Біоплівка гетеротрофних бактерій як чинник біопошкоджень захисного покриття Полікен 980-25

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

УДК 576.8:620.193

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Біоплівка гетеротрофних бактерій як чинник біопошкоджень захисного покриття Полікен 980-25

03.00.07 - мікробіологія

Юмина Юлія Михайлівна

Київ 2010

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Широко застосований сучасний метод пасивного захисту великомасштабних підземних споруд, а саме використання плівкових або мастичних покриттів, є яскравим прикладом впливу техногенезу на грунтову мікрофлору. Внесення у грунт величезних об'ємів металу у вигляді трубопроводів, вкритих полімерними матеріалами (поліетиленом, полівінілхлоридом і т.д.) або бітумами, додає грунтовій мікрофлорі джерела вуглецю і азоту, що стимулює її деструктивну активність. Біопошкодження захисних матеріалів цих споруд веде до економічних збитків, які тільки у нафтогазовій промисловості світу складають сотні мільярдів у.о. на рік.

Біопошкодження захисних покриттів є результатом взаємодії бактерій - деструкторів і матеріалу, який руйнується. Необхідною умовою перебігу цього процесу є тісний контакт мікроорганізмів із поверхнею матеріалу, що здійснюється у біоплівці. Біоплівка стає мікронішею, де формується і функціонує агресивне мікробне угруповання як чинник біодеградації захисного покриття.

На сучасному етапі досліджень біопошкоджень широкого кола захисних матеріалів актуальним є вивчення структури і функцій біоплівок, сформованих бактеріями - деструкторами на їх поверхні.

Використання новітніх неруйнуючих методів дослідження біоплівок, а саме конфокальної лазерної сканувальної мікроскопії (КЛСМ), дає змогу отримати важливі дані щодо їх формування, архітектоніки і функціонування на поверхні поліетиленових захисних покриттів. Отримані результати безумовно є необхідними для подальшої розробки надійних засобів захисту цих матеріалів від біопошкоджень.

З'язок роботи з науковими програмами. Представлені результати дослідження є частиною роботи, що проводилась у відділі загальної та грунтової мікробіології Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України в рамках держбюджетної теми 2.28.9.10 «Мікробно індукована корозія в біоплівці як модельна система для вивчення метал - мікробної взаємодії».

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було дослідити особливості формування і функціонування біоплівки монокультурами бактерій-деструкторів та їх асоціацією на поверхні клейової основи поліетиленового захисного покриття «Полікен 980-25». Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання:

- визначити якісний склад природного угруповання, яка повністю зруйнувала бутилкаучуковий шар захисного покриття «Полікен 980-25»; ідентифікувати культури угруповання, виділених з пошкодженого бутилкаучукового шару поліетиленового покриття «Полікен 980-25»;

- дослідити динаміку мікробних популяцій у біоплівці;

- вивчити мікроструктуру біоплівок, сформованих моно- та бінарними культурами бактерій-деструкторів на бутилкаучуковому шарі покриття «Полікен 980-25»;

- визначити моносахаридний склад екзополімерного комплексу моно- та бінарних культур за умов планктонної і біоплівкової моделі росту;

- дослідити мікробну деградацію бутилкаучукового шару поліетиленового захисного покриття «Полікен 980-25» моно- та бінарними культурами бактерій-деструкторів;

- визначити фізико-механічні властивості поліетиленового захисного покриття «Полікен 980-25».

Об'єкти дослідження - фізіологічні характеристики бактерій, що були виділені із пошкодженого бутилкаучукового шару поліетиленового захисного покриття «Полікен 980-25» фірми «Polyken technologis» (США).

Предмет дослідження -особливості структури і функції біоплівок, сформованих моно- та бінарними культурами на поверхні бутилкаучукового шару покриття «Полікен 980-25».

Методи дослідження - мікробіологічні, біохімічні, фізичні, мікроскопічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено якісний склад природного угруповання бактерій-деструкторів бутилкаучукового шару покриття та вивчено особливості формування і функціонування біоплівки на поверхні клейової основи поліетиленового захисного покриття «Полікен 980-25» моно- і бінарними культурами Arthrobacter flavescens 102 і Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, що виділені з пошкодженого покриття «Полікен 980-25», а саме:

· використання конфокального лазерного сканувального мікроскопу дозволило встановити суттєві розбіжності у структурі біоплівок, сформованих моно- і бінарними культурами на поверхні бутилкаучукового шару покриття «Полікен 980-25»;

· виявлено більш структуровану біоплівку бінарної культури порівняно з монокультурами Arthrobacter flavescens 102 і Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 , якій притаманне формування конгломератів, оточених екзосполуками, певний розподіл бактерій у просторі біоплівки та зміна домінантів;

· встановлено, що бінарна культура досліджуваних бактерій більш активно порушує цілісність структури бутилкаучукового шару покриття «Полікен 980-25» у порівнянні із дією монокультур.

· запропоновано гіпотетичний механізм деструкції бутилкаучукового шару покриття «Полікен 980-25»

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано новий підхід з використанням мікроскопічних (конфокальна лазерна скануюча мікроскопія) і фізичних (ІЧ - спектроскопія) методів досліджень зразків поліетиленового захисного покриття «Полікен 980-25», що дозволяє визначити товщину, архітектоніку біоплівки, оцінити агресивність ізольованих культур. Отримані результати можуть бути використані для розробки нових ефективних стрічкових покриттів для захисту підземних споруд від корозії.

Матеріали дисертації використані у спецкурсі «Біопошкодження» біологічних факультетів вищих навчальних закладів України, зокрема у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка, Львівському національному університеті імені Івана Франка, Одеському національному університеті імені І.І. Мечнікова.

Особистий внесок здобувача. Автором зібрана і проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, розроблені методичні підходи щодо виконання поставленої мети, проведена статистична обробка одержаних результатів. Здобувачем було особисто ідентифіковано культури бактерій, досліджено динаміку мікробних популяцій у біоплівці, етапи формування біоплівки моно- і бінарними культурами на клейовій основі захисного покриття «Полікен 980-25», проведено вивчення мікробної деградації бутилкаучукового шару покриття «Полікен 980-25» під дією досліджуваних культур.

Ідентифікацію Bacillus subtillis 140 здійснено к.б.н. Л.А. Сафроновою (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України), виділення екзополімерного комплексу, що синтезується моно- та бінарними культурами та визначення моносахаридного складу проведено спільно з к.б.н. Ж.П. Коптєвою, к.б.н. В.В. Заніною ( Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України), які є співавторами публікацій. Дослідження бактерій, за допомогою електронного мікроскопу (Electronic microscope Jeol 1400, Japan), проведено на базі Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України. Дослідження біоплівки за допомогою КЛСМ (CLSM Pascal 5, Carl Zeiss, Німеччина) було проведено на базі Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України з люб'язного дозволу чл.-кор. НАН України, д.б.н. Кордюм Є.Л., фізико-хімічні і фізико-механічні дослідження проводили на базі Інституту хімії високомолекулярних сполук НАН України сумісно з к.х.н. Н.М. Ласковенко, яка є співавтором відповідних публікацій.

Аналіз результатів, їхнє узагальнення, інтерпретація та формулювання основних положень, висновків дисертації, підготовку публікацій за отриманими результатами та представлення результатів на наукових конференціях здійснено за участі наукового керівника д.б.н. І.П. Козлової.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та були представлені на конференції “Проблеми корозії і протикорозійного захисту матеріалів” (Україна, Львів, 2006); ХІ Українській конференції з високомолекулярних сполук (Україна, Дніпропетровськ, 2007); The young scientists' and students' international scientific conference “Modern Problems in Microbiology and Biotechnology” (Україна, Одеса, 2007); науковій конференції - конкурсі молодих вчених ІМВ НАН України “Молодь та сучасні проблеми мікробіології і вірусології” (Україна, Київ, 2007, доповідь була відмічена премією, 2008); VI Відкритій українській конференції молодих вчених з високомолекулярних сполук “ВМС- 2008” (Україна, Київ, 2008); V Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології ” (Україна, Львів, 2009); ХІ з'їзді Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Україна, Ужгород, 2009) стендова доповідь була відмічена премією.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 11 робіт: 4 статті, з них 3-у фахових журналах та 7 - у матеріалах і тезах конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 139 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, огляду літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення), висновків, списку використаних джерел, що містить 207 посилань, з яких 151 іноземних авторів. Робота включає 11 таблиць та 30 рисунків.

Загальний зміст роботи

Розділ 1. Мікробіологічні аспекти пасивного захисту підземниих споруд (огляд літератури)

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів. В першому підрозділі дана загальна характеристика захисних покриттів. У другому підрозділі описано етапи формування біоплівки. Третій розділ присвячено структурі екзополісахаридів біоплівки. Засоби захисту покриттів від біопошкодження описано у четвертому підрозділі.

Розділ 2. Об'єкти і методи досліджень

біоплівка біопошкодження покриття полікен

Об'єктом досліджень були бактерії-деструктори штам 109, штам 102, штам 140, та поліетиленове захисне покриття Полікен-980-25 фірми «Polyken technologis» (США).

Культури бактерій із пошкоджених поліетиленових покриттів виділяли загальноприйнятними методами загальної та грунтової мікробіології. Виділення вуглеводнеокиснювальних, залізо відновлювальних, спорових бактерій проводили на середовищі Таусона, Каліненко, Громико відповідно [Романенко, Кузнецов, 1974].

Ідентифікація виділених бактерій базувалася на сукупності морфолого-культуральних і фізіолого - біохімічних властивостей. Для встановлення систематичного положення вивчали наступні ознаки: морфологію клітин, забарвлення за Грамом, рухливість, тип метаболізму, відношення до кисню, утворення пігментів, ріст за різних температур, наявність ферментів, утилізація субстратів тощо [Берджі, 1997;Смирнов, Киприанова, 1990].

З метою вивчення морфології виділених бактерій використовували метод електронної мікроскопії (Electronic microscope Jeol 1400, Japan).

Для отримання біоплівок моно- та бінарних культур у флакони, що містили 100 мл стерильного середовища Таусона (рН 7,0), вносили, дотримуючись правил асептики, по 5 мл суспензії бактерій Arthrobacter flavescens 102 і Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 (титр клітин становив 108 кл/мл). Після цього занурювали стерильні зразки поліетиленового захисного покриття Полікен 980-25. Інкубацію проводили при 28єС.

Зразки покриття Полікен 980-25 обробляли 72 % розчином етилового спирту, після чого опромінювали УФ-промінням протягом 20хв.

Товщину, структуру і етапи формування біоплівок на поверхні клейової основи покриття досліджували за допомогою конфокальної лазерної скануючої мікроскопії (CLSM Pascal 5, Carl Zeiss, Німеччина).

Зміну мікробних популяцій в біоплівці на поверхні захисного покриття Полікен 980-25 досліджували методом сукцесійного аналізу.

Біоплівку десорбували з поверхні покриття на ультразвуковому диспергаторі УЗДН -2Т (частотою 22 кГц) протягом 30 с (два рази з інтервалом 2 хвилини) у фіксований об'єм фізіологічного розчину (50 мл). Після цього виконували мікробіологічні, біохімічні і фізичні аналізи.

Чисельність бактерій на покритті визначали на 3, 6, 9, 14, 24, 72, 168 і 336 годину культивування. Кількість бактерій визначали методом висіву з розведень на м'ясопептонний агар (МПА) і виражали у колоній утворюючих одиницях (КУО)/см2 поверхні зразка покриття.

Адгезію бактерій до поверхні покриття визначали методом реплік з поліетиленового та бутилкаучукового шару дослідних зразків на МПА. Вид адгезованих бактерій визначали за морфологією клітин і колоній.

Для виділення екзополімерного комплексу Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 та їх бінарної культури, після п'ятидобової експозиції центрифугували при 5000 тис. об/хв. Отриману надосадову рідину концентрували, потім діалізували проти дистильованої води протягом 3 діб, після чого діалізат ліофілізували.

Питому продуктивність екзополімерного комплексу досліджуваних бактерій визначали за формулою:

Р =Mк / Mб ,

де Р - питома продукція,

Mк - суха маса екзополімерного комплексу,

Mб - суха біомаса клітин.

Осадження білку екзополімерного комплексу проводили трихлороцтовою кислотою. Загальну кількість білку визначали за методом Лоурі [Сківка, 2004 ]. Колориметрували при довжині хвилі 750 нм (КФК-2МП, кювета 5,042).

Загальну кількість вуглеводів визначали фенолсірчаним методом. Інтенсивність кольору вимірювали на фотоелектроколориметрі (КФК-2МП, кювета 5,042) при довжині хвилі 490 нм для гексоз і 480 нм - для пентоз [Захарова, Косенко, 1982].

Аналіз моносахаридного складу проводили методом газорідинної хроматографії у зразках у вигляді ацетатів поліолів на приладі «Chrom-5» (“LP Praga” Чехія). Детектор іонізації у полум'ї, газ-носій - гелій, швидкість газу-носія 20 мл/хв. Температура випаровування 160°С; термостату - 140-210°С, 3°/хв. Колонка діаметром - 4 мм, довжина - 2 м, заповнення 3% SP 2340 Superlcoport.

Методом ІЧ-Фурьє спектроскопії на приладі TENSOR 37 фірми «Bruker» були досліджені зразки захисного покриття після впливу моно- і бінарних біоплівок. Визначення міцності при розриві покриття проводилось відповідно до ГОСТ 14236-81. Зразки покриття досліджувались у динаміці: після 1, 30, 90 і 180 діб досліду.

Для статистичного аналізу результатів досліджень використовували методи варіаційної статистики [Лакин Г.Ф., 1990], а також пакет програм Exсel 2007.

Розділ 3. Ідентифікація бактерій-деструкторів

Дослідження культурально-морфологічних ознак штаму 109 показало, що при культивуванні на МПА (28°С) він утворював дрібні, блискучі, гладенькі колонії, розмір колоній коливався від 1,2 до 2,7 мм. Після 24 годин росту в м'ясопептоному бульйоні (МПБ) мали форму прямих або злегка зігнутих паличок, розміром 0,5 - 1 мкм. Рухливі, кількість джгутиків - один, тип розташування - монотрихіальне (рис.1). Грамнегативні, не утворюють спор.

При культивуванні штаму 109 на середовищі Кінг «А» і Кінг «В» пігменти не виявлені. Бактерії не здатні до росту на сольовому агарі. Максимальна концентрація NaCІ, за якої наявний ріст - 5%. На рідкому середовищі МПБ бактерії штаму 109 здатні рости при температурі +4…+ 41°С. Оптимальний температурний режим +28… + 37°С. Досліджуваний штам - облігатний аероб. Штам 109 не здатний накопичувати включення резервного полімера полі-в-оксимасляної кислоти. Тести на наявність ферментів оксидази і каталази дали позитивний результат. Окиснення бактеріями глюкози на піврідкому середовищі Хью-Лейвсона в аеробних і анаеробних умовах було відсутнє. Штам 109 здатний до нітратредукції та денітрифікації. На піврідкому середовищі Хью-Лейвсона, в умовах вільного доступу кисню, з глюкозою, манітом, бактерії засвоювали пептон.

Згідно з даними визначників [Берджі, 1997;Смирнов, Киприанова 1990], штам 109 відноситься до виду Pseudomonas pseudoalcaligenes.

Штам 102 на МПА рН 6,8-7,0, при температурі 28°С, формує колонії м'якої консистенції без повітряного міцелію з кремовим пігментом.

Досліджений штам 102 за морфологією плеоморфний, а саме в молодих культурах являє собою палички неправильної V-, Т-форми, розміром 0,8-1,2 х 1,0- 8,0 мкм. Нерухливі. З часом палички розпадаються на коки діаметром 0,6-1,0 мкм, що розташовуються поодиноко, парами і скупченнями неправильної форми.

Грампозитивний, аспорогенний мікроорганізм.

При культивуванні штаму 102 на середовищі Кінг «А» і Кінг «В» пігменти не виявлені. Бактерії цього штаму не здатні до росту на сольовому агарі. Максимальна концентрація NaCІ , за якої наявний ріст - 7%. Здатні рости при температурі +4, +28, + 37°С на рідкому середовищі (МПБ). Оптимальний температурний режим +28…+ 37°С. Досліджуваний штам 102 - облігатний аероб. Штам 102 не здатний накопичувати включення резервного полімера полі-в-оксимасляної кислоти. Оксидазо- та каталазопозитивний. Штам утворює кислоту з глюкози, мальтози, маніту. Здатний до гідролізу крохмалю і желатину. Штам 102 здатний до нітратредукції.

Отже, за морфолого- культуральними і фізіолого-біохімічними ознаками штам 102 належить до виду Arthrobacter flavescens.

Штам 140 на стандартних лабораторних середовищах рН 6,8-7,0, за температури 28°С формує шкірясті кремові колонії без повітряного міцелію.

Морфологічні ознаки дослідженого штаму 140: прямі палички 0,7-0,8 х 2-3 мкм з заокругленими кінцями (рис. 3), рухливі за рахунок перитрихіальних джгутиків, спороутворювальні (місце розташування ендоспор центральне).

Штам 140 є грампозитивним.

Пігменти не утворює. Досліджений штам 140 не здатний до росту в анаеробних умовах, а також на поживних середовищах при концентраціях NaCl понад 7%.

Досліджуваний штам 140 не здатний до накопичення полі-в-гідроксибутирату. Каталазопозитивний та оксидазонегативний. Здатний гідролізувати крохмаль і желатин. Утворював кислоту з глюкози, маніту. Штам 140 здійснює нітратредукцію (NO3 >NO2).

Таким чином, за морфологією і фізіолого-біохімічними ознаками штам 140 належить до виду Bacillus subtilis.

Отже, визначено якісний склад природного угруповання, яке повністю зруйнувала бутилкаучуковий шар покриття «Полікен 980-25». Воно складається із Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 та Bacillus subtilis 140.

Розділ 4. Динаміка мікробних популяцій у біоплівці на захисному покритті

Динаміка мікробних популяцій вивчалась у системі покриття-середовище-біоплівка.

Методом реплік на МПА вже за годину після постановки досліду нараховували від 1-3 до 10 колоній бактерій P. Pseudoalcaligenes 109. Тобто, опосередковано підтверджено, що на твердій поверхні покриття відбувається адгезія бактерій. Зі збільшенням експозиції кількість бактерій біоплівки зростає.

Виявлено, що на бутилкаучуковому шарі покриття кількість бактерій була в 5-10 разів більша, ніж на поверхні поліетилену. На зразках клейової основи після дії бактерій спостерігали пошкодження.

У процесі формування біоплівки спостерігались зміни таксономічного складу бактерій. Міжвидова взаємодія бактерій відіграє важливу роль у функціонуванні біоплівки вже на ранніх етапах її формування - прикріплення бактерій та колонізація ними поверхні покриттів. На ранніх етапах (1-24години) домінували бактерії P. Pseudoalcaligenes 109, які утворюють екзополімерний матрикс і створюють відповідні умови для адгезії і функціонування інших бактерій угруповання. Після двох годин експозиції у біоплівці виявлялися бактерії A. flavescens 102. Після 6 годин інкубації починають розвиватися спороутворювальні бактерії B. subtilis 140. За експозиції від 24 годин і до кінця експерименту вони займають домінуюче положення в структурі бактеріального комплексу біоплівки.

Таким чином, у динаміці в умовах лабораторного експерименту вивчено структуру бактеріальної сукупності на поверхні покриття Полікен 980-25. Показано, що бактерії P. pseudoalcaligenes 109 нетривалий час домінують на ранніх етапах формування біоплівки. Ці бактерії продукують велику кількість слизу, тим самим, створюють відповідні умови для адгезії і функціонування інших асоціантів. Дуже швидко у біоплівці починають розвиватись бактерії A. flavescens 102, а пізніше - B. subtilis 140, які стійкіші до несприятливих факторів навколишнього середовища. Так, домінування певної мікробної популяції створює оптимальні умови для функціонування наступних популяцій у біоплівці.

Розділ 5. Дослідження архітектоніки біоплівки, сформованої на поверхні захисного покриття

Суттєву роль у розумінні структури, функціонування біоплівки відіграє застосування конфокальної лазерної сканувальної мікроскопії (КЛСМ).

Для подальших досліджень структури біоплівки, що формується на бутилкаучуковому шарі Полікен 980-25, було відібрано дві культури бактерій-деструкторів: P. pseudoalсaligenes 109 і A. flavescens 102. По-перше, саме ці дві культури в перші години колонізують поверхню клейової основи покриття. По-друге, для вивчення їхнього розподілення у товщі біоплівки дуже суттєвим є розбіжності у морфології: палички P. pseudoalсaligenes 109 легко відрізняються від коків A. flavescens 102 вже на третю добу. По-третє, з літератури відомо, що бактерії роду Arthrobacter є деструкторами нафтопродуктів.

З часом товщина біоплівки мала тенденцію зростати. Біоплівка P. pseudoalcaligenes 109 рівномірно зростала до 21 доби, її товщина становила 22 мкм. Для бінарної біоплівки характерним був також максимум товщини на 7 добу, як і для біоплівки A. flavescens 102, - 28 мкм.

Товщина біоплівки у A. flavescens 102 була більш потужною, ніж у P. pseudoalcaligenes 109, досягала максимуму на 7 добу - 30 мкм, після чого в незначній мірі зменшувалась до 26 мкм і трималась до кінця експерименту в цих межах (28 мкм). Можливо, товщина біоплівки A. flavescens 102 на першу добу була більша за рахунок більших розмірів клітин, ніж у P. pseudoalcaligenes 109.

Після певного зменшення товщини біоплівки відбувалося її зростання. Так, на 28 добу зросла товщина біоплівки A. flavescens до 28 мкм, а товщина бінарної біоплівки - до 32 мкм. Причому товщина бінарної біоплівки за тиждень зросла у два рази. Вірогідно, що клітини, які відірвалися від біоплівки, потрапляють у сприятливіші умови для формування нової біоплівки, ніж їх попередники. Таким чином, можна припустити що у симбіотичних відносинах клітини P. pseudoalcaligenes 109 і A. flavescens 102 отримують більше поживних речовин, впливаючи на бутилкаучуковий шар покриття, ніж у біоплівках монокультур. Аналізуючи отримані дані, можна припустити, що процеси формування біоплівки дещо співпадають з фазами росту планктонної культури. Отримані нами дані корелюють з даними літератури [Nguyen, Belkhadir, 1989].

І стадія (лаг-фаза) триває протягом кількох хвилин або годин. Під час цієї стадії починається адгезія поодиноких клітин. Як було описано вище у розділі 4, адгезія P. pseudoalcaligenes 109 триває близько години, а адгезія A. flavescens 102 - приблизно дві години. Бактерії, адсорбовані на поверхні (рис.6, а), виділяють клейкий позаклітинний полімер, який утримує біоплівку компактно і прикріплює її до твердої поверхні. Цей шар щільного непрозорого слизу завтовшки 5-10 мкм є здебільшого основою структури біоплівки (рис.6, б). ІІ стадія формування біоплівки (фаза експонеційного росту, лог-фаза) характеризується розмноженням адсорбованих клітин і синтезом ними екзополімеру. Так, з рисунку 7 видно, що P. pseudoalcaligenes 109 з 1-ої по 21-у добу утворював велику кількість слизу. Адгезовані клітини інтенсивно розмножувались, утворюючи колонію.

У культури Arthrobacter flavescens 102 на першу добу кількість слизу була незначна, клітини мали вигляд паличок неправильної форми. Після 7-ої доби починається інтенсивне утворення екзополімеру Arthrobacter flavescens 102 і спостерігається наявність коків, що знаходяться у товщі слизу.

Стадії ІІІ (сповільненого росту) і ІV (стаціонарна фаза) характеризуються утворенням (визріванням) повністю сформованої біоплівки і залежно від умов довкілля, можуть тривати від кількох годин до кількох тижнів [Nguyen, Belkhadir, 1989].

Коли товщина біоплівки стає досить потужною, настає V фаза її розвитку: деякі клітини від неї відкріплюються, що призводить до часткового зменшення її товщини. Згідно з нашими даними, товщина біоплівки Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 після 22 доби зменшувалась до 15 мкм, що можна пояснити її частковим відшаруванням. Для бінарної біоплівки характерним був також максимум товщини на 7-у добу, після чого спостерігалось ущільнення біоплівки, товщина її становила 16 мкм внаслідок утворення конгломератів.

Дослідження розподілу бактерій у бінарній біоплівці дозволяє говорити, що клітини Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 містилися у слизу, утворюючи конгломерати, а клітини Arthrobacter flavescens 102 були виявлені у базальній частині біоплівки. Пошарове сканування нативної бінарної біоплівки, проведене у напрямку до поверхні покриття виявило, що клітини P. pseudoalcaligenes 109 та A. flavescens 102 занурені у екзополімерний матрикс. Cтруктура біоплівки була гетерогенна і мала розвинений рельєф: були присутні порожнини, поверхня нерівномірна. Сканування на різних рівнях біоплівки показало, що екзосполуки повністю покривають поверхню субстрату, а окремі колонії занурені у цей матрикс.

КЛСМ показала, що змішані культури мають здатність формувати біоплівку, створюючи конгломерати з клітин та екзосполук, що їх оточують. Складна архітектоніка біоплівок забезпечує можливість метаболічної кооперації клітин і створює умови, які сприяють виникненню симбіотичних відносин між бактеріями різних видів

Таким чином, вперше застосований метод конфокальної лазерної сканувальної мікроскопії у дослідженні біоплівок бактерій-деструкторів, що сформовані на поверхні захисного покриття, дозволив визначити структуру моно- та бінарних біоплівок, утворених P. pseudoalcaligenes 109 та A. flavescens 102, тобто розподіл цих бактерій у просторі біоплівок, та показав наявність певних стадій формування біоплівки.

Розділ 6. Моносахаридний склад екзополімерного комплексу бактерій-деструкторів захисних покриттів

Порівняльне вивчення синтезу екзополімерного комплексу (ЕПК) клітинами гетеротрофних бактерій-деструкторів за різних форм росту показало суттєву різницю у продукції ЕПК бактеріями біоплівки і планктону. Питоме продукування ЕПК P. pseudоalсaligenes 109 за умов біоплівкового росту становило 6·10-8 мг/кл, а за планктонного 2,8·10-8 мг/кл, тобто у 2,14 рази вище за умов біоплівкової моделі росту. Питоме продукування ЕПК за біоплівкової моделі росту A. flavescens 102 на порядок вище, ніж за планктоної моделі: 3·10-6 мг/кл і 2,2·10-7 мг/кл відповідно. Отже, отримані дані підтверджують переваги росту і функціонування бактерій у прикріпленому стані.

Загальна кількість вуглеводів у ЕПК планктону P. pseudоalсaligenes 109 складає 35,8%, а загальна кількість вуглеводів у ЕПК біоплівки - 24,6 %. ЕПК планктону A. flavescens 102 містить 31,5% вуглеводів, а ЕПК біоплівки - 17,3%. Вміст вуглеводів у ЕПК бінарної культури за умов планктонного і біоплівкового росту становив 34% і 24,6 % відповідно (від сухої маси ЕПК).

Вміст білку у ЕПК планктону Pseudomonas pseudоalсaligenes становить 4,5%, кількість білка біоплівки - 2,5% (від сухої ваги ЕПК). Загальна кількість білку ЕПК планктону Arthrobacter flavescens складає 4,7 %, біоплівки - 2,7 %. ЕПК бінарної культури вміщує 4,7 % вуглеводів за умов планктонного росту і 2,6 % за умов біоплівкового росту.

Для розуміння структури біоплівок, сформованих моно- і бінарними культурами, було визначено моносахаридний склад екзосполук монокультур P. pseudoalcaligenes 109 та A. flavescens 102 та їхньої бінарної культури за умов планктонного і біоплівкового росту.

Якісне дослідження ЕПК бактерій біоплівки і планктону виявило чіткі розбіжності у моносахаридному складі за різних моделей росту.

Основними моносахаридами, які присутні у ЕПК за різних умов росту у всіх варіантах досліду є глюкоза, галактоза, арабіноза, маноза.

Моносахаридний склад ЕПК планктону P. pseudoalcaligenes вміщує шість моносахаридів. Моносахаридний склад екзополімерного комплексу біоплівки представлений глюкозою, рамнозою, фукозою, рибозою, арабінозою, ксилозою, манозою, галактозою, тобто на один моносахарид більше.

За умов планктонного росту у складі ЕПК A. flavescens 102 було виявлено 6 моносахаридів, з яких рамноза і фукоза відсутні при біоплівковому рості. Моносахаридний склад ЕПК біоплівки представлений глюкозою, галактозою, манозою, арабінозою, ксилозою і двома неідентифікованими глюканами.

За умов планктонного росту бінарної культури до складу її ЕПК входять п'ять моносахаридів. У моносахаридний комплекс біоплівки входить глюкоза, арабіноза, галактоза, ксилоза, маноза, рибоза та один неідентифікований глюкан.

Таким чином, моносахаридний склад ЕПК біоплівок більш різноманітний, ніж за умов планктонного росту. Необхідно відзначити, що ксилоза була виявлена тільки у ЕПК біоплівок досліджуваних культур та в їхній асоціації .

Отже, досліджені екзополімери як чинник адгезії бактерій до покриттів відрізняються рівнем накопичення моносахаридів та їхнім якісним складом. Вони повністю складаються з альдогексоз і альдопентоз, що забезпечує високу реактивність цих сполук. Можливо, прикріплення бактерій до поверхні матеріалів здійснюється не тільки за рахунок реологічних характеристик біополімеру, а також унаслідок хімічної взаємодії альдегідних груп моносахаридів з активними групами на поверхні покриттів.

Розділ 7. Мікробна деградація захисного покриття «Полікен 980-25»

Для визначення впливу біоплівок на експлуатаційні параметри покриття, що формувались моно- і бінарними культурами проводили фізико-хімічні дослідження зразків покриття «Полікен 980-25». ІЧ-спектри бутилкаучукового шару без впливу бактерій (контроль), та після впливу бактерій знімали на 1, 30, 90 ,180 добу досліду.

У хімічній будові зразка, який знаходився у стерильному середовищі Таусона (рН-7), протягом 180 діб не відбувається змін, що видно із наведених спектрів. Отже, складові та рН середовища не впливають на структуру бутилкаучукового шару захисного покриття «Полікен 980-25». Вплив бактеріальних біоплівок на клейову основу покриття позначився на значних змінах у ІЧ-спектрах. В усіх випадках зі збільшенням експозиції, відбувається збільшення інтенсивності піку в області 1028 см-1 та зменшення інтенсивності піків у областях 1440 см-1, 846 см-1.

Збільшення інтенсивності піку 1028 см-1говорить про збільшення вмісту карбонільних груп (С=О). Зменшення інтенсивності піку 846 см-1, що відповідає частоті позаплощинних коливань в =СН- групах ,засвідчуває розрив подвійних зв'язків.

Згідно з даними ІЧ-спектроскопії, можна зробити припущення, що під впливом бактерій A. flavescens 102, P. pseudoalcaligenes 109 та їх асоціації відбувається окисна деструкція клейової основи

На підставі вище викладених фактів можна припустити, що механізм біодеградації бутилкаучукового шару виглядає наступним чином:

Відомо, що бутилкаучуковий шар покриття «Полікен 980-25» є сополімером ізобутилу і ізопрену, які з'єднані між собою у положенні 1,4. У макромолекулі бутилкаучуку вміст ізобутилу понад 99%.

Першим етапом деструкції є ініціювання ланцюгів. На цьому етапі саме бактеріальний фермент оксигеназа розриває р- зв'язок у подвійному зв'язку[Диксон, Уэбб, 1982], внаслідок чого відбувається окиснення СН-груп. Під час ініціювання ланцюгів утворюються неспарені електрони. Далі відбувається передача неспареного електрона, в результаті чого виникають активні центри. Для того, щоб закрити активний центр, шляхом хімічної взаємодії між атомами, відбувається розрив ланцюгу. Внаслідок розриву полімерного ланцюгу, утворюються диальдегід та кетони, в складі яких є карбонільні групи. Отже, під впливом бактерій полімер розкладається на більш прості сполуки, що дає можливість використовувати їх як джерело живлення і енергії. Таким чином, процес окисної деструкції призводить до порушення цілісності хімічної структури бутилкаучуку.

В результаті вказаних процесів, міцність до розриву захисного покриття «Полікен 980-25» під впливом бактерій знижується.

Отримані результати міцності до розриву покриття аналізували відносно контролю і виражали у відсотках.

Міцність до розриву покриття “Полікен 980-25” за шість місяців знижувалась під впливом: P. pseudoalcaligenes 109 на 5,6 %, A. flavescens 102 на 9%, бінарної культури P. pseudoalcaligenes 109 та A. flavescens 102 на 20%. Отже, біоплівка, сформована бінарною культурою бактерій в умовах модельного досліду, є більш агресивною по відношенню до захисного покриття ніж монокультур. Очевидно, що в умовах експлуатації магістральних газопроводів, на поверхні захисного покриття формується багатовидова біоплівка, вплив якої може бути ще більш суттєвий.

Висновки

Досліджено структурно-функціональні особливості біоплівок, сформованих моно- і бінарними культурами бактерій-деструкторів Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 та Arthrobacter flavescens 102 на поверхні клейової основи поліетиленового захисного покриття «Полікен 980-25» і запропонований гіпотетичний механізм його біодеградації.

1. Вперше досліджено якісний склад природного угруповання гетеротрофних бактерій, яка зруйнувала бутилкаучуковий шар покриття Полікен 980-25. Вона складається із Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 та Bacillus subtilis 140.

2. Проведений сукцесійний аналіз мікробних популяцій біоплівки на поверхні стрічкового захисного покриття Полікен 980-25 показав чітку зміну домінантів в процесі формування біоплівки. В першу годину домінують Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, які утворюють екзополімерний матрикс і створюють відповідні умови для адгезії і функціонування інших асоціантів, представлених Arthrobacter flavescens (2-а година) та Bacillus subtilis 140 (6-а година).

3. Досліджені бактерії-деструктори за умов біоплівкового росту виявляють більш високе питоме продукування синтезу ЕПК ніж за умов планктонного росту: у Pseudomonas pseudоalсaligenes 109 - у 2 рази, у Arthrobacter flavescens 102 - у 10 разів, у бінарній культурі- у 8 разів.

4. Порівняльне дослідження складу екзополімерного комплексу бактерій виявило чіткі розбіжності у моносахаридному складі за різних моделей росту, як у моно-, так і у бінарній культурі. Моносахаридний склад ЕПК біоплівки більш різноманітний ніж у планктоні. Ксилоза була виявлена тільки у ЕПК біоплівок моно- та бінарних культур.

5. За допомогою КЛСМ встановлено чітко виражену гетерогенність біоплівок, сформованих моно- і бінарними культурами Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102. Біоплівка має велику кількість порожнин та нерівний профіль. Основою біоплівки є шар щільного слизу. Зміна товщини біоплівки у процесі її утворення свідчить про наявність певних стадій формування. У бінарній біоплівці безпосередньо на бутилкаучуковому шарі розташовані вуглеводнеокиснювальні бактерії Arthrobacter flavescens 102.

6. Встановлено, що структурно-функціональні особливості (формування біоплівки як структурованого слизового матриксу, розподіл в ньому клітин Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 та Arthrobacter flavescens 102, і якісний склад моносахаридів) сприяють зниженню міцності до розриву покриття «Полікен 980-25»: на 5,6 % під впливом Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, на 9% - Arthrobacter flavescens 102, на 20% - бінарної культури бактерій.

7. Запропоновано гіпотетичний механізм біодеградації бутилкаучукового шару покриття Полікен 980-25 під впливом моно- і бінарної біоплівок Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 та Arthrobacter flavescens 102, суть якого полягає у розриві подвійних зв'язків (=СН) між групами лінійного ланцюга та утворення карбонільних груп (С=О), що є результатом окисної деструкції.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Юмина Ю. Особливості архітектоніки біоплівки бактерій-деструкторів, що сформована на поверхні захисного покриття / Юмина Ю., Козлова І., Коптєва Ж. // Вісник КНУ ім. Тараса Шевченка - 2008.- 52-53 - С.83-84 (Здобувачем самостійно поставлені досліди, досліджено за допомогою КЛСМ особливості формування біоплівки бактеріями-деструкторами на поверхні бутилкаучукового шару покриття, підготовлено статтю до друку).

2. Юмина Ю.М Біодеградація захисного покриття «Полікен 980-25»/ Юмина Ю.М. , Коптєва Ж. П., Ласковенко Н.Н.,Бубнова А.С., Остапюк С.М. / Полімер. журн.- 2009. - Т. 31, № 4, - С 349 - 352 (Здобувачем самостійно поставлений дослід і розшифровані ІЧ-спектри, підготовлено статтю до друку).

3. Юмина Ю.М. Динаміка мікробних популяцій у біоплівці на захисному покритті / Юмина Ю.М., Коптєва Ж.П., Козлова І. П. // Мікробіол. журнал. -2009. - Т.71, № 3,- С. 37-41(Здобувачем самостійно опрацювано та проаналізовано результати та підготовлено статтю до друку).

4. Занина В.В. Моносахаридный состав экзополимерного комплекса бактерий- деструкторов защитных покритый/ Занина В.В., Коптева Ж.П., Юмына Ю.М., Остапчук А.Н. //Мікробіол. журнал. -2009.- Т.71, № 4, - С.21-27. (Здобувачем отримано ЕПК, що синтезувався моно- та бінарними культурами за різних моделей росту, опрацювано та проаналізовано результати).

5. Юмина Ю.М., Козлова І. П., Коптєва Ж.П., Бубнова А.С., Ласковенко Н.М. Біодеградація захисного покриття під впливом біоплівки, яка сформована на його поверхні: матеріали ХІ з'їзду Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Україна, Ужгород, Травень 2009).

6. Юмина Ю.М., Коптєва Ж.П., Козлова І. П Сукцесія мікробних популяцій в біоплівці на захисному покритті: матеріали конференції “Проблеми корозії і протикорозійного захисту матеріалів”, (Україна, Львів, 2006).

7. Юмина Ю., Козлова І., Коптєва Ж. Особливості архітектоніки біоплівки, сформованої на поверхні скла бактеріями - деструкторами захисних покриттів.// Матеріали ХІ Української конференції з високомолекулярних сполук (Україна, Дніпропетровськ, 1- 5 жовтня, 2007).

8. Юмина Ю.М., Бубнова А.С. Мікробна деградація захисного покриття «Полікен 980-25»: матеріали V Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології ” (Україна, Львів, 12 -15 травня 2009).

9. Бубнова А.С., Юмына Ю.М. Формирование и свойства композиционных полимерных материалов на основе функционализированых изоционатсодержащих олигомеров и алкидных смол: материали VI Відкритої української конференції молодих вчених з високомолекулярних сполук “ВМС- 2008” (Україна, Київ,30 вересня- 3 жовтня 2008).

10. Коптєва Ж.П., Заніна В.В., Коптєва А.Є., Юмина Ю.М. Метаболічна активність гетеротрофних бактерій біоплівки на захисних покриттях: матеріали ХІ з'їзду Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського (Україна, Ужгород, Травень 2009).

11. Yumyna J. M. Succession of microbial population in a biofilm on the protective coating: The young scientists' and students' international scientific conference “Modern Problem in Microbiology and Biotechnology” 28-31 May, 2007 in Odessa.

Анотація

Юмина Ю.М. Біоплівка гетеротрофних бактерій як чинник біопошкоджень захисного покритя «Полікен 980-25. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2010.

Дисертація присвячена вивченню формування і функціонування біоплівок на поверхні клейової основи захисного поліетиленового покриття «Полікен 980-25».

Досліджено якісний склад природного угрупування гетеротрофних бактерій, яке зруйнувала бутилкаучуковий шар покриття Полікен 980-25. Воно складається із Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 і Bacillus subtilis 140.

За допомогою КЛСМ досліджено архітектоніку біоплівок моно- і бінарної культур Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102. Дослідження динаміки утворення біоплівок моно- і бінарною культурами показало наявність певних стадій формування біоплівки.

Визначено питоме продукування синтезу ЕПК, загальну кількість білку та вуглеводів у ЕПК за різних моделей росту. Вивчено моносахаридний склад ЕПК. Моносахаридний склад ЕПК біоплівки більш різноманітний ніж у планктоні. Ксилоза була виявлена тільки у ЕПК біоплівок моно- та бінарних культур.

Показано, що міцність до розриву захисного покриття Полікен 980-25 під впливом біоплівок, сформованих моно- та бінарними культурами значно знижуються. Механізм біодеградації бутилкаучукового шару під впливом моно- і бінарної біоплівок відбувається внаслідок окисної деструкції. Запропоновано можливий механізм біодеградації бутилкаучукового шару покриття Полікен 980-25.

Ключеві слова: біоплівка, Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 Bacillus subtilis 140, екзополімерний комплекс, бутилкаучуковий шар, біодеградація.

Аннотация

Юмына Ю.М. Биоплёнка гетеротрофных бактерий как фактор биоповреждений защитного покрытия Поликен 980-25. - Рукопись.

Дисертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07. - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена изучению структурно-функциональных особенностей биоплёнок, сформированных моно- и бинарными культурами Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102, Bacillus subtilis 140 на поверхности клеевого слоя защитного полиэтиленового покрытия «Поликен 980-25».

Изучен качественный состав природного сообщества гетеротрофных бактерий, которая полностью разрушила бутилкаучуковий слой покрытия Поликен 980-25. Возбудитили его деградации представлены Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 и Bacillus subtilis 140. Изучена динамика микробных популяций в этом сообществе. Установлено, что в первый час формирования биоплёнки доминируют бактерии Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, которые продуцируют экзополимерный матрикс и создают условия для функционирования других асссоциантов. Через два часа обнаружен Arthrobacter flavescens и через шесть часов - Bacillus subtilis 140.

С помощью КЛСМ исследована архитектоника биоплёнок моно- и бинарной культур Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102. Установлена чётко выраженная гетерогенность бинарной биоплёнки. Биопленка имеет множество пустот и неровный профиль. Основой биопленки является слой непрозрачной слизи. В бинарной биопленке показано распределение бактерий: непосредственно на поверхности бутилкаучукового слоя обнаружены клетки Arthrobacter flavescens 102. Исследование динамики образования биопленки моно- и бинарными культурами(изменения толщины биоплёнки) показало наличие определённих стадий формирования биоплёнки.

Установлена удельная продуктивность ЭПК, которая при биопленочном росте была выше, чем при планктонной форме роста: Pseudomonas pseudоalсaligenes 109 - в 2 раза, у Arthrobacter flavescens 102 - в 10 раз, в бинарной культуры- в 8 раз. При планктонной форме роста относительное количество углеводов и белка в ЭПК значительно выше, чем в ЭПК биоплёнки.

Изучен моносахаридный состав ЭПК моно- и бинарных культур при разных формах роста. При биоплёночном росте моносахаридный состав более разнообразный. Ксилоза была обнаружина только в ЭПК биоплёнок.

Изучены физико-химические параметры защитного покрытия Поликен 980-25. Показано, что прочность при розрыве за шесть месяцев понижается: под. действием Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 - на 5,6 %, Arthrobacter flavescens 102 - на 9%, бинарной культуры бактерий - на 20%. Предложен возможный механизм биодеградации бутилкаучукового слоя, который связан с разрывом двойных связей СН-групп и увеличением количества карбонильных групп (С=О), то есть, с окислительной деструкцией.

Ключевые слова: биопленка, Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102, Bacillus subtilis 140, экзополимерный комплекс, бутилкаучуковый слой, биодеградация.

Summary

Yumyna J. M. Biofilm of heterotrophic bacteria as a factor of protection coating Polyken 980-25 biodeterioration. - Manuscript.

Dissertation on the competition of scientific degree of the Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.07. - microbiology. - Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of the NAS of Ukraine, Kyiv, 2010.

The dissertation is dedicated to study of structural - functional peculiarities of biofilms, formed by mono- and binary cultures of Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 and Bacillus subtilis 140 on the surface of Polyken 980-25 butil-rubber layer.

The qualitative composition of natural association of heterotrophic bacteria that degradated completely the Polyken 980-25 butil-rubber layer has been studied. The causes of its degradation are presented by Pseudomonas pseudoalcaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102 and Bacillus subtilis 140.

The succession changes in this association have been studied. It was shown that during the first hour of biofilm formation Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 is dominating and producing exopolymer matrix creating conditions for functioning of another associants. After two hours Arthrobacter flavescens 102 has been detected and after six hours - Bacillus subtilis 140 was detected too.

With the help of CLSM the biofilm architectonic of mono- and binary cultures of Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 and Arthrobacter flavescens 102 have been investigated. It was shown the clearly expressed heterogenity of the binary biofilm. This biofilm has the unequal profile and many voids. The layer of the opaque slame is the base of the biofilm. In the binary biofilm it is shown the distribution of bacteria: immediately on the surface of the butil-rubber layer the cells of Arthrobacter flavescens 102 have been revealed. The investigation of dynamics of biofilm making by mono- and binary cultures (changes of the biofilm thickness) showed the presence of definite stagies of biofilm formation.

It has been established the specific productivity of the exopolymer complex (EPC) that at the biofilm growth was more than at the planctonic growth: for Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 - twice, for Arthrobacter flavescens 102 - 10 times, for the association - 8 times. At the planktonic growth the quantity of carbohydrates and protein in EPC was considerably more than in the biofilm EPC.

The monosaccharide composition of mono- and binary cultures EPS at different growth forms was studied. At the biofilm growth the monosaccharide composition is more diverse. Xylosa was detected in the biofilm EPS only. The physics - chemical parameters of the Polyken 980-25 coating have been studied. It is shown that the rupture to strength during six months is decreased: under the influence of Pseudomonas pseudoalcaligenes 109 - on 5,6 %, Arthrobacter flavescens 102 - on 9 % and the bacteria association - on 20 %. It is proposed the possible biodegradation mechanism of the butil - rubber layer that is connected with the rupture of double CH-groups linkage and increase of carbonyl groups (C=O) i.e. with oxidative destruction.

Key words: biofilm, Pseudomonas pseudоalсaligenes 109, Arthrobacter flavescens 102, Bacillus subtilis 140 exopolymer matrix, butil-rubber layer, biodegradation.

Размещено на Allbest.ru