Лектинова гістохімія нирки щура в динаміці постнатального онтогенезу та при експериментальному цукровому діабеті

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Близько 40 років лектини з успіхом застосовуються в різних ділянках гісто- та цитохімії і є достатньо чутливими та селективними маркерами вуглеводних детермінант біополімерів (Nicolson G.L., 1971; Roth J., 1978; Луцик М.Д. та ін., 1980; Хомутовский О.А. та ін., 1986; Луцик А.Д. та ін., 1989; Антонюк В.О., 2005). Разом із тим, актуальними продовжують залишатися пошук і характеристика нових препаратів лектинів, розширення можливостей їх використання в якості інструментів дослідження динаміки і характеру змін глікокон'югатів органів і тканин в онтогенезі та при різних формах патології.

У гістофізіології нирки виключно важлива роль належить високомолекулярним вуглеводвмісним біополімерам - глікопротеїнам та протеогліканам (Дедов И.И. та ін., 2000; Schumacher K. et al., 2002; Бондарь И.А. та ін., 2007). Зокрема, глікопротеїни подопланін та подокаліксин подоцитів, мегалін та кубілін епітеліоцитів проксимальних трубочок детермінують підтримання морфо-функціонального статусу означених клітинних елементів (Ziak M. et al., 1999; Morelle W. et al., 2000; Zuber C. et al., 2003; Odera K. et al., 2007). Перлекан та інші гепарансульфат-протеоглікани забезпечують від'ємну зарядженість та селективну проникність фільтраційного бар'єру; версикани та декорини є cпецифічними протеогліканами мезангію та інтерстицію нирок (Noonan D.M., 1993; Добронравов В.А., 2002; Бондарь И.А. та ін., 2004).

Глікопротеїни міжклітинного матриксу фібронектин, ламінін, тенасцин, колаген, рівно ж як і протеоглікани відіграють важливу роль у процесах морфогенезу нирки (Schumacher K. et al., 2002). Молекули протеогліканів модифікуються під час пренатального та раннього постнатального онтогенезу нирки; зі змінами їхнього складу пов'язують розвиток багатьох патологічних процесів у нирках, при цукровому діабеті зокрема (Дедов И.И. и др., 2000; Добронравов В.А., 2002; Бондарь И.А. и др., 2004). З урахуванням вищезазначеного нирка може служити зручним тест-об'єктом для застосування методів лектинової гістохімії.

Цукровий діабет (ЦД), у зв'язку зі значним поширенням цієї патології і високим рівнем інвалідизації уражених осіб, належить до числа найактуальніших проблем сучасної медицини (Дедов И.И. и др., 2001; Шестакова М.В. и др., 2001; Тронько М.Д., 2005). Особливе занепокоєння викликає стійка тенденція до наростання захворюваності на ЦД у розвинених країнах світу. До числа найпоширеніших ускладнень і причин смертності при ЦД належить діабетична нефропатія (ДН) (Дедов И.И. и др., 2000; Пиріг Л.А., 2001; Семидоцкая Ж.Д., 2006; Самсонов Б.Б., 2008). Незважаючи на незаперечні успіхи сучасної теоретичної та клінічної діабетології, молекулярні механізми розвитку ДН залишаються нез'ясованими (Бондарь И.А. и др., 2004; Иванов Д.Д., 2008).

Аналіз доступної літератури показав, що при наявності значної кількості публікацій, присвячених лектиновій гістохімії нирки, дані стосовно перерозподілу ряду лектинових рецепторів у цьому органі при розвитку ДН відсутні. Відсутні також порівняльні дані щодо закономірностей експресії діабет-альтерованих та ембріоспецифічних глікокон'югатів нирки, що може становити значний інтерес як для теоретичної, так і практичної медицини.

Мета і задачі дослідження. Вивчити зміну вуглеводних детермінант нирки щура в динаміці постнатального морфогенезу, а також у процесі розвитку стрептозотоцин (СЦ)-індукованої діабетичної нефропатії з використанням лектинів різної вуглеводної специфічності, серед яких п'ять нових лектинів, очищених з представників підцарства грибів-базидіоміцетів.

Завдання дослідження:

1. В експерименті на щурах вивчити гістотопографію та перерозподіл манозо-, фукозо- та сіалогліканів, вуглеводних детермінант DGal і DGalNAc у структурних компонентах нирки впродовж постнатального морфогенезу.

2. На моделі СЦ-індукованої діабетичної нефропатії, із використанням загальноморфологічних і морфометричних методів, лектинів різної вуглеводної специфічності, дослідити характер змін у нирці при діабеті.

3. Порівняти якісний характер перерозподілу глікокон'югатів у динаміці постнатального морфогенезу нирки зі змінами вуглеводних детермінант цього органа при розвитку СЦ-індукованої діабетичної нефропатії.

4. Дослідити специфічність зв'язування з тканинними структурами та перспективи використання у гістохімічних дослідженнях п'яти нових препаратів лектинів, отриманих з плодових тіл грибів-базидіоміцетів.

5. Оцінити інформативну та діагностичну цінність методів лектинової гістохімії для поглиблення уявлень стосовно патогенетичних механізмів розвитку діабетичної нефропатії.

6. На основі проведених досліджень сформулювати гіпотезу перебудови глікокон'югатів нирки як наслідку розвитку метаболічного синдрому при цукровому діабеті.

1. Матеріал і методи дослідження

В роботі використано 78 щурів лінії Вістар. Для вивчення закономірностей перебудови глікополімерів нирки упродовж постнатального онтогенезу, вагітних самок відсаджували в ізольовані клітки і спостерігали двічі на добу за народженням потомства. Тварин утримували у вільному доступі до їжі та води на стандартному раціоні віварію. Всього для дослідження морфогенезу нирки використано 28 щурів чотирьох вікових груп - на 1-у, 20-у, 40-у та 120-у постнатальну добу (по 7 тварин у кожній групі).

Для моделювання ДН використано 35 щурів-самців масою 120-140 г. Кожній тварині доочеревинно вводили розчин СЦ (Sigma, США), приготований на 0,1М цитратному буфері pH 4,5, з розрахунку 70 мг/кг маси тіла. Розвиток діабету контролювали за рівнем глюкози, яку визначали глюкооксидазним методом з використанням реактивів фірми LaСhema (Чехія) відповідно до інструкцій виробника. Свідченням розвитку ЦД був рівень глюкози в крові у межах 10-18 мМоль/л. Були досліджені нирки тварин на 14-у, 30-у, 40-у, 60-у та 80-у добу після ін'єкції СЦ.

В якості контролю для кожної групи тварин зі СЦ-індукованим ЦД було використано по три щурі, котрим доочеревинно було введено по 1 мл буферного розчину (разом 15 контрольних тварин). Утримання тварин та маніпуляції з ними проводилися у відповідності до положень “Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”, ухвалених І Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001).

Щурів виводили з досліду шляхом декапітації після передозування ефірного наркозу. Гістологічні проби нирки фіксували в 4% нейтральному формаліні з наступною заливкою в парафін за стандартною методикою. Нирки виділяли з капсули, розрізали по серединній площині і поміщали у 4% нейтральний формалін на 24 години, після чого зневоджували і заливали у парафін за стандартною методикою (Лилли Р., 1969). Для отримання оглядових препаратів зрізи товщиною 5-7 мкм зафарбовували гематоксиліном і еозином, а також із використанням PAS-реакції. Оглядові препарати були використані для морфометричного аналізу ниркових структур.

Набір використаних лектинів, їх міжнародна абревіатура та вуглеводна специфічність наведені у Таблиці 1. Усі лектини були очищені та кон'юговані з пероксидазою хрону в лабораторії “Лектинотест” д. фарм. н. Антонюком В.О. Візуалізацію місць зв'язування лектинів досягали з використанням в якості хромогена діамінобензидину тетрагідрохлориду (Sigma, США) у присутності перекису водню як описано раніше (Луцик А.Д. та ін., 1989).

Оскільки в попередніх дослідженнях було встановлено, що афінність лектинів до тканинних глікополімерів перевищує величину їх спорідненості до відповідних інгібіторних моно- і дисахаридів, контроль специфічності гістохімічних реакцій здійснювали шляхом виключення лектин-пероксидазних кон'югатів зі схеми обробки гістопрепаратів.

Таблиця 1. Перелік використаних лектинів та їх вуглеводна специфічність

Детальніше вуглеводна специфічність використаних лектинів охарактеризована в монографіях (Луцик М.Д. та ін., 1980; Антонюк В.О., 2005).

Мікроскопію і фотографування препаратів здійснено на мікроскопі Olympus BX-41, а також Carl Zeiss Ng, доукомплектованого цифровою фотокамерою Canon IXUS 700. Морфометричний аналіз проведено з використанням комп'ютерної програми Image Tools 2000 після попереднього фотографування в системі Aver Media.

2. Результати досліджень та їх обговорення

Закономірності перебудови нирки у постнатальному онтогенезі.

При вивченні закономірностей постнатального морфогенезу нирки щура з використанням традиційних гістологічних методів (зафарбовування гематоксиліном і еозином), на 1-у постнатальну добу у прилеглій до зовнішньої мозкової речовини глибокій зоні кіркової речовини виявлено поодинокі ниркові тільця. Під капсулою були ідентифіковані термінальні ампули, S-подібні тільця та острівці метанефрогенної мезенхіми, які до 20-ї постнатальної доби трансформувалися на ниркові тільця. Ці спостереження віддзеркалюють незавершеність у тварин перших постнатальних діб розвитку процесів формотворення нових нефронів, які, за даними Богомоловой Н.А. (1965), продовжуються до 20-ї доби постнатального онтогенезу, розгортаючись у напрямі від мозкової речовини до поверхні нирки (Гончаревская О.А.,1977).

Сучасні літературні дані (Holthofer H. et al.,1988; Zuber C. et al.,2003) свідчать про те, що якісна та кількісна перебудова нирки щура не завершується до 20-ї постнатальної доби, а продовжується і на пізніших етапах онтогенезу. Проведені нами морфометричні дослідження показали, що у динаміці постнатального морфогенезу прогресивно зменшувалась густина ниркових тілець на одиниці площі зрізу від 39,55±3,99 на 1-у постнатальну добу до 21,20±1,91 на 20-у добу, і до 13,70±1,49 на 60-у добу. Зменшення густини ниркових тілець корелювало зі збільшенням сечового простору як індивідуального ниркового тільця, так і сумарної площі сечового простору нирки у проміжку між 1-ю та 60-ю добою. У той же час, морфометричні параметри нирок тварин 60-ї та 120-ї доби практично не відрізнялися. Описаний феномен можна пояснити триваючими від народження до 60-ї постнатальної доби видовженням ниркових трубочок і збірних проток, а також збільшенням об'єму фільтрації як окремим нефроном, так і ниркою у цілому, що узгоджується з даними інших дослідників (Гончаревская О.А., 1977).

Нами виявлено накопичення PAS-реактивного матеріалу у структурних елементах ниркових тілець та щіточковій облямівці нефроцитів у проміжку між 1-ю та 60-ю добою, відсутність виражених відмінностей між нирками тварин 60-ї та 120-ї доби, що також можна трактувати як ознаки досягнення ниркою щура морфологічної зрілості до 60-ї постнатальної доби. Результати PAS-реакції свідчать про важливу роль глікопротеїнів, гліколіпідів та глікогену, на виявлення яких спрямована означена реакція, у процесах постнатального морфогенезу нирки. Використання PAS-реакції не дозволило нам ідентифікувати описаних у літературі (LeHir M. et al., 1982) тинкторіальних відмінностей окремих сегментів нефронів, що, можливо, пов'язано з особливостями використаних у нашій роботі умов фіксації та подальшої обробки гістопрепаратів.

Проведені нами лектиногістохімічні дослідження продемонстрували значні якісні відмінності складу глікокон'югатів нирки новонароджених і дорослих щурів. Зокрема, у процесі постнатального морфогенезу нирки було виявлено загальну тенденцію до накопичення у складі її структурних компонентів манозо-, фукозо- та сіалогліканів (посилення експресії рецепторів лектинів Con A, LCA, LVA, PSA, MPFA, LABA, LASA, PFA, LLA, TPA, SNA, WGA, RCA) у поєднанні з редукцією вуглеводних детермінант DGalNAc та DGal (рецепторів лектинів SBA, HPA, PNA, VAA, SJA, LPFA, LTFA, LSFA та PAFA).

Означений феномен ми пояснюємо маскуванням упродовж постнатального онтогенезу типових для ембріональних та ранніх постнатальних структур вуглеводних детермінант DGal та DGalNAc залишками DMan/ DGlc, LFuc, DGlcNAc або NeuNAc, що узгоджується з даними інших авторів (Schulte B.A. et al., 1982; Holthofer H. et al., 1987,1988; Zuber C. et al., 2003). Збільшення загального вмісту вуглеводів та глікополімерів у структурах нирки упродовж її постнатального морфогенезу було раніше задокументовано з використанням класичних гістохімічних методів (Богомолова Н.А., 1965). Тепер ці дані доповнені характеристикою якісного складу їх олігосахаридних детермінант.

У нирці новонароджених щурів практично всі використані нами лектини маркували апікальні частини та люмінальну поверхню клітин термінальних ампул та S-подібних тілець, що свідчить про важливу роль глікокон'югатів у формотворенні нових нефронів. Нефроцити збірних ниркових проток цієї ж вікової групи демонстрували інтенсивну реактивність перинуклеарних ділянок з манозоспецифічними лектинами, що може бути обумовлене приєднанням залишків DMan/DGlc до олігосахаридних ланцюгів глікополімерів у складі комплексу Гольджі означених клітиних елементів.

Постнатальне ускладнення морфології нирки корелювало зі зростанням гетерогенності вуглеводних детермінант окремих її компонентів. Зокрема, на 20-у постнатальну добу було виявлено експресію нирковими тільцями рецепторів WGA, RCA, MPFA та LPFA, що може служити свідченням важливої ролі глікополімерів з визначальними для зв'язування цих лектинів детермінантами NeuNAc, DGlcNAc та DGal у становленні фільтраційного бар'єру. У цій же віковій групі - на 20-у постнатальну добу - уперше було ідентифіковано селективну афінність лектинів SBA та HPA до клітин кортикальних ниркових трубочок (вуглеводних детермінант DGalNAc), лектинів WGA та RCA - до щіточкової облямівки ниркових трубочок зовнішньої мозкової речовини (спільними рецепторами для обох означених лектинів можуть служити залишки NeuNAc). Набуті у ході морфогенезу вуглеводні маркери закріплювались і проявлялися також у дорослих тварин.

У групі тварин 60-ї постнатальної доби та у дорослих щурів виявлено накопичення у складі ареактивних до того ядер подоцитів, мезангіоцитів, ендотеліоцитів, клітин ниркових трубочок, рецепторів низки лектинів, а саме - Con A, LCA, LVA, PSA, LABA, SNA, PNA, LTFA, PAFA та LSFA. Це спостереження доповнює літературні дані стосовно афінності конканаваліну А до деяких ядерних структур, зокрема, гетерохроматину та ядерцевого апарату (Roth J., 1983, 1986), і може бути пояснено посиленням процесів гетерохроматинізації ядерного матеріалу близько 60-ї постнатальної доби - у зв'язку із завершенням морфогенетичних процесів у нирці, що знаходить своє підтвердження в дослідженнях, проведених із застосуванням інших методичних підходів (Zuber C. et al., 2003).

Таким чином, судячи з отриманих нами даних, гістохімічних ознак дефінітивного органа нирка щура набуває до 60-ї постнатальної доби, оскільки після цього терміну залежний від віку перерозподіл рецепторів лектинів припиняється або стає мінімальним.

Морфо-гістохімічні маніфестації стрептозотоцин-індукованої діабетичної нефропатії.

На 14-у добу після ін'єкції СЦ на оглядових препаратах структура нирки була практично не зміненою. На 30-у та 40-у добу експерименту на тлі загальної гіпертрофії та набряків нефроцитів, звуження сечового простору ниркових тілець, виявлено ділянки деструкції окремих нефронів. На 60-у та 80-у добу розвитку ДН ідентифіковано набряки паренхіми нирки; окремі ділянки геморагій у цей період поєднувалися з гіаліново-крапельною дистрофією мезангіоцитів ниркових тілець, нефроцитів ниркових трубочок, атрофією та потоншенням збірних проток. Виявлені гістопатологічні зміни узгоджуються з загальною концепцією морфологічних маніфестацій ДН (Дедов И.И. та ін., 2000; Салтыков Б.Б., 2008).

Проведені нами морфометричні дослідження показали, що розвиток ЦД супроводжувався деяким збільшенням густини ниркових тілець на ранніх етапах (14-а доба) після ін'єкції СЦ, що може бути обумовлено ущільненням стромальних і паренхіматозних компонентів нирки, з поступовим поверненням до контрольних показників на 80-у добу, правдоподібно, внаслідок набряку тканин нирки. Об'єм сечового простору окремих ниркових тілець і органа в цілому був достовірно меншим у порівнянні з контрольними показниками, що може бути пов'язано з діабет-індукованим підвищенням інтенсивності реабсорбції. Розвиток ЦД також супроводжувався підвищенням PAS-реактивності ниркових тілець та щіточкової облямівки ниркових трубочок, що свідчить про залучення глікокон'югатів цих структурних компонентів нирки до механізмів розвитку ДН.

Результати використання методів лектинової гістохімії дозволили раніше у порівнянні з загальноморфологічними методами - вже на 14-у добу після ін'єкції СЦ - ідентифікувати гістопатологічні зміни вуглеводних детермінант нирки. Зокрема, було виявлено зворотню у порівнянні з постнатальним морфогенезом тенденцію до редукції манозо-, фукозо- та сіалогліканів (рецепторів Con A, LCA, LVA, PSA, LABA, LASA, PFA, LLA, TPA, MPFA, SNA, WGA) у поєднанні з посиленням експресії вуглеводних детермінант DGal та DGalNAc (рецепторів лектинів PNA, VAA, SJA, SBA, HPA, LPFA, LTFA, LSFA, PAFA). На нашу думку, означений феномен віддзеркалює індуковану ЦД тенденцію до незавершеності кінцевих етапів глікозилювання синтезованих нефроцитами біополімерів, а саме, неприєднання залишків Man/ Glc, Fuc, NeuNAc до субтермінальних залишків DGal та DGalNAc, що супроводжується експресією останніх.

У низці попередніх публікацій (Луцик А.Д. та ін., 1986, 1987), подібну тенденцію до редукції манозо-, фукозо- та сіалогліканів у поєднанні з посиленням експресії термінальних залишків DGal та DGalNAc було задокументовано в слинних залозах щурів при експериментальному гіпо- та гіпертироїдизмі. Результати нашого дисертаційного дослідження дозволяють зробити певні узагальнення і сформулювати гіпотезу щодо спорідненості гістохімічних маніфестацій різних типів ендокринопатій, спільними проявами яких служать порушення процесів кінцевого глікозилювання глікополімерів, і, відповідно, посилення експресії ембріоспецифічних чи гістопатологічних вуглеводних детермінант.

З літератури відомо, що розвиток діабетичної нефропатії супроводжується втратою нирковими структурами гепаран-сульфатів внаслідок порушень їхнього синтезу, посиленого розщеплення та вимивання (Дедов И.И. та ін., 2000; Добронравов В.А., 2002), а також накопиченням хондроїтин- та дерматан-сульфатів (Бондарь И.А. та ін., 2004; Салтыков Б.Б., 2008). Отримані нами результати поширюють ці спостереження на інші типи глікополімерів нирки та деталізують патомеханізми перерозподілу їхніх вуглеводних детермінант. Як окремий прояв діабет-індукованих альтерацій глікополімерів нирки внаслідок порушення характеру глікозилювання при розвитку метаболічного синдрому можна розцінити виявлені нами зміни реактивності лектинів з клітинами інтерстицію, що узгоджується з даними інших дослідників (Дедов И.И. та ін., 2000; Бондарь И.А. та ін., 2004; Салтыков Б.Б., 2008).

Своєрідною маніфестацією діабет-індукованих змін ниркових глікокон'югатів виявилося посилене контурування щіточкової облямівки ниркових трубочок переважною більшістю використаних лектинів. Означений феномен корелював з виявленим у результаті морфометричного аналізу зменшенням сечового простору ниркових тілець, і, ймовірно, був гістохімічним віддзеркаленням посиленого синтезу нефроцитами глікополімерів, що забезпечують характерний для діабетичної нефропатії підвищений рівень реабсорбції, на що вказують, зокрема (Дедов И.И. та ін., 2000; Салтыков Б.Б., 2008). Іншим можливим поясненням виявленого нами феномену посиленого контурування лектинами люмінальної поверхні ниркових трубочок і збірних проток при ЦД, може бути підвищене транспортування через цю поверхню глікополімерів з кінцевими залишками DMan/ DGlc, LFuc, NeuNAc та DGlcNAc.

Дещо несподіваними виявилися наші спостереження редукції зв'язування конканаваліну А зі структурними компонентами паренхіми нирки з урахуванням даних щодо афінності цього лектину до глікогену (Roth J.,1986; Zlotowski P. et al., 2006). Накопичення останнього у клітинах паренхіми нирки (т.зв. глікогеновий нефроз) вважається однією з патогномонічних ознак розвитку ЦД (Дедов И.И. та ін., 2000; Бондарь И.А. та ін., 2004), у тому числі СЦ-індукованого (Hennigar R.A. et al., 1985; Holck P. et al., 1993). З урахуванням вищезазначеного, розвиток ДН мав би супроводжуватися зростанням реактивності нефроцитів з
конканаваліном А, що було задокументовано низкою авторів (Hennigar R.A. et al., 1985; Rosenquist T.H. et al., 1985), однак у наших дослідженнях не отримало підтвердження. Навпаки, по мірі прогресії ЦД ми спостерігали поступову редукцію зв'язування конканаваліну A зі структурними компонентами нирки. Можливе пояснення - використання різних протоколів фіксації гістологічного матеріалу.

Результати апробації нових препаратів лектинів.

При виконанні дисертації вперше в практиці гістохімічних досліджень апробовано п'ять нових препаратів лектинів, отриманих з представників підцарства грибів-базидіоміцетів - міцени чистої (MPFA), хряща-молочника пергаментного (LPFA), мохначки (LTFA), свинушки товстої (PAFA) та трутовика сірчано-жовтого (LSFA). Вивчена селективність зв'язування вищеозначених лектинів зі структурними компонентами нирки щура в умовах постнатального морфогенезу, розвитку ЦД та показана перспективність застосування у гістохімії.

Зокрема, встановлено, що лектини MPFA та LPFA можуть знайти використання в якості селективних гістохімічних маркерів ниркових тілець щура починаючи від 20-ї постнатальної доби, а також при розвитку ДН. З використанням лектину LSFA було задокументовано гетерогенність нефроцитів збірних ниркових проток, що погоджується з літературними даними, отриманими з використанням низки інших лектинів (LeHir M. et al., 1982; Roth J. et al., 1985; Holthofer H. et al., 1990: Zuber C. et al., 2003).

У результаті проведеного нами гістохімічного дослідження спектру комплементарних до лектину MPFA глікополімерів нирки показано, що молекули лужної фосфатази, до яких лектин MPFA виявляв максимальну афінність у тестах пригнічення реакції гемаглютинації, хоча і можуть служити потенційним рецептором означеного лектину, не обмежують його гістоспецифічності, яка може бути спрямована також на взаємодію і з іншими глікополімерами з термінальними залишками DGlc та DGlcNAc.

Нами уперше в практиці гістохімічних досліджень для характеристики ниркових структур було використано два фукозоспецифічних лектини - з кори та насіння золотого дощу (LABA та LASA). При цьому, зокрема, було виявлено відмінності зв'язування означених лектинів зі структурними компонентами нирки на 1-у постнатальну добу, що, правдоподібно, обумовлено наявністю у їхньому складі ембріоспецифічних глікополімерів з термінальними залишками DGal, які, окрім фукози, можуть визначати зв'язування лектину LASA, але не мають спорідненості до лектину LABA.

У процесі розвитку ДН було ідентифіковано менш виражену редукцію зв'язування лектину LASA у порівнянні з лектином LABA, що може бути обумовлено експресією галактозильних залишків одночасно з редукцією залишків фукозильних. Таким чином, доповнено результати попередніх біохімічних, імунохімічних та гістохімічних досліджень стосовно відмінностей вуглеводної специфічності двох споріднених лектинів з кори та насіння золотого дощу.

Нові можливості використання лектинів як селективних гістохімічних маркерів.

Якісні зміни глікокон'югатів нирки на послідовних етапах постнатального онтогенезу та у динаміці розвитку ЦД дозволяють використовувати лектини в якості селективних гістохімічних маркерів ниркових структур. Знахідки об'єктів селективного маркування лектинами, хоча значною мірою і носять емпіричний характер, розширяють уявлення стосовно глікому клітин, екстрацелюлярних структур організму, і можуть бути використані як для їх ізолювання, так і для прицільної патогенетичної терапії патологічних станів.

Зокрема, у нирці новонароджених щурів переважна більшість використаних у роботі лектинів маркувала люмінальну поверхню термінальних ампул, S-подібних тілець та збірних ниркових проток. Починаючи від 20-ї постнатальної доби та у тварин усіх наступних вікових груп виявлено селективне маркування фільтраційної мембрани ниркових тілець лектинами WGA, RCA, MPFA та LPFA, причому при розвитку ДН експресія рецепторів лектинів RCA та LPFA, наростала.

Селективне маркування лектинами дозволило виявити сегментарну і регіональну гетерогенність ниркових трубочок починаючи від 1-ї постнатальної доби і закінчуючи маніфестаціями ДН. Зокрема, у нирці новонародженого щура лектин омели білої (VAA) селективно зв'язувався з популяціями клітин окремих груп ниркових трубочок кіркової речовини. У тварин цієї ж групи лектин LASA демонстрував селективну афінність до ниркових трубочок кіркової речовини, а також кіркових колонок у складі зовнішньої мозкової речовини.

Нами було також виявлено селективне маркування кортикальних ниркових трубочок лектинами SBA та HPA, трубочок зовнішньої мозкової речовини - лектинами WGA та RCA. Клітини збірних ниркових проток демонстрували гетерогенність зв'язування SNA, LPFA та ряду інших лектинів, що співпадає з даними літератури (Holthofer H. et al., 1983; Roth J. et al., 1985; Satlin L. et al., 1992; Zuber C. et al., 2003), і, правдоподібно, обумовлено присутністю у складі збірних ниркових проток головних та вставних клітин.

Відмінності селективного маркування гістологічних структур можуть бути використані як один із вагомих показників, що відрізняють лектини спорідненої вуглеводної специфічності. Такі відмінності були нами встановлені, зокрема, між окремими представниками використаних у роботі груп манозо-, фукозо-, сіало- та галактозо-специфічних лектинів.

Висновки

гістотопографія постнатальний лектиновий діабетичний

У дисертаційній праці наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення актуального наукового завдання - з використанням 22 лектинів різної вуглеводної специфічності, у тому числі п'яти нових лектинів, очищених з грибів-базидіоміцетів, досліджено перебудову глікополімерів нирки щура в динаміці постнатального морфогенезу та при стрептозотоцин-індукованій діабетичній нефропатії. Гістохімічні дані доповнені результатами використання загальноморфологічних методів, PAS-реакції, морфометрії. Отримані результати розширюють і доповнюють існуючі уявлення щодо гістохімічних проявів постнатального морфогенезу нирки та патомеханізмів розвитку ДН, демонструють перспективність подальшого застосування методів лектинової гістохімії для вивчення перерозподілу глікополімерів у динаміці онтогенезу та гістопатології.

1. Аналіз даних лектинової гістохімії дозволяє стверджувати, що набуття ниркою щура дефінітивних ознак не завершується до 20-ї постнатальної доби, як вважалося раніше, а продовжується у проміжку між 20-ю та 60-ю добою. У процесі постнатального морфогенезу виявлена тенденція до накопичення та генералізації у цитоплазмі нефроцитів манозо-, фукозо- та сіалогліканів у поєднанні з редукцією вуглеводних детермінант DGal та DGalNAc.

2. Розвиток стрептозотоцин-індукованої діабетичної нефропатії супроводжувався редукцією манозо-, фукозо- та сіалогліканів у поєднанні з підвищенням експресії термінальних залишків DGal та DGalNAc, посиленим контуруванням щіточкової облямівки та люмінальної поверхні проксимальних та дистальних трубочок, збірних ниркових проток. Порівняння методів лектинової гістохімії з традиційними морфологічними методами показало, що перші є чутливішими і дозволяють раніше - вже на 14-у добу після ін'єкції стрептозотоцину - ідентифікувати гістопатологічні зміни у нирці.

3. На основі отриманих гістохімічних даних сформульована гіпотеза про незавершеність кінцених етапів глікозилювання біополімерів внаслідок розвитку загального метаболічного синдрому при цукровому діабеті. Серед інших можливих пояснень виявлених гістопатологічних змін нирки - підвищений розпад і вимивання протеогліканів та глікозаміногліканів, зокрема, гепаран-сульфатів, а також загальний набряк і розвиток гіаліново-крапельної дистрофії нефроцитів.

4. Уперше в практиці гістохімічних досліджень застосовано п'ять нових препаратів лектинів, очищених з представників підцарства справжніх грибів - MPFA, LPFA, LTFA, LSFA та PAFA, показано специфічність їх зв'язування з нирковими структурами та перспективу подальшого застосування у цито- та гістохімії.

5. Лектини MPFA та LPFA продемонстрували високу селективність зв'язування з фільтраційною базальною мембраною ниркових тілець щура починаючи від 20-ї постнатальної доби і старших вікових груп, що свідчить про доцільність використання цих новоочищених лектинів для морфо-гістохімічного вивчення закономірностей становлення органних систем в онтогенезі.

6. Уперше для характеристики перерозподілу і якісних змін глікополімерів нирки щура в динаміці постнатального онтогенезу та при стрептозотоцин-індукованій діабетичній нефропатії використано два оригінальних фукозоспецифічних лектини - з кори та насіння золотого дощу (LABA та LASA), які продемонстрували різну гістохімічну специфічність.

7. Ідентифіковано підвищену експресію нирковими тільцями рецепторів лектинів WGA, RCA, MPFA та LPFA починаючи від 20-ї постнатальної доби, а також при розвитку діабетичної нефропатії. Лектини WGA та RCA продемонстрували селективну афінність до ниркових трубочок зовнішньої мозкової речовини нирки дорослого щура, тоді як селективними маркерами кортикальних ниркових трубочок виявилися лектини SBA та HPA.

Отримані нові дані стосовно селективного зв'язування лектинів зі структурами нирки, а також апробовані у роботі нові оригінальні препарати лектинів, очищені з грибів-базидіоміцетів, можуть бути використані в практиці гістологічних і патогістологічних лабораторій, у навчальному процесі відповідних кафедр.

Література

1. Амбарова Н.О. Характер зв'язування лектинів різної вуглеводної специфічності з глікополімерами нирки новонароджених щурів/ Н.О. Амбарова, О.Д. Луцик// Acta Medica Leopoliensia-2007.-Т.13,№4.-С.59-66.

2. Амбарова Н.О. Манозоглікани нирки щура в динаміці постнатального онтогенезу та при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті: гістохімічне дослідження з використанням лектинів Сon A, LCA, PSA та нового лектину з гриба міцени чистої (MPFA)/ Н.О.Амбарова, Р.В. Антонюк, О.Д. Луцик// Світ медицини та біології.-2008.-№4.-С.95-103.

3. Амбарова Н.О. Фукозоглікани нирки щура: перерозподіл в динаміці постнатального онтогенезу та в процесі розвитку стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету/ Н.О. Амбарова, В.О. Антонюк, О.Д. Луцик// Клінічна анатомія та оперативна хірургія.-2009.-Т.8,№1.-С.15-21.

4. Амбарова Н.О. Перебудова сіалогліканів нирки щура у постнатальному морфогенезі та при стрептозотоцин-індукованій діабетичній нефропатії// Acta Medica Leopoliensia.-2009.- Т.15,№2.-С.35-45.

5. Амбарова Н.О. Перебудова сіалогліканів нирки щура у постнатальному морфогенезі та при стрептозотоцин-індукованій діабетичній нефропатії// Морфологія (електронний журнал).-2009.-Т.3,№3.-С.21-31.

6. Антонюк В.О. Вуглеводна специфічність лектину, одержаного з плодових тіл міцени чистої (Mycena pura /Fr./ Kumm.), та його використання в гістохімічних дослідженнях/ В.О. Антонюк, А.М. Ященко, Р.В. Антонюк, Н.О. Амбарова // Біополімери та клітина.-2009.-Т.25,№6.-С.454-465.

Размещено на Allbest.ru