Вплив антиоксидантів рослинного походження на метаболізм нітрогеновмісних сполук за нейрогенного стресу у щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХЕРСОНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КРАВЧЕНКО ГАННА БОРИСІВНА

УДК 577.122.8:615.272.6

ВПЛИВ АНТИОКСИДАНТІВ РОСЛИННОГО ПОХОДЖЕННЯ НА МЕТАБОЛІЗМ НІТРОГЕНВМІСНИХ СПОЛУК ЗА НЕЙРОГЕННОГО СТРЕСУ У ЩУРІВ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Херсон - 2010



ДИСЕРТАЦІЄЮ Є РУКОПИС

Робота виконана на кафедрі біохімії Національного фармацевтичного університету МОЗ України (м. Харків).

Науковий керівник:

кандидат біологічних наук, доцент

Загайко Андрій Леонідович,

Національний фармацевтичний університет, МОЗ України, доцент кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, доцент

Князєва Марина Владіславівна,

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна МОН України, м. Харків, професор кафедри біологічної хімії

- доктор біологічних наук, професор

Фіра Людмила Степанівна,

Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України, м. Тернопіль, зав. кафедрою фармацевтичної хімії

Захист відбудеться « 9 » квітня 2010 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 67.051.01 Херсонського державного університету МОН України (73000, м. Херсон, вул. 40 років Жовтня, 27, ауд. 725).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Херсонського державного університету МОН України (73000, м. Херсон, вул. 40 років Жовтня, 27).

Автореферат розісланий «_3_» березня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Полещук С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Стан стресу виникає як наслідок дії на організм будь-яких сильних або незвичайних подразників (Greenberg N., 2002; Vale S., 2005; Kassahn K.S., 2009), а психоемоційний стрес, спричинений перенапруженням центральної нервової системи, є одним із негативних наслідків технічного прогресу. Тому дослідження молекулярних механізмів розвитку стресових станів, зокрема, психоемоційного стресу, та пошук оптимальних шляхів їх корекції, є актуальним.

Суттєву роль у процесі метаболізму за умови стресу відіграють нітрогенвмісні сполуки (McCarty R. еt al., 2002; Harding H.P., 2003). Загальновідомо, що під впливом екстремальних чинників неспецифічні реакції стресу спрямовані на стимуляцію енергетичного забезпечення пристосувальних процесів (Charney D.S., 2004; Kyrou I. et al., 2007) шляхом мобілізації до кров'яного русла глюкокортикоїдів та катехоламнів. Глюкокортикоїди стимулюють перетворення амінокислот на попередники глюконеогенезу, гальмують синтез білка та прискорюють його деградацію в лімфоїдній тканині та м'язах (Sapolsky R.M., 2000; Shimonitsu Y., 2001), що не компенсується підсиленням біосинтезу глобулінів та трансаміназ у печінці (Charmandari E. Et al., 2005; Romero L.M., 2007). Унаслідок цих процесів в організмі встановлюється негативний азотистий баланс, що супроводжується утворенням великої кількості неутилізованого нітрогену (Baynes J., 2009). Такі органи, як серце, легені, печінка, залози внутрішньої секреції та кишківник здатні довго зберігати принаймні мінімум своїх функцій (Powers S.K., 2005; Wolfe R.R., 2006). Отже, виникає питання про зміни метаболізму нітрогенвмісних сполук у цих органах за умов стресу. Не достатньо дослідженим є механізм впливу катехоламінів на метаболізм нітрогенвмісних сполук під впливом екстремальних чинників.

Наявні шляхи корекції негативних наслідків стресу спрямовані, переважно, на подолання окремих виявів або підвищення резистентності нервової системи до стресорних впливів (Everly G.S., 2002; Horowitz M.J., 2003). Разом з тим, розробка прийомів метаболічної корекції негативного впливу стресу на різні ланки обміну речовин допоможе запобігти розладам серцево-судинної системи.

Відомо, що розвиток оксидативного стресу є однією з патогенних ланок нервових та інших перенапружень (Hallivel B., 2007; Jones D.P., 2008). У зв'язку з цим пріоритетним та актуальним вбачається дослідження впливу рослинних антиоксидантів на метаболізм загалом та метаболізм нітрогенвмісних сполук, зокрема, за умови нейрогенного стресу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в Національному фармацевтичному університеті в межах науково-дослідної програми з проблеми МОЗ України «Фармакологічне дослідження біологічно активних речовин та лікарських засобів синтетичного та рослинного походження та їх застосування в медичній практиці» (№ державної реєстрації 0103U000478).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає у встановленні впливу антиоксидантів рослинного походження на метаболізм нітрогенвмісних сполук за умов нейрогенного стресу в щурів.

Для реалізації поставленої мети було визначено такі завдання:

1. Дослідити стан метаболізму нітрогенвмісних сполук за умов гострого та повторюваного нейрогенного стресів у щурів.

2. З'ясувати роль адреналіну у формуванні метаболічної відповіді з боку нітрогенвмісних сполук за умов гострого та повторюваного нейрогенного стресів у піддослідних тварин.

3. Установити вплив поліфенольних екстрактів насіння різних сортів Винограду культурного на метаболізм нітрогенвмісних сполук за умов гострого та повторювального стресів у щурів.

4. Визначити вплив антиоксидантної та фітоестрогенної складових поліфенольних екстрактів з насіння Винограду культурного на метаболізм нітрогенвмісних сполук за умов нейрогенного стресу в піддослідних тварин.

Об'єкт дослідження - біохімічні механізми розвитку нейрогенного стресу в щурів.

Предмет дослідження - показники метаболізму нітрогенвмісних сполук за умови нейрогенного стресу в щурів під впливом антиоксидантних компонентів насіння Винограду культурного.

Методи дослідження. Спектрофотометричне дослідження вмісту основних продуктів азотистого метаболізму (за кольоровими реакціями) та активності ферментів обміну нітрогенвмісних сполук (за кінцевими продуктами). Імуноферментне визначення вмісту кортикостероїдів. Статистичний аналіз отриманих даних проведено непараметричними методами.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено порівняльне експериментальне дослідження змін у процесі метаболізму нітрогенвмісних сполук за умов гострого та повторюваного стресів та введення адреналіну. Доведено, що активація катаболічних процесів за умов нейрогенного стресу спричиняє зниження в крові та тканинах щурів вмісту аргініну й креатину.

Уперше доведено, що поліфенольні концентрати, отримані з різних сортів винограду, сприяють розвитку специфічних та неспецифічних метаболічних реакцій. Установлено, що за умов нейрогенного стресу, викликаного іммобілізацією тварин, та при введенні адреналіну в тканинах та крові щурів зростає активність g-глутамілтранспептидази - маркера оксидативного стресу.

Уперше з'ясовано, що антиоксидантні сполуки насіння Винограду культурного, зменшують вияви цитолізу та інтенсивність нітрогенвмісного катаболізму, полегшуючи розвиток стрес-реакції. Підтверджено, що біологічна активність поліфенольних концентратів визначається антиоксидантними та фітоестерогенними складовими. Обчислено рівень гіпоурикемічних ефектів поліфенольних концентратів з насіння різних сортів винограду.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження поглиблюють сучасні уявлення про біохімічні механізми розвитку метаболічних змін в організмі за умови гострого та повторювального нейрогенного стресів та про ефективність використання рослинних антиоксидантів для їх корекції. Результати, одержані в процесі проведення дослідів, обґрунтовують використання антиоксидантних сполук насіння Винограду культурного в корекції стрес-індукованих метаболічних змін та сприяють пошуку й розробці нових препаратів на їх основі для комплексної терапії проатерогенних наслідків стресу.

Матеріали дисертаційної роботи впроваджено в навчальний процес Національного фармацевтичного університету кафедрою біохімії під час викладання дисциплін: «Клінічна біохімія», «Загальна біохімія та молекулярна біологія» та «Функціональна біохімія».

Особистий внесок здобувача. Автором разом із науковим керівником обґрунтовано концепцію роботи та особисто розроблено її план, проведено всі біохімічні дослідження, статистичну обробку результатів. Аналіз та обговорення результатів проведено разом із науковим керівником. Поліфенольні концентрати з насіння різних видів Винограду культурного для досліджень було надано Національним інститутом винограду і вина «Магарач», м. Ялта.

Апробація результатів роботи. Основні положення дисертаційної роботи було представлено на Всеукраїнській науково-практичній конференції «Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії» (2009 р., м. Тернопіль), XVII Международній науково-практичній конференції «Казантип-Эко-2009. Экология, энерго- и ресурсосбережение, охрана окружающей среды и здоровье человека, утилизация отходов» (2009 р., м. Щьолкіно, Крим), Региональной 65-й конференции по фармации и фармакологии (2010 г, Пятигорск), XXVII Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Ліки-людині. Сучасні проблеми створення, вивчення та апробації лікарських засобів» (м. Харків, 2010 р.), семінарах кафедри біохімії НФаУ (2007-2009 рр.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 статей, у тому числі 6 з них у виданнях, затверджених ВАК України, та 3 статті - у збірниках матеріалів конференцій, з них 1 - без співавторів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів роботи, узагальнення, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел. Роботу викладено на 156 сторінках машинописного тексту. Основну частину викладено на 123 сторінках, містить 40 таблиць та 34 рисунки. Таблиці та рисунки займають 23 сторінок. Бібліографічний список уміщає 240 джерел, з них 210 іноземних.

метаболізм нітрогеновмісний нейрогенний стрес

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У огляді літератури представлено аналіз сучасних праць, що стосуються механізмів розвитку стрес-реакції взагалі та стану метаболізму нітрогенвмісних сполук зокрема. Визначено роль активації вільнорадикального окиснення в змінах метаболізму. Вивчено стрес-протекторні перспективи природних антиоксидантів - прямої протиокисної дії та фітоестрогенних механізмів. Проаналізовано роль метаболітів амінокислот у підтриманні судинного тонусу та значення ендотеліальної дисфункції в розвитку патологій серцево-судинної системи. Обґрунтовано доцільність з'ясування механізмів змін метаболізму нітрогенвмісних сполук за умови стресу.

Матеріали та методи дослідження. У роботі використано 246 білих безпородних щурів-самців 3-місячного віку, масою 180-220 г, які утримувалися у стандартних умовах віварію.

Щурів було розподілено на 12 груп залежно від мети експерименту:

Інтактні тварини.

Тварини, яким уводили перорально відповідний об'єм фізіологічного розчину (контрольні тварини № 1). Тварин декапітували тоді ж, коли й піддослідних тварин.

Тварини, яким уводили перорально відповідний об'єм фізіологічного розчину та робили підшкірну ін'єкцію фізіологічного розчину (контрольні тварини № 2). Тварин декапітували тоді ж, коли й піддослідних тварин;

Тварини, яким уводили одноразово підшкірно адреналін з розрахунку 2 мг на 100 г ваги тіла (Фроликова М.В. и др., 2005). Тварин декапітували через 1 год після ін'єкції.

Тварини, які підлягали іммобілізації на череві протягом 3 годин (Семагин В.Н. и др., 1988) та декапітували через 0,5 годин після іммобілізації.

Тварини, яким протягом 14 діб щоденно перорально вводили поліфенольні концентрати, отримані з насіння винограду сортів «Каберне», «Мерло», «Ркацителі» та «Рислінг» дозами, з розрахунку на поліфеноли, - 9 мг на 100 г ваги тіла (профілактичне введення). Частина тварин підлягала гострому нервово-м'язовому напруженню іммобілізації на 15 добу введення екстрактів, а інша частина використовувалася як контрольна група.

Тварини, яким протягом 14 діб щоденно перорально вводили поліфенольні концентрати, отримані з насіння винограду сортів «Каберне», «Мерло», «Ркацителі» та «Рислінг» дозами, з розрахунку на поліфеноли, - 9 мг на 100 г ваги тіла (профілактичне введення). Частина тварин підлягала гострому нервово-м'язовому напруженню іммобілізації на 15 добу введення екстрактів, а інша частина використовувалася як контрольна група.

Тварини, яким щоденно протягом 21 доби підшкірно вводили адреналін дозою 0,5 мг на 100 г ваги тіла (Соболев В.И. и др., 2001) та декапітували на 8, 15 та 22 добу.

Тварини, у яких викликали тривале нервово-м'язове напруження щоденною іммобілізацією на череві протягом 3 годин 21 добу (McLaughlin K. J., et al., 2007), та яких декапітували на 8, 15 та 22 добу.

Тварини, яким щоденно протягом 21 доби підшкірно вводили адреналін з розрахунку 0,5 мг на 100 г ваги тіла (Соболев В.И. и др., 2001) та починаючи з 8-ої доби протягом 15 діб щодня перорально вводили поліфенольний концентрат, отриманий з насіння винограду сорту «Каберне» дозою 9 мг поліфенолів на 100 г ваги тіла (лікувальне введення). Тварин декапітували на 15 та 21 добу від початку експерименту.

Тварини, які щоденно протягом 21 доби підлягали іммобілізації на 3 години та яким починаючи з 8-мої доби протягом 15 діб щодня перорально вводили поліфенольний концентрат, отриманий з насіння винограду сорту «Каберне» з розрахунку 9 мг поліфенолів на 100 г ваги тіла (лікувальне введення). Тварин декапітували на 15 та 21 добу від початку іммобілізування.

Тварини, яким протягом двох тижнів з 8-ї доби з початку експерименту щоденно перорально вводили поліфенольний концентрат, отриманий з насіння винограду сорту «Каберне» дозою 9 мг поліфенолів на 100 г ваги тіла (контрольні тварини № 3). Тварин декапітували тоді ж, коли й піддослідних тварин.

Розвиток стрес-реакції реєстрували за підвищенням у крові піддослідних тварин вмісту кортикостерону, рівень якого визначали імуноферментним методом. Усіх тварин декапітували під хлоралозо-уретановим наркозом. Дослідження проводилися відповідно до національних «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (Україна, 2001), узгоджених з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985). У декапітованих тварин збирали кров для отримання сироватки, печінку перфузували холодним фізіологічним розчином та видаляли для отримання гомогенатів. Нирки видаляли і, відмиваючи на холоді, отримували гомогенати. З цією метою застосовували гомогенізатор Поттера з охолодженою скляною пробіркою.

Вміст сечовини в сироватці крові та органах тварин визначали, за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом (Камышников В. С., 2000). Для цього використовували набір реактивів виробництва ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика», Україна.

Вміст креатиніну та креатину в сироватці крові та органах тварин визначали, за допомогою кольорової реакції реакції Яффе зі застосуванням пікринової кислоти (Камышников В. С., 2000). Для визначення креатиніну використовували набір реактивів ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика», Україна.

Вміст сечової кислоти (СК) в сироватці крові, гомогенатах печінки та нирок визначали за допомогою реакції з фосфорновольфрамовим реактивом Фоліна (Камышников В. С., 2000). Цей дослід проводили, застосовуючи набір реактивів ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика», Україна.

Визначення вмісту аргініну в сироватці крові та гомогенатах органів проводили за реакцією з a-нафтолом (Akamatsu S. et al., 1961). Вміст цитруліну визначали за реакцією з діацетилмоноксимом у сильно кислому середовищі (Boyde T.R. et al. 1980).

Визначення активності аргінази в гомогенатах органів проводили методом D.M. Greenberg (Guven A., et al., 2006). Для визначення сечовини використовували набор реактивів виробництва ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика», Україна.

Активність аланінамінотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ) у сироватці крові та постмітохондріальній фракції органів визначали уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом (Камышников В. С., 2000). Для цього використовували набір реактивів виробництва ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика», Україна.

Активність g-глутамілтранспептидази (ГГТП) у сироватці крові та гомогенатах органів визначали, керуючись кількісним кінетичним методом G. Szatsz (1983) та використовуючи набір реактивів виробництва ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика», Україна.

Вміст білка в сироватці крові, тканинах печінки та нирок визначали методом J.Y Lowry модифікованим G.L. Miller (Miller G.L., 1959).

Статистичну обробку отриманих результатів проводили за непараметричним критерієм Манна-Уітні на персональному комп'ютері з використанням пакетів Excel та Statistica 7, коефіцієнт кореляції визначали за Спірменом.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вивчення показників метаболізму нітрогенвмісних сполук за умов гострого нейрогенного стресу, спричиненого іммобілізацією. В експерименті встановлено (табл. 1, 2), що нейрогенний стрес у піддослідних щурів супроводжується характерними змінами метаболізму, спрямованими на постачання джерел енергії та активацію енергетичного обміну. Так, рівень сечовини в сироватці крові зростає на 31%, аргініну - знижується на 53%, а цитруліну - на 25%, у печінці це зниження відповідно склало 15 та 55%, а в нирках - рівень аргініну зріс на 30% на тлі зменшення вмісту цитруліну на 22%.

Таблиця 1. Активність аргінази та вміст аргініну тканинах щурів за умов гострого нейрогенного стресу (M±m, n=6)

Група тварин	Активність аргінази мкмоль сечовини/хв на мг білка	Вміст аргініну, мкмоль/л (г)
	Печінка	Нирки	Сироватка	Печінка	Нирки
Інтакт	0,440,02	0,250,01	68,050,86	6,130,17	48,331,13
Стрес	0,560,01a	0,360,02a	32,631,01a	5,270,44a	62,581,33a
Примітка: a - рЈ0,05 відносно інтакту

Ці дані загалом свідчать про активацію утилізації аргініну як через зростання активності сечовиноутворення, так і з метою синтезу креатину та Нітроген оксиду (Solomonson et al., 2003; Morris S.M., 2004; Powers et al., 2007).

Стрес, викликаний іммобілізацією, спричиняє падіння рівня аргініну як в сироватці крові, так і в тканинах тварин, що корелює зі зростанням активності аргінази.

Оскільки вміст цитруліну також знижується, ми припускаємо, що головною причиною зменшення вмісту аргініну є активація орнітинового циклу, і за цих умов кількість аргініну для утворення Нітроген оксиду може стати недостатньою, що розглядається як показник розвитку ендотеліальної дисфункції під впливом стресу (Sagach V. et al., 2006; Shaikh A. K. et al., 2008). Активація сечовиноутворення підтверджується збільшенням умісту сечовини в сироватці крові стресованих тварин. Окрім того, рівень креатину в сироватці крові та печінці таких тварин знижується (у сироватці - на 61%, у печінці - на 37%), що можна пояснити активацією його перетворення на креатинфосфат і активним використанням останнього як джерела енергії з утворенням креатиніну (Wyss M., 2000).

Таблиця 2. Вміст деяких небілкових нітрогеновмісних сполук за умов гострого нейрогенного стресу в тканинах щурів (M±m, n=6)

Група тварин	Показники
	Сечовина, ммоль/л (мкмоль/г тканини)	Цитрулін, мкмоль/л (нмоль/г тканини)	Креатин, мкмоль/л (г)
Сироватка крові
Інтакт	7,250,59	41,392,38	75,340,44
Стрес	9,530,61a	31,412,49a	29,850,41a
Гомогенат печінки
Інтакт	8,560,35	21,401,86	425,240,84
Стрес	13,250,37a	9,740,79a	268,540,59a
Гомогенат нирок
Інтакт	22,360,42	103,6112,17	Не досліджували
Стрес	36,470,39a	81,523,18a
Примітка: a - рЈ0,05 відносно інтакту

Не виключена можливість зниження продуктивності формування креатину з аргініну через зниження рівня останнього. Найімовірніше, мають місце всі зазначені механізми: за умови стресу активується використання карбонових скелетів амінокислот для енергетичного забезпечення, що призводить до нагромадження амоніаку, на знешкодження якого спрямоване зростання активності ферментів орнітинового циклу (Morris S.M., 2002). Активація аргінази за цих умов призводить до зниження рівня аргініну та його нестачу для синтезу біологічно активних продуктів - креатину й Нітроген оксиду. Наведені ефекти можуть призвести до розвитку ендотеліальної дисфункції та виступати одним з механізмів проатерогенезу.

Активація катаболічних процесів за умови нейрогенного стресу підтверджується збільшенням умісту креатиніну в сироватці крові та печінці щурів (табл. 3), що вказує на активацію використання аргініну для синтезу креатину.

Таблиця 3. Вміст продуктів та активність ферментів азотистого обміну в сироватці крові щурів за умов нейрогенного стресу (M±m, n=7)

Показник	Групи
	Інтакт	Стрес
Креатинін,мкмоль/л	69,793,47	107,485,58a
Сечова кислота, мкмоль/л	131,255,73	247,986,34a
АлАт,мкмоль/годмл	1,150,08	1,680,09a
АсАт, мкмоль/годмл	0,990,09	1,770,11a
ГГТП, мккат/л	0,330,02	0,620,03a
Примітка: a - рЈ0,05 відносно інтакту

Установлено, що нейрогенний стрес, спричинений іммобілізацією тварин, супроводжувався гіперферментемію: активність трансаміназ зростала (АлАт - на 46%, АсАт - на 88 %) порівняно з інтактними тваринами, таку ж тенденцію виявляла активність ГГТП (зростала на 93%). Імовірно, це зумовлено активацією цитолізу внаслідок вільнорадикального пошкодження мембран.

У процесі експерименту відзначено підвищення рівня сечової кислоти в сироватці крові (див. табл. 3.) та органах (табл. 4) тварин за умов гострого стресу.

Останнім часом нагромаджено важливі відомості про значення зростання вмісту сечової кислоти в розвитку серцево-судинних захворювань. Виявлено, що в пацієнтів з артеріальною гіпертонією, ішемічною хворобою серця, застійною серцевою недостатністю, порушенням ниркової функції спостерігається більш високий рівень вмісту сечової кислоти (Feig D. I. et al., 2008).

Про динаміку інтенсивності катаболічних процесів та використання білкових резервів за умов гострого нейрогенного стресу свідчать зміни активності досліджених ферментів у тканинах (табл. 4). Разом із зниженням загального вмісту білка (в печінці - на 12%, у нирках - на 15%) у тканинах спостерігалася активація амінотрансфераз (у печінці активність АлАт зростала на 37%, АсАт - на 73%, у нирках - у 2,5 та 1,5 рази відповідно). Зафіксовані у процесі дослідження ефекти вказують на активацію використання карбонових кислот в енерегетичному обміні, що підтверджується нагромадженням сечовини (див. табл. 2). Відзначене зростання активності ГГТП-циклу (див. табл. 4) указує, ймовірно, на інтенсифікацію транспортних процесів, та може бути пов'язане з активацією вільнорадикальних процесів.

Таблиця 4. Вміст продуктів та активність ферментів азотистого обміну в тканинах щурів за умов нейрогенного стресу (M±m, n=7)

Група тварин	Показники
	Білок мг/г	СК мкмоль/г	АлАТ мкмоль/ годмг білка	АсАТ мкмоль/ годмг білка	ГГТП мкмоль/ годмг білка
Гомогенат печінки
Інтакт	155,121,01	122,360,54	3,520,31	1,210,09	102,751,29
Стрес	139,380,68a	178,360,86a	4,780,16a	2,110,16a	139,360,94a
Гомогенат нирок
Інтакт	142,401,11	54,360,79	1,690,16	3,110,08	1996,881,72
Стрес	123,341,26a	68,460,64a	4,220,11a	4,890,19a	2009,968,13a
Примітка: a - рЈ0,05 відносно інтакту

Вивчення впливу поліфенолів винограду на показники метаболізму нітрогенвмісних сполук за умов введення адреналіну. Відомо, що введення високих доз адреналіну спричиняє розвиток ендотеліальної дисфункції, провокує енергетичний голод, що розглядається як один з механізмів переключення метаболізму з вуглеводного типу на жировий за умови стресу (MacFarlane D.P., 2008). Установлено, що введення тваринам значних доз адреналіну викликало істотне зниження вмісту аргініну в крові й печінці, та його зростання в нирках (табл. 5). Разом з тим, активність аргінази в печінці зростала в 2,25 рази і в нирках - на 47%. Зниження вмісту аргініну в печінці та крові можна пояснити його розщепленням аргіназою, про що свідчить збільшення вмісту сечовини (табл. 6).

Таблиця 5. Активність аргінази та вміст аргініну в печінці та нирках щурів за умов введення адреналіну (M±m, n=6)

Група	Сироватка крові	Гомогенат печінки	Гомогенат нирок
	Аргінін мкмоль/л (г)	Аргінін мкмоль/л (г)	Аргіназа мкмоль/хв на мг білка	Аргінін мкмоль/л (г)	Аргіназа мкмоль/хв на мг білка
Інтакт	68,050,86	6,130,17	0,830,06	48,331,13	0,590,03
Адреналін	27,661,38a	4,390,34a	1,870,05a	67,930,79a	0,870,06a
Примітка: a - рЈ0,05 відносно інтакту

У нирках активація аргінази супроводжується підвищенням рівня сечовини, тому зростання вмісту аргініну в цій тканині можна пояснити порушенням співвідношення між його утворенням в орнітиновому циклі і розщепленням. Це підтверджується більшим вмістом цитруліну в нирках, ніж у печінці та крові, й більш значним, ніж у печінці та крові, питомим зменшенням його вмісту. Тим часом, цитрулін є попередником аргініну в орнітиновому циклі та продуктом NO-синтазної реакції, тому скорочення вмісту цієї амінокислоти свідчить про зниження продуктивності утворення Нітроген оксиду й може бути виявом ендотеліальної дисфункції за умов введення адреналіну (Esper R.J. et al., 2006).



Таблиця 6. Вміст деяких небілкових нітрогенвмісних сполук у сироватці крові та органах щурів за умов введення адреналіну (M±m, n=6)

Група тварин	Показники
	Сечовина ммоль/л (мкмоль/г тканини)	Цитрулін мкмоль/л (нмоль/г тканини)	Креатин мкмоль/л (г)	Креатінин мкмоль/л (г тканини)
Сироватка крові
Інтакт	8,150,24	41,392,38	75,340,44	68,403,31
Адреналін	9,160,21a	22,062,65a	22,690,70a	139,687,68a
Гомогенат печінки
Інтакт	5,940,17	21,401,86	425,240,84	59,331,96
Адреналін	10,180,31a	11,461,13a	200,770,92a	82,626,08a
Гомогенат нирок
Інтакт	20,191,22	103,6112,17	Не досліджували
Адреналін	31,750,39a	71,921,62a
Примітка: a - рЈ0,05 відносно інтакту

Зростання інтенсивності реакцій орнітинового циклу, спрямованого на знешкодження продуктів транс/дезамінування амінокислот та включення їх карбонових скелетів до енергетичного обміну, підтверджує активацію катаболізму, що спостерігається за умов введення адреналіну. Окрім того, нестача аргініну за цих умов спричиняє дефіцит креатину, необхідного для утворення одного з джерел метаболічної енергії - креатинфосфату. Отже, ускладнюється розвиток адаптивних реакцій, оскільки розпад креатинфосфату, очевидно, зростає, на що вказує підвищення рівня креатиніну в крові та печінці тварин.

Введення адреналіну викликає активацію цитолітичних процесів, про що свідчить зростання активності маркерних щодо цитолізу ферментів у сироватці крові (табл. 7). Так, активність АлАТ підвищується в 2,7 рази, АсАТ - у 2,8 разів, а ГГТП - у 3,2 рази. Установлено, що цитоліз за умови введення адреналіну супроводжується виходом у кров цитозольних (АлАТ) і мітохондріальних (АсАТ) ферментів.

Таблиця 7. Вміст продуктів та активність ферментів обміну нітрогенвмісних сполук у сироватці крові щурів за умов введення адреналіну (M±m, n=7)

Група тварин	Показники
	Білок мг/мл	СК мкмоль/мл	АлАТ мкмоль/ годмл	АсАТ мкмоль/ годмл	ГГТП мкмоль/ годмл
Інтакт	60,622,39	146,282,85	1,280,04	0,460,03	1,510,02
Адреналін	48,11,27a	198,994,59a	3,410,08a	1,280,02a	4,840,12a
Примітка: a - рЈ0,05 відносно інтакту

Необхідно відзначити зниження загального вмісту білка в сироватці крові за умов введення адреналіну (див. табл. 8), що зумовлено як порушенням функції печінки внаслідок цитолітичного ураження, так і втратами білка через порушення роботи нирок та зниженням надходження амінокислот через гальмування процесів травлення. Зазначені процеси розгортаються під впливом надлишку адреналіну.

З'ясовано, що в тканинах щурів за умов застосування адреналіну спостерігалося зменшення загального вмісту білка в печінці на 24%, у нирках - на 14%, що на тлі значного зростання активності амінотрансфераз свідчить про збільшення використання амінокислот як джерела енергії. Збільшення вмісту СК, що виявлено за умов введення адреналіну, також може свідчити про розвиток гіперметаболізму.

Відзначено значне підвищення активності ГГТП: у печінці - у 3,1 рази, у нирках - у 2 рази, що може бути як сприятливим, так і негативним. Відомо, що деградація позаклітинного відновленого глутатіону, що каталізується екзоферментом ГГТП, і наступний його синтез de novo в цитозолі може захистити клітини від оксидативного стресу. Припускають, що підвищення активності ГГТП може виступати частиною системи адаптації клітин до оксидативного стресу. Разом з тим, зростання внутрішньоклітинної активності ГГТП призводить до дефіциту глутатіону та пов'язано з кардіоваскулярними, неврологічними й онкологічними захворюваннями (Sacuta H. Et al., 2005; Yokoyama H., 2007). Отже, активація ГГТП призводить до різних наслідків, як знижуючи, так і збільшуючи стійкість клітин до вільнорадикальних порушень.

Вплив поліфенолів винограду на показники метаболізму нітрогенвмісних сполук за умов гострого нейрогенного стресу, спричиненого іммобілізацією. Під впливом екстремального чинника активується вільнорадикальне окиснення, тому застосування сполук з антиоксидантною активністю, імовірно, сприяє усуненню негативних наслідків стресу.

Результати нашого дослідження свідчать, що поліфенольні комплекси, отримані з Винограду культурного, в цілому мають нормалізуючий вплив на встановлені показники. Зокрема, профілактичне застосування екстрактів винограду знижує інтенсивність катаболічних процесів.

Так, введення тваринам екстрактів насіння винограду нормалізувало рівень вмісту сечовини та активність аргінази і збільшувало вміст цитруліну та креатину.

Разом з тим, ця активність виявилася відмінною в різних екстрактів. Так, введення поліфенольного комплексу «Мерло» нормалізувало вміст досліджених амінокислот у нирках, хоча в крові їх рівень залишається нижчим за показники норми. Поліфенольний концентрат «Каберне» нормалізував лише вміст цитруліну в нирках. Поліфенольні комплекси «Ркацителі» та «Рислінг» також сприяли нормалізації вмісту досліджених амінокислот у нирках.

Установлені результати не корелюють з антиоксидантною активністю досліджуваних поліфенольних комплексів, представленою в попередніх дослідженнях (Загайко А.Л. та ін., 2007). За антиоксидантною активністю комплекси розташовано в такій послідовності: «Каберне»> «Мерло» > «Ркацителі» > «Рислінг». Тому ймовірно, що зазначений уплив поліфенольних комплексів пояснюється не лише антиокисною дією поліфенолів, а й іншими, зокрема, фітоестрогенними, ефектами.

Відомо, що виноград червоних сортів містить значні кількості похідних ксантинів, що можуть спричиняти гіперурікемію (Manach C. et al., 2004; Mennen L.I. et al., 2005). Отже, виникла необхідність уточнити умови застосування даних концентратів зі стрес-протекторною метою. Профілактичне застосування поліфенольних концентратів винограду значно полегшувало й ці аспекти протікання стрес-реакції, що виражалося зниженням інтенсивності катаболічних процесів та проявів цитолізу. Наприклад, введення тваринам поліфенольного комплексу «Каберне» нормалізувало активність вивчених ферментів у сироватці, та зменшувало гіперурікемію та гіперкреатинінемію (рівень сечової кислоти був на 22%, а креатиніну - на 26% нижчим, ніж у контрольних стресованих тварин). Концентрат «Мерло» також нормалізував активність АлАт і ГГТП, понижував рівень креатиніну (на 74%) та сечової кислоти (на 75 %) порівняно з рівнем у контрольних тварин. Концентрати «Ркацителі» та «Рислінг» викликали повернення до норми вмісту креатиніну, а рівень сечовини та сечової кислоти під їх впливом знижувався навіть більше за показники у інтактних тварин та під дією концентратів «Мерло» і «Каберне». Останнє спостереження дозволяє припустити, що концентрати «Ркацителі» та «Рислінг» можуть надавати анаболічної дії за умов нейрогенного стресу.

Звернемо увагу ще і на те, що введення екстрактів з насіння винограду, очевидно, загалом стабілізувало клітинні мембрани, що виявлялося в зниженні імовірності потрапляння клітинних ферментів у кров (активність АлАт знижувалася за дії концентратів «Мерло» та «Ркацителі», АсАт - «Каберне» та «Рислінгу», а ГГТП - «Каберне» та «Ркацителі»).

Відмінності в антицитолітичній дії екстрактів, очевидно, пов'язані з різними точками впливу компонентів концентратів на клітину: для «Мерло», ймовірно, була більшою мірою характерна стабілізувальна дія на мітохондрії, а для «Рислінгу» - на плазматичні мембрани. Концентрат «Ркацителі», ймовірно, стабілізував як зовнішні, так і внутрішні мембрани клітин.

Вплив поліфенолів винограду на показники метаболізму нітрогенвмісних сполук за умов повторюваного нейрогенного стресу. Стан повторюваного стресу призводить до порушення механізму зворотного зв'язку і тривалому персистуванню високих концентрацій глюкокортикоїдів у крові. Це, у свій час, веде до зниження вмісту естрогенів. Відомо, що поліфенольні концентрати з насіння винограду містять сполуки з фітоестрогенними властивостями, зокрема, флавоноїди, антиоксидантні та протизапальні властивості яких добре відомі (Middleton E., 2000; Nijveldt R. J et al., 2001; Szmitko P. E., 2005).

Завдяки антиоксидантним властивостям поліфеноли винограду, ймовірно, здатні стабілізувати біологічні мембрани, внаслідок чого за умов повторюваного нейрогенного стресу застосування поліфенольного концентрату винограду знижувало інтенсивність виявів цитолізу під час стресу (рис. 1).

Введення поліфенольного концентрату «Каберне» знижувало активність досліджуваних ферментів, що, вірогідно свідчить про зменшення виявів оксидативного стресу, який виникає за умови повторюваного нейрогенного стресу та призводить до змін у потребах метаболічної енергії.

З'ясовано, що введення поліфенолів інтактним тваринам також супроводжувалося стабілізацією мембран, про що свідчить зниження активності маркерних ферментів цитолізу - АлАт та ГГТП у сироватці крові через тиждень застосування концентрату.

Відсутність зазначеного вище ефекту щодо активності АсАТ указує на більшу активність поліфенолів відносно плазматичних мембран, оскільки, як відомо, АсАТ переважно локалізована в мітохондріях. Окрім того, застосування комплексів поліфенольного комплексу Винограду культурного зменшувало вияви гіпопротеїнемії під час стресу.

За умови повторюваного нейрогенного стресу анаболічна дія поліфенольного концентрату може реалізуватися двома шляхами - через уплив на утворення стероїдних гормонів (що можна пояснити фітоестрогенною активністю компонентів концентрату) та через вплив на синтез та секрецію інсуліну (показано для окремих поліфенолів (Nijveldt R.J. et al., 2001). Очевидно, за умов повторюваного нейрогенного стресу реалізуються обидва механізми, що доповнюють один одного в протекторній дії.

Рис. 1. Вплив поліфенольного концентрату «Каберне» на активність ферментів сироватки крові щурів за умов повторюваного нейрогенного стресу (M±m, n=6)

Примітки: - вихідні; - 1 тиждень; - 2 тиждень; - 3 тиждень; * - р?0,05 порівняно з відповідним контролем.

Важливим механізмом стрес-протекторної дії комплексу поліфенольних екстрактів винограду є вплив на метаболізм аргініну. Установлено, що вміст цієї амінокислоти збільшується у стресованих тварин, які отримували поліфенольний концентрат «Каберне» (рис. 2).



Рис. 2. Вплив поліфенольного концентрату «Каберне» на вміст аргініну в тканинах щурів за умов повторюваного нейрогенного стресу (M±m, n=6).

Примітки: - вихідні; - 1 тиждень; - 2 тиждень; - 3 тиждень; С - стрес, Каб - введення «Каберне»; *- р?0,05 порівняно з відповідним контролем

Оскільки активність аргінази в тканинах цих тварин знижується, можна стверджувати, що збереження пулу аргініну, важливе для підтримання судинного тонусу та синтезу креатину, досягається шляхом гальмування його розпаду в орнітиновому циклі. Це підтверджується нормалізацєю вмісту цитруліну. Про зменшення інтенсивності катаболічних процесів при введенні стресованим тваринам поліфенольного комплексу «Каберне» свідчить нормалізація вмісту сечовини в крові та тканинах.

Разом з тим, застосування поліфенольних комплексів винограду, покращує гіперурікемічний аспект розвитку стрес-реакції, хоча викликає певне збільшення вмісту СК у нирках (рис. 3), що можна пояснити вмістом пуринових похідних у цьому концентраті.

Введення поліфенольного комплексу «Каберне» за умов повторюваного стресу знижує вміст сечової кислоти в сироватці крові порівняно зі стресованими тваринами.



Рис. 3. Вплив поліфенольного концентрату «Каберне» на вміст сечової кислоти в нирках щурів за умови повторюваного нейрогенного стресу (M±m, n=6)

Примітки: - вихідні; - 1 тиждень; - 2 тиждень; - 3 тиждень; С - стрес, Каб - введення «Каберне»; * - р?0,05 порівняно з відповідним контролем

Відмічено, що на 3-й тиждень стресування сумісна дія поліфенольного комплексу «Каберне» та стресу відрізняється від ефектів цих чинників, узятих окремо: як під час стресу, так і за умов уведення поліфенольного комплексу «Каберне» вміст сечової кислоти в крові зростає. За умов повторюваного нейрогенного стресу на тлі введення поліфенольного концентрату цей показник перебував майже на рівні контролю. Такий ефект можна пояснити, з одного боку, гальмуванням виснаження, що спостерігалося за умови стресу, а з іншого - зменшенням катаболізму під впливом поліфенольного комплексу «Каберне».

Отже, у результаті проведеного дослідження доходимо висновку про значну антиоксидантну, стрес-протекторну та мембраностабілізувальну активність комплексів поліфенольних екстрактів винограду культурного, що робить їх цінним об'єктом для впровадження в профілактичні та оздоровчі програми.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішена актуальна наукова задача з'ясування особливостей метаболізму нітрогенвмісних сполук за умов гострого та повторюваного нейрогенного стресу та пошук шляхів корекції антиоксидантами рослинного походження. Проведене дисертаційне дослідження дало змогу отримати наступні висновки:

1. Установлено, що як при гострому, так і повторюваному нейрогенному стресі, викликаному іммобілізацією тварин, та при введенні адреналіну відбувається зниження рівня загального білка, аргініну і креатину та збільшення рівня сечової кислоти, сечовини, креатиніну в сироватці крові, що свідчить про активацію катаболізму нітрогенвмісних сполук.

2. Доведено, що активація білкового катаболізму за умов гострого та повторюваного нейрогенного стресу проявляється підвищеною активністю амінотрансфераз, аргінази, g-глутамілтранспептидази в крові та тканинах щурів.

3. Установлено, що вплив адреналіну за умов гострого та повторюваного нейрогенного стресу сприяє розвитку оксидативного стресу, що супроводжується активацією цитолізу і виходом тканинних ферментів до крові.

4. Доведено, що поліфенольні концентрати з насіння Винограду культурного за умов нейрогенного стресу сприяють зниженню активності досліджуваних ферментів та вмісту кінцевих продуктів азотистого катаболізму, що свідчить про зменшення проявів цитолізу та інтенсивність катаболізму нітрогенвмісних сполук.

5. Установлено, що біологічна активність поліфенольних концентратів з насіння Винограду культурного обумовлена антиоксидантними властивостями і фітоестрогенною активністю, що проявляється у впливі на співвідношення анаболічних та катаболічних процесів в організмі.

6. Виявлено, що стрес-протекторна дія поліфенольних концентратів з насіння винограду різних сортів супроводжується зниженням активності різних ферментів: аланінамінотрансферази - за умов впливу концентратів «Мерло»; «Ркацителі»; аспартатамінотрансферази - під впливом концентратів «Каберне»; «Рислінг». Найбільша анаболічна дія на метаболізм нітрогенвмісних сполук виявлена у концентрату «Ркацителі».

7. З`ясовано, що поліфенольні концентрати «Рислінг» і «Ркацителі» характеризуються виразною гіпоурікемічною та гіпокреатинінемічною дією, яка менш характерна для поліфенольних концентратів «Мерло» та «Каберне». Виявлений ефект необхідно враховувати при обґрунтуванні застосування поліфенольних концентратів.



СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Порівняльний аналіз біологічної активності субстанцій, отриманих з насіння винограду різних сортів / Л.М. Вороніна, А.Л. Загайко, Г.Б. Кравченко, С.В. Заїка, Ю.О. Огай // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 2. - С. 67--70. (Дисертантом самостійно виконано визначення показників білкового метаболізму, аналіз експериментальних даних, здобувач брала участь у написанні та оформленні статті).

2. Вплив поліфенольних комплексів винограду на стан та функцію печінки в умовах гострого парацетомолового гепатиту / Л.М. Вороніна, А.Л. Загайко, С.В. Заїка, Г.Б. Кравченко // Медична хімія. - 2008. - Т. 11, № 3. - С. 93 - 95. (Дисертантом самостійно виконано визначення показників азотистого метаболізму та аналіз експериментальних даних, здобувач брала участь у написанні та оформленні статті).

3. Кравченко А.Б. Влияние полифенолов винограда на содержание белка в тканях крыс при введении адреналина // Природничий альманах. Серія: біологічні науки. - 2009. - № 13. - С. 92-97.

4. Вплив поліфенолів винограду на показники цитолізу при хронічному стресі / А.Л. Загайко, Л.М. Вороніна, Г.Б. Кравченко, Л.М. Соловйова, Ю.О. Огай // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - 2009. - Вип. 96 (9). - С. 329-337. (Дисертантом безпосередньо виконано визначення показників цитолізу та аналіз експериментальних даних, здобувач брала участь у написанні та оформленні статті).

5. Вплив поліфенольних комплексів, отриманих з насіння Винограду, на азотистий метаболізм за введення адреналіну / Л.М. Вороніна, А.Л. Загайко, Г.Б. Кравченко, Л.М. Соловйова // Клінічна фармація. - 2010. - № 1. - С. 26-29. (Дисертантом самостійно виконано визначення показників азотистого метаболізму та аналіз експериментальних даних, здобувач брала участь у написанні та оформленні статті).

6. Вивчення гепатозахисної активності поліфенольних комплексів з винограду сортів «Каберне» та «Ркацителі» в умовах гострого токсичного гепатиту у щурів / Л.М. Вороніна, А.Л. Загайко, О.В.Файзуллін, С.В. Заїка, Г.Б. Кравченко // Український біофармацевтичний журнал. - 2009. - Т.1, № 3. - С. 44-46. (Дисертантом самостійно виконано визначення показників азотистого метаболізму та аналіз експериментальних даних, здобувач брала участь у написанні та оформленні статті).

7. Вплив нейрогенного стресу на показники метаболізму білків та оксидантний статус у щурів / А.Л. Загайко, Г.Б. Кравченко, Н.В. Шишкіна, С.В. Заїка, Б.М. Назен // Збірник наукових праць співробітників НМАПО ім. П.Л. Шупіка. - 2008. - Кн. 3, вип. 17. - С. 163-168. (Дисертантом самостійно виконано визначення показників білкового метаболізму, аналіз експериментальних даних, здобувач брала участь у написанні та оформленні статті).

8. Вплив поліфенолів винограду на зміни гормонального тла щурів за інтоксикації іонами кобальту та кадмію / Л.М. Вороніна, А.Л. Загайко, Г.Б. Кравченко, С.В. Заїка, Б.М. Назен // Казантип-Эко-2009. Экология, энерго- и ресурсосбережение, охрана окружающей среды и здоровье человека, утилизация отходов : сборник научных статей XVII Международной научно-практической конференции (г. Щелкино, АР Крым, 1-5 июня 2009). - Х.: «Изд-во Сага». - 2009. - Т. 1. - С. 193-195. (Дисертант брала участь в опрацьовуванні й аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні статті).

9. Вплив поліфенолів винограду на вміст аргініну та цитруліну у щурів при стресі / Л.М. Вороніна, А.Л. Загайко, Г.Б. Кравченко, С.В. Заїка // Ліки-людині. Сучасні проблеми створення, вивчення та апробації лікарських засобів: Матеріали XXVII науково-практичної конференції з міжнародною участю (Харків, 4 лютого 2010 р.). - Харків: Вид-во НФаУ, 2010. - С. 222-225. (Дисертантом виконано визначення показників азотистого метаболізму, аналіз експериментальних даних, здобувач брала участь у написанні та оформленні статті).

АНОТАЦІЯ

Кравченко Г.Б. Вплив антиоксидантів рослинного походження на метаболізм нітрогенвмісних сполук за умов нейрогенного стресу у щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Херсонський державний університет, Херсон, 2010.

Дисертацію присвячено дослідженню зміни показників метаболізму нітрогенвмісних сполук у тканинах щурів за умови гострого та повторювального нейрогенного стресів й уведення адреналіну та з'ясуванню впливу поліфенольних концентратів, отриманих з насіння Винограду культурного, на ці показники.

У роботі доведено, що нейрогенний стрес, викликаний іммобілізацією, і введення високих доз адреналіну, спричиняє зниження рівня аргініну в сироватці крові й тканинах тварин, що корелює зі зростанням активності аргінази. Активація сечовиноутворення підтверджується зростанням вмісту сечовини та сечової кислоти в сироватці крові стресованих тварин. Нестача аргініну спричиняла дефіцит креатину. Розпад креатинфосфату при цьому зростає, на що вказує збільшення рівня креатиніну в крові та печінці тварин. Нейрогенний стрес та введення адреналіну супроводжувалися активацією цитолізу в щурів шляхом вільнорадикального пошкодження мембран, що супроводжувалося гіперферментемією. Уведення екстрактів з насіння винограду стабілізувало клітинні мембрани, що виявлялося в зниженні активності цитолізу та виявах катаболізму. Відмінності в дії екстрактів, пов'язані з різними напрямами впливу компонентів екстрактів на клітину.

Ключові слова: метаболізм нітрогенумісних сполук, нейрогенний стрес, адреналін, поліфенольні комплекси винограду



АННОТАЦИЯ

Кравченко А.Б. Влияние антиоксидантов растительного происхождения на метаболизм азотсодержащих соединений в условиях нейрогенного стресса у крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Херсонский государственный университет, Херсон 2010.

Диссертация посвящена исследованию изменений показателей метаболизма азотсодержащих соединений в тканях крыс при острой и повторяемой иммобилизации или введении адреналина, а также влиянию введения полифенольных концентратов, полученных из семян Винограда культурного, на изучаемые показатели.

В работе показано, что нейрогенный стресс, спровоцированный иммобилизацией, и введение высоких доз адреналина вызывает уменьшение уровня аргинина в сыворотке крови и тканях животных, которое коррелирует с возрастанием активности аргиназы. Снижение содержания цитруллина свидетельствует об активации орнитинового цикла, и в этих условиях количество аргинина для образования оксида азота может стать недостаточным, что можно рассматривать как показатель развития эндотелиальной дисфункции при стрессе. Активация мочевинообразования подтверждается возрастанием содержания мочевины и мочевой кислоты в сыворотке крови стрессированных животных. Установлено, что в условиях стресса активируется использование углеводных скелетов аминокислот с целью получения энергии, которое приводит к накоплению аммиака, на обезвреживание которого направлено возрастание активности ферментов орнитинового цикла. Нейрогенный стресс, вызванный иммобилизацией животных, и введение адреналина сопровождались активацией цитолиза из-за свободнорадикального повреждения мембран. Это приводило к поступлению ферментов в кровь и вызывало гиперферментемию. Возрастание активности g-глутамилтранспептидазы под влиянием иммобилизации и адреналина отражает развитие оксидативного стресса, в котором g-глутамилтранспептидаза может играть как защитную, так и отягчающую роль, изменяя соотношения внутриклеточного и внеклеточного глутатиона. Увеличение содержания мочевой кислоты сопровождается прогрессированием оксидативного стресса, поскольку в этих условиях возрастает активность ключевого фермента деградации пуринов - ксантиноксидазы, которую рассматривают как один из главных источников активных форм кислорода. Применение экстрактов винограда значительно облегчало протекание стресс-реакции, что проявлялось снижением интенсивности катаболических и цитолитических процессов. Введение экстрактов из семян винограда в целом стабилизировало клеточные мембраны, что характеризовалось снижением поступлением клеточных ферментов в кровь. Отличия в антицитолитическом действии экстрактов обусловлены разными направлениями влияния компонентов экстрактов на клетку: для «Мерло» в большей мере характерно стабилизирующее действие на митохондрии, а для «Рислинга» - на плазматические мембраны. Экстракт «Ркацителли» стабилизировал внешние и внутренние мембраны клеток.

Полученные результаты свидетельствуют, что полифенольные комплексы, приготовленные из семян Винограда культурного, в целом оказывают нормализующее влияние на метаболизм нитрогенсодержащих соединений. Вместе с тем, это действие отличалась у разных экстрактов. Так, введение комплекса «Мерло» нормализует содержание исследованных аминокислот в почках, хотя в крови их уровень остается ниже нормы; комплекс «Каберне» нормализовал лишь содержание цитруллина в почках; комплексы «Ркацителли» и «Рислинг» существенно влияли на содержание исследованных аминокислот в почках. Эти данные не коррелируют с антиоксидантной активностью данных комплексов, показанной в наших исследованиях (по степени антиоксидантной активности комплексы расположены в порядке «Каберне» > «Мерло» > «Ркацителли» > «Рислинг»), и свидетельствуют о сочетанном антиокидантном и фитогормональном эффектах полифенольных комплексов.

Ключевые слова: метаболизм азотсодержащих соединений, нейрогенный стресс, адреналин, полифенольные комплексы винограда.



SUMMARY

Kravchenko G.B. The influence of phytogenic antioxidants on metabolism of the nitrogen-containing compounds under the neurogenic stress in rats. - Manuscript.

Thesis for the scientific degree of the candidate of biological science by speciality 03.00.04. - biochemistry. - Kherson State University, Kherson, 2010.

The thesis is devoted to research changes of some indices of nitrogen metabolism in rat tissues under acute and repeated immobilisation or introduction of epinephrine, and also to research influence of therapeutic and prophylactic introduction of polyphenol concentrates obtained from the Grape seed on these indices.

It was shown, that as neurogenic stress caused by immobilisation and the introduction of epinephrine high doses, lead to arginine level decrease both in the blood and tissues of the animals that is correlated with the increase of arginase activity. The activation of urea synthesis is also proved by the increase of the urea contents in the blood of stressed animals. In addition the lack of arginine caused the creatine deficiency, which is necessary for phosphocreatine synthesis. In this conditions the phosphocreatine degradation is activated that indicated by creatinine level increase in animal blood and liver.

The used models were also accompanied by cytolysis activation because of free-radical damage of the membranes. This caused the observable hyperenzynemia. The uric acid increase was common for the used models.

In general the introduction of Grape seed extracts stabilized cell membranes that were manifested by cytolysis activity decrease and catabolism development. Obviously, the differences in extracts actions are connected with different points of their components influence on the cell.