Властивості кріоконсервованих культур клітин в регенераційних середовищах, що містять низькомолекулярну фракцію з кордової крові

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК: 57.043: 57.085.23.017.35:615.361.018.5.013.8

03.00.19 ? кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Властивості кріоконсервованих культур клітин в регенераційних середовищах, що містять низькомолекулярну фракцію з кордової крові

Трифонова Ганна Валеріївна

Харків - 2010



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України Гулевський Олександр Кирилович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу біохімії холодової адаптації, м. Харків.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, Малоштан Людмила Миколаївна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри біології, фізіології та анатомії людини, м. Харків;

доктор медичних наук, професор, Юрченко Тетяна Миколаївна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріоморфології, м. Харків.

Захист дисертації відбудеться ?_16_? __листопада__ 2010 р. о __13.30_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий ?_15_? ____жовтня____ 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук, професор Розанов Л. Ф.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Використання ізольованих клітин та клітинних ліній тваринного походження у сучасній медицині та біотехнології потребує створення низькотемпературних банків для їх довготривалого зберігання. Дослідження в галузі кріоконсервування клітинних суспензій спрямовані на розробку нових та удосконалення існуючих кріозахисних середовищ й протоколів кріоконсервування [Цуцаева А. А. и др., 1983; Фуллер Б. и др., 2003]. Для кожного типу клітин створюються індивідуальні умови кріоконсервування, що забезпечують максимальне збереження їх морфологічних та функціональних властивостей. Незважаючи на це, в клітинах, що піддані кріоконсервуванню, відбувається ряд нелетальних ушкоджень, які можуть бути відновлені за сприятливих умов. Пошкодження клітин пов'язані із порушенням бар'єрної, транспортної та рецепторної функцій плазматичної мембрани [Гулевский А. К. и др., 1988; McLaughlin E. A. et al., 1994], пошкодженнями інших мембранних структур та ядра клітин [Кравченко Л. П., 1978; Петренко А. Ю., 1984; Фуллер Б. и др., 2004], зміною внутріклітинного балансу мембранозв'язаних та розчинених ферментів [Луговой В. И., 1985].

Проблеми відновлення клітин, що отримали під час кріоконсервування нелетальні ушкодження, досліджені недостатньо. Встановлено, що більша частина пошкоджених клітин здатна відновлюватися при подальшій інкубації в стандартних умовах [Глушко Т. А., 1983; Федец О. И., 1989; Строна В. И., 1989; Семенченко О. А. и др., 1989; Белочкина И. В. и др., 1994; Morimoto R. et al., 1998]. Але повне відновлення властивостей клітинних популяцій потребує чимало часу, що ускладнює біотехнологічне виробництво та знижує ефективність використання ізольованих та культивованих клітин у медицині.

Розроблені на сьогодні заходи відновлення клітин після кріоконсервування спрямовані на укріплення й стабілізування плазматичної мембрани [Гусева Н. Р., 1984; Луговой В. И., 1985; Виноградов В. Л. и др., 1988], та стимулювання енергетичного обміну [Гусева Н. Р., 1984; Виноградов В. Л. и др., 1988; Тибилова Н. Н. и др., 1988] шляхом додавання субстратів та азотистих основ. Для прискорення відновлювальних процесів при культивуванні клітинних культур в ростове середовище додають фібронектин, підвищені концентрації сироватки крові [Стегний Б. Т., 1993], інкубують у кондиціоньованому середовищі [Петренко Т. Ф., 1986].

Перспективними препаратами для відновлення клітин, що отримали функціональні порушення внаслідок кріоконсервування, можуть бути низькомолекулярні фракції, одержані з крові тварин. Було показано, що препарат актовегін («Nycomed», Австрія), який вироблено на основі фракції до 5 кДа крові молочних телят, в дослідах in vitro здатен підвищувати життєздатність клітин [Holtmann H. W., 1976], покращувати їх морфологію [Koschel К. et al., 1972], прискорювати ріст клітинних культур [Riede U. N., 1974] завдяки стимулюванню енергетичного обміну клітин [Румянцева С. А., 2002]. Фракція до 5 кДа, що була отримана з кордової крові, та містить біологічно активні речовини плацентарного комплексу [Грищенко В. И. и др., 1997; Гулевський О. К. и др., 2005], на моделях різних патологічних станів: опікових ран [Гулевский А. К. и др., 2008; Моисеева Н. Н., 2009], субхронічної виразки шлунку [Гулевский А. К. и др., 2007; Гулевский А. К. и др., 2008], механічному ушкодженні хряща колінного суглоба [Гулевский А. К. и др., 2009] виявила високу біологічну активність, що перевищувала дію актовегіну.

Таким чином, вивчення у порівняльному аспекті здатності фракції до 5 кДа кордової крові та препарату актовегін впливати на відновлювальні процеси в клітинах, які піддані кріоконсервуванню, має теоретичний та практичний інтерес, що обумовило актуальність проведених досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі біохімії холодової адаптації в рамках планової теми НДР ІПКіК НАН України «Використання низьких температур для виділення біологічно активних низькомолекулярних компонентів (менше 5 кДа) з кордової крові тварин з метою отримання ранозагоюючих препаратів» (шифр - 2.2.6.21 № ДР 0105U003917).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було вивчити у порівняльному аспекті вплив фракції до 5 кДа, що отримана з кордової крові великої рогатої худоби, та актовегіну на відновлення нелетальних ушкоджень в клітинах після кріоконсервування.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

Визначити здатність фракції до 5 кДа кордової крові та актовегіну впливати на проліферативні властивості різних клітинних культур при додаванні їх до складу ростових середовищ.

Визначити здатність фракції до 5 кДа кордової крові та актовегіну відновлювати проліферативні властивості клітинних культур, що були кріоконсервовані.

Вивчити вплив фракції до 5 кДа кордової крові та актовегіну на мітотичний режим клітинних культур до та після кріоконсервування.

Дослідити адгезивні властивості клітинних культур до та після кріоконсервування при додаванні фракції до 5 кДа кордової крові або актовегіну в середовище культивування.

Об'єкт дослідження. Відновлення морфо-функціональних властивостей клітинних культур після кріоконсервування в процесі їх культивування із додаванням фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби.

Предмет дослідження. Кріоконсервовані клітинні культури, що піддані дії фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби.

Методи дослідження. В роботі використовувалися методи: культивування клітинних культур, кріоконсервування клітинних суспензій, цитологічні та мікроскопічні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлена здатність фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби впливати на ріст клітинних культур при її додаванні у ростове середовище. Показано, що фракція до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби та актовегін стимулюють всі етапи росту клітинних культур починаючи з перших годин культивування. Встановлено, що як фракція до 5 кДа з кордової крові, так і актовегін мають різний вплив на різні досліджувані клітинні культури: ембріональні фібробласти людини, ВНК-21 clone 13/04 та РК-15-IECVM, який залежить від концентрації досліджуваних препаратів та від походження культури.

Вперше використано додавання фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби або актовегіну до середовищ культивування клітинних культур, які були кріоконсервовані, для покращення їх функціонального стану. Встановлено збільшення концентрацій досліджуваних препаратів, що мають максимальний стимулюючий ефект, в лінії ВНК-21 clone 13/04 після кріоконсервування.

Показано, що при культивуванні перещеплюваних лінії ВНК-21 clone 13/04 та РК-15-IECVM стимулююча дія фракції до 5 кДа кордової крові значно перевищувала дію актовегіну як до, так і після кріоконсервування. При культивуванні диплоїдної культури ембріональних фібробластів людини відмінностей у стимулюючої дії фракції до 5 кДа кордової крові та актовегіну знайдено не було.

Вперше встановлено, що основою дії фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби є не тільки стимуляція енергетичного метаболізму клітин, що є відомим механізмом дії актовегіну, але й наявність ростових факторів ембріонального походження.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі показана можливість стимулювання проліферації клітинних культур додаванням фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби або актовегіну у стандартні умови культивування.

Результати роботи, спрямовані на підвищення проліферації диплоїдної культури ембріональних фібробластів додаванням в стандартне середовище культивування актовегіну в концентрації 224 мкг/мл, захищені деклараційним патентом України № 42022, МПК С12 N5/00.

Результати, які було отримано в роботі, щодо відновлення морфо-функціональних властивостей фібробластів в середовищі, яке містить фракцію до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби чи актовегін, можуть бути використані у регенераційній медицині.

Результати роботи можуть бути основою створення регенераційних та ростових середовищ для клітинних культур.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено огляд літератури за темою дисертаційної роботи, отримані експериментальні результати, проведена їх статистична обробка та аналіз. Разом із науковим керівником проф. О. К. Гулевським були визначені мета та задачі роботи, інтерпретовано результати і сформульовані висновки. У наукових працях, які опубліковані у співавторстві, відбито результати спільного планування, проведення експериментів та обговорення результатів. В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботі [1] - пошук та аналіз літературних даних

у роботах [2-11] - культивування клітинних культур

у роботах [3, 5, 6] - кріоконсервування клітинних культур

у роботах [2-11] - підрахунок кількості клітин та аналіз проліферації клітинних культур

у роботах [2, 4, 8-11] - дослідження мітотичного режиму перещеплюваних культур клітин

у роботах [3-6, 11] - вивчення ефективності прикріплення клітинних культур

у роботах [4-6, 11] - дослідження швидкості розшаровування клітинних культур

у роботі [6] - вивчення морфології клітин

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на міжнародних та національних конференціях: «Актуальные проблемы и достижения криобиологии и криомедицины. Структурная и функциональная организация стволовых клеток в условиях действия низких температур» (м. Харків, 2005), конференції молодих вчених ІПКіК НАН України «Холод в биологии и медицине» (м. Харків, 2006), конференції-конкурсі робот молодих вчених «Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии» (м. Київ, 2007), науково-практичний конференції «Актуальные проблемы патологии, иммунологии и морфологии» (м. Харків, 2007), «Новые криотехнологии для решения фундаментальных и прикладных задач медицины» (м. Харків, 2008); науково-практичній конференції «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новий Світ, Крим, Україна, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 наукових робот, з яких 6 статей, 1 патент и 4 тез доповідей на міжнародних і національних конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 148 сторінках друкованого тексту, з яких 106 сторінок основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, заключення, висновків, списку цитованої літератури (28 сторінок), що включає 272 джерела. Дисертацію ілюстровано 7 таблицями та 17 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

кордовий кров кріоконсервування адгезивний

Матеріали та методи дослідження. В роботі були використані три культури клітин: диплоїдна культура ембріональних фібробластів людини (ФЛ) [Гончарук О. І. та ін., 2005] та дві перещеплювані лінії клітин, отримані з колекції клітинних культур Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» УААН (м. Харків): ВНК-21 clone 13/04 [Стегній Б. Т. та ін., 2004] та РК-15-IECVM [Стегній Б. Т. та ін., 2004]. Стандартні умови культивування для кожної культури були наступні: ФЛ культивували на середовищі 199 із додаванням 10 % ембріональної сироватки великої рогатої худоби (ВРХ); лінію ВНК-21 clone 13/04 - на середовищі DMEM із додаванням 10 % ембріональної сироватки ВРХ; лінію РК-15-IECVM - на суміші (1:1) середовищ 199 та Ігла DMEM із додаванням 10 % сироватки ВРХ. Крім того, всі культури культивували на середовищах із зниженим вмістом сироватки крові, яке склало для культур ФЛ та РК-15-IECVM - 2 %, а ВНК-21 clone 13/04 - 1 %.

Всі культури були кріоконсервовані з використанням ДМСО у концентрації 10 %. Кріоконсервування клітинних культур здійснювали в контейнерах фірми «Nunc» (США) за режимами двоетапного заморожування [Пинаев Г. П., 1988; Белоконь В. С., 1993; Стегній Б. Т. та ін., 2004]. Зберігання кріоконсервованих клітин здійснювали в умовах низькотемпературних банків ІПКіК НАНУ и ННЦ “ІЕКВМ” УААН (м. Харків). Відігрів виконували на водяній бані при 40оС протягом 40 ? 60 с. Проводили видалення кріопротектора [Цуцаева А. А. и др., 1983].

Низькомолекулярну фракцію отримували з цільної кордової крові ВРХ, яку збирали під час розтелення, одразу механічно дефібрінували [Шишков В. Н. и др., 1981] та піддавали процедурі кріодеструкції шляхом повільного заморожування - відтаювання. Виділення фракції з молекулярною вагою компонентів до 5 кДа з кордової крові (ФКК) проводилось шляхом тангенціальної мембранної ультрафільтрації [Брок Т., 1987], з використанням мембранного модуля «Vivaflow-200» («Sartorius», Німеччина). Отриманий об'єм фракції ліофілізували [Абакумова O. С., 2009]. Перед використанням суху фракцію розводили стерильним 0,9 % розчином NaCl із розрахунку 40 мг/мл.

Актовегін («Nycomed», Австрія) використовували у вигляді готового розчину з вмістом сухої речовини 40 мг/мл.

ФКК та актовегін додавали в середовище культивування клітин у двох концентраціях: 56 мкг сухої речовини на 1 мл ростового середовища (мкг/мл) та 224 мкг/мл, які були розраховані походячи з дозировок актовегіну згідно інструкції застосування в клініці.

Для первинної характеристики стану культур після кріоконсервування використовували експрес-метод оцінки життєздатності клітин за допомогою прижиттєвого забарвлення трипановим синім [Пинаев Г. П., 1988]. Підрахунок кількості клітин здійснювали в камері Горяєва [Базарнова М. А., 1982]. Результати аналізували за допомогою формули:

А Життєздатність = x 100%

Б де А ? кількість клітин, які не зафарбувалися;

Б ? загальна кількість клітин;

Швидкість проліферації культур оцінювали по кількості клітин на 4 добу культивування. Клітини знімали з культуральної поверхні ферментативним способом та підраховували в камері Горяєва. Результат виражали через індекс проліферації (ІП) [Пригода А. С. и др., 1990] ? відношення в 1 мл кількості клітин на 4 добу культивування до кількості клітин, що були посіяні.

Вивчення загальної морфології клітинних культур проводили щоденно за допомогою інвертованого мікроскопу.

Для вивчення мітотичного режиму кожні 24 год росту культури скельця, на яких росли культури, виймали з культурального флакону та фіксували у спирт-оцтовій (1:1) суміші. Фарбували гематоксиліном Карачі та готували постійні препарати [Блюмкин В. Н. и др., 1973; Белоконь В. С., 1993]. За допомогою світлового мікроскопу підраховували кількість клітин, що розподіляються, на загальну кількість 1000 клітин. Окремо враховували патологічні форми мітозів. Результат виражали в проміле (‰).

Ефективність прикріплення культур оцінювали за кількістю клітин, які здатні прикріплюватися до культуральної поверхні [Davis J. M., 2001] за формулою:

е = [(m-n)/m] x 100 %,

де e ? ефективність прикріплення;

m ? кількість клітин, що були посіяні;

n ? кількість неприкріплених клітин

Для цього через 24 год культивування підраховували у ростовому середовищі кількість клітин, що не прикріпилися.

Для вивчення швидкості розшаровування клітинних культур скельця з прикріпленими клітинами фіксували розчином Буену через 1,5 год, 3 год, 5 год та 24 год культивування. Потім послідовно фарбували гематоксиліном Карачі та 0,1 % розчином еозину. Готували постійні препарати [Ченцов Ю. С., 1988]. Ступінь розшарування клітин оцінювали за допомогою світлового мікроскопу. Підраховували всі клітини, які мали ознаки розшарування та окремо враховували клітини, котрі мали веретеноподібну форму, на загальну кількість 100 клітин.

Статистичну обробку результатів проводили використовуючи програмний пакет "Statgraphic plus for Windows", версії 2.1 непараметричним методом за допомогою критерію Манна-Уітні (Уілкінсона) [Лакин Г. Ф., 1990]. Результати представлені як M ± m. Рівень вірогідності складав 0,05.

Матеріали і методи, які застосовані в дисертаційній роботі, розглянуті і схвалені комісією по біоетиці ІПКіК НАН України.

Результати роботи та їх обговорення

Вплив ФКК та актовегіну на проліферацію диплоїдної культури ембріональних фібробластів людини до та після кріоконсервування.

При культивуванні нативної культури ФЛ (рис. 1А) у стандартному середовищі (10 % сироватки крові) ІП на 4 добу складав 1,15 ± 0,06. Додавання ФКК у концентрації 56 мкг/мл стимулювало проліферацію культури на 47,6 %, а додавання актовегіну в цієї ж концентрації - на 19,4 %. В концентрації 224 мкг/мл ФКК стимулювала ріст культури на 78 %, а актовегін на 65 %. Зменшення кількості сироватки крові у середовищі культивування до 2 % призводило до зниження показників росту культури. ІП на 4 добу культивування складав 0,73 ± 0,06. Додавання ФКК у концентрації 224 мкг/мл до середовища із зменшеною кількістю сироватки крові стимулювало проліферацію культури на 72,8 %, а додавання актовегіну - на 45,2 %. Кількість клітин на 4 сутки при додаванні ФКК та актовегіну в концентрації 56 мкг/мл була трохи менша, ніж при їх додаванні у концентрації 224 мкг/мл.

Отже, у концентрації 56 мкг/мл актовегін не мав впливу (р > 0,05) на ріст нативної культури ФЛ при обох варіантах ростового середовища, на відміну від ФКК. Додавання ФКК в обох концентраціях та актовегіну в концентрації 224 мкг/мл до середовища із зменшеним вмістом сироватки крові дозволяло достигнути показників росту культури ФЛ в стандартних умовах культивування.

Встановлено, що кріоконсервування порушує ріст культури ФЛ (рис. 1Б). ІП при культивуванні деконсервованих ФЛ у стандартному середовищі складав 0,73 0,06, а в середовищі зі зменшеним вмістом сироватки крові 0,52 0,04, та був у обох випадках вірогідно нижчій, ніж у нативній культурі. Додавання ФКК та актовегіну у стандартне середовище культивування як у концентрації 56 мкг/мл, так і 224 мкг/мл стимулювало (р < 0,05) проліферацію культури ФЛ після кріоконсервування. Більший стимулюючий вплив мало додавання ФКК та актовегіну у концентрації 224 мкг/мл - відповідно 43,4 % та 29 % відносно контролю. В умовах дефіциту сироватки крові у середовищі культивування ФКК та актовегін не впливали на проліферацію деконсервованих ФЛ.

Таким чином, вивчення проліферації диплоїдної культури ФЛ до та після кріоконсервування дозволило встановити, що по-перше ФКК та актовегін мають однаковий стимулюючий вплив (отримані відмінності не вірогідні), та по-друге, більш ефективним виявилось їх додавання до середовищ культивування у концентрації 224 мкг/мл.



А Б

Рис. 1. Показники приросту клітин диплоїдної культури ембріональних фібробластів людини до (А) та після (Б) кріоконсервування при вмісті різних концентрацій ФКК та актовегіну у ростовому середовищі.

Примітки: * ? р < 0,05 порівняно з відповідним контролем; х - р < 0,05 між відповідними концентраціями ФКК та актовегіну при їх додаванні в однакові середовища культивування (10 % та 2 % сироватки крові); # - р < 0,05 між концентраціями фракцій, що додаються.

Вплив ФКК та актовегіну на проліферацію перещеплюваних культур клітин до та після кріоконсервування.

При культивуванні нативної лінії ВНК-21 clone 13/04 (рис. 2А) у стандартних умовах ІП на 4 добу культивування складав 2,23 ± 0,08. При додаванні до середовища культивування ФКК в концентрації 56 мкг/мл кількість клітин перевищувала контрольні показники на 89 %, а в концентрації 224 мкг/мл - на 70 %. Додавання актовегіну стимулювало проліферацію лінії ВНК-21 clone 13/04 значно менше. Вірогідні відмінності від контролю спостерігалися при додаванні актовегіну лише в концентрації 56 мкг/мл - на 20 %. Зменшення кількості сироватки крові у середовищі культивування до 1 % призводило до значного зменшення ІП, який на 4 добу культивування складав 0,55 0,02. В цих умовах додавання ФКК в концентрації 56 мкг/мл стимулювало проліферацію нативної лінії ВНК-21 clone 13/04 відносно контролю в 5 разів, а в концентрації 224 мкг/мл - в 4,17 разів. Вплив актовегіну на ріст культури також був більшим при його додаванні у концентрації 56 мкг/мл. Кількість клітин на 4 добу в цьому варіанті перевищувала контроль на 53,6 %.

Отже, концентрація ФКК та актовегіну, що мала більший стимулюючий вплив в нативній культурі ВНК-21 clone 13/04 склала 56 мкг/мл. Дія ФКК значно перевищувала дію актовегіну при їх додаванні до обох варіантів ростового середовища. Стимулюючий вплив ФКК та актовегіну відносно контролю на нативну лінію ВНК-21 clone 13/04 був більш виражений у середовищі із зменшеною кількістю сироватки крові. Додавання обох концентрації ФКК до цього середовища дозволяло достигнути показників росту лінії ВНК-21 clone 13/04 в стандартних умовах культивування, чого не спостерігалося при додаванні актовегіну.

Після кріоконсервування відбувалося значне порушення росту лінії ВНК-21 clone 13/04 (рис. 2Б). ІП при культивуванні деконсервованої культури в стандартних умовах становив 0,92 ± 0,01. Додавання ФКК стимулювало проліферацію цієї культури відносно контролю в концентрації 56 мкг/мл на 15,2 %, а в концентрації 224 мкг/мл - на 83,7 %. Показники приросту клітин деконсервованої лінії ВНК-21 clone 13/04 відносно контролю при додаванні актовегіну були значно менші: на 6,5% и 16,3% в концентрації 56 мкг/мл та 224 мкг/мл відповідно.

Прижиттєве вивчення клітин деконсервованої лінії ВНК-21 clone 13/04 на підложжі показало, що додавання ФКК в стандартне середовище культивування сприяло не тільки збільшенню кількості клітин, але й нормалізуванню їх морфології більшою мірою, ніж додавання актовегіну.

ІП при культивуванні деконсервованої культури в середовищі зі зменшеною до 1 % концентрацією сироватки крові складав 0,46 ± 0,01. Вірогідні відмінності спостерігалися при додаванні ФКК та актовегіну в цих умовах тільки у концентрації 224 мкг/мл. Показники росту культури перевищували контроль на 13 % та 15,8 % відповідно. Але ці відмінності пов'язані не зі стимуляцією проліферації, а з їх протекторною дією, завдяки чому загибель клітин та їх відкріплення від підложжя відбувалося повільніше.

Таким чином встановлено, що після кріоконсервування концентрація як ФКК так і актовегіну, яка має більший стимулюючий вплив на ріст лінії ВНК-21 clone 13/04, становить 224 мкг/мл. Мабуть це пов'язано із тим, що метаболічні потреби деконсервованих клітин збільшуються.

А. Б.

Рис. 2. Показники приросту клітин лінії ВНК-21 clone 13/04 до (А) та після (Б) кріоконсервування при вмісті різних концентрацій ФКК та актовегіну у ростовому середовищі.

Примітки: * ? р < 0,05 порівняно з відповідним контролем; х - р < 0,05 між відповідними концентраціями ФКК та актовегіну при їх додаванні в однакові середовища культивування (10 % та 1 % сироватки крові); # - р < 0,05 між концентраціями фракцій, що додаються.

Для знаходження закономірностей впливу ФКК та актовегіну на фізіологічно різні клітинні культури: диплоїдні та перещеплювані, було проведено вивчення проліферації також нативної лінії РК-15-IECVM. Встановлено, що як і при культивуванні лінії ВНК-21 clone 13/04 концентрація ФКК та актовегіну, що мала більший вплив на проліферацію цієї культури склала 56 мкг/мл. Додавання ФКК в стандартне ростове середовище в цій концентрації сприяло підвищенню ІП відносно контролю на 40,5 %, а додавання актовегіну - на 13,7 %. В умовах зниження до 2 % сироватки крові у ростовому середовищі додавання ФКК стимулювало ріст культури на 90 %, актовегіну - на 39 %. Додавання ФКК в концентрації 224 мкг/мл стимулювало ріст культури РК-15-IECVM на 31,5 % в стандартних умовах культивування, й на 59 % - в умовах дефіциту сироватки. Актовегін в цієї концентрації на ріст лінії РК-15-IECVM не впливав.

Отже було встановлено, що вплив актовегіну на обидві перещеплювані культури був слабовиражений. Дія ФКК значно перевищувала дію актовегіну, особливо в умовах знижених концентрації сироватки крові у середовищах культивування. Клітини лінії РК-15-IECVM виявилися менш чутливими до дії ФКК та актовегіну, ніж клітини лінії ВНК-21 clone 13/04.

Відмінності концентрацій ФКК та актовегіну, що мали більший стимулюючий ефект на проліферацію нативних культури ФЛ та перещеплюваних культур, вочевидь пов'язані з тим, що перещеплювані культури під час довготривалого культивування отримали високу чутливість до факторів середовища, завдяки чому в сучасних наукових дослідженнях їх використовують як тестові культури.

Значне перевищення показників росту клітинних ліній в середовищах із зниженою концентрацією сироватки крові при додаванні ФКК ніж при додаванні актовегіну може бути пов'язане не тільки з інтенсифікацією енергетичних процесів у клітинах, що є відомим механізмом дії актовегіну [Нордвик Б., 2002; Румянцева С. А., 2002; Muehlbacher C. et al., 1987; Obermaier-Kusser B. et al., 1988; Machicao F. et al., 1990], а й з присутністю в ФКК низькомолекулярних факторів росту ембріонального походження.

Відсутність дії ФКК та актовегіну при їх додаванні в середовища зі зниженою концентрацією сироватки крові на обидві деконсервовані культури клітин пов'язана з браком ростових факторів, що містяться у сироватці крові, для протікання відновлювальних процесів у клітинах.

Мітотичний режим лінії ВНК-21 clone 13/04 до та після кріоконсервування при додаванні ФКК або актовегіну в середовище культивування.

Вивчення дії ФКК на процеси розподілу клітин проводили в культурі ВНК-21 clone 13/04, що обумовлено її високою чутливістю до речовин, що вивчаються. ФКК та актовегін додавали в концентраціях, які у попередніх дослідженнях мали більший вплив: для нативної культури - 56 мкг/мл и для культури після кріоконсервування - 224 мкг/мл.

Встановлено, що нативна лінія ВНК-21 clone 13/04 має високу мітотичну активність. Пик мітотичної активності при культивуванні в стандартному середовищі приходиться на 2-3 добу росту культури та складає 33-36 ‰ (рис. 3 (1А)).

Додавання ФКК в стандартне ростове середовище нативної лінії ВНК-21 clone 13/04 призводило до збільшення відносно контрольних показників кількості клітин, що розподіляються на 1 добу росту - на 64,3 %, на 2 добу - на 54,8 %, на 3 добу - на 20,6 %. При додаванні актовегіну кількість клітин, що розподіляються, була значно менша та перевищувала (р < 0,05) контрольні показники на 2-3 добу росту культури.

При культивуванні перещеплюваної лінії в ростовому середовищі, що містило 1 % сироватки крові, кількість мітозів в контролі складала у всі строки росту культури 5,3 - 7,7 ‰ (рис. 3 (2A)). Додавання ФКК в ростове середовище із дефіцитом сироватки крові, на 1 добу росту культури призводило до збільшення кількості мітозів відносно контролю в 4,7 рази, на 2 добу - в 4,9 рази. На 3 добу росту культури стимулююча дія ФКК залишалася на тому ж рівні. Стимулююча дія актовегіну була значно меншою у порівнянні з дією ФКК.



1А. 1Б.

2А.

? мітотична активність;

патологічні форми

мітозів

Рис. 3. Мітотичний режим лінії ВНК-21 clone 13/04 до (А) та після (Б) кріоконсервування при додаванні ФКК та актовегіну в ростове середовище, яке містить сироватку крові у концентрації (1) - 10 % та (2) - 1 %.

Примітки: * ? р < 0,05 порівняно з відповідним контролем, х - р < 0,05 між відповідними варіантами із додаванням ФКК та актовегіну

В лінії ВНК-21 clone 13/04, що була кріоконсервована, при її подальшому культивуванні в стандартних умовах мітотична активність була значно зменшена, особливо на 1 добу росту культури (рис. 3 (1Б)). У продовж перших 3 діб культивування її мітотична активність не досягала нативних показників, що відображає значні порушення процесів розподілу в деконсервованих культурах.

При додаванні ФКК у стандартне середовище культивування деконсервованої лінії ВНК-21 clone 13/04 кількість мітозів була вища, ніж в контролі на 1 добу росту - в 3 рази, на другу добу - на 75 %, на третю - на 61,5 %. Додавання актовегіну стимулювало процеси розподілу клітин у порівнянні з контролем на 1 добу - в 2,25 рази, а на другу добу - на 20 %. На 3 добу росту культури відмінностей від контролю по кількості клітин, що розподіляються знайдено не було. Таким чином, після кріоконсервування додавання ФКК та актовегіну в середовище культивування лінії ВНК-21 clone 13/04 так само як і в нативній культурі, сприяє більш ранньої активації процесів розподілу клітин.

При культивуванні деконсервованої лінії ВНК-21 clone 13/04 на середовищі, яке містило 1 % сироватки крові, клітин, що розподіляються знайдено не було.

Зниження мітотичної активності культур, що були піддані кріоконсервуванню, може бути пов'язане з руйнівною дією цього процесу на мітотичний апарат клітин. Вивчення кількості патологічних форм мітозів виявило наступне. В нативній культурі не було знайдено відмінностей по цьому показнику в усі досліджені строки між контролем та варіантами із додаванням до середовища ФКК або актовегіну як при культивуванні в стандартних умовах, так і в умовах дефіциту сироватки крові. Після кріоконсервування кількість патологічних розподілів клітин значно збільшувалася, особливо на 1 добу культивування. Але відмінностей між контролем та дослідними варіантами також не було знайдено. Серед форм патологічних мітозів в деконсервованій культурі найбільше було пов'язаних із порушеннями веретена розподілу, які можуть бути викликані порушенням структури тубуліну, моторних та регуляторних білків; елімінацією з клітин їх мономерів; порушенням умов полімеризації тубуліну; ушкодженням центріолей та механізмів їх розходження до полюсів. Вочевидь, що ФКК и актовегін не можуть прямо впливати на відновлення таких порушень в деконсервованих клітинах.

Підвищення мітотичної активності клітинних культур, підданих кріоконсервуванню, під дією ФКК та актовегіну можливо пов'язати з відомим механізмом дії актовегіну [Нордвик Б., 2002; Румянцева С.А., 2002], спрямованим на підвищення енергетичного статусу клітин, що в свою чергу прискорює в них протікання відновлювальних процесів, та із більшим вмістом у ФКК речовин, що є мітогенними стимулами для клітин.

Таким чином, вивчення впливу фракції до 5 кДа з кордової крові на різні клітинні культури як до так и після кріоконсервування показало значну стимуляцію їх проліферації. Додавання ФКК до складу регенераційних середовищ для клітинних культур, підданих кріоконсервуванню, сприяло підвищенню інтенсивності відновлювальних процесів, які виражалися в нормалізації морфології культур клітин на підложжі, більш ранньому вступу клітин в мітоз, підвищенні їх мітотичної активності.

Ефективність прикріплення клітин нативних та деконсервованих культур під дією ФКК та актовегіну.

На наступному етапі роботи ми досліджували здатність ФКК та актовегіну впливати на ранні етапи росту клітинних культур, стимуляція яких саме й відображає відновлювання ушкоджень, отриманих клітинами підчас кріоконсервування.

Було встановлено, що здатність клітин нативної культури ФЛ прикріплюватися до підложжя не залежала від кількості сироватки крові у складі ростового середовища та складала 59 ? 61 % від кількості клітин, що були посіяні. Вивчення впливу ФКК на ефективність прикріплення ФЛ показало, що кількість прикріплених клітин не мала відмінностей від відповідних контролів. Актовегін також не мав впливу на цей показник. Встановлено, що процес кріоконсервування не впливав на ефективність прикріплення ФЛ у порівнянні з нативною культурою у всіх варіантах. ФКК и актовегін в культурі після кріоконсервування також не впливали на цей показник у порівнянні з контролем.

Ефективність прикріплення нативної культури ВНК-21 clone 13/04 при культивуванні в стандартних умовах склала 90,2 ± 0,4 %. Зниження вмісту сироватки крові в середовищі культивування не викликало відмінностей цього показника. ФКК и актовегін також не впливали на кількість прикріплених клітин нативної культури. Після кріоконсервування ефективність прикріплення клітин лінії ВНК-21 clone 13/04 вірогідно знижувалася та складала в стандартних умовах культивування ? 83,6 ± 2 %, а при дефіциті сироватки крові в середовищі культивування ? 77,5 ± 0,7 %. Додавання ФКК та актовегіну в стандартне середовище культивування сприяло збереженню ефективності прикріплення культури на рівні нативних показників, чого не спостерігалося при їх додаванні в середовище із зниженою концентрацією сироватки крові.

Прижиттєве дослідження в ці ж строки спостереження - 24 години - показало покращення морфології культури ВНК-21 clone 13/04 на підложжі при додаванні ФКК ефективніше, ніж при додаванні актовегіну. При культивуванні в середовищі з дефіцитом сироватки крові при додаванні ФКК відбувалася нормалізація морфології клітин та активізування процесів розподілу клітин. Показано, що процес кріоконсервування не тільки знижує ефективність прикріплення лінії ВНК-21 clone 13/04 але й порушує процеси розшаровування клітин на підложжі. При культивуванні в стандартних умовах в контролі спостерігалися переважно сферичні клітини, які частково не мали ознак розшаровування; при додаванні ФКК кількість клітин, що мали нормальну морфологію збільшувалася, а не розшарованих зменшувалася. Додавання як ФКК, так і актовегіну в середовище, яке містило 1 % сироватки крові, в деконсервованій культурі ВНК-21 clone 13/04 не впливало на морфологію її клітин.

Вивчення швидкості розшаровування клітин культури ФЛ до та після кріоконсервування під впливом ФКК.

Відомо, що ступінь розшарування клітин на підложжі впливає на протікання таких процесів, як запуск механізмів розподілу, цитоскелетні перебудови, регуляцію експресії генів [Folkman J. et al., 1978; Liang Y. et al., 2007]. У випадку, коли перестають поступати позитивні сигнали від адгезивних білків, блокується не тільки вступ клітин в мітотичний цикл, але й активується апоптоз [Montgomery A.M.P. et al., 1994; Owen C.H. et al.,1992].

Таким чином, вивчення швидкості розшаровування клітин є важливим показником фізіологічного стану культур, а оцінка ступеню розшарованості клітин на підложжі необхідна для прогнозу її подальшого росту.

При вивченні процесів розшаровування нативної культури ФЛ під дією ФКК та актовегіну було встановлено, що вони не впливали на загальну кількість розшарованих клітин, незалежно від кількості сироватки крові в ростовому середовищі (рис. 4 (А)).

1А 1Б.

2А 2Б.

Рис. 4. Динаміка розшаровування культури ФЛ до (А) та після (Б) кріоконсервування при додаванні ФКК та актовегіну в ростове середовище, яке містить сироватку крові у концентрації (1) ? 10 % та (2) ? 2 %.

Примітки: Загальна кількість розшарованих клітин: А - контроль, Б - при додаванні актовегіну, В - при додаванні ФКК

Кількість веретеноподібних клітин: Г - контроль, Д - при додаванні актовегіну, Е - при додаванні ФКК

* ? відмінності статистично вірогідні для варіанту із додаванням ФКК відносно контролю (р < 0,05); х - відмінності статистично вірогідні для варіанту із додаванням актовегіну відносно контролю (р < 0,05)

Починаючи з 1,5 год культивування загальна кількість розшарованих клітин у всіх варіантах складала 96,6 - 96,8%. Однак ступінь розшарованості клітин, яку ми оцінювали за кількістю клітин, що прийняли характерну для фібробластів веретеноподібну форму, мала значні відмінності у всіх варіантах.

Процес розшаровування клітин у середовищі з дефіцитом сироватки крові відбувався повільніше, ніж у стандартному середовищі. Але на 24 год кількість веретеноподібних клітин при культивуванні ФЛ у обох середовищах була однаковою. Додавання ФКК (рис. 4 (1А)) в стандартне середовище підвищувало кількість веретеноподібних клітин починаючи з 3 год культивування, а в середовище, яке містило 2 % сироватки крові (рис. 4 (2А)) - з 1,5 год. Через 24 год культивування в обох варіантах ростових середовищ із додаванням ФКК відмінностей у ступеню розшарованості клітин знайдено не було. Дія актовегіну була аналогічна, але нижча за дію ФКК на ранніх строках росту культури. К 24 год культивування кількість веретеноподібних клітин при додаванні актовегіну в обидва ростові середовища не відрізнялась від варіантів із додаванням до них ФКК, та перевищувала контрольні показники. Можливо це є свідоцтвом репарації незначних ушкоджень клітин, які виникають при пересіві.

Встановлено, що розшаровування клітин деконсервованих культур при їх подальшому культивуванні значно уповільнюється (рис. 4 (Б)). Це стосується обох показників, що вивчалися: як загальної кількості розшарованих клітин, так і кількості веретеноподібних клітин. В перші строки культивування розшаровування деконсервованої культури відбувалося скоріше в середовищі із зниженою концентрацією сироватки крові (рис. 4 (2Б)), але к 24 год - загальна кількість розшарованих клітин при культивуванні ФЛ в обох ростових середовищах не відрізнялася та була трохи менша, ніж в нативній культурі. Додавання ФКК та актовегіну до обох варіантів ростових середовищ при культивуванні ФЛ, що були кріоконсервовані, підвищувало загальну кількість розшарованих клітин починаючи з 1,5 год культивування, але на 24 год показники в цих варіантах не відрізнялися від контрольних.

Подібне можливо було спостерігати й при вивченні динаміки іншого показника - кількості веретеноподібних клітин. Процес розшаровування клітин у перші 5 год культивування був більш виражений в середовищі з 2% сироватки крові (рис. 4 (2Б)), ніж у стандартному середовищі (рис. 4 (1Б)), але к 24 год - ступінь розшарованості культури в стандартному середовищі був більший, ніж в середовищі з дефіцитом сироватки крові. Додавання ФКК та актовегіну стимулювало швидкість розшаровування деконсервованих ФЛ при їх культивуванні в обох варіантах ростового середовища. Кількість веретеноподібних клітин значно перевищувала контрольні значення починаючи з 1,5 год культивування. Але к 24 год культивування відмінностей у кількості веретеноподібних клітин дослідних варіантів від контролів знайдено не було. Відсутність впливу ФКК на адгезію клітин через 24 год росту культури може говорити про завершення процесу розшаровування клітин, які збереглися після кріоконсервування.

Відомо, що після повного розшаровування клітин та формування характерної морфології на підложжі вони стають чутливими до дії мітогенів [Мушкамбаров Н. Н. и др., 2003]. Отже прискорення розшаровування культур призводить до більш раннього початку у клітина підготування до розподілу. Таким чином, вивчення впливу ФКК на протікання адгезивних процесів різних клітинних культур як до, так и після кріоконсервування показало стимуляцію різних етапів їх росту. Включення ФКК до складу регенераційних середовищ для клітинних культур, підданих кріоконсервуванню, сприяло підвищенню інтенсивності відновлювальних процесів у клітинах, що виражалося у підвищенні кількості прикріплених до підложжя клітин, прискоренні розшаровування клітинних культур, нормалізації їх морфології.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі дано теоретичне узагальнення наукової проблеми нелетальних кріоушкоджень клітин та активації відновлювальних процесів в них при подальшому культивуванні та знайдене її вирішення. В роботі було розроблено регенераційне середовище для культур клітин, які були кріоконсервовані, де у якості активного компоненту використовується фракція до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби.

Показано, що оптимальна для стимуляції росту клітинних культур концентрація фракції до 5 кДа з кордової крові та актовегіну, в диплоїдній культурі фібробластів людини становить 224 мкг/мл до та після кріоконсервування, в нативних перещеплюваних культурах ВНК-21 clone 13/04 та РК-15-IECVM - 56 мкг/мл, та в деконсервованій культурі ВНК-21 clone 13/04 - 224 мкг/мл.

Встановлено, що фракція до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби при її додаванні у середовища культивування клітинних культур як до, так і після кріоконсервування стимулює проліферацію диплоїдної культури фібробластів людини відповідно на 78 % та 43,4 %, лінії ВНК-21 clone 13/04 - на 89 % та на 83,7 %, й нативної лінії РК-15-IECVM на 40,5 % .

При культивуванні клітинних культур у середовищах, які містять знижену концентрацію сироватки крові, додавання фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби стимулює проліферацію нативних культур: фібробластів людини на 72,8 %, лінії ВНК-21 clone 13/04 в 5 разів та лінії РК-15-IECVM на 90 %, і не впливає на проліферацію деконсервованих культур.

Встановлено, що в диплоїдній культурі фібробластів людини фракція до 5 кДа з кордової крові та актовегін мають однаковий вплив на її проліферацію як до, так і після кріоконсервування; в перещеплюваних культурах дія фракції до 5 кДа з кордової крові перевищує дію актовегіну в лінії ВНК-21 clone 13/04: при стандартних умовах культивування в 1,6 рази як до так і після кріоконсервування, при зниженої концентрації сироватки крові в середовищі культивування нативної культури - в 3,3 рази, та в нативній лінії РК-15-IECVM в 1,3 - 1,4 рази при обох вищеозначених умовах культивування.

Встановлено, що додавання фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби до складу ростових та регенераційних середовищ для клітинних культур сприяє більш ранньому вступу більшої кількості клітин в мітоз та активує їх мітотичну активність більш ефективно ніж актовегін, й не впливає на кількість патологічних розподілів клітинних культур.

При культивуванні диплоїдної культури фібробластів людини як до, так і після кріоконсервування показано, що фракція до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби, так само як і актовегін, не впливає на здатність клітин прикріплюватися до підложжя та значно підвищує швидкість їх розшаровування.

Додавання фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби або актовегіну до середовищ культивування деконсервованої лінії BHK-21 clone 13/04 сприяло збереженню кількості клітин, які здатні прикріплюватися до підложжя, на рівні нативної культури й покращувало їх морфологію.



СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гулевський О. К. Поживні середовища для культивування клітин тварин в сучасній біотехнології (огляд) / О. К. Гулевський, Г. В. Трифонова, О. А. Лаврик // Ветерінарна біотехнологія. - 2006. - №8. - С. 47-63.

2. Гулевский А. К. Влияние актовегина на пролиферацию клеток перевиваемых линий / А. К. Гулевский, А. В. Трифонова, А. А. Лаврик // Цитология и генетика. - 2008. - Т.42, № 1. - С. 53-57.

3. Воздействие фракции из кордовой крови крупного рогатого скота (до 5 кДа) на пролиферативную активность клеток in vitro после криоконсервации / А. К. Гулевский, А. В. Трифонова, Т. Ф. Петренко, А. А. Лаврик // "Ветеринарна медицина" : [межвідомч. тематичн. наук. зб.] - 2008. ? Вип. 89. - С. 147-153.

4. Исследование биологической активности фракции до 5 кДа из криогемолизата кордовой крови крупного рогатого скота / А. К. Гулевский, Н. Н. Моисеева, Е. С. Абакумова, И. И. Щенявский, А. Ю. Никольченко, О. Л. Долгих, А. В. Трифонова, Е. Г. Иванов // Проблемы криобиологии. - 2008. - Т. 18, № 4. - С. 531-534.

5. Гулевский А. К. Стимулирующее действие низкомолекулярной фракции из кордовой крови на адгезию и пролиферацию культуры фибробластов человека после криоконсервации / А. К. Гулевский, А. В. Трифонова, Т. Ф. Петренко // Проблемы криобиологии. - 2009. - Т. 19, № 4. - С. 395-405.

6. Гулевский А. К. Восстановление криоконсервированных культур клеток в регенерационных средах, содержащих низкомолекулярную фракцию кордовой крови / А. К. Гулевский, А. В. Трифонова, Т. Ф. Петренко, А. А. Лаврик // Биотехнология. - 2010. - Т. 3, № 1. - С. 52-57.

7. Пат. 42022 UA, МПК7 С12N 5/00. Спосіб культивування фібробластів людини / О. К. Гулевський, Г. В. Трифонова, Т. П. Петренко; заявник та патентовласник ІПКіК НАНУ. - № 200814006; заявл. 05. 12. 2008; опубл. 25. 06. 2009, Бюл. № 12.

8. Гулевский А. К. Влияние фракции менее 5 кДа криогемолизата крови молочных телят («Актовегин») на митотическую активность клеточной культуры РК-15-IECVM / А. К. Гулевский, А. В. Трифонова, А. А. Лаврик // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, №3. - С. 539.

9. Трифонова А. В. Воздействие фракции до 5 кДа крови молочных телят «Актовегин») на перевиваемые линии клеток / А. В. Трифонова, А. А. Лаврик, А. К. Гулевский // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т.17, №4. - С. 434.

10. Трифонова Г. В. Використання низькомолекулярної фракції кордової крові у біотехнології культур клітин // Конференція молодих вчених [«Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2007»]: Тези доповідей. - Київ, 2007. - С. 43.

11. Изучение свойств биологически активных веществ низкомолекулярных фракций до 5 кДа из крови крупного рогатого скота / А. К. Гулевский, Н. Н. Моисеева, И. И. Щенявский, А. Ю. Никольченко, Е. С. Абакумова, А. В. Трифонова, О. Л. Горина, Е. Г. Иванов // Научно-практическая конференция [«Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения»]: Тезисы докладов. - Новый Свет, 2009. - С. 291-292.



АНОТАЦІЯ

Трифонова Г. В. Властивості кріоконсервованих культур клітин в регенераційних середовищах, що містять низькомолекулярну фракцію з кордової крові - Рукопис.

Дисертація на здобуття ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, Харків, 2010.

Дисертаційна робота присвячена вивченню у порівняльному аспекті дії фракції до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби та препарату актовегін на ріст диплоїдної та двох перещеплюваних клітинних культур при додаванні до складу ростових середовищ, та їх здатності прискорювати відновлювальні процеси у клітинах, що були піддані кріоконсервуванню, при додаванні до складу регенераційних середовищ.

Дослідження проліферації як нативних, так і деконсервованих клітинних культур виявило значну стимулюючу дію фракції до 5 кДа з кордової крові, яка перевищувала дію актовегіну та залежала по-перше від використаної культури клітин, по-друге від концентрації, що додавалась. Встановлена здатність фракції до 5 кДа з кордової крові та актовегіну прискорювати вступ клітин до розподілу та підвищувати мітотичну активність культур, що вивчалися. Було показано покращення процесів адгезії клітинних культур та загальної морфології клітин при додаванні фракції до 5 кДа з кордової крові чи актовегіну до середовищ культивування. Додавання фракції до 5 кДа з кордової крові або актовегіну значно прискорювало розшаровування клітин як нативних культур, так і культур, які були кріоконсервовані.

Доведена доцільність створення регенераційних середовищ для клітинних культур, підданих кріоконсервуванню, де в якості активного начала застосовується фракція до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби.

Ключові слова: фракція до 5 кДа з кордової крові великої рогатої худоби, актовегін, клітинні культури, кріоконсервування, регенераційні середовища, проліферація, мітотичний режим, адгезія.



АННОТАЦИЯ

Трифонова А. В. Свойства криоконсервированных культур клеток в регенерационных средах, содержащих низкомолекулярную фракцию из кордовой крови - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2010.

Диссертационная работа посвящена изучению в сравнительном аспекте действия фракции до 5 кДа из кордовой крови крупного рогатого скота и препарата актовегин на рост диплоидной и двух перевиваемых клеточных культур при добавлении в ростовые среды, и их способности ускорять восстановительные процессы в клетках после криоконсервирования при добавлении в регенерационные среды. В задачи исследования входило: определить способность фракции до 5 кДа из кордовой крови и актовегина влиять на пролиферативные свойства различных клеточных культур при их включении в состав ростовых сред; определить способность фракции до 5 кДа из кордовой крови и актовегина восстанавливать пролиферативные свойства клеточных культур, подвергнутых криоконсервированию; изучить влияние фракции до 5 кДа из кордовой крови и актовегина на митотический режим клеточных культур до и после криоконсервирования; исследовать адгезивные свойства клеточных культур до и после криоконсервирования при добавлении фракции до 5 кДа из кордовой крови или актовегина в среду культивирования.