Вплив антибіотиків та цитостатиків на формування дисбактеріозу піхви

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВПЛИВ АНТИБІОТИКІВ ТА ЦИТОСТАТИКІВ НА ФОРМУВАННЯ ДИСБАКТЕРІОЗУ ПІХВИ

Спеціальність: Біологія

ВОРОНКОВА ОЛЬГА СЕРГІЇВНА

Київ, 2010 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що індигенна мікрофлора відкритих порожнин має суттєве значення у підтримці імунного статусу та гомеостазу організму. Порушення мікроекологічної рівноваги різних біотопів призводять до серйозних ускладнень та дисфункції різних систем органів. Так, порушення складу мікробіоценозу репродуктивного тракту, в тому числі і піхви породіллі, може призвести до колонізації організму дитини умовно-патогенними та патогенними мікроорганізмами при проходженні плоду через статеві шляхи жінки та при грудному вигодовуванні, що може опосередкувати виникнення дисбактеріозу або інфекційно-запального процесу у дитини (Николаева И.В. и соавт., 2008).

Порушення складу мікрофлори генітального тракту, як відомо, спричиняють негативну дію на репродуктивне здоров'я жінки та фізіологічний перебіг вагітності. Нормальна мікрофлора піхви виступає як фактор неспецифічного захисту макроорганізму від проникнення патогенів. Порушення її складу - дисбактеріоз - дає змогу проникнення мікроорганізмів, що опосередковують виникнення інфекційних захворювань репродуктивної системи, етіологічним фактором яких можуть виступати мікроорганізми різних груп (Назарова Е.К. и соавт., 2003).

Дискусійним є питання про значущість причин та механізмів виникнення дисбактеріозів.

Щодо чинників, які спричиняють дисбактеріоз піхви, існують такі точки зору: зниження функціональної активності імунокомпетентних клітин, порушення гормонального фону та вплив інших ендогенних факторів, які, на тлі несприятливих умов життя, призводять до надмірного розвитку умовно-патогенної мікрофлори порівняно із сапрофітними мікроорганізмами, надмірна дія екзогенних факторів, - таких як умовно-патогенні та патогенні мікроорганізми, а також нераціональна антибіотикотерапія спричиняють розлад у системі мікробіоценозу піхви.

Вивчення дисбактеріозу у хворих не дає змоги визначити початкові механізми виникнення цього явища: у таких пацієнток, як правило, має місце певний патогенетичний ланцюг, що охоплює різні системи організму. Тому перспективним видається застосування експериментальних моделей дисбактеріозу на тваринах.

Експериментальна модель має широкі можливості при вивченні будь-якого типу патології. Поряд із клінічними та епідеміологічними спостереженнями досліди на тваринах сприяють розширенню знань про властивості мікроорганізмів та їх взаємодію між собою та з організмом-носієм. Також моделі на тваринах можна використовувати для вивчення процесів, що відбуваються у латентному періоді розвитку хвороби, при випробовуванні нових препаратів тощо (Червонская Г.П. и соавт., 1998, Москаленко В.Ф., Попов М.В., 2005, Бенюмович М., 1998).

Моделювання патологічних станів на тваринах вимагає урахування багатьох факторів: при цьому дослідженням підлягають різні сторони реактивних процесів організму. Експериментальна модель на тваринах дозволяє дослідити більшість процесів відповіді макроорганізму, зумовлених багатьма факторами екзо- та ендогенної природи (Шендеров Б.А. и соавт., 1992). Загалом, моделювання використовується для вивчення складних механізмів патогенезу, морфогенезу та імуногенезу хвороби. Ще одним важливим аспектом розробки моделі на тваринах є подальше порівняння її із випадками захворювання людини, адже досягнути ідентичності в клініко-морфологічному відношенні майже неможливо (Omri A. et all., 2002, Urano T. et all., 1995). В лабораторних дослідженнях переважно використовують мишей та щурів, що вважаються близькими до людини у генетичному плані. Для всебічного вивчення проблеми виникнення і розвитку дисбактеріозів піхви необхідно проведення серій експериментів, спрямованих на створення моделі дисбактеріозу піхви експериментальних тварин під дією різних факторів. Створення такої моделі дозволить з'ясувати більшість проблемних питань щодо ролі окремих видів мікроорганізмів, антибіотиків та імуносупресантів в якості чинників дисбактеріозу. Розуміння цих механізмів може сприяти розробці методів профілактики та лікування порушень екологічної рівноваги мікрофлори піхви.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету.

Представлені дослідження є частиною роботи, що виконувалася на кафедрі мікробіології та вірусології Дніпропетровського національного університету ім. Олеся Гончара в межах програми науково-дослідної держбюджетної теми №4-127-06 “Роль ферментів у взаємовідносинах мікро- та макроорганізмів, продукції біологічно активних речовин та розвитку антибіотикорезистентності”, що координується планом науково-дослідних тем Міністерства освіти та науки України.

Дисертанткою були проведені дослідження, присвячені вивченню ролі різних екзо- та ендогенних факторів у формуванні дисбіотичних станів у мікробіоценозі піхви та встановленню їх взаємозв'язку зі змінами показників імунітету. Частину роботи виконано в межах досліджень за рахунок коштів Гранта Президента України для обдарованої молоді (розпорядження №19/2007-рп від 30.01.2007). Тему дисертаційної роботи було затверджено на засіданні Вченої ради біологічного факультету Дніпропетровського національного університету (протокол №1 від 31.01.2006), тему уточнено на засіданні Вченої ради біолого-екологічного факультету Дніпропетровського національного університету (протокол №1 від 06.02.2009). Мета та задачі дослідження.

Метою роботи було дослідження впливу різних екзо- та ендогенних факторів як можливих чинників для створення експериментальних моделей вагінального дисбактеріозу піхви у піддослідних тварин (мишей).

Виходячи з мети даної роботи було поставлено наступні завдання:

1. Вивчити склад мікрофлори піхви клінічно-здорових невагітних та вагітних самиць білих лабораторних мишей;

2. Вивчити роль антибіотичних препаратів різних груп (в-лактамів, тетрациклінів, макролідів, фторхінолонів) як чинників дисбактеріозу піхви при їх інтравагінальному введенні;

3. Дослідити значення порушень імунного статусу організму у розвитку дисбактеріозу піхви при створенні штучної імуносупресії;

4. Вивчити зміни у складі мікрофлори піхви дослідних тварин при створенні моделі експериментального дисбактеріозу шляхом порушення кількісного співвідношення мікроорганізмів;

5. Визначити зміни показників імунітету при створенні моделі експериментального дисбактеріозу.

Об'єкт досліджень - мікрофлора піхви самиць безпородних лабораторних мишей, отриманих з віварію Дніпропетровського національного університету ім. Олеся Гончара.

Предмет досліджень - зміни у якісному та кількісному складі мікрофлори піхви та показниках імунітету тварин при розвитку експериментальних станів у порівнянні зі станом норми.

Методи досліджень - мікробіологічні, фізіолого-біохімічні, імунологічні.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

В огляді літератури проаналізовано сучасні відомості про склад мікрофлори репродуктивної системи в нормі та при виникненні дисбіотичних явищ. Наведено відомості про склад мікрофлори в нормі, при патологічних змінах, розглянуто зв'язок зі станом імунітету. Зібрано дані про відомі моделі патологічних станів на тваринах та перспективи їх використання для різних експериментальних досліджень.

Досліди було проведено на самицях білих лабораторних мишей, віком 18-24 тижнів, вагою 18-22 г., яких утримували в стандартних умовах (Западнюк, 1983).

Вивчення особливостей дії антибіотиків як факторів виникнення дисбіотичних станів здійснювали після інтравагінального введення антибіотиків різних класів (в-лактамів, фторхінолонів, тетрациклінів, макролідів) один раз на добу у концентраціях, що становили:

- для введення рокситроміцину максимальна доза 0,086 мг. препарату на 1 г. ваги, 75% максимальної - 0,065 мг. препарату на 1 г. ваги, 50% максимальної - 0,043 мг. препарату на 1 г. ваги протягом 10 діб;

- для введення офлоксацину - 0,11 мг. препарату на 1 г. ваги протягом 5 діб;

- для введення амоксіцилін/клавуланової кислоти - 0,5 мг. препарату на 1 г. ваги протягом 5 діб;

- для введення доксіцикліну - 0,08 мг. препарату на 1 г. ваги організму на 1-шу добу введення та 0,054 мг. для 2-5 доби введення препарату протягом 5 діб.

Імуносупресію створювали шляхом внутрішньом'язового введення циклофосфаміду: добова доза становила 0,12 мг. протягом 14 днів.

Для створення екзогенного мікробного навантаження здійснювали введення суспензій клітин S. aureus та E. coli, виділених від мишей. Видову належність бактерій було визначено за допомогою тест-систем Арі (Api-Staph та Api-20E (Біо-Мер'є, Франція) відповідно). Тваринам вводили суспензію (50 мкл), що містила 1Ч109 клітин/мл у піхву за допомогою дозатора (тобто кількість клітин, яку вводили становила відповідно 5Ч107 клітин/мл). Суспензію тваринам вводили одноразово. В якості контролю використовували інтравагінальне введення стерильного фізіологічного розчину (об'єм 50 мкл).

Біологічний матеріал для дослідження у тварин відбирали уніфікованими стерильними ватними тампонами та проводили змив з них в 1 мл. стерильного фізіологічного розчину (масова доля натрію хлориду 0,5%). Після цього проводили висів аліквот (по 50 мкл) з нерозведеного матеріалу для виявлення представників родини Enterobacteriaceae на середовище Ендо, для виявлення представників роду Lactobacillus на середовища MRS або лактобакагар, для виявлення аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів (Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Micrococcus та Enterococcus) на МПА, для визначення мікроорганізмів представників роду Gardnerella висівали зразок на м'ясо-пептонний бульйон (МПБ) із додаванням лізованої крові (3%), глюкози (1%) та триптофану (0,2%). Для подальшої ідентифікації та вивчення деяких властивостей виділених мікроорганізмів проводили пересіви на середовища Чистовича, МПА із додаванням крові (3%), на МПА із желатиною (15%), МПБ із додаванням триптофану та нітратів, на середовища Гіса з індикаторами та цукрами (глюкоза, лактоза, манітол), на лужне середовище, МПА із жовчю (40%), (Егоров Н.С., 1976).

Для визначення анаеробів проводили висів аліквот (по 50 мкл) із розведень змиву 10-2-10-4 на середовища лактобакагар для визначення Lactobacillus sрp., на біфідум-агар та середовище Блаурокка для визначення мікроорганізмів представників роду Bifidobacterium sрp., на 5%-вий кров'яний агар із додаванням нітрату (1%) та фумарату (1%) для визначення Peptococcus, Peptostreptococcus, Eubacterium та Fusobacterium, та при необхідності на середовище Кітт-Тароцці для накопичення матеріалу. Культивування анаеробів проводили в анаеростаті, заповненому інертним газом. Ідентифікацію вивчаємих культур бактерій проводили згідно ознак, що наведені у “Определителе бактерий Берджи”, згідно до “Приказа МОЗ СССР №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» від 22.04.1985 р.” та методичних рекомендацій з лабораторної діагностики гнійно-запальних захворювань, обумовлених аспорогенними анаеробними мікроорганізмами (Дяченко В.Ф. та ін., 2002).

Культури ідентифікували за результатами вивчення морфологічних, тінкторіальних та фізіолого-біохімічних ознак.

В експериментах було вивчено стан таких ланок клітинного імунітету, як: абсолютна кількість лейкоцитів (підраховували за допомогою камери Горєва-Тома), відносна кількість лімфоцитів (підраховували на мазках крові, пофарбованих із застосуванням фіксатора Май-Грюнвальда та барвника Романовського-Гімзи), кількість клітин, що гинуть апоптотичним шляхом (оцінювали за морфологічними ознаками), активність фагоцитів (тест відновлення тетразолія нітросинього) та кількість циркулюючих імунних комплексів (ЦІКів, осадження поліетиленгліколєм) (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990). Статистичну обробку результатів проводили за стандартною методикою (Лакин Г.Ф., 1980) та із використанням програми OriginLab 7,5 Pro. Усі дослідження на тваринах здійснювали згідно до норм, встановлених законом України №3447-IV “Про захист тварин від жорстокого поводження” та норм, прийнятих в Європейській конвенції із захисту хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей від 20.09.1985 (Рєзніков О., 2001). Мікробіоценоз організму відіграє важливу роль у нормальному його функціонуванні. Підтримання сталості мікрофлори репродуктивного тракту набуває особливого значення в зв'язку з тим, що порушення мікроекологічної рівноваги викликає цілу низку патологічних процесів, що здатні змінювати імунний та гормональний статус, а отже, і впливати на загальний стан здоров'я. Однак, про сталість складу мікрофлори слід говорити у сенсі підтримання домінування сапрофітних мікроорганізмів, насамперед, лактобацил, біфідобактерій, непатогенних стрептококів тощо.

Загалом аналіз отриманих даних по дослідженим групам тварин дозволяє говорити про певну подібність складу мікрофлори піхви інтактних мишей і здорових жінок.

За основу для порівняння нами узяті дані ряду дослідників (Дерябин Д.Г., 2001) щодо складу мікрофлори репродуктивного тракту жінок. Так, у жінок виявляються мікроорганізми - представники родів з частотою виявлення: Lactobacillus - 90%, Staphylococcus - 40%, Streptococcus - 30%, Enterococcus - 10%, Bacillus - в нормі взагалі відсутні у жінок, представники родини Enterobacteriaceae - 20%, анаеробні бактерії - представники родів Peptococcus - 10%, Fusobacterium - 25%, Bacteroides - 20%, Peptostreptococcus - 80%. У здорових невагітних мишей мікроорганізми виявляються з частотою: представники родів Lactobacillus -100%, Staphylococcus - 87,5%, Streptococcus - 100%, Enterococcus - 0%, Bacillus - 12,5% та родини Enterobacteriaceae - 12,5%, анаеробні бактерії - представники родів: Peptococcus - 62,5%, Fusobacterium - 87,5%, Bacteroides - 100%, Peptostreptococcus - 50%. Порівняння титрів виділених мікроорганізмів проводили лише на рівні співвідношення кількості факультативно-анаеробних та облігатно-анаеробних мікроорганізмів.

Відомо, що для жінок показником норми є відношення аероби: анаероби від 1:20 до 1:100, для здорових мишей, які складали контрольні групи, цей показник коливався у межах 1:53-1:74.

Взагалі у інтактних тварин не визначено мікроорганізмів представників родів Corynebacterium, Bifidobacterium та Eubacterium, яких у жінок виявляють відповідно із частотою 20%, 50% та 10%. Також у мишей не виявлено такі мікроорганізми як Prevotella, що зазвичай у жінок складає асоціацію з Bacteroides. У складі мікрофлори піхви тварин контрольної групи не виявлено й інші умовно-патогенні мікроорганізми, а саме: Mycoplasma spp., Propionibacterium spp., Clostridium spp., Candida spp., що за деякими даними (Сидорова И.С., 2005) вважаються представниками нормофлори (за умов, що кількість їх не перевищує певного порогу).

Але більшість авторів наголошує, що ці мікроорганізми можуть спричинювати захворювання, особливо урогенітального тракту (Назарова Е.К., Гиммельфарб Е.И., Созаева Л.Г., 2003), що відповідає протоколам та методичним рекомендаціям, розробленим МОЗ України, з діагностики та лікування інфекцій, викликаних цими мікроорганізмами.

На рис. 1 представлено дані щодо основних представників мікрофлори піхви мишей. Порівняння складу мікрофлори здорових невагітних та вагітних мишей дозволило встановити, що переважно всі мікроорганізми виявляються у подібному спектрі та з близькими кількісними показниками в обох групах. Так, в групі вагітних самиць мишей зростають частота виявлення та кількість представників роду Staphylococcus та родини Enterobacteriaceae. Дослідження показників клітинного імунітету мишей дозволило встановити, що показник функціональної спроможності фагоцитарних клітин тварин є дещо вищим, ніж у людини (близько 18%, коли для людини типовими вважають значення 8-12%), а кількість клітин з ознаками апоптозу є теж значно вищою, ніж у людини (у мишей близько 20%, а у людини - 9-11%).

Рис. 1. - Частота виявлення мікроорганізмів різних родів, виділених з піхви здорових невагітних (n = 8) та вагітних мишей (n = 7):

Значно меншою у дослідних тварин є тільки кількість ЦІКів: цей показник має значення менше 1, в той час як у людини ці значення в середньому складають 40-60 одиниць оптичної густини. Порівняльний аналіз результатів дослідження обраних нами показників імунітету, отриманих для здорових невагітних та вагітних самиць мишей, показав, що коливання значень відбуваються у межах припустимої статистичної помилки для показника функціональної спроможності фагоцитарних клітин, кількості ЦІКів та клітин з ознаками апоптозу. Кількість лейкоцитів та лімфоцитів у вагітних мишей була меншою, що обумовлено, вірогідно, тим же, що і для людини - загальним пригніченням клітинної ланки імунітету, що є одним з механізмів, який забезпечує нормальний перебіг вагітності. Аналіз видового різноманіття стафілококів та порівняння із даними літератури дозволив встановити, що у здорових невагітних мишей були представники видів, що типові для людини, так і види, що майже не виділяються від людей.

Рис. 2. - Видовий спектр стафілококів, виділених з піхви здорових мишей:

Значно більш вираженим було видове різноманіття представників родини Enterobacteriaceae (рис. 3). Серед виділених від вагітних мишей ізолятів ідентифікували Е. coli, Е. hermanii, E. fergusonii, E. cloaceae, E. aerogenes, E. sakazakii, K. oxytoca, C. freundii, C. rodentium, P. vulgaris та S. marcescens. Сьогодні існує значна кількість даних на користь того, що порушення мікробіоценозу можуть бути наслідками нераціональної антибактеріальної терапії (Страчунский Л.С. и соавт., 2005, Ткачик І., 2004, Чилова Р.А. и 2006). В наших дослідженнях вивчено можливість використання антибіотиків для створення моделі дисбактеріозу піхви на мишах: розглянуто дію антибіотичних препаратів 4 різних груп на стан мікробіоценозу піхви тварин з метою визначення змін, ініційованих ними.

Рис. 3. - Спектр штамів мікроорганізмів з родини Enterоbacteriaceae, які виділені з піхви вагітних мишей:

Однією із найбільш важливих рис нашої моделі дисбактеріозу піхви, створеної введенням антибіотиків, була залежність від спектру дії препарату і від часу.

На протязі експерименту певним чином відбувається відновлення мікрофлори до деяких показників, що відповідають нормі, але остаточного відновлення не спостерігалося: здебільшого кількісні показники для умовно-патогенних мікроорганізмів (стафілококів та представників родини ентеробактерій) лишалися вищими за такі, що є типовими для тварин контрольної групи.

Результати порівняльного аналізу частоти виявлення та кількості основних представників мікрофлори піхви мишей за умов інтравагінального введення антибіотиків представлені на рисунку 4, де відношення аероби: анаероби в контрольній групі тварин для даної експериментальної серії становило 1:74.

По експериментальних групах на 10-ту добу визначено такі співвідношення: група 2 (введення офлоксацину) - 1:98, група 3 (введення амоксіцилін/клавуланової кислоти) - 1:130, група 4 (введення доксіцикліну) - 1:115, група 5 (введення рокситроміцину) - 1:118.

Рис. 4. - Частота виявлення мікроорганізмів різних родів, виділених з піхви мишей після інтравагінального введення антибактеріальних препаратів різних груп у максимальній добовій дозі (10-та доба):

Порівняльний аналіз інтравагінального введення даних антибіотиків дозволив встановити, що при дії офлоксацину у складі індигенної мікрофлори відбувається пригнічення переважно грамнегативних бактерій при домінуванні грампозитивних коків. Натомість при застосуванні амоксіцилін/клавуланової кислоти спостерігається значне пригнічення грампозитивних коків на тлі зростання кількості представників родини ентеробактерій. В наших експериментах препарат був ефективним проти більшості визначених нами у тварин родів мікроорганізмів, окрім представників родини Enterobacteriaceae. На 10-ту добу після припинення введення антибіотика відмічено, що значно зниженим був рівень мікроорганізмів - представників нормальної мікрофлори при підвищенні долі умовно-патогенних бактерій. При введенні доксіцикліну переважно спостерігали зникнення мікроорганізмів - представників родини ентеробактерій. Порівняно із двома вище згаданими препаратами, що їх було використано у наших дослідженнях, доксіциклін виявився більш активним проти ентерококів та представників родини ентеробактерій.

При дослідженні дії рокситроміцину встановлено тривале пригнічення росту грампозитивних коків.

У складі мікрофлори піхви мишей спостерігалося зниження частоти виявлення та кількості лактобацил при високій частоті та кількості виявлених мікроорганізмів - представників умовно-патогенної флори (Enterobacteriaceae).

Резюмуючи результати досліджень по дії антибіотиків як чинників дисбіотичних явищ, можна зробити висновки про те, що застосування антибіотичних препаратів призводить до порушення рівноваги мікробіоценозу піхви у лабораторних тварин.

Визначено, що загальними тенденціями змін у мікробіоценозі піхви тварин при застосуванні будь-якого з 4 вивчених препаратів є зміни якісного та кількісного складу мікрофлори піхви мишей, що виражалися у вигляді зменшення кількості лактобацил та зростання кількості анаеробних та факультативно-анаеробних умовно-патогенних мікроорганізмів, що є подібним до тенденцій, які виявлені у людини.

Загальний аналіз змін показників імунітету при вивченні дії різних чинників дозволив встановити, що при введенні антибіотиків відбувається або пригнічення показників імунітету при введенні доксіцикліну, та у певній мірі офлоксацину, або вивчені показники не відрізняються від таких у нормі при введенні амоксіцилін/клавуланової кислоти та рокситроміцину.

В експериментах визначено, що введення будь-якого з препаратів призводило до зниження кількості лейкоцитів та лімфоцитів у мазках периферійної крові, але кількість клітин лишалася у межах 106 клітин/мл. Стимулюючу дію відносно функціональної спроможності нейтрофілів відмічено лише для рокситроміцину, що погоджується з відомими даними (Гуртовой Б.Л., 2004), всі інші препарати здійснювали пригнічуючий вплив на цей показник.

Відчутного впливу на такий показник як кількість клітин з ознаками апоптозу інтравагінальне введення антибіотиків не здійснювало.

Отже, при виборі антибіотика для створення моделі слід ураховувати і аспект впливу введення препаратів на показники клітинного та гуморального імунітету.

В експериментах було вивчено питання про можливу роль екзогенного мікробного навантаження у формуванні дисбактеріозу піхви.

Найбільш часто виявляли S. aureus та Е. coli, а тому у даній серії експериментів використовували саме ці мікроорганізми для інтравагінального введення тваринам.

Окрім того, обидві згадані бактерії є небезпечними тому, що постійно присутні у різних біотопах організму у великих кількостях і володіють певними факторами патогенності, а також мають значну антибіотикорезистентність і швидко набувають її нових ознак (Сенчило Н.В., 2004, Чилова Р.А. и соавт., 2006).

Рис. 5. - Частота виявлення мікроорганізмів різних родів, виділених з піхви мишей при створенні штучної імуносупресії шляхом введення циклофосфаміду:

В результаті наших досліджень по створенню мікробного навантаження було встановлено (рис. 6), що введення суспензій мікроорганізмів (S. aureus (1) та E. coli (1)), виділених від мишей, що містили 5Ч107 клітин, призводили до зростання кількості КУО представників ентеробактерій та стафілококів, при паралельному зниженні кількісного показника лактобацил.

Зростання кількості лейкоцитів та ЦІКів у периферійній крові при інтравагінальному введенні суспензій мікроорганізмів свідчило на користь розвитку запального процесу піхви, та водночас процес не набував генералізації, що підтверджується негативними гемокультурами і відсутністю росту на МПА та ЖСА, на яких робили відбитки селезінки.

Визначення інших показників імунітету, які ми досліджували, виявило пригнічення функціональної спроможності фагоцитарних клітин лише у групі тварин, яким вводили стафілокок.

Кількість клітин з ознаками апоптозу в обох випадках статистично не відрізнялася від показників контрольної групи. Підсумовуючи результати нашої експериментальної роботи, маємо визначити наступне, що хоча дисбактеріози, створені нами в дослідах, були різними за походженням, однак, всі вони мали певні спільні риси. Так, в усіх випадках ми спостерігали подібність клінічних ознак:

- поява характерних виділень;

- зміна рН відділяємого у бік зростання (до 5,0-6,0).

Також було відмічено подібність тенденцій у змінах складу мікрофлори в усіх експериментальних групах тварин. Так, в усіх розглянутих нами випадках дисбактеріозу характерним є наступне:

- зниження кількості та частоти виявлення лактобацил;

- зростання кількості та частоти виявлення умовно-патогенних мікроорганізмів - представників родів Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Fusobacterium, Bacteroides, Peptococcus та Peptostreptococcus та родини Enterobacteriaceae;

- співвідношення аероби: анаероби змінюється на користь облігатно-анаеробних мікроорганізмів.

Результати проведених нами експериментів дозволяють стверджувати, що з плином часу зберігаються лише головні тенденції у складі мікрофлори піхви мишей - домінування умовно-патогенних мікроорганізмів при зниженні частоти виявлення лактобацил, але зафіксовані й певні зміни у складі мікрофлори. Так, спостерігається зміна частоти виділення певних груп мікроорганізмів, зникнення або поява інших, відбувається змінення співвідношення між мікроорганізмами різних груп тощо.

Все це свідчить на користь необхідності постійного відстеження змін характеристик дисбактеріозу, а не лише констатації його як факту.

В клініці здебільшого відбувається встановлення діагнозу дисбактеріоз із визначенням його статичних характеристик: тобто чи є він близьким до нормобіозу, чи є компенсованим або некомпенсованим, з якими іншими патологічними змінами корелює. Однак, результати наших досліджень свідчать, що дисбактеріоз є динамічним процесом, тобто слід ураховувати його динамічні характеристики, для чого слід проводити постійний моніторинг складу мікрофлори і з урахуванням цього проводити адекватну коригуючу терапію.

ВИСНОВКИ

1. Визначено, що до складу мікрофлори піхви мишей входять мікроорганізми - представники родів: Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Fusobacterium та родини Enterobacteriaceae. Лактобацили є домінуючою групою мікроорганізмів, водночас з високою частотою виявляли стафіло- та стрептококи. Встановлено, що при фізіологічному протіканні вагітності у мишей з високою частотою виявляються мікроорганізми - представники родини Enterobacteriaceae. Відмічено зростання кількісного показника для представників роду Staphylococcus (від 1,95 ± 1,23 КУО/мл для невагітних до 2,55-1,18 КУО/мл для вагітних) та родини Enterobacteriaceae (від 1,30 КУО/мл для невагітних до 2,14-0,98 КУО/мл для вагітних відповідно);

2. Експериментальна модель дисбактеріозу піхви, створена шляхом інтравагінального введення антибіотиків різних груп, характеризувалася наступними ознаками: зміни у складі мікрофлори піхви залежали від спектру дії застосованого препарату. Введення амоксіцилін/клавуланової кислоти та рокситроміцину призводило до зростання кількісного показника ентеробактерій (контроль близько 1,6 lg КУО/мл, в дослідних групах більше 2,2 lg КУО/мл). При введенні доксіцикліну та офлоксацину відмічали значне зростання кількості представників роду Staphylococcus (здорові тварини близько 2,2 lg КУО/мл, в дослідних групах більше 2,6 lg КУО/мл);

3. Встановлено, що при розвитку штучної імуносупресії у мишей формується дисбактеріоз піхви, що характеризується наступними ознаками: зниження кількості лактобацил (здорові тварини близько 2,2 lg КУО/мл, в дослідній групі близько 2,0 lg КУО/мл), зростання кількісного показника мікроорганізмів представників роду Staphylococcus (здорові тварини близько 2,0 lg КУО/мл, в дослідній групі більше 2,9 lg КУО/мл) та родини Enterobacteriaceae (здорові тварини близько 1,7 lg КУО/мл, в дослідній групі більше 2,9 lg КУО/мл);

4. Визначено, що експериментальна модель, створена шляхом інтравагінального введення суспензій клітин мікроорганізмів, виділених від мишей (S. aureus (1) та E. coli (1)), характеризувалася зниженням кількісного показника лактобацил (приблизно у 2-3 рази), зростанням кількості мікроорганізмів - представників роду Staphylococcus (здорові тварини близько 1,9 lg КУО/мл, в дослідних групах більше 2,7 lg КУО/мл) та представників родини Enterobacteriaceae (здорові тварини близько 1,3 lg КУО/мл, в дослідних групах більше 2,4 lg КУО/мл). Розвитку генералізованої інфекції при введенні суспензій мікроорганізмів не відмічали;

5. При застосуванні офлоксацину та доксіцикліну відмічено тенденцію до зниження кількості лейкоцитів (більше ніж у 1,4 рази порівняно із контролем), при застосуванні доксіцикліну зростання концентрації ЦІКів та при застосуванні рокситроміцину підвищення показника функціональної спроможності макрофагів. Визначено, що при створенні штучної імуносупресії кількість лейкоцитів у мишей зменшувалася від рівня 106 до рівня 102 клітин/мл. Показник функціональної спроможності макрофагів був нижчий за контрольний, але відхилення не виходило за межі статистичної помилки. Кількість ЦІКів меншала порівняно із показником контрольної групи в 3,3 рази. Встановлено, що при введенні суспензій мікроорганізмів відбувалося зростання кількості лейко- та лімфоцитів (більше ніж у 1,4 рази), концентрації ЦІКів (більше ніж у 2 рази) та у випадку введення суспензії клітин S. aureus (1) зниження функціональної спроможності фагоцитарних клітин в 1,5 рази.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вплив експериментальної імуносупресії на розвиток дисбактеріозу урогенітального тракту білих мишей / О.С. Воронкова, О.А. Сірокваша, Т.М. Полішко и др. // Одеський медичний журнал. - 2008. - №2. - С. 3-6. (Здобувачем визначено склад мікрофлори піхви мишей в нормі та при експериментальній імуносупресії, проведено статистичну обробку результатів та оформлення статті).

2. Воронкова О.С. Модель экспериментального вагинального дисбиоза на белых лабораторных мышах / О.С. Воронкова, Е.А. Сирокваша, А.И. Винников // Мікробіологічний журнал. - 2008. - №6. - С. 47-58. (Здобувачем прийнято участь у розробці моделі експериментального дисбіозу, проведено експериментальні роботи, прийнято участь у аналізі результатів та написанні статті). мікрофлора тварина дисбактеріоз

3. Порівняльний аналіз характеру впливу інтравагінального введення антибіотиків різних груп на стан мікробіоценозу урогенітального тракту мишей / О.С. Воронкова, О.А. Сірокваша, Т.М. Полішко и др. // Мікробіологічний журнал - 2008. - №5. - С. 47-53. (Здобувачем прийнято участь у розробці моделі інтравагінального введення антибіотичних препаратів, розраховано дози для введення, проведено експериментальні дослідження із вивчення складу мікрофлори піхви та оформлення статті).

4. Екологічна рівновага мікробіоценозу урогенітального тракту мишей в умовах навантаження антибіотиками / О.С. Воронкова, О.А. Сірокваша, Т.М. Полішко и др. // Довкілля та здоров'я. - 2008. - №2. - С. 68-71. (Здобувачем виконано висів та ідентифікацію мікроорганізмів з піхви мишей, математичну обробку результатів, оформлення статті).

5. Деякі показники імунітету білих лабораторних мишей в нормі та при різних патологічних станах / О.С. Воронкова, О.А. Сірокваша, Т.М. Полішко и др. // Мікробіологія та біотехнологія. - 2008. - №2(3). - С. 70-75. (Здобувачем проведено підрахунок кількості лейко- та лімфоцитів, оцінення функціональної спроможності макрофагів та аналіз отриманих результатів, оформлення статті).

6. Воронкова О.С. Порівняльний аналіз кількісного складу мікрофлори піхви жінок та білих лабораторних мишей / О.С. Воронкова, Д.А. Умеренкова, О.А. Сірокваша // Імунологія та алергологія. - 2006. - №4. // Матеріали VI Міждисциплінної науково-практичної конференції «Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика, лікування хламідіозу та TORCH-інфекції». - 20-21 грудня 2006 р., м. Київ. - С. 87.

7. Воронкова О.С. Взаємозв'язок показників імунного статусу та резидентної мікрофлори урогенітального тракту лабораторних мишей / О.С. Воронкова, Т.Ф. Галайдюк, М.П. Довгий // Матеріали ІХ Укр. біохімічного з'їзду. - 24-27 жовтня 2006р. М. Харків. - Т. 2. - С. 37.

8. Voronkova O.S. Influence of intravaginal administration of the suspension of microorganisms of Staphylococcus aureus 209-P culture on the pregnancy of laboratory mice / O.S. Voronkova, E.A. Sirokvasha, A.I. Vinnikov // Матеріали наук. конф. “Modern problems of Molecular biology and biotechnology” 29-31 травня. - Одеса, 2007. - С. 180.

9. Воронкова О.С. Изменения в составе микрофлоры урогенитального тракта мышей при интравагинальном введении офлоксацина / О.С. Воронкова, Е.А. Сирокваша, А.И. Винников // Сборник тезисов 11-й Междунар. школы-конференции «Биология - наука ХХІ века”, 29октября -2 ноября 2007 г., - г. Пущино (РФ). С. 236.

10. Воронкова О.С. Склад мікробіоценозу урогенітального тракту самиць білих лабораторних мишей в нормі та при фізіологічній вагітності / О.С. Воронкова // Матеріали IV Міжнародної наукової конференції «Біорізноманіття та роль тварин в екосистемах: Zoocenosis - 2007». - 9-12 жовтня 2007 року, м. Дніпропетровськ. - С. 328-329.

11. Вплив інтравагінального введення роксітроміцину на склад мікрофлори урогенітального тракту / О.С. Воронкова, О.А. Сірокваша, Т.М. Полішко и др. // Матеріали IV Міжнародної молодіжної наукової конференції «Довкілля - ХХІ». - 9-10 жовтня 2008 року, м. Дніпропетровськ. - С. 24-25.

12. Взаимосвязь микробиоценоза урогенитального тракта и показателей иммунитета при дисбиозе / О.С. Воронкова, Е.А. Сирокваша, Т.М. Полишко и др. // Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием "Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах", 27-29 мая 2009 года, г. Москва. - Бюллетень Московского общества испытателей природы, отдел биологический. - 2009. - т. 114, вып. 2. - С. 34-36.

13. Бабенко Л.П. Спектр грампозитивних коків, що виділяються з урогенітального тракту інтактних самиць білих лабораторних мишей / Л.П. Бабенко, В.В. Мокрозуб, О.С. Воронкова // ХІІ з'їзд Товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, 25-30 травня 2009 року, м. Ужгород. - С. 146.

14. Бабенко Л.П. Динаміка зміни мікробного пейзажу урогенітального тракту при застосуванні антибіотичного препарату «Амоксіклав» / Л.П. Бабенко, О.С. Воронкова, А.І. Вінніков // Молодь і поступ біології: збірник тез V Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів, м. Львів, 12-15 травня 2009 року. - Т. 2. - С. 159.

Размещено на Allbest.ru