Генерування активних форм кисню фотозбудженими вуглецевими нанотрубками та їхня гіпертермічна дія в системі in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 546.26.043+577.352.2+547.9

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Генерування активних форм кисню фотозбудженими вуглецевими нанотрубками та їхня гіпертермічна дія в системі in vitro

03.00.02 - біофізика

Ременяк Ольга Володимирівна

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики навчально-наукового центру «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор Прилуцький Юрій Іванович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біофізики.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Сиволоб Андрій Володимирович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри загальної та молекулярної генетики;

кандидат біологічних наук Білий Ростислав Олександрович, Інститут біології клітини НАН України, науковий співробітник, керівник відділу інноваційної діяльності та трансферу технологій.

Захист відбудеться "19" січня 2011 року о 14⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр. акад. Глушкова, 2, ННЦ «Інститут біології» (біологічний факультет), ауд. 215.

Поштова адреса: 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, ННЦ «Інститут біології» (біологічний факультет).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "17" грудня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Цимбалюк О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. З моменту відкриття вуглецевих нанотрубок (ВНТ) минуло майже 20 років, але, незважаючи на це, експериментальні і теоретичні дослідження цієї алотропної форми вуглецю як і раніше залишаються актуальними у зв'язку з їх перспективним використанням у нанотехнологіях. ВНТ - це циліндричні структури діаметром від одного до декількох десятків нанометрів і завдовжки до декількох десятків мікрометрів, що складаються з однієї або декількох згорнутих у трубку гексагональних графенових площин (Dresselhaus, 1996; Harris, 1999; Jorio, 2001). ВНТ виявляють унікальні фізико-хімічні властивості, зокрема високу механічну міцність, електричну і теплопровідність, адсорбційну активність і термостабільність. В залежності від структурно-геометричних параметрів ВНТ набувають властивостей металів або напівпровідників (Motta, 2005; Пиотровский, 2007; Кац, 2008).

Поєднання згаданих вище властивостей ВНТ з їх біосумісністю та біоактивністю в цілому уможливлює їх застосування у нанобіотехнологіях, зокрема для вирощування м'язових та нервових клітин, відновлення кісток та хрящів, розробки методів ціленаправленого транспортування лікарських засобів до біологічних мішеней, знешкодження пухлинних клітин внаслідок їх локального нагрівання, створення біокаталізаторів та біосенсорів у швидкій діагностиці аутоімунних хвороб, генетичних захворювань та злоякісних новоутворень на ранніх стадіях (Sinha, 2005; Bekyarova, 2005; Bianco, 2005; Kam, 2005; Lanone, 2006; Levi-Polyachenko, 2009). Однак, перешкодою у практичному використанні ВНТ залишаються нез'ясовані до кінця питання, а також інколи суперечливі дані, щодо біофізичних механізмів взаємодії ВНТ з клітинною мембраною, визначення токсичної дії ВНТ на клітинному, органному та організменному рівнях, генерування ВНТ активних форм кисню (АФК) та їх гіпертермічної дії у біосистемах. У зв'язку з цим актуальними є дослідження генерування АФК фотозбудженими ВНТ, їх здатності викликати гіпертермічний ефект в системі in vitro з метою застосування цих наноструктур у терапії злоякісних пухлин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в рамках держбюджетної теми «Синтез, просторова будова та функціональні властивості координаційних сполук та нанокомпозитів» (№ д.р. 0106U005889). Робота також підтримана грантом Федерального міністерства освіти і наукових досліджень ФРН «Вуглецеві нанотрубки для біотехнології» (№ Ukr 08/021).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - встановити токсичну дію ВНТ у суспензіях нормальних і трансформованих клітин, їх здатність генерувати АФК під дією ближнього інфрачервоного опромінення та викликати гіпертермічний ефект за умов in vitro.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- дослідити агрегацію ВНТ у воді за різних концентрацій з використанням спектроскопії оптичного поглинання у видимій (ВИД) та інфрачервоній (ІЧ) ділянках та комбінаційного розсіювання світла (КРС);

- дослідити взаємодію ВНТ зі штучною бімолекулярною ліпідною мембраною шляхом оцінки їх впливу на електричні характеристики мембрани методом нестаціонарних циклічних вольт-амперних характеристик;

- дослідити вплив ВНТ на життєздатність нормальних (тимоцити) і трансформованих клітин (асцитна карцинома Ерліха, лейкоз L1210);

- з використанням методу електронного парамагнітного резонансу та спінових уловлювачів оцінити здатність ВНТ за умови їх опромінення ближнім ІЧ-світлом генерувати АФК у клітинному середовищі;

- дослідити фототермічну дію ВНТ у системі in vitro.

Об'єкт дослідження - вуглецеві нанотрубки (ВНТ).

Предмет дослідження - взаємодія ВНТ з штучною бімолекулярною ліпідною мембраною (БЛМ) та клітинами в умовах ІЧ-опромінення.

Методи дослідження - скануюча та просвічуюча електронна мікроскопія (СЕМ та ПЕМ), оптична мікроскопія, ІЧ- та КРС-спектроскопія, реєстрація провідності БЛМ методом нестаціонарних циклічних вольт-амперних характеристик (ЦВАХ), МТТ-тест, реєстрація АФК методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) та спінових уловлювачів, визначення зміни температури за допомогою диференційної мідь-константанової термопари.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що при взаємодії зі штучною БЛМ досліджувані ВНТ, адсорбуючись на її поверхні, ініціюють появу дефектів у структурі ліпідного бішару, що сприяє механічному формуванню додаткових каналів у мембрані і проникненню ВНТ крізь мембрану внаслідок пасивної дифузії. З використанням методу ЦВАХ виявлено, що питома провідність БЛМ за присутності ВНТ у системі зростає. Встановлено, що ВНТ залежно від їх типу (одно- (ОВНТ) і багатостінні (БВНТ)) та концентрацій у середовищі інкубації прискорюють процеси гемолізу еритроцитів щура і виявляють токсичну дію на нормальні і трансформовані клітини, яка має часо- та дозозалежний характер, і може бути пов'язана зі здатністю ВНТ пошкоджувати клітинну мембрану. Вперше встановлено, що опроміненні на протязі 30 с ІЧ-світлом БВНТ генерують АФК зі сталою швидкістю ~10 нмоль/(мг?хв) незалежно від їх концентрації у водному середовищі. Проте, в залежності від концентрації БВНТ у водній суспензії спостерігали різний проміжок часу генерування ними АФК після дії ІЧ-опромінення. Виявлено, що швидкість генерування АФК у суспензіях клітин АКЕ і L1210 у присутності БВНТ (0,1 мг/мл) після їх 30 с опромінення ІЧ-світлом підвищувалась в 4,5 і 5,3 рази, відповідно, відносно контролю. Встановлено, що під час опромінення ІЧ-світлом трансформованих клітин у присутності БВНТ (0,1 мг/мл) протягом 1,5 хв температура суспензії клітин АКЕ зростала до 50 °С, а суспензії клітин L1210 - до 47 °С, що є достатнім для їх незворотної деструкції. Встановлено, що після 1,5 хв опромінення ІЧ-світлом суспензій трансформованих клітин у присутності БВНТ (0,1 мг/мл) зниження їх життєздатності складало ~95% відносно контролю.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють уявлення про механізми взаємодії ВНТ з клітинами до та після їх фотозбудження і сприяють розробці методів контрольованого генерування АФК, направленого на загибель пухлинних клітин. Здатність БВНТ під дією короткотривалого опромінювання ближнім ІЧ-світлом локально нагріватися до високих температур може бути використаним у гіпертермічній терапії злоякісних пухлин.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто опрацьовано та проаналізовано наукову літературу за темою дисертаційної роботи, виконано експериментальні дослідження та інтерпретацію отриманих результатів, підготовлено матеріали до друку. ВНТ та їх водні суспензії були отримані та охарактеризовані за участі наукової групи проф. П. Шарфа (Технічний університет м. Ілменау, ФРН) (підрозділ 3.1). Дані підрозділу 3.2 отримано за участі наукової групи д.б.н., проф. В.К. Рибальченка (Науково-дослідний інститут фізіології імені академіка Петра Богача), розділу 4 - за участі наукової групи д.б.н., проф. О.П. Матишевської (кафедра біохімії біологічного факультету), розділу 5 - за участі наукової групи д.б.н., пров.н.с. А.П. Бурлаки (відділ мікрооточення пухлинних клітин Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України) та опубліковано у спільних роботах. Основні теоретичні та експериментальні ідеї були розроблені за участі наукового керівника д.ф-м.н., проф. Ю.І. Прилуцького.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені на вітчизняних і міжнародних конференціях: Нанорозмірні системи НАНСИС (Київ, 2007); 213^th ECS Meeting (Arizona, USA, 2008); Ninth International Conference on the Science and Application of Nanotubes (Montpellier, France, 2008); Біофізичні механізми функціонування живих систем (Львів, 2008); Биология: от молекулы до биосферы (Харьков, 2008); Фундаментальні та прикладні дослідження в біології (Донецьк, 2009); 1^st Ukrainian-French School-Seminar “Carbon Nanomaterials: Structure and Properties (Beregove, 2009).

Публікації. Основний зміст дисертації відображено у 6 публікаціях у наукових фахових виданнях та 8 тезах вітчизняних і міжнародних конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Повний обсяг дисертації складає 128 сторінок друкованого тексту, містить 26 рисунків та 2 таблиці. Робота складається зі вступу, списку скорочень, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, трьох оригінальних розділів з висновками, узагальнення висновків, списку використаних джерел (184 посилання).

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Тимоцити виділяли з тимусу щурів лінії Вістар вагою 120-150 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тимус (200-300 мг) перетирали через нейлонову сітку у буфері такого складу (мМ): Na₂НРО₄·12Н₂О - З, КС1 - 5, NaСІ - 120, глюкоза - 10, NaHCO₃ - 4, НЕРЕS - 5, СаСl₂ - 100, MgCl₂ - 50, рН 7,4.

Асцитну форму трансформованих клітин отримували на 8-10 добу після внутрішньочеревного перещеплення мишам відповідних штамів клітин від тварин-донорів. Клітини асцитної карциноми Ерліха (рак молочної залози) перевивали безпородним мишам вагою 20 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, а клітини лейкозу L1210 (лімфоїдна лейкемія) - мишам гібридів F₁ DBA2. При роботі з тваринами дотримувались Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин.

ВНТ та їх водні суспензії було синтезовано у хімічній лабораторії Технічного університету Ілменау (ФРН) під керівництвом професора П. Шарфа. ОВНТ отримували з використанням методу термічного розпилення графітових електродів у плазмі дугового розряду, а БВНТ - методом хімічного осадження з газової фази. Синтезовані ВНТ аналізували за допомогою просвічуючої (ТЕМ, Philips Technai 20 S-TWIN HRTEM, Japan) та скануючої (SЕМ, FEI XL30 LaB6 SE, Japan) електронної мікроскопії, а також термогравіметричного аналізу. Було встановлено, що зразки містили більше ніж 90% БВНТ та ОВНТ, а також менше 1 ваг.% металу-каталізатора, який знаходився лише всередині ВНТ. Діаметр отриманих БВНТ складав 8-12 нм, а ОВНТ - 1,4-2 нм. Їх довжина не перевищувала 1 мкм. Розчинність ВНТ у воді забезпечувалася їх окисненням (шляхом кислотного титрування), що призводило до появи карбоксильних груп на кінцях і частково на поверхні БВНТ та ОВНТ, вміст яких складав 3 ваг.% і був підтверджений рентгенівською фотоелектронною спектроскопією. Наявність БВНТ та ОВНТ у водній суспензії фіксували спектрофотометрично. Максимальне значення концентрації отриманих БВНТ та ОВНТ у воді становило 2 мг/мл.

Стан агрегації ВНТ залежно від їх концентрації у воді досліджували з використанням спектроскопічних методів поглинання світла в діапазоні довжин хвиль 400-1100 нм (ВИД/ІЧ спектрофотометр “Scinco” (ФРН)) та комбінаційного розсіювання світла (КРС спектрофотометр Hobolab 5000R (Японія); лазерне збудження на довжині хвилі 785 нм). Вимірювання КРС спектрів проводили в області хвильових чисел від 500 до 2000 см^-1 упродовж 4 хв. нанотрубка спектроскопія бімолекулярний

Електричні характеристики штучної БЛМ (питома провідність (G) та електрична ємність (С)) вимірювали методом нестаціонарних ЦВАХ (Омельченко, 1990). БЛМ формували з розчину азолектину (24 мг/мл) в n-декані за методом Мюллера (Mueller, 1962) на отворі у тефлоновій склянці за умов симетричного оточення мембрани 100 мМ розчином KCl. Процес формування БЛМ спостерігали за допомогою бінокулярного мікроскопу МБС-2 (Росія) (Ивков, 1982) та потенціометричного методу реєстрації електричної ємності. Експерименти проводили за температури 21-23 ^оС.

Реєстрацію ЦВАХ мембрани здійснювали через 15 хв після внесення наноматеріалів (ОВНТ чи БВНТ) за різних концентрацій в омиваючий мембрану 100 мМ розчин KCl (рН?6,5). Отримані дані представляли у вигляді відносних змін провідності G/G_o та електричної ємності С/С_о, де G_о та С_о - параметри немодифікованої досліджуваними зразками БЛМ (контроль). Значення величин G/G_o та С/С_о визначали згідно системи рівнянь, запропонованої у роботі (Омельченко, 1990).

Стійкість еритроцитів щурів до гемолізу оцінювали за параметрами еритрограм залежності відсотка гемолізованих еритроцитів у суспензії від часу гемолізу (Терсков, 1957). Суспензію еритроцитів, отриманих з гепаринізованої крові щурів лінії Вістар, інкубували протягом 60 хв при 25 °С без добавок (контроль) та у присутності ВНТ за різних концентрацій, після чого гемоліз еритроцитів викликали 0,002 н НСl. Динаміку гемолізу реєстрували упродовж 2 хв через кожні 10 с спектрофотометрично (“Scinco” (ФРН)) при л=630 нм.

Життєздатність клітин різних типів оцінювали з використанням 0,4% трипанового синього та МТТ-тесту. Клітини інкубували у термостаті при 37 °С у середовищі RPMI 1640 з додаванням 5% ембріональної телячої сироватки, стрептоміцину та пеніциліну (10 мкг та 10 од на 1 мл середовища, відповідно). Клітини інкубували без добавок (контроль) та у присутності ОВНТ або БВНТ за різних концентрацій протягом 4 та 24 год. Кількість клітин підраховували у камері Горяєва з використанням 0,4% розчину трипанового синього. Життєздатність клітин оцінювали за швидкістю відновлення МТТ (3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифеніл тетразолій бромід). Суть методу полягає у здатності мітохондріальних дегідрогеназ дихального ланцюга перетворювати МТТ на формазан, вміст якого визначали з використанням цифрового спектрофотометра ІФКО-2 (АВОТЕК, Росія) при л=570 нм (Carmichael, 1987).

Для реєстрації АФК у пробах використовували метод ЕПР та спіновий уловлювач 1-гідрокси-2,2,6,6-тетраметил-4-оксіпіперидин за концентрації 2·10^-3 М (Бурлака, 2006), який характеризується високою спорідненістю до супероксидного радикал-аніону. Зв'язуючи цей радикал, спіновий уловлювач переходить у нітроксильний радикал і реєструється ЕПР спектрометром (Бурлака, 1994). Спектри ЕПР реєстрували за кімнатної температури ex tempore після 30 с опромінення проб лампою (IF-9900 Gold, Hasell CO, USA) потужністю 3,5 Вт/см² в області довжин хвиль 780-1400 нм.

Зміну температури водних суспензій БВНТ, суспензій трансформованих клітин у відсутності БВНТ та за їх присутності упродовж 2 хв їх опромінення лампою (IF-9900 Gold, Hasell CO, USA) потужністю 3,5 Вт/см², л=780-1400 нм реєстрували через кожні 30 с з використанням диференційної мідь-константанової термопари з точністю ±0,1 °С.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Плохинский, 1981). Розрахунки та побудову графіків проводили з використанням прикладних програм „Microsoft Excel 98” та „Origin 8”.

Результати досліджень та їх обговорення

Агрегація вуглецевих нанотрубок у воді та їх взаємодія зі штучною бімолекулярною ліпідною мембраною. ВНТ характеризуються гідрофобними властивостями, завдяки чому вони здатні взаємодіяти між собою у водній суспензії, що призводить до утворення агрегатів і ускладнення їх взаємодії з біологічними структурами. Саме тому було досліджено залежність стану агрегації розчинених ВНТ у воді від їх концентрації з використанням ВИД/ІЧ та КРС спектроскопії.

Спектр оптичного поглинання розчинених у воді ОВНТ за різних концентрацій в діапазоні довжин хвиль 400-1100 нм (рис. 1) показує, що в ІЧ - ділянці спектра присутня інтенсивна смуга з максимумом поглинання при 985 нм. Представлені спектри демонструють, що зі збільшенням концентрації ОВНТ у воді їх здатність утворювати агрегати зростає.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Спектри оптичного поглинання розчинених у воді ОВНТ за різних концентрацій: 1 - 0,1 мг/мл; 2 - 0,033 мг/мл; 3 - 0,01 мг/мл

З отриманого КРС спектру для ОВНТ (рис. 2) встановлено, що фундаментальні коливні моди ОВНТ є чутливими до їх розчинності. Як видно з отриманих спектрів, ширина та інтенсивність піків поглинання дещо збільшуються зі збільшенням концентрації ОВНТ у воді, що зумовлено їх агрегацією.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. КРС спектри розчинених у воді ОВНТ за різних концентрацій: 1 - 0,5 мг/мл; 2 - 0,166 мг/мл; 3 - 0,05 мг/мл

Аналогічні спектроскопічні дослідження були виконані для з'ясування стану агрегації БВНТ у водній суспензії.

Отже, зі збільшенням концентрації ВНТ у воді їх здатність утворювати агрегати зростає. Імовірно, агрегація ВНТ зумовлена гідрофобними та Ван-дер-Ваальсовими взаємодіями між ними.

Взаємодія ВНТ з мембранами клітин є однією з важливих умов прояву їх біологічної дії. Оскільки ВНТ характеризуються гідрофобними властивостями, існує можливість їх взаємодії з ліпідними компонентами мембрани. Така спорідненість може зумовлювати вплив ВНТ на функціонування та життєздатність клітин. Саме тому у модельному експерименті була досліджена взаємодія ВНТ зі штучною БЛМ (азолектин в n-декані).

Внесення ОВНТ та БВНТ у концентраціях 0,05 та 0,5 мг/мл в омиваючий мембрану розчин електроліту спричиняло зростання провідності БЛМ, яка була виражена у її відносних змінах і становила 1,07, 1,11 для ОВНТ і 1,09, 1,15 для БВНТ відповідно (рис. 3 А). Питома електрична ємність БЛМ при її модифікації зразками ВНТ у концентраціях 0,05 та 0,5 мг/мл також зростала та виражалася у її відносній зміні, яка складала 1,02, 1,04 за присутності ОВНТ та 1,06, 1,07 за присутності БВНТ відповідно (рис. 3 Б).

Рис. 3. Відносна питома провідність (G/G_o) (А) та електрична ємність (C/C_o) (Б) БЛМ при модифікації її ОВНТ та БВНТ за різних значень концентрацій: 1 - 0,05 мг/мл; 2 - 0,5 мг/мл. G_о=25,41±0,12 нСм/см² та C_o=5,30±0,12 мкФ/см² - провідність та питома електрична ємність немодифікованої наноматеріалами БЛМ (контроль).

Встановлено, що модифікація БЛМ ВНТ призводила до появи стохастичних стрибків провідності величиною в середньому 24,3 пСм, що свідчить про наявність певних короткоживучих змін у структурі БЛМ.

Отже, ВНТ, адсорбуючись на поверхні ліпідного бішару, ініціюють появу дефектів у структурі мембрани, які обумовлюють появу стохастичної електричної провідності і можуть відображати можливі локальні фазові перебудови ліпідів у зоні контакту. Крім того, локальне збільшення провідності БЛМ за присутності БВНТ у досліджуваних концентраційних межах у порівнянні з ОВНТ може бути пов'язано як з типом провідності цих наноматеріалів, так і з їх відносними розмірами, що збільшує площу зони контакту та питому кількість дефектів у структурі БЛМ.

Отримані результати досліджень узгоджуються з даними літератури, зокрема щодо здатності ОВНТ взаємодіяти зі штучною фосфатидилхоліновою БЛМ, проникати крізь неї та вбудовуватися у ліпідний бішар, формуючи канали (Liu, 2008).

Здатність ВНТ взаємодіяти з плазматичною мембраною та проникати крізь неї всередину клітини відкриває перспективи їх застосування як для ціленаправленої доставки лікарських препаратів, так і для знешкодження злоякісних новоутворень. Однак, для цього потрібно встановити чіткий діапазон концентрацій, за яких ВНТ не викликатимуть значних токсичних ефектів у нормальних клітинах, але які, в той же час, будуть достатньо високими для того, щоб забезпечити бажані ефекти (див. нижче).

Оскільки біологічні ефекти ВНТ у модельних системах можуть відрізнятися від таких у внутрішньоклітинному середовищі, наступним етапом роботи було оцінити токсичний вплив ВНТ на біологічні об'єкти.

Токсична дія вуглецевих нанотрубок на різні типи клітин. Для дослідження біологічних ефектів ВНТ був обраний діапазон їх концентрацій 0,01-0,5 мг/мл, за яких ВНТ здатні адсорбуватися на поверхні плазматичної мембрани та/або проникати крізь неї. Токсичність ВНТ на клітинному рівні оцінювали за такими показниками, як гемолітична активність та вплив на життєздатність нормальних клітин (тимоцитів) і трансформованих клітин (асцитної карциноми Ерліха та лейкозу L1210).

Результати дослідження впливу ВНТ на стійкість еритроцитів щура до дії гемолітика представлено на рис. 4. Встановлено, що за умови 60 хв преінкубації еритроцитів у присутності 0,1 та 0,5 мг/мл ОВНТ процес гемолізу прискорювався, а частка гемолізованих еритроцитів зростала, зокрема від 24,2% (контроль) до 30,8% за присутності 0,5 мг/мл ОВНТ. Також стійкість еритроцитів до дії гемолітика знижувалась у присутності 0,05, 0,1 та 0,5 мг/мл БВНТ, а саме - максимальна кількість гемолізованих еритроцитів зростала від контрольних значень до 27,3, 30,2 та 33,8% відповідно, а за присутності 0,1 та 0,5 мг/мл БВНТ у середовищі преінкубації загальний час гемолізу вкорочувався.

Рис. 4. Динаміка гемолізу еритроцитів щура інкубованих без добавок (контроль) та у присутності ВНТ за різних концентрацій

Отже, ОВНТ за концентрації >0,1 мг/мл та БВНТ за концентрації >0,05 мг/мл здатні спричиняти такі ушкодження мембрани еритроцитів, які в кінцевому результаті призводять до зниження стійкості еритроцитів до дії досліджуваного гемолітика. Оскільки БВНТ мають значно більший розмір, аніж ОВНТ, вони більшою мірою можуть пошкоджувати мембрану еритроцитів внаслідок перфорації.

Отримані результати щодо гемолітичного ефекту ВНТ узгоджуються з літературними даними, згідно яких БВНТ за концентрації 50 мкг/мл призводили до прискорення гемолізу та збільшення частки гемолізованих еритроцитів щура (Prylutska, 2008).

Наступним етапом роботи було дослідити вплив ВНТ за різних концентрацій на життєздатність нормальних (тимоцитів) і трансформованих (АКЕ і L1210) клітин з використанням трипанового синього.

Кількість життєздатних тимоцитів, клітин L1210 та АКЕ у суспензії після 4 та 24 год інкубації у відсутності ВНТ приймали за 100% і використовували як контроль. У випадку інкубації суспензій клітин різних типів упродовж 4 год у присутності 0,01, 0,1 та 0,5 мг/мл як ОВНТ, так і БВНТ не було виявлено їх негативного впливу на кількість життєздатних клітин (рис. 5). Однак, за умови тривалого терміну інкубації - 24 год - кількість життєздатних тимоцитів у присутності ОВНТ та БВНТ знижувалась відносно контролю на 28% (у присутності 0,5 мг/мл ОВНТ), 25% (0,1 мг/мл БВНТ) та 33% (0,5 мг/мл БВНТ) (рис. 5). Подібні ефекти спостерігали і для трансформованих клітин, зокрема кількість життєздатних клітин L1210 та АКЕ через 24 год інкубації знижувалась у присутності 0,5 мг/мл ОВНТ на 14 і 18% відповідно (рис. 5). За присутності БВНТ кількість життєздатних клітин L1210 та АКЕ знижувалась на 23 і 35% відповідно (0,1 мг/мл БВНТ) та на 26 і 37% відповідно (0,5 мг/мл БВНТ) (рис. 5).

Рис. 5. Кількість життєздатних клітин різних типів (% відносно контролю) після 4 та 24 год інкубації у присутності ОВНТ (А) та БВНТ (Б) за концентрацій 0,01 мг/мл (1), 0,1 мг/мл (2) та 0,5 мг/мл (3)

Отже, діапазон концентрацій, за яких ВНТ проявляють негативний ефект на клітини різних типів, для БВНТ є ширшим, аніж для ОВНТ, причому цитотоксична дія ВНТ характеризується як часо- і дозозалежним характером, так і залежить від типу клітин.

Для підтвердження отриманих результатів щодо концентраційних меж цитотоксичності ВНТ було оцінено життєздатність клітин різних типів через 4 та 24 год преінкубації за присутності ОВНТ та БВНТ з використанням МТТ-тесту.

Життєздатність тимоцитів, клітин лейкозу L1210 та АКЕ у відсутності ВНТ через 4 год преінкубації становила 0,38±0,20, 0,81±0,07 та 0,57±0,09 опт.од. відповідно, а через 24 год преінкубації - 0,3±0,1, 0,91±0,07 та 0,67±0,08 опт.од. відповідно. Ці показники відносно до типу клітин і термінів інкубації приймали за 100% (контроль).

Відповідно до результатів, представлених на рис. 6, ОВНТ і БВНТ за концентрацій 0,01, 0,1 та 0,5 мг/мл не впливали на життєздатність тимоцитів, клітин L1210 та АКЕ через 4 год їх преінкубації, тоді як через 24 год ВНТ проявляли негативні ефекти на клітини, які залежали від типу клітин, типу ВНТ та їх концентрації в інкубаційному середовищі. Встановлено, що через 24 год преінкубації клітин різних типів у присутності ОВНТ життєздатність клітин знижувалась у присутності 0,5 мг/мл ОВНТ, а саме тимоцитів - на 25%, клітин L1210 - на 19% та АКЕ - на 22% (рис. 6) відносно контролю. Присутність БВНТ за концентрацій 0,1 і 0,5 мг/мл у суспензіях клітин різних типів спричиняла зниження життєздатності тимоцитів на 27 і 36% відповідно, клітин L1210 - на 25 і 39% відповідно, а клітин АКЕ - на 29 і 42% відповідно (рис.6) відносно контролю. Згідно отриманих даних, концентраційні межі цитотоксичності ВНТ для нормальних і трансформованих клітин лежать в одному і тому ж діапазоні, а саме у випадку ОВНТ токсичний ефект на клітини мав місце за концентрацій >0,5 мг/мл, а у випадку БВНТ - за концентрацій >0,1 мг/мл. Токсичні ефекти ВНТ на клітини проявляли часо- та дозозалежний характер і залежали від типу клітин, типу ВНТ, їх концентрацій у середовищі та терміну інкубації. БВНТ характеризуються більш токсичною дією на еритроцити, тимоцити, клітини лейкозу L1210 та АКЕ, аніж ОВНТ.

Рис. 6. Життєздатність клітин різних типів (% відносно контролю) за МТТ-тестом після 4 та 24 год преінкубації у присутності ОВНТ (А) та БВНТ (Б) за концентрацій 0,01 мг/мл (1), 0,1 мг/мл (2) та 0,5 мг/мл (3)

На основі даних про можливість ВНТ взаємодіяти з ліпідними компонентами мембрани, збільшуючи її провідність, та виходячи з отриманих даних про цитотоксичні властивості ВНТ, можна припустити, що токсична дія ВНТ обумовлена саме здатністю їх адсорбуватися з часом на мембранах клітин і механічно пошкоджувати їх цілісність. У цьому випадку БВНТ, завдяки більшим розмірам порівняно з ОВНТ, за більш низьких концентрацій пошкоджують клітинну мембрану і викликають цитотоксичний ефект.

Принциповим залишається питання щодо механізму токсичного впливу ВНТ на клітини, який, зокрема може бути обумовлений, окрім здатності ними пошкоджувати клітинні мембрани, ще й здатністю генерувати АФК, що на сьогодні досліджено недостатньо.

Генерування активних форм кисню вуглецевими нанотрубками та їх гіпертермічний ефект внаслідок дії ІЧ-опромінення. Генерування активних форм кисню вуглецевими нанотрубками. Оскільки БВНТ здатні викликати пошкодження клітин за більш низьких концентрацій, аніж ОВНТ, принциповим було дослідити саме їх можливість генерувати АФК.

З використанням методу ЕПР та спінового уловлювача з високою спорідненістю до супероксидного радикал-аніону було встановлено, що водні суспензії БВНТ спричиняють незначне накопичення супероксидного радикал-аніону (рис. 7 а). Отриманий ефект є результатом присутності невеликої кількості металу-каталізатора ферроцину ([Fe(C₅H₅)₂]; менше 1 ваг.%) всередині БВНТ, який у своєму складі містить залізо. Як відомо, залізо в результаті окиснення може виступати донором електронів для молекул кисню, що і призводить до одноелектронного відновлення кисню та утворення супероксидних радикал-аніонів.

Принциповим залишається питання щодо здатності ВНТ генерувати АФК при їх ІЧ-опроміненні, оскільки відомо, що ВНТ ефективно поглинають світло в ближній ІЧ-ділянці спектру (Kouklin, 2004; Saito, 2004). Така властивість ВНТ може бути використана для цілеспрямованого знешкодження злоякісних клітин шляхом контрольованого генерування в них АФК з наступним порушенням в них оксидантної рівноваги.

Генерування активних форм кисню вуглецевими нанотрубками після ІЧ-опромінення. Для того, щоб підібрати умови фотозбудження БВНТ, спочатку було проаналізовано їх спектри поглинання у водному середовищі в діапазоні концентрацій 0,01-0,5 мг/мл. Інтенсивна смуга поглинання була виявлена в ІЧ-ділянці спектра 780-1100 нм з максимумом поглинання при 985 нм (рис. 7).

Встановлено, що після 30 с опромінення БВНТ (0,1 мг/мл) ближнім ІЧ-світлом (780-1400 нм) інтенсивність сигналів ЕПР зростає з часом, що свідчить про збільшення концентрації АФК у суспензії (рис. 7 б, в). Отже, ІЧ-опромінення зразків БВНТ, викликаючи перебудову в їх електронній структурі (Geru, 2010), здатне генерувати АФК у досліджуваній системі.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7. Динаміка ЕПР спектрів супероксидних радикал-аніонів, генерованих у водних суспензіях БВНТ (0,1 мг/мл; T = 290 K) після 30 с опромінення ближнім ІЧ-світлом 780-1400 нм: a - до опромінення (контроль); б - 2 хв після дії опромінення; в - 45 хв після дії опромінення.

Опромінені протягом 30 с ближнім ІЧ-світлом БВНТ генерували АФК з постійною швидкістю 9,7±0,3 нмоль/(мг?хв) незалежно від їх концентрації у воді. БВНТ за концентрації 0,1 мг/мл, 0,05 мг/мл і 0,01 мг/мл після дії ІЧ-опромінення генерували АФК протягом 47, 26 і 21 хв, відповідно. Отримані ефекти, на нашу думку, залежать від геометричної та електронної структури металевої наночастинки БВНТ у водній суспензії.

Отже, БВНТ є перспективними наноматеріалами для використання у клінічній практиці з метою регулювання патологічних станів, викликаних порушенням механізмів регуляції метаболізму АФК. Однак, ефективність генерування АФК фотозбудженими БВНТ у водній суспензії та біологічному середовищі може бути різною, тому наступним завданням було дослідити генерування АФК БВНТ у суспензіях трансформованих клітин.

Генерування активних форм кисню у суспензіях клітин лейкозу L1210 та асцитної карциноми Ерліха, опромінених за присутності БВНТ. Оскільки швидкість генерування АФК БВНТ після ІЧ-опромінення не залежить від їх концентрації у воді, у подальших дослідженнях генерації АФК in vitro було використано водну суспензію БВНТ за концентрації 0,1 мг/мл. Встановлено, що у суспензії клітин АКЕ швидкість утворення АФК становила 1,2±0,1 нмоль/хв·10⁶ клітин, а у суспензії клітин L1210 - 0,9±0,1 нмоль/хв·10⁶ клітин. Ці показники відповідно до типу клітин було використано як контроль (рис. 8 А).

Внесення БВНТ до клітинних суспензій без дії опромінення не впливало на генерацію АФК. Однак після 30 с опромінення ближнім ІЧ-світлом клітинних суспензій АКЕ і L1210 у присутності БВНТ спостерігали зростання швидкості генерування супероксидних радикал-аніонів до величини 5,4±0,4 нмоль/хв·10⁶ клітин у суспензії АКЕ та до 4,8±0,6 нмоль/хв·10⁶ клітин у суспензії L1210 (рис. 8 Б).

Рис. 8. Швидкість генерування АФК (супероксидних радикал-аніонів) у суспензіях трансформованих клітин за присутності 0,1 мг/мл БВНТ без опромінення (А) та після опромінення ІЧ-світлом (Б) протягом 30 с

Отже, отримані результати щодо генерування АФК у суспензіях трансформованих клітин за присутності БВНТ після короткотривалого ІЧ-опромінення відкривають перспективу використання ВНТ в онкології з метою знешкодження трансформованих клітин.

Важливим залишається питання щодо здатності БВНТ локально нагріватися під дією ближнього ІЧ-опромінення і тим самим ціленаправлено викликати деструкцію трансформованих клітин (АКЕ та L1210) внаслідок гіпертермічного ефекту.

Фототермічна дія ВНТ. Для дослідження здатності ВНТ під час опромінення ближнім ІЧ-світлом локально нагріватися були використані лише БВНТ, оскільки вони, порівняно з ОВНТ, виявляють лише властивості металів, мають більші розміри, більш інтенсивно поглинають світлo, що, відповідно, і призводить до кращого їх нагрівання і більшого виділення тепла в оточуюче середовище (Berger, 2003). Оскільки водні суспензії БВНТ за концентрації <0,1 мг/мл не спричиняють значного токсичного впливу на життєздатність нормальних і трансформованих клітин, у подальших дослідженнях були використанi БВНТ саме за цієї концентрації.

Використовуючи диференційну мідь-константанову термопару встановлено, що під час опромінення ближнім ІЧ-світлом 780-1400 нм водної суспензії БВНТ протягом 2 хв відбувалося її часозалежне нагрівання до температури ~70 °С (рис. 9). Механізм цього явища полягає у тому, що оптично стимульоване збудження електронів БВНТ швидко перетворюється на енергію коливань атомів вуглецю і викликає нагрівання цієї наноструктури в цілому. Встановлено, що суспензії клітин АКЕ і L1210 у присутності БВНТ при опроміненні ближнім ІЧ-світлом нагріваються до 50 і 47 °С відповідно протягом 1,5 хв (рис. 9). Таке зростання температури у суспензіях клітин є достатнім для реалізації гіпертермічного ефекту у клінічній онкології. Саме тому подальшим завданням було оцінити життєздатність трансформованих клітин за цих умов з використанням 0,4 % трипанового синього.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 9. Температура водної суспензії БВНТ (0,1 мг/мл; крива 1), суспензій клітин АКЕ (крива 2) і L1210 (крива 3) за присутності БВНТ (0,1 мг/мл) та суспензій клітин АКЕ (крива 4) і L1210 (крива 5) у відсутності БВНТ під час опромінення ближнім ІЧ-світлом протягом 2 хв (n=9)

Кількість життєздатних клітин L1210 та АКЕ у суспензії без добавок і за присутності БВНТ без опромінення після 12 год інкубації приймали за 100% і використовували як контроль. Після опромінення клітин АКЕ і L1210 ближнім ІЧ-світлом протягом 1,5 хв зміна температури у суспензіях складала 6,1 і 5,3 °С (рис. 9) відповідно, а кількість життєздатних клітин в обох випадках не знижувалась і залишалась такою ж, як і до опромінення (контроль). При опроміненні ІЧ-світлом суспензій клітин АКЕ і L1210 протягом 1,5 хв за присутності БВНТ спостерігали зниження кількості життєздатних клітин АКЕ на 95,2±4,8%, а клітин L1210 - на 94,8±5,2% (таблиця 1) відносно контролю. Цей факт можна пояснити денатурацією білків внаслідок нагрівання до температур вище 42 °С, що призводить до пошкодження цитоплазматичної мембрани клітин та їх загибелі.

Таблиця 1 Кількість життєздатних клітин (% від контролю) у присутності БВНТ (0,1 мг/мл) через 12 год інкубації після опромінення ближнім ІЧ-світлом, оцінена за допомогою 0,4% трипанового синього

Час опромінення ближнім ІЧ-світлом, с	Клітини АКЕ	Клітини L1210
30	96,3 ± 2,2	98,1 ± 1,7
60	81,4 ± 3,4	82,1 ± 3,1
90	4,8 ± 2,8*	5,2 ± 3,2*

*Р<0,05 порівняно з контролем (n=7)

Отримані результати узгоджуються з літературними даними, згідно яких ВНТ нагрівалися при їх опроміненні ближнім ІЧ-світлом та призводили до зниження життєздатності пухлинних клітин (Levi-Polyachenko, 2009; Fisher, 2008; Torti, 2007).

Отримані результати щодо здатності БВНТ під дією ближнього ІЧ-світла локально нагріватися підтверджуються теоретичними розрахунками, згідно яких розсіювання світла досліджуваними БВНТ та їх агрегатами (до 20 нм в діаметрі) у досліджуваному діапазоні ІЧ-випромінювання 780-1400 нм не перевищує 4%. Як наслідок, за рахунок інтенсивного поглинання БВНТ ІЧ-опромінення має місце їх швидке нагрівання з подальшим випромінюванням тепла в оточуюче середовище.

Аналіз отриманих даних дозволяє зробити висновок, що здатність ВНТ генерувати АФК під дією ближнього ІЧ-світла може бути використана для цілеспрямованого знешкодження злоякісних клітин шляхом контрольованого генерування в них АФК. Виявлена властивість ВНТ локально нагріватися під дією короткотривалого ближнього ІЧ-світла дозволяє сподіватись, що ВНТ є також перспективними наноматеріалами для швидкої деструкції пухлинних клітин внаслідок гіпертермічного ефекту.

Висновки

1. З використанням методів скануючої та просвічуючої електронної мікроскопії високої роздільної здатності встановлені структурно-геометричні характеристики синтезованих зразків ВНТ, зокрема їх діаметр, довжина і тип (одно- (ОВНТ) і багатостінні (БВНТ)). З використанням методів ВИД/ІЧ та КРС спектроскопії встановлено, що із зростанням концентрації ВНТ у воді, вони утворюють агрегати (в'язки), що має важливе значення для з'ясування механізмів їх взаємодії з біоструктурами. Спектр оптичного поглинання розчинених у воді ВНТ за різних концентрацій показує, що в ІЧ - ділянці спектра присутня інтенсивна смуга з максимумом поглинання при 985 нм.

2. З використанням методу циклічних вольт-амперних характеристик встановлено, що питома провідність бімолекулярної ліпідної мембрани за присутності БВНТ перевищує питому провідність бімолекулярної ліпідної мембрани за присутності ОВНТ у досліджуваних концентраційних межах, що пов'язано з їх відносними розмірами і типом провідності. Виявлено, що при взаємодії зі штучною бімолекулярною ліпідною мембраною досліджувані ВНТ, адсорбуючись на її поверхні, ініціюють появу дефектів у структурі ліпідного бішару, що можливо сприяє механічному формуванню додаткових каналів у мембрані і проникненню ВНТ крізь мембрану внаслідок пасивної дифузії.

3. Встановлено, що процес гемолізу еритроцитів прискорюється за присутності ВНТ залежно від їх концентрацій у середовищі інкубації. БВНТ більшою мірою знижують стійкість еритроцитів до дії гемолітика порівняно з ОВНТ. Виявлено, що ОВНТ за концентрації >0,5 мг/мл та БВНТ за концентрації >0,1 мг/мл проявляють токсичну дію на тимоцити, клітини лейкозу L1210 та АКЕ, яка має часо- та дозозалежний характер і може бути пов'язана зі здатністю ВНТ пошкоджувати клітинну мембрану.

4. Вперше встановлено, що опромінені протягом 30 с ІЧ-світлом 780-1400 нм БВНТ, незалежно від їх концентрації у водному середовищі, генерують активні форми кисню зі сталою швидкістю 9,7±0,3 нмоль/(мг?хв). Проте, в залежності від концентрації БВНТ у водній суспензії спостерігали різний проміжок часу генерування ними активних форм кисню після дії ІЧ-опромінення. Виявлено, що швидкість генерування активних форм кисню у суспензіях клітин АКЕ і L1210 за присутності БВНТ (0,1 мг/мл) після їх 30 с опромінення ІЧ-світлом підвищувалась в 4,5 і 5,3 рази відповідно відносно контролю. Завдяки цій властивості фотозбуджені БВНТ можна використовувати для направленої регуляції загибелі пухлинних клітин шляхом порушення в них оксидантної рівноваги.

5. Встановлено, що під час опромінення ІЧ-світлом водної суспензії БВНТ (0,1 мг/мл) протягом 2 хв відбувалось їх нагрівання до температури ~70 °С. Показано, що під час опромінення ІЧ-світлом трансформованих клітин у присутності БВНТ (0,1 мг/мл) протягом 1,5 хв температура суспензії клітин АКЕ зростала до 50 °С, а суспензії клітин L1210 - до 47 °С, що є достатнім для їх незворотної деструкції. Виявлено, що після 1,5 хв опромінення ІЧ-світлом суспензій трансформованих клітин у присутності БВНТ (0,1 мг/мл) зниження кількості життєздатних клітин АКЕ складало 95,2±4,8%, а клітин L1210 - 94,8±5,2% відносно контролю. Отже, фотозбуджені БВНТ здатні руйнувати злоякісні пухлини внаслідок гіпертермічного ефекту.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Ременяк О. В. Мембранотропна дія вуглецевих нанотрубок / О. В. Ременяк, С. В. Прилуцька, А. В. Бичко, Ю. І. Прилуцький, В. К. Рибальченко // Доповіді НАН України. - 2009. - № 2. - С. 163-167. Особистий внесок автора: аналіз структури ВНТ, дослідження процесів агрегації ВНТ у воді та їх вплив на електричні характеристики штучних БЛМ, узагальнення результатів та оформлення статті.

2.Прилуцька С. В. Вуглецеві нанотрубки як новий клас матеріалів для нанобіотехнології / С. В. Прилуцька, О. В. Ременяк, Ю. В. Гончаренко, Ю. І. Прилуцький // Біотехнологія. - 2009. - Т.2, № 2. - С. 55-66. Особистий внесок здобувача: літературнй пошук, узагальнення результатів та оформлення статті.

3.Прилуцька С. В. Перспективи використання вуглецевих нанотрубок у протираковій терапії / С. В. Прилуцька, О. В. Ременяк, А. П. Бурлака, Ю. І. Прилуцький // Онкология. - 2010. - Т. 12, № 1 (43). - С. 5-9. Особисто дисертантом проведено аналіз експериментальних досліджень, узагальнення та формулювання висновків до статті.

4.Ременяк О. В. Порівняльний аналіз цитотоксичності вуглецевих нанотрубок / О. В. Ременяк, С. В. Прилуцька, Ю. І. Прилуцький, О. П. Матишевська // Доповіді НАН України. - 2010. - № 3. - С. 180-183. Автор проводив дослідження цитотоксичної дії ВНТ, аналіз отриманих результатів та формулювання висновків.

5.Burlaka A. Hyperthermic effect of multi-walled carbon nanotubes stimulated with near infrared irradiation for anticancer therapy: in vitro studies / A. Burlaka, S. Lukin, S. Prylutska, O. Remeniak, Yu. Prylutskyy, M. Shuba, S. Maksimenko, U. Ritter, P. Scharff // Experimental oncology. - 2010. - Vol. 32, № 1. - Р. 48-50. Внесок автора: дослідження гіпертермічного ефекту опроміненних ВНТ та їх вплив на життєздатність клітин, участь в обговоренні отриманих результатів та формулюванні висновків.

6.Burlaka A. P. Generation of reactive oxygen species by multi-walled carbon nanotubes as a result of light irradiation / A. P. Burlaka, S. M. Lukin, S. V. Prylutska, O. V. Remeniak, Yu. I. Prylutskyy, U. Ritter, P. Scharff // Biotechnology. - 2010. - Vol. 3, № 4. - Р. 62-66. Особисто здобувачем проведені дослідження здатності ВНТ генерувати АФК під дією опромінення, аналіз отриманих результатів, формулювання висновків та оформлення статті.

7. Remeniak О. V., Prylutska S. V., Grynyuk I. I., Matyshevska O. P., Golub A. O., Prylutskyy Yu. I., Ritter U., Scharff P. Bioactivity of functionalized CNT in vitro and in vivo // Нанорозмірні системи НАНСИС. - Київ. - 2007. - С. 433.

8. Remeniak О. V., Prylutska S. V., Grynyuk I. I., Matyshevska O. P., Ptylutskyy Yu. I., Burlaka A. P., Ritter U., Scharff P.. Biocompatibility of pristine carbon nanotubes // 213^th ECS Meeting, Phoenix. - Arizona. - 2008. - P. 128.

9. Remeniak О. V., Prylutska S. V., Grynyuk I. I., Matyshevska O. P., Ptylutskyy Yu. I., Burlaka A. P., Ritter U., Scharff P. Cytotoxicity and reactivity of carbon nanotubes // Ninth International Conference on the Science and Application of Nanotubes. - Montpellier. - 2008. - P. 154.

10. Ременяк О. В., Прилуцька С. В., Бичко А. В., Прилуцький Ю. І., Рибальченко В. К. Мембранотропна дія вуглецевих нанотрубок // Біофізичні механізми функціонування живих систем. - Львів. - 2008. - С. 8.

11. Ременяк О. В., Прилуцька С. В., Гринюк І. І., Матишевська О. П., Прилуцький Ю. І. Цитотоксичність вуглецевих нанотрубок // Биология: от молекулы до биосферы. - Харьков. - 2008. - С. 76.

12. Ременяк О. В., Прилуцька С. В., Гончаренко Ю. В., Бурлака А. П., Прилуцький Ю. І. Продукція активних форм кисню у сусензії клітин за присутності вуглецевих нанотрубок // Фундаментальні та прикладні дослідження в біології. - Донецьк. - 2009. - Том 2. - С. 167.

13. Remeniak О. V., Prylutska S. V.,.Honcharenko Yu. V, Prylutskyy Yu. I., Matyshevska O. P., Ritter U., Scharff P. Comparative study of cytotoxicity of carbon nanotubes // 1 ^st Ukrainian-French School “Carbon Nanomaterials: Structure and Properties”. - Beregove. - 2009. - Р. 83-84.

14. Remeniak О. V., Burlaka A. P., Lukin S. N., Prylutska S. V., Prylutskyy Yu. I., Ritter U., Scharff P. Multi-walled carbon nanotubes as a new reactive oxygen species catalytic system // 1 ^st Ukrainian-French School “Carbon Nanomaterials: Structure and Properties”. - Beregove. - 2009. - Р. 77.

Анотація

Ременяк О.В. Генерування активних форм кисню фотозбудженими вуглецевими нанотрубками та їхня гіпертермічна дія в системі in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2010.

Дисертація присвячена вивченню структурної організації вуглецевих нанотрубок (ВНТ) у водному середовищі, їх взаємодії зі штучною бімолекулярною ліпідною мембраною (БЛМ), токсичної дії ВНТ у суспензіях нормальних і трансформованих клітин, їх здатності генерувати активні форми кисню (АФК) під дією ближнього ІЧ-опромінення та викликати гіпертермічний ефект за умов in vitro.

З використанням електронної мікроскопії високої роздільної здатності встановлено тип ВНТ (одно- (ОВНТ) і багатостінні (БВНТ)), їхній діаметр, який складав 1,4-2 нм для ОВНТ та 8-12 нм для БВНТ, їхню довжину, що не перевищувала 1 мкм. За допомогою ВИД/ІЧ та КРС спектроскопії показано, що ВНТ утворюють агрегати зі зростанням їх концентрації у воді. Методом циклічних вольт-амперних характеристик (ЦВАХ) встановлено, що ВНТ (0,05 та 0,5 мг/мл) локально збільшують провідність БЛМ внаслідок їх адсорбування на поверхні ліпідного бішару та механічного формування додаткових каналів у мембрані, причому, питома провідність БЛМ за присутності БВНТ перевищує питому провідність БЛМ за присутності ОВНТ. ОВНТ за концентрації >0,5 мг/мл та БВНТ за концентрації >0,1 мг/мл виявляли гемолітичні та цитотоксичні ефекти - прискорювали гемоліз та збільшували частку гемолізованих еритроцитів щура, знижували кількість життєздатних тимоцитів, клітин лейкозу L1210 та АКЕ. Методом ЕПР вперше доведено, що при опроміненні ІЧ-світлом 780-1400 нм протягом 30 с БВНТ генерують АФК зі сталою швидкістю ~10 нмоль/(мг?хв) незалежно від їх концентрації у воді. Однак, в залежності від концентрації БВНТ у водній суспензії спостерігали різний проміжок часу генерування ними АФК після дії ІЧ-опромінення. Встановлено, що швидкість генерування АФК у суспензіях клітин АКЕ і L1210 за присутності БВНТ (0,1 мг/мл) після їх 30 с ІЧ-опромінення підвищувалася в 4,5 і 5,3 рази відповідно відносно контролю. З використанням диференційної мідь-константанової термопари виявлено значне нагрівання як водної суспензії БВНТ, так і суспензій клітин АКЕ та L1210 за присутності БВНТ під час їх опромінення ближнім ІЧ-світлом, що призвело до значного зниження кількості життєздатних клітин (~95%).

Ключові слова: тимоцити, клітини лейкозу L1210, клітини асцитної карциноми Ерліха, вуглецеві нанотрубки, бімолекулярна ліпідна мембрана, ІЧ-опромінення, активні форми кисню, гіпертермія.

Аннотация

Ременяк О.В. Генерирование активных форм кислорода фотовозбужденными углеродными нанотрубками и их гипертермическое действие в системе in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2010.

Диссертация посвящена изучению структурной организации углеродных нанотрубок (УНТ) в водной среде, их взаимодействия с искусственной бимолекулярной липидной мембраной (БЛМ), токсического действия УНТ в суспензиях нормальных и трансформированных клеток, их способности генерировать АФК под влиянием ближнего ИК-излучения и вызывать гипертермический эффект в системе in vitro.

Тип УНТ (одно- (ОУНТ) и многостенные (МУНТ)), их диаметр и длину определяли с использованием сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения. Установлено, что диаметр ОУНТ составлял 1,4-2 нм, а МУНТ - 8-12 нм. Длина УНТ не превышала 1 мкм, а количество стенок в МУНТ варьировала от 12 до 17. Также было обнаружено присутствие внутри УНТ металла-катализатора, величина которого составляла менее 1 мас.% и карбоксильных групп (3 мас.%), которые располагались на концах и частично на поверхности УНТ и обеспечивали их растворимость в воде.

Методами ВИД/ИК и КРС спектроскопии подтверждена способность УНТ образовывать агрегаты в воде, которая возрастает с увеличением их концентрации от 0,01 до 0,5 мг/мл.

В модельных экспериментах с использованием искусственной БЛМ (азолектин в n-декане) установлено, что при концентрациях 0,05 и 0,5 мг/мл ОУНТ и МУНТ (в большей степени, чем ОУНТ) вызывали рост как проводимости БЛМ, так и ее удельной электрической емкости и приводили к появлению стохастических прыжков проводимости величиной в среднем 24,3 пСм. Полученные эффекты указывают на возможность формирования дополнительных каналов в мембране и возможное проникновение УНТ сквозь мембрану в результате пассивной диффузии.

Показано, что ОУНТ при концентрации >0,1 мг/мл и МУНТ при концентрации >0,05 мг/мл ускоряли процесс гемолиза и увеличивали количество гемолизированных эритроцитов крысы. Также установлено, что ОУНТ при концентрации >0,5 мг/мл и МУНТ концентрацией >0,1 мг/мл снижали жизнеспособность тимоцитов, клеток лейкоза L1210 и АКЕ. Причем во всех случаях токсические свойства УНТ проявляли время- и дозозависимый характер.

Методом ЭПР с использованием спиновой ловушки с высоким сродством к супероксидному радикал-аниону впервые доказано, что облученные в течение 30 с ИК-светом 780-1400 нм МУНТ генерируют АФК с постоянной скоростью ~10 нмоль/(мг?мин) независимо от их концентрации в воде. Однако, с увеличением их концентрации - 0,01, 0,05 и 0,1 мг/мл - увеличивалось время генерирования АФК в системе - 21, 26 и 47 мин соответственно. Также обнаружено возрастание скорости генерирования супероксидных радикал-анионов в трансформированных клетках, а именно, в 4,5 и 5,3 раза относительно контроля в суспензиях клеток АКЕ и L1210 после 30 с их облучения ближним ИК-светом в присутствии МУНТ.