Одержання одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіл проти дифтерійного токсину

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

УДК 571.27:616-097

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ОТРИМАННЯ scFv-АНТИТІЛ, СПЕЦИФІЧНИХ ДО ДИФТЕРІЙНОГО ТОКСИНУ, ДОСЛІДЖЕННЯ ЇХ ПРОТЕКТИВНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ТА МОЖЛИВОСТЕЙ ВИКОРИСТАННЯ В ДІАГНОСТИЦІ ДИФТЕРІЇ

Олійник Олена Сергіївна

Київ 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України та на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Наукові керівники:

- доктор біологічних наук, професор, академік НАН і АМН України Комісаренко Сергій Васильович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, директор інституту, завідувач відділу молекулярної імунології;

- кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Колибо Денис Володимирович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, заступник директора з наукової роботи, провідний науковий співробітник відділу молекулярної імунології.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Гриненко Тетяна Вікторівна, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України завідувач відділу хімії та біохімії ферментів;

- кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Дерябіна Олена Григорівна, Інститут генетичної і регенеративної медицини АМН України, завідувач відділу генних технологій.

Захист відбудеться 22 лютого 2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 21 січня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

Анотації

Олійник О.С. Одержання одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіл проти дифтерійного токсину. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. ? Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено отриманню scFv-антитіл проти дифтерійного токсину, дослідженню їх протективних властивостей та можливості використання у діагностиці дифтерії. З неімунної та імунної бібліотек імуноглобулінових генів миші отримано методом фагового дисплею та охарактеризовано scFv-антитіла до дифтерійного токсину. Зконструйовано імунну бібліотеку кДНК імуноглобулінових генів мишей, імунізованих рекомбінантними аналогами А та В субодиниць дифтерійного токсину. Запропоновано універсальний підхід для детекції scFv-антитіл та їх комплексів з антигеном у імуноферментному аналізі. Продемонстровано можливість використання отриманих scFv та їх похідних, об'єднаних із фрагментом стафілококового білка А, для виявлення дифтерійного токсину. Відібрано чотири антитоксичні scFv-антитіла, які здатні пригнічувати токсичні ефекти дифтерійного токсину, перешкоджаючи його проникненню до клітин-мішеней. Отримані scFv-антитіла можуть бути використані у діагностиці та терапії дифтерії.

Ключові слова: scFv-антитіла, дифтерійний токсин, бібліотека імуноглобулінових генів, фаговий дисплей, антитоксичні антитіла.

Олейник Е.С. Получение одноцепочечных вариабельных фрагментов антител против дифтерийного токсина. ? Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 ? биотехнология. ? Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена получению scFv-антител против дифтерийного токсина, исследованию их протективных свойств и возможности использования в диагностике дифтерии. Из неиммунной и иммунной библиотек иммуноглобулиновых генов мыши получены методом фагового дисплея и охарактеризованы scFv-антитела к дифтерийному токсину. Сконструирована иммунная библиотека кДНК иммуноглобулиновых генов мышей, иммунизированных рекомбинантными аналогами А и В субъединиц дифтерийного токсина. Предложен универсальный подход для детекции scFv-антител и их комплексов с антигеном в иммуноферментном анализе. Продемонстрирована возможность использования полученных scFv и их производных, объединенных с фрагментом стафилококкового белка А, для выявления дифтерийного токсина. Отобраны четыре антитоксические scFv-антитела, подавляющие токсические эффекты дифтерийного токсина, предотвращая его проникновение в клетки-мишени. Полученные scFv-антитела могут быть использованы в диагностике и терапии дифтерии.

Ключевые слова: scFv-антитела, дифтерийный токсин, библиотека иммуноглобулиновых генов, фаговый дисплей, антитоксические антитела.

Oliinyk O. S. Obtaining of single chain variable antibody fragment against diphtheria toxin. - Manuscript.

Dissertation for the PhD degree in Biology, specialty 03.00.20 - biotechnology. - Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

Antibody cloning coupled with phage display is a relatively recent approach to the issue of developing better diagnostic and therapeutic reagents, which could have a major impact on immunology, cell biology, drug discovery and pharmacology.

This work is dedicated to obtaining of recombinant scFv (single chain variable fragments) against diphtheria toxin, study of their toxin-neutralization properties and their ability to be used in diagnostics of diphtheria. Diphtheria toxin is the main diagnostic and pathogenic antigen of Corynebacterium diphtheriae, so single chain antibody against toxin could be used for passive immunization and for diagnostics of diphtheria.

scFv against diphtheria toxin were isolated from naive and immune murine libraries. We have selected one scFv (scFv II-15) to diphtheria toxin from naive library. It was shown that this scFv was specific to diphtheria toxin B subunit, its affinity constant was about 1,13*10⁷ М^-1, scFv II-15 preserved activity on storage in the course of 8 months.

For our purpose was important to obtain a number of scFv with high affinity. We have constructed immune library specific to diphtheria toxin. For library construction the total RNA was isolated from spleens of BALB/c mice immunized with recombinant diphtheria toxin A and B subunits and was used as matrix in the reaction of RT-PCR. Then gene fragments encoding V_H and V_L DNA-sequences were amplified from cDNA and assembled into a single chain by SOE-PCR with a linker DNA encoding the peptide (Gly₄Ser)₃. The variable fragments were digested with SfiI and NotI, cloned into the phagemid pCANTAB-5E and electroporated into Escherichia coli TG1. The repertoire of the obtained phage display library was about 1,2 x 10⁶.The specific scFv against diphtheria toxin B subunit were obtained after one round of selection. A direct in vitro panning afforded a panel of eight scFv-phage clones. ScFv encoding fragments were subcloned into plasmid pET-22b(+) and electroporated into Escherichia coli Rosetta (DE3). ScFv were expressed and purified by metalaffinity chromatography. It was shown that selected scFv are highly specific to B subunit. Measured affinity constants for different clones were from 10⁷ to 10⁹ М^-1. It was confirmed by restriction endonuclease cleavage analysis that the scFv-antibodies selected from immune library were diverse and all selected sequences were unique.

Single chain variable fragment is useful and effective recombinant antibody format. But detection of scFv and their complexes with antigens is problematical: prevailing systems for detection have some drawbacks and are not universal. We constructed fusion proteins, which include sequences of scFv and staphylococcal protein A. Protein A of Staphylococcus aureus interacts with antibody's Fc-fragment. It was shown, that obtained fusion proteins interact with diphtheria toxin and are effectively recognized by labelled immunoglobulins with any antigenic specificity.

Obtained scFvs fused with staphylococcal protein A were evaluated for use in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of diphtheria toxin. Different scFv fusion proteins were compared with a sandwich-ELISA that employs a horse polyclonal antibody preparation to coat microtiter plates and scFv-protein A as detecting antibodies. The limit of detection of diphtheria toxin for the different scFv-protein A fusions ranged from 250 to 10 ng/ml. The sensitivity of test with the best candidate, scFv30-protein A was up to 8 ng/ml of diphtheria toxin.

We have selected four scFv-clones that can block interaction of diphtheria toxin with target cells. The ability of this scFv to block binding of labelled subunit B with a surface of sensitive to toxin cells was studied by flow-cytometry. As was demonstrated by cytotoxic test, survival of cells incubated with diphtheria toxin was grown in scFv's presence. Obtained scFv could be considered as promising candidates for a role of antitoxic antidiphtheria drugs of new generation.

We propose that selected scFv will be useful in diagnostics and therapy of diphtheria or as a tool for investigation of diphtheria toxin.

Key words: scFv-antibodies, diphtheria toxin, immunoglobulin gene library, phage display, antitoxic antibodies.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Дифтерія є небезпечною інфекційною хворобою. На думку багатьох вчених, епідемії дифтерії обумовлені періодичною активізацією збудника інфекції, що в свою чергу пов'язана з певними умовами або причинами, природа яких досі лишається невідомою, а тому передбачити і запобігти появі нових епідемій дифтерії досить складно. Ця хвороба залишається загрозою для країн з різним рівнем життя та розвитку системи охорони здоров'я, і розробка нових ефективних засобів боротьби з дифтерією є надзвичайно важливою. При лікуванні дифтерії застосовують антитоксичну сироватку, що ефективно нейтралізує дифтерійний токсин, але, оскільки таку сироватку отримують від імунізованих коней, вона є ксеногенною для людини, і при введенні в організм сама здатна викликати ряд патологічних станів (від анафілактичного шоку до сироваткової хвороби), тому існує потреба у розробці більш безпечних антитоксичних препаратів. Для діагностики дифтерії в Україні у медичній практиці, на жаль, часто застосовуються застарілі методи, і тому існує потреба у вітчизняних доступних ефективних системах діагностики дифтерії.

За основні патологічні прояви дифтерії відповідає дифтерійний токсин, який є основним діагностичним антигеном збудника дифтерії. Тому антитіла проти токсину можуть використовуватись при лікуванні дифтерії та як компоненти діагностичних тест-систем. У сфері біотехнології антитіл надзвичайно перспективним напрямком є технологія рекомбінантних антитіл, яка дозволяє отримувати різні форми антитіл, що відрізняються за деякими властивостями. Зокрема, одноланцюгові варіабельні фрагменти антитіл ? scFv, відповідають активному центру імуноглобуліну, здатні специфічно зв'язуватись із цільовим антигеном, невеликі за розмірами, менш імуногенні, ніж повнорозмірні антитіла, можуть бути отримані у різних системах експресії, є моноклональними. Ці властивості в комплексі надають scFv переваги в порівнянні як з поліклональними, так і моноклональними антитілами, отриманими за допомогою гібридомної технології, та роблять їх перспективними кандидатами на роль компонентів діагностикумів та терапевтичних протидифтерійних препаратів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках НДР 2.2.1. №15 "Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики та лікування." (№ державної реєстрації 0102V006218, 2002-2006) та НДР 2.2.1. №15 "Структурно-функціональний аналіз білків за норми та деяких патологій" (№ державної реєстрації 0107V007187, 2007-2011).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було отримати рекомбінантні scFv-антитіла, специфічні до дифтерійного токсину, дослідити їх здатність нейтралізувати цитотоксичну активність дифтерійного токсину та можливості їх використання у діагностиці.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Відібрати scFv-антитіла до дифтерійного токсину із неімунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші.

2. Сконструювати імунну бібліотеку та провести з неї селекцію scFv-антитіл, специфічних до субодиниці В дифтерійного токсину.

3. Охарактеризувати отримані scFv-антитіла.

4. Отримати злиті білки, що містять послідовність scFv та фрагменту стафілококового білка А. Оцінити перспективність використання таких злитих білків у імуноферментному аналізі, зокрема для детекції дифтерійного токсину.

5. Дослідити здатність відібраних рекомбінантних антитіл нейтралізувати цитотоксичну активність дифтерійного токсину.

Об'єкт досліджень ? біотехнологія препаратів для лікування та діагностики дифтерії, заснованих на використанні новітніх методів та підходів.

Предмет дослідження - рекомбінантні scFv-антитіла до субодиниці В дифтерійного токсину як можливі компоненти протидифтерійних терапевтичних препаратів та діагностикумів.

Методи дослідження ? При виконанні роботи було використано молекулярно-біологічні, імунологічні, імунохімічні, біохімічні, мікробіологічні методи, а також методи роботи із культурами клітин еукаріот.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було запропоновано використати новітній біотехнологічний підхід - технологію рекомбінантних антитіл, для створення сучасних засобів терапії і діагностики дифтерії та продемонстровано ефективність обраної стратегії.

В роботі вперше доведено принципову здатність рекомбінантних антитіл нейтралізувати токсичну дію дифтерійного токсину. Також було запропоновано новий універсальний підхід для детекції scFv та їх комплексів з антигенами у імуноферментному аналізі, що полягає в генетичному злитті scFv-антитіл з рекомбінантним аналогом стафілококового білка А.

Практичне значення одержаних результатів. Основні цілі роботи орієнтовані на досягнення результатів, що мають практичне значення. Зокрема, отримані scFv-антитіла можуть бути застосовані при виявленні дифтерійного токсину в діагностиці. Відносно низька собівартість scFv та моноклональна природа надають їм переваги в порівнянні із поліклональними антитілами та моноклональними антитілами, отриманими на основі гібридомної технології. При виконанні роботи було отримано злиті молекули на основі scFv-антитіл, що містять у своєму складі фрагмент стафілококового білка А, та розроблено системи для їх отримання. Використання таких злитих білків у імуноферментному аналізі дозволяє застосовувати для детекції різні мічені антитіла, в тому числі і найбільш економічно доступні.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В розділі висвітлено сучасні уявлення про епідеміологію та особливості дифтерійної інфекції, проаналізовано дані про епідемію дифтерії 90-их рр. на території колишнього СРСР та епідемічну ситуацію в Україні. Окремо викладено сучасні дані щодо структури та властивостей дифтерійного токсину. Значна частина розділу присвячена технології рекомбінантних антитіл, зокрема, описано основні різновиди рекомбінантних антитіл та їх особливості, найпоширеніші методи відбору антигензв'язувальних молекул із імуноглобулінових бібліотек, системи для експресії рекомбінантних антитіл. На основі аналізу літературних джерел продемонстровано перспективність використання рекомбінантних антитіл для створення нових засобів боротьби з дифтерією.

Матеріали і методи. В розділі детально описано методологію, методики, що застосовували при виконанні роботи, наведено перелік використаних матеріалів.

В цілому, для отримання scFv-антитіл проти дифтерійного токсину використовували сконструйовану імунну бібліотеку кДНК імуноглобулінових генів мишей, імунізованих рекомбінантними аналогами А та В субодиниць дифтерійного токсину, а також неімунну бібліотеку, що була отримана у Філіалі інституту біоорганічної хімії ім. М.М. Шемякіна та Ю.А. Овчіннікова РАН (м. Пущіно). Як антиген, в залежності від задач, на різних етапах дослідження використовували нативний дифтерійний токсин (отриманий з культурального середовища штаму дифтерійних бактерій Парк-Вільямсон-8 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАНУ), дифтерійний токсоїд (люб'язно наданий АТЗТ НВК "Діапроф-Мед"), рекомбінантні аналоги А та В субодиниць дифтерійного токсину (отримані у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ). При створені бібліотеки використовували компоненти системи RPAS (Amersham, зараз GE Healthcare), при підборі олігонуклеотидних праймерів для ампліфікації ДНК-послідовностей VH- та VL-доменів і їх подальшого об'єднання спирались на роботу [Okamoto et al., 2004]. Для відбору специфічних scFv-антитіл використовували метод фагового дисплею. Скринінг проводили методом фільтр-аналізу та імуноферментного аналізу.

ДНК-послідовності відібраних scFv-антитіл субклонували у векторі pET-22b (Novagen), як продуценти використовували трансформовані відповідними конструкціями клітини E. coli Rosetta (DE3). Виділення цільових білків проводили методом афінної хроматографії на іммобілізованих іонах металів (ІМАС) на колонці з Ni-NTA сефарозою або з використанням набору RPAS Purification Module (Amersham). В разі потреби проводили рефолдинг білків in vitro ступінчатим зниженням концентрації сечовини на колонці.

Рекомбінантні антитіла характеризували методами імуноферментного аналізу, імуноблотингу та електрофорезу в ПААГ у присутності ДСН. Для аналізу різноманітності відібраних scFv-антитіл проводили рестрикційний аналіз ендонуклеазою MvaI. Константу афінності визначили згідно [Bobrovnik et al., 2005].

Для отримання злитих білків, що містять у своєму складі послідовність scFv-антитіл та фрагмент стафілококового білка А, було отримано конструкцію на основі вектора pET-22b із ДНК-послідовністю білка А, в цій конструкції було субклоновано послідовності восьми scFv-антитіл. Отримані злиті білки характеризували методом імуноферментного аналізу. Розробку системи для виявлення дифтерійного токсину проводили на основі бісайтового імуноферментного аналізу (так званого сендвіч-методу), як антитіла нижнього шару використовували антисироватку, а як детектуючі ? scFv30, злиті з фрагментом білка А.

При дослідженні здатності scFv-антитіл нейтралізувати дифтерійний токсин використовували чутливі до токсину клітини лінії Vero з банку клітинних ліній Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ. При первинному відборі застосували протокову цитофлуориметрію з використанням флуоресцентно міченої субодиниці В дифтерійного токсину [Кабернюк та ін., 2009 a] та [Кабернюк та ін., 2009 b]. Оцінку рівня виживання клітин проводили за допомогою МТТ-тесту.

Результати досліджень та їх обговорення

дифтерія антитіло токсин імуноферментний

Відбір та характеристика scFv проти дифтерійного токсину із неімунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші. З неімунної бібліотеки було відібрано одне scFv-антитіло до дифтерійного токсину, ? scFv ІІ-15. Використана бібліотека сконструйована на основі вектора pHEN1, тому для подальшої роботи ДНК-послідовність scFv ІІ-15 субклонували у векторі pCANTAB-5E, що входить до системи RPAS. Наведено результати рестрикційного аналізу плазміди та імуноблотинг периплазматичних екстрактів з клітин клонів-продуцентів.

З 1 л клітинної суспензії клону ІІ-15 було виділено та очищено близько 550 мкг scFv з периплазматичного екстракту та 140 мкг з середовища інкубування. Таким чином, вихід продукту склав близько 690 мкг/л.

Методом імуноферментного аналізу було показано, що виділені scFv реагують з дифтерійним токсоїдом і не реагують із контрольним антигеном. Константа афінності scFv клону II-15 склала 1,13*10⁷ М^-1. Було показано, що scFv II-15 зв'язуються із нативним дифтерійним токсином та є специфічними до його субодиниці В (як антигени використовували рекомбінантні аналоги А та В субодиниць дифтерійного токсину).

За токсичну функцію відповідає субодиниця А, але, як правило, нейтралізувати токсин здатні антитіла до субодиниці В. Блокуючи сайт зв'язування, такі антитіла перешкоджають проникненню токсину до клітин-мішеней. Тому були підстави сподіватись, що scFv II-15 можуть мати антитоксичні властивості.

Стабільність scFv II-15, досліджували, перевіряючи, як з часом змінюються два ключових параметри - активність по відношенню до цільового антигену та специфічність - відсутність взаємодії із контрольним антигеном. Для цього scFv, що зберігали за -20° С (заморожуючи невеликими аліквотами або додаючи рівний об'єм гліцерину та 2% сироваткового альбуміну), тестували методом імуноферментного аналізу щотижня. Було показано, що після 8 місяців зберігання активність scFv ІІ-15 у імуноферментному аналізі лише в незначній мірі зменшується.

Щоб підвищити вихід цільового білка, ДНК-послідовність scFv ІІ-15 було субклоновано у векторі pET-22b. Це дозволило підняти вихід scFv ІІ-15 із 700 мкг/л до 6 мг/л.

Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір одноланцюгових scFv-антитіл, специфічних до В субодиниці дифтерійного токсину. Як джерело генетичного матеріалу при конструюванні бібліотеки використовували РНК, виділену зі спленоцитів двох мишей, імунізованих рекомбінантними аналогами А та В субодиниць токсину. ДНК-послідовності варіабельних доменів важкого та легкого ланцюгів імуноглобулінів ампліфікували окремо, після чого об'єднували методом SOE-ПЛР та використовували при створенні бібліотеки.

Після селекції було відібрано близько двадцяти специфічних клонів scFv-антитіл. Як антиген використовували субоди-ницю В, виходячи з того, що scFv проти субодиниці В з більшою вірогідністю, ніж scFv-антитіла до субодиниці А можуть володіти здатністю нейтралізувати дифтерійний токсин. ДНК-послідовності восьми відібраних scFv-антитіл були субклоновані у векторі рET-22b. Було отримано відповідні клони-продуценти та виділено і очищено цільові білки.

Аналіз експресії показав, що усі вісім scFv-антитіл синтезуються переважно у нерозчинній формі, тому при виділенні проводили рефолдинг in vitro. Методом імуноферментного аналізу було продемонстровано, що scFv ефективно розпізнають цільовий антиген (субодиницю В дифтерійного токсину) і не реагують із контрольним антигеном. Константа афінності у scFv-антитіл, отриманих з імунної бібліотеки була вищою, ніж у scFv ІІ-15, виділених з неімунної бібліотеки: у 2 з 8 досліджених scFv константа афінності складала близько 10⁷ М^-1, у 5 ? близько 10⁸ М^-1 і у одного scFv ? близько 10⁹ М^-1.

Також було продемонстровано, що всі вісім scFv відрізняються один від одного. При обробці їх ДНК ендонуклеазою рестрикції MvaI утворювався набір рестриктних фрагментів, що був унікальним для кожного клону, а це можливо лише за умови, коли нуклеотидна послідовність кожного з scFv відрізняється від ДНК-послідовності семи інших scFv-антитіл.

Одержання біфункціональних молекул, специфічних до дифтерійного токсину і Fc-фрагментів антитіл, та їх використання для детекції дифтерійного токсину. Детекція scFv-антитіл ускладнена через відсутність у них константних доменів. Щоб вирішити цю проблему ми об'єднали ДНК-послідовність scFv із послідовністю стафілококового білка А. Було отримано рекомбінантну конструкцію на основі вектору pET-22b та відповідні клони-продуценти; виділено та очищено цільові білки - SpA-scFv.

Білок А здатний зв'язуватись із константними ділянками імуноглобулінів багатьох видів ссавців, тому ми припустили, що для детекції злитих білків можна буде використовувати мічені антитіла незалежно від їх антигенної специфічності. Методом імуноферментного аналізу було підтверджено, що отримані злиті білки детектуються міченими антитілами, специфічними до різних антигенів.

Також було розроблено систему для виявлення дифтерійного токсину методом бісайтового імуноферментного аналізу, як антитіла нижнього шару використовували анти-сироватку, а як детектуючі ? scFv30, злиті з фрагментом білка А. Чутливість такої системи склала до 8 нг токсину на мл, що відповідає чут-ливості аналогічних систем для виявлення дифтерійного токсину, які використовують у діагностиці дифтерії.

Дослідження токсин-нейтралізуючих властивостей scFv-антитіл проти субодиниці В дифтерійного токсину. При первинному відборі було перевірено здатність кожного із scFv перешкоджати зв'язуванню токсину із рецептором клітин-мішеней. Дослідження проводили методом протокової цитофлуориметрії, використовуючи чутливі до токсину клітини лінії Vero та флуоресцентно мічену рецепторну субодиницю В дифтерійного токсину. Методом протокової цитофлуориметрії оцінювали зв'язування із поверхнею клітин флуоресцентно міченої субодиниці В, попередньо проінкубованої з відповідними scFv.

Одне scFv-антитіло, scFv51, лише частково перешкоджало зв'язуванню, три з досліджених scFv не впливали на процес зв'язування, чотири scFv-антитіла, scFv30, scFv42, scFv II-15 i scFv120 перешкоджали зв'язуванню міченої субодиниці В із поверхнею клітин, очевидно, внаслідок блокування рецепторзв'язувального сайту дифтерійного токсину.

Щоб підтвердити, що чотири відібрані scFv-антитіла справді здатні пригнічувати цитотоксичний ефект дифтерійного токсину, було проведено цитотоксичний тест на клітинах лінії Vero. Частину клітин інкубували за присутності визначеної кількості дифтерійного токсину, частину ? за присутності такої ж кількості дифтерійного токсину та scFv-антитіл відповідного клону, ще частину клітин інкубували у середовищі без токсину. Виживання клітин оцінювали за допомогою МТТ-тесту. За 100% брали виживання клітин, що інкубувались у середовищі і, відштовхуючись від цього значення, розраховували виживання клітин, які інкубували лише з токсином або і з токсином, і з scFv. Присутність кожного з чотирьох scFv-антитіл підвищувала виживання клітин в середньому на 20-30%, тобто усі чотири scFv пригнічували цитотоксичний вплив дифтерійного токсину.

Висновки

Технологія рекомбінантних антитіл дозволяє отримувати антигензв'язуючі молекули різних форматів, які у багатьох сферах біології та медицини мають переваги в порівнянні із повнорозмірними імуноглобулінами. В цій роботі отримано та охарактеризовано scFv-антитіла, специфічні до дифтерійного токсину; продемонстровано можливість використання отриманих scFv та їх похідних, об'єднаних із фрагментом стафілококового білка А, для виявлення дифтерійного токсину; відібрано чотири нейтралізуючі scFv-антитіла, які здатні пригнічувати токсичні ефекти дифтерійного токсину, перешкоджаючи його проникненню до клітин-мішеней.

1. Вперше отримано імунну бібліотеку кДНК імуноглобулінових генів мишей, імунізованих рекомбінантними аналогами А та В субодиниць дифтерійного токсину.

2. Вперше отримано scFv-антитіла, специфічні до субодиниці В дифтерійного токсину. Відбір проводили як з неімунної, так і з імунної бібліотек.

3. Встановлено, що scFv II-15 (Ка?1,13·10⁷ М^-1), виділені з неімунної бібліотеки, були менш афінними, ніж scFv-антитіла, відібрані з імунної бібліотеки (scFv56: Ка?1,12·10⁹ М^-1, scFv42: Ка?6,7·10⁷ М^-1, scFv61: Ка?5,08·10⁷ М^-1, scFv14: Ка?1,63·10⁸ М^-1, scFv51: Ка?3,98·10⁸ М^-1, scFv30: Ка?5,42·10⁸ М^-1, scFv94: Ка?2,08·10⁸ М^-1, scFv120: Ка?1,1·10⁸ М^-1).

4. Запропоновано підхід для детекції scFv-антитіл та їх комплексів з антигеном, що базується на об'єднанні послідовності scFv із фрагментом стафілококового білка А. Показано, що для детекції таких злитих білків можна використовувати мічені антитіла ряду тварин незалежно від їх антигенної специфічності.

5. Продемонстровано ефективність використання scFv, об'єднаних із фрагментом білка А, для виявлення дифтерійного токсину у бісайтовому імуноферментному аналізі, що може бути використаним у діагностиці дифтерії.

6. Відібрано чотири scFv-антитіла, що пригнічують цитотоксичну активність дифтерійного токсину. Отримані токсин-нейтралізуючі scFv можуть бути використані для розробки антитоксичних протидифтерійних терапевтичних препаратів.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Получение рекомбинантных ScFv-антител против дифтерийного токсина методом фагового дисплея / Е.С. Олейник, А.А. Кабернюк, Д.А. Буркалева, С.И. Романюк, Д.В. Колибо, А.О. Шепеляковская, А.Г. Ламан, С.В. Комисаренко // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т. 79, №5. ? C. 50-56.

2. Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір одноланцюгових Fv-антитіл, специфічних до В субодиниці дифтерійного токсину / О.С. Олійник, А.А. Кабернюк, Т.А. Редчук Н.В. Короткевич, А.Ю. Лабинцев, С. І. Романюк, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т. 81, № 2. ? C. 60-71.

3. Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A / О.С. Олійник, А.А. Кабернюк, Т.А. Редчук, Д.В. Колибо. С.В. Комісаренко // Біополімери і клітина. ? 2009. ? Т.25, №3. ? С. 245-249.

4. Дослідження токсин-нейтралізуючих властивостей рекомбінантних одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіл проти субодиниці В дифтерійного токсину / О.С. Олійник, Ю.А. Лабинцев, Н.В. Короткевич, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Біополімери і клітина. ? 2009. ? Т.25, №4. ? С. 315-318.

5. Олійник О.С. Характеристика scFv-антитіл проти дифтерійного токсину, виділених з імунної та неімунної бібліотек імуноглобулінових генів / О.С. Олійник, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Біотехнологія. ? 2009. ? Т.2, № 3. ? С. 55-63.

6. Одержання scFv-антитіл проти дифтерійного токсину методом фаг-дисплея / О.С. Олійник, А.А. Кабернюк, Д.О. Буркальова, С. І. Романюк // Конференція молодих учених "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2005", 2-3 черв. 2005 р.: тези доп., Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, №5. ? C. 150.

7. Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір одноланцюгових scFv-антитіл, специфічних до в субодиниці дифтерійного токсину / О.С. Олійник, А.А. КАбернюк, Т.А. Редчук, Ю.А. Лабинцев, Н.В. Короткевич, Д.В. Колибо // Конференція молодих учених "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2009". 28-29 трав. 2009 р. : тези доп., Укр. біохім. журн. - 2009. - Т. 81, №4. ? C. 37.

8. Construction and screening of phage display single chain antibody library against diphtheria toxin / O.S. Oliinyk, A.A. Kaberniuk, T.A. Redchuk, N.V. Korotkevich, A.J. Labyntsev, S.I. Romaniuk, D.V. Kolibo // Bridges in Life Sciences US-CEE Regional Networking Meeting IV, April 4, 2009, Debrecen, Hungary: Bridges in Life Sciences Annual Scientific Review. - V. 4, N1. ? P. 152.

9. Development of sandwich-ELISA with scFv-protein A fusions for detection of diphtheria toxin / Oliinyk O.S., Kaberniuk A.A., Redchuk T.A., Korotkevich N.V., Labyntsev A.J., Romaniuk S.I., Kolibo D.V. // 7th Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology. October 3 - 7, 2009. special issue of The Ukrainian Biochemical Journal. - 2009. ? V.81, N4. ? P. 306.

Размещено на Allbest.ru