 лінії Lug62 та маркери другої і третьої хромосом відповідно er-1 і gl1-1 виявляють зчеплення зі всіма генами цих хромосом. Маркер bp-1 четвертої хромосоми розташований таким чином, що дозволяє визначити локалізацію мутацій до 65 локуса, при загальній довжині хромосоми 76 сМ. Маркер tfl1-2 п'ятої хромосоми придатний для локалізації до груп зчеплення більшості мутацій цієї хромосоми (від 0 до 52 локуса).

Загальна довжина геному A. thaliana складає 475 сМ. Вірогідність визначення локалізації до групи зчеплення за допомогою раніше створеного пентарецесива bp-1, ch5-1, clv1-1, er-1, gl1-1 дорівнює 84% (Сігідіненко, 2008). Вірогідність визначення локалізації до групи зчеплення при використанні новоствореної тест-лінії за рецесивними генами ap1-1, bp-1, clv1-1, dis2-1, er-1, gl1-1, tfl1-2 дорівнює 88%. Інакше кажучи, майже у 88% випадків тестована мутація буде чітко локалізована по групі зчеплення A. thaliana. По 1, 2 та 3 хромосомах локалізація за сайтами дорівнює 100%.

Молекулярно-генетичні особливості мутантних ліній arabidopsis thaliana (l.) Heynh., визначені за використання rapd-pcr аналізу

На основі проведеного RAPD-PCR аналізу мутантних ліній NW20, N28, N45 та Lug228 отримано 147 продуктів ампліфікації сумарно за використання 17 RAPD-праймерів, 13 з яких були поліморфними у досліджених ліній (8,8%). Найбільшу кількість продуктів ампліфікації (13 ампліконів) було виявлено для праймера OPA-10, найменшу (4 амплікони) - для праймера OPA-22.

Встановлено зчеплення молекулярних маркерів: OPA-1, OPA-5, OPA-8, OPA-23 з мутацією er-1; OPA-4, OPA-11, OPA-18 з мутацією ap1-1; OPA-10 з комбінацією трьох рецесивних мутантних алелів ap1-1,clv1-1,er-1. Це дає змогу ідентифікувати, диференціювати мутантні лінії та встановити відмінності на молекулярному рівні. Таким чином, на основі RAPD аналізу виявлено поліморфні ампліфікони, які вказують на відмінність в організації геному ліній арабідопсиса.

На основі аналізу RAPD локусів визначили коефіцієнти генетичної подібності та дистанцій за Неєм та Лі (Williams, Welsh, 1990). Коефіцієнт генетичних дистанцій розглядався як міра генетичного різноманіття між досліджуваними генотипами. На основі коефіцієнтів генетичної подібності побудовано дендрограму філогенетичних зв'язків між лініями NW20, N28, N45 та Lug228 арабідопсиса у відповідності до розподілу алельних варіантів локусів, виявлених за допомогою RAPD - ПЛР (рис. 4).

Встановлено, що утворюються два кластери, які об'єднують мутантні лінії у порівнянні з вихідною. Розмах коефіцієнту дивергенції становить 0,08 - 0,1.

Більшість таксономістів приймають типологічну концепцію виду Arabidopsis thaliana, за якою вид вважається монотиповим. Багато індукованих мутацій арабідопсиса викликають морфологічні зміни, що виходять за рамки діагностичних ознак. Спадкові зміни під впливом досліджуваних алелів clv1-1 та ap1-1 входять в суперечності з описами арабідопсиса у флорах, визначниках, атласах та іншій довідковій літературі. Морфологічні критерії, що використовуються, не дозволяють успішно класифікувати види в межах роду Arabidopsis. Отримана лінія за генами ap1-1,clv1-1,er-1 арабідопсиса має таку нову сукупність фенотипових ознак, що ускладнює її віднесення до виду A. thaliana, роду Arabidopsis та род. Brassicaceae.

За допомогою молекулярно-генетичного аналізу встановлено, що досліджувані нами мутантні лінії A. thaliana є генетично подібними та безумовно відносяться до арабідопсиса. Найбільш генетично подібними є мутантна лінія за рецесивними алелями clv1-1,er-1 та гомозиготний трирецесив за мутантними алелями ap1-1,clv1-1,er-1, коефіцієнт генетичної подібності між якими становить 0,9794.

АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

У результаті проведених досліджень доведено наявність плейотропного ефекту мутантних генів clv1 та ap1 на будову квітки та плоду. Визначено вплив мутантного гена clv1 на утворення більшої кількості насіння в плоді. Установлено посилену дію алеля ap1-1 як мінус-алеля на формування всіх органів квітки. Вперше отримано три-, пента- та гептамутантні лінії Arabidopsis thaliana, марковані зчепленими високо життєздатними алелями, прояв яких легко візуально визначити на різних етапах онтогенезу рослин. На основі RAPD- аналізу виявлено відмінність в організації геному ліній арабідопсиса за рецесивними картованими генами er-1; clv1-1,er-1; ap1-1,er-1 та ap1-1,clv1-1,er-1.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення щодо генетичних механізмів контролю будови квіток і плодів Arabidopsis thaliana за впливу рецесивних картованих мутантних алелів clv1-1 та ap1-1.

1. Алель clv1-1 є алелем-підсилювачем (плюс-алелем) кількості майже всіх органів квітки арабідопсиса: чашолистків (на 1,5%), тичинок (на ~ 4%) та плодолистків (на 100%).

2. Присутність у генотипі рецесивних алелів clv1-1,er-1 спричиняє зміну форми плоду зі стручка на три-чотиригнізду коробочку, що сприяє утворенню більшої кількості насінин в плоді.

3. Вперше установлено посилену дію алеля ap1-1 як мінус-алеля на формування всіх органів квітки, що є свідченням помилковості віднесення його до генів класу А в межах так званої АВС-моделі генетичного контролю розвитку квітки.

4. Досліджено диференційну модифікаційну мінливість структури квітки димутанта за рецесивними алелями ap1-1,er-1 за різних температурних умов. Зниження температури викликає зменшення кількості чашолистків, збільшує кількість пелюсток і не впливає на кількість тичинок та плодолистків.

5. Мутантний алель ap1-3 є сильним алелем з плейотропним ефектом, що зменшує кількість чашолистків (~ на 40%), тичинок (~ на 16%) та призводить до повної відсутності пелюсток.

6. Сумісний вплив рецесивних алелів ap1-1 та clv1-1 на кількість органів квітки визначається епістатичною взаємодією. Рецесивний надепістаз зумовлює суттєве (на 32%) збільшення тичинок тримутантної лінії Lug228 у порівнянні з вихідними димутантними.

7. Шляхом ступінчатої гібридизації та добору створено нові гомозиготні полімутантні рецесивні лінії, фенотипові ознаки яких виходять за межі діагностичних ознак виду A. thaliana. Гептамаркерна лінія за алелями ap1-1, bp-1, clv1-1, dis2-1, er-1, gl1-1, tfl1-2 (Lug62) зручна для генетичного аналізу арабідопсиса, оскільки маркована 1-3 мутантними алелями у кожній з п'яти хромосом гаплоїдного набору.

8. Взаємодія трьох рецесивних алелів ap1-1, clv1-1, er-1 (лінія Lug228) призводить до збільшення кількості насіння з рослини (на 128%).

9. Методом RAPD- аналізу виявлено поліморфні ампліфікони, які свідчать про відмінність в організації геному ліній NW20, N28, N45 та Lug228 A. thaliana. Найбільш генетично подібними є мутантна лінія за рецесивними алелями clv1-1,er-1 та гомозиготний трирецесив за мутантними алелями ap1-1,clv1-1,er-1, коефіцієнт генетичної подібності між якими становить 0,9794.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Соколов И.Д. Влияние мутантной аллели ap1-1 на строение цветков арабидопсиса Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) / И.Д. Соколов, О.М. Медведь, С.Г. Хаблак // Збірн. наук. праць Луганського НАУ. - 2006. - № 66 (89). - С. 65-79 (Частка авторства - 40%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення даних, оформлення роботи).

2. Медвідь О.М. Вплив температури та місцеположення квіток на їх будову у лінії ap1-1 арабідопсиса Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) / О.М. Медвідь, І.Д. Соколов, С.Г. Хаблак // Науковий вісник Волинського державного університету ім. Л. Українки - 2007. - № 5. - С. 186-191 (Частка авторства - 40%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення експериментальних даних, написання роботи).

3. Чеченева Т.Н. Сравнительное исследование влияния мутантных аллелей ар1-1 и ар1-3 арабидопсиса на органы цветка / Т.Н. Чеченева, О.М. Медведь // Науковий вісник НАУ. - 2007. - Вип. 117. - С. 183-189 (Частка авторства - 50%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення даних, написання роботи).

4. Медведь О.М. Морфологические особенности строения плодов у растений линии clv1-1 арабидопсиса Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) / О.М. Медведь // Збірн. наук. праць Луганського НАУ. - 2007. - № 75 (98). - С. 52-59.

5. Медведь О.М. Температура - фактор, влияющий на строение цветков линии apetala1-1 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. / О.М. Медведь // Збірн. наук. праць Луганського НАУ. - 2008. - № 83. - С. 61-65.

6. Соколов И.Д. Получение и изучение мультимутантной линии арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) с признаками, выходящими за рамки семейственноспецифических / И.Д. Соколов, О.М. Медведь // Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2008. - Т. 6, № 2. - С. 302-309 (Частка авторства - 80%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення даних, написання статті).

7. Медведь О.М. Морфологические особенности тримутанта ap1-1,bp-1,gl1-1 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. / О.М. Медведь, И.Д. Соколов // Вісник Запорізького національного університету. - 2008. - № 2. - С. 135-139 (Частка авторства - 60%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення даних, написання статті).

8. Медведь О.М. Влияние мутантного аллеля ар1-3 на органы цветка Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. / О.М. Медведь, Т.Н. Чеченева // Доклады ТСХА. - Москва, 2009. - Вып. 281. - С. 3-5 (Частка авторства - 50%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення даних, написання роботи).

9. Медведь О.М. Создание новых мультимаркерных линий арабидопсиса Таля / О.М. Медведь // Збірн. наук. праць Луганського НАУ. - 2009. - № 98. - С. 65-69.

10. Медвідь О.М. Отримання потрійного мутанта за рецесивними генами ap1-1, clv1-1, er-1 / О.М. Медвідь // Наук. вісник Луганського НАУ. - 2009. - № 8. - С. 45-48.

11. Соколов И.Д. Lugansk Arabidopsis Seed Stock Center (LASSC): каталог генетической коллекции / И.Д. Соколов, Л.И. Сигидиненко, Е.И. Соколова, О.М. Медведь, И.В. Кирпичева, П.В. Шелихов. - Луганск, Элтон-2, 2009. - 60 с. (Частка авторства - 20%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення даних, оформлення роботи).

12. Чеченєва Т.М. Молекулярно-генетичні особливості мутантних ліній Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. на основі RAPD-PCR аналізу / Т.М. Чеченєва, Д.О. Кисельов, О.М. Медвідь, О.В. Дубін // Наукові доповіді НУБіП України: [Електронний ресурс]. - 2010. - № 2 (18) (Частка авторства - 25%, особистий внесок здобувача - проведення досліджень, узагальнення даних).