Методы количественного определения витамина B6

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ

ОБЛАСТНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

СРЕДНЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«УСОЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ТЕХНИКУМ»

КУРСОВАЯ РАБОТА

Методы количественного определения витамина B6

Работу выполнила:

Константинова В.В.

Руководитель: Преподаватель химии

Жилкина Е.С.

Усолье-Сибирское, 2014



Содержание

Введение

Глава 1. Общая характеристика витамина B6

1.1 Историческая справка

1.2 Место витамина B6 в современной классификации витаминов

1.3 Химическое строение и свойства витамина B6

1.4 Биологическая роль витамина B6

Глава 2. Методы количественного определения витамина B6

2.1 Колориметрические методы

2.2 Спектрофотометрические методы

2.3 Флуорометрические методы

2.4 Ферментативные методы

2.5 Микробиологические методы

2.6 Методы хроматографии и электрофореза

2.7 Методы рекомендуемые ГФ

Заключение

Список литературы



Введение

Витамин В6 -- пиридоксин. Существует несколько веществ, объединенных названием витамин B6: пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин. Они способны превращаться друг в друга, но необратимо переходят в пиридоксовую кислоту, выделяемую с мочой.

В фармакодинамике пиридоксина ведущую роль играют его влияние на функции сердечной мышцы, печени, и участие в кроветворении.

Пиридоксин оказывает кардиотонический эффект: улучшает сократительную функцию миокарда и замедляет темп. Особенно это влияние заметно в условиях хронической недостаточности сердца в результате миокардиодистрофии, декомпенсации деятельности сердца на почве клапанных пороков и т.д. Пиридоксин потенцирует также действие сердечных гликозидов.

Не менее ценны и гепатотропные эффекты пиридоксина. Он улучшает внешнесекреторную функцию печени, стимулируя не только отделение желчи, но и выход желчных пигментов, усиливает углеводную функцию и дезинтоксикационную способность. Наиболее заметно положительное влияние пиридоксина на белковообразующую функцию печени.

Пиридоксин выступает также в роли стимулятора гемопоэза. Однако эритропоэтический эффект пиридоксина проявляется только в случаях токсического поражения красного кровяного ростка. При железодефицитной и злокачественной анемии пиридоксин не проявляет лечебного действия. Более выражено влияние пиридоксина на лейкопоэз. Именно поэтому он эффективен при агранулоцитозе, а также при алейкии, отмечающейся при лучевой болезни, передозировке рентгенооблучения.

Пиридоксин показан при миокардиодистрофии и недостаточности кровообращения, при ожоговой болезни и поражении проникающей радиацией, при токсической апластической анемии и алейкии, при болезни Боткина и других формах гепатита, а также в комплексном лечении истощающих инфекций (туберкулез, бруцеллез и др.)[1].

Цель: определить наиболее подходящий метод количественного определения витамина В6.

Задачи:

1. Провести анализ научно-популярной и учебной литературы по выбранной теме;

2. Рассмотреть общую характеристику, химическое строение и свойства витамина В6;

3. Изучить биологическую роль витамина В6;

4. Изучить методы количественного определения витамина В6;

5. Обобщить результаты исследования и сформулировать выводы по работе.

Методы исследования: теоретические (анализ учебной и научно-популярной литературы по теме исследования), эмпирические (сравнение).

Теоретическая значимость: изучены общая характеристика, химическое строение, свойства витамина В6 и его биологическая роль, определено место данного витамина в общей классификации.



Глава 1. Общая характеристика витамина B6

витамин пиридоксин количественный биологический

В данной главе остановимся на рассмотрении вопросов истории изучения, классификации, химическом строении, свойствах и биологической роли витамина B6.

1.1 Историческая справка

Открытие витамина B6 связано с поисками средств лечения пеллагры - тяжелого заболевания, свирепствовавшего во многих странах до середины прошлого века.

В 1926 году Гольдбергер установил, что симптомы пеллагры у крыс, не поддающиеся лечению витаминами В1 и В2, проходят при скармливании животным дрожжей. Содержащийся в них неизвестный компонент он назвал "крысиный фактор". В 1938 году его выделили, синтезировали и назвали витамином В6, или пиридоксином. Как оказалось, к пеллагре человека он не имел отношения - виновником там служила никотиновая кислота (витамин РР). Вскоре выяснилось, что процесс переаминирования аминокислот, открытый в 1937 году нашим соотечественником, выдающимся ученым-биохимиком Александром Браунштейном, возможен лишь при участии пиридоксина. Точку в этом вопросе поставил американец Снелл Е. - выделив в 1944 году еще две разновидности этого витамина: пиридоксаль и пиридоксамин [2].



1.2 Место витамина В6 в современной классификации витаминов

Современная классификация витаминов не является совершенной. Она может быть основана на их физико-химических свойствах (в частности, растворимости) и химической природе. В зависимости от растворимости все витамины делятся на две большие группы: водорастворимые (энзимовитамины) и жирорастворимые (гормоновитамины). Это позволяет выявить в каждой из этих групп свои особенности и определить присущие им индивидуальные свойства. Водорастворимые витамины участвуют в структуре и функции ферментов, жирорастворимые витамины входят в структуру мембранных систем, обеспечивая их функциональное состояние. Помимо этих двух главных групп витаминов, различают группу разнообразных химических веществ, частично синтезирующихся в организме и обладающих витаминными свойствами. Для человека и ряда животных эти вещества принято объединять в группу - витаминоподобных ( табл. 1)[3].

Таблица 1 Общая классификация витаминов и витаминоподобных веществ

Водорастворимые витамины	Жирорастворимые витамины	Витаминоподобные соединения
Витамин С (аскорбиновая кислота)	Витамин А (ретинол) и каротин	Витамин Р (биофлавоноиды)
Витамин В1 (тиамин) Витамин В (рибофлавин)	Витамин D (кальциферолы)	Витамин U (метилметиосульфоний)
Витамин РР (никотиновая кислота, ниацин)	Витамин Е (токоферолы)	Витамин В15 (пангамовая кислота)
Витамин В6 (пиридоксин)	Витамин К	Холин
Витамин В12 (цианокобаламин)		Липоевая кислота Оротовая кислота
Витамин В9 (фолиевая кислота)		Парааминобензойная кислота
Пантотеновая кислота		Инозит
Витамин Н (биотин)		Карнитин



В основе так называемой химической классификации витаминов лежит их химическая природа. Однако витамины представляют собой сборную в химическом отношении группу органических соединений, поэтому с точки зрения химического строения им нельзя дать общего определения (см. табл. 2).

Таблица 2 Химическая классификация витаминов

Алифатические	Алициклические	Ароматические	Гетероциклические
а) производные лактонов ненасыщенных полиоксикарбоновых кислот (аскорбиновая кислота -- витамин С); б) алифатические ненасыщенные кислоты (высоконепредельные жирные кислоты по типу линолевой и линоленовой -- витамин F).	а) ретинолы (циклогексеновые соединения -- витамина A, A1 или каротиноиды, витамины группы Д).	а) нафтохиноны (витамин K1 -- филлохинон, витамин К2 -- фарнахинон).	а) хромановые (токоферолы -- витамин Е); б) фенилхромановые (биофлавоноиды -- витамин Р); в) пиридин-карбоновые (никотиновая кислота -- витамин РР); г) пиридоксиновые (пиридоксин -- витамин В6); д) пиримидинотиазовые (тиамин -- витамин B1); е) птериновые (фолиевая кислота -- витамин Вc); ж) изоаллоксазиновые (рибофлавин -- витамин В2); з) кобаламиновые (цианокобаламин -- витамин B12)

Итак, по двум приведенным классификациям витамин В6 является водорастворимым витамином, относящимся к группе витаминов гетероциклического ряда.



1.3 Химическое строение и физические свойства

Пиридоксин - белое кристаллическое вещество, хорошо растворимое в воде и спирте, устойчивое к кислотам и щелочам[4].

Структурные формулы трех форм витамина В6 (пиридоксина, пиридоксаля и пиридоксамина) следующие:

Эти соединения различаются природой заместителя у атома С-4 пиридинового ядра. Пиридоксин -- это первичный спирт, пиридоксаль -- соответствующий альдегид, а пиридоксамин -- первичный амин. Каждое их этих соединений в печени млекопитающих быстро превращается в активную форму витамина -- пиридоксальфосфат.

Синтезированы вещества, блокирующие действие пиридоксина и вызывающие симптомы авитаминоза В6. Наиболее активным из них является 4-дезоксипиридоксин, из которого in vivo образуется 4-дезоксипиридоксин-5-фосфат -- конкурентный ингибитор некоторых ферментов, содержащих пиридоксальфосфат[5].

Все формы витамина B6 растворимы в воде и этаноле, плохо - в других органических растворителях. Устойчивы к действию кислорода, а также при нагревании в 5н. H2SO4, HCl или щелочах. Легко разрушаются под воздействием света в нейтральных и щелочных средах. Под действием КМnО4 или Н2О2 пиридоксин и пиридоксамин окисляются до пиридоксаля.

Последний легко взаимодействует с различными реагентами на карбонильную группу: с аминами образует шиффовы основания (азометины), с 1,2- и 1,3-аминотиолами (напр., цистеином, гомоцистеином) - производные тиазолидина. При взаимодействии с NH2OH пиридоксаль образует оксим, гидрирование которого позволяет получить пиридоксамин[6].

1.4 Биологическая роль

Витамин В6 характеризуется исключительно широким спектром биологического действия. Он принимает участие в регуляции белкового, углеводного и липидного обмена, биосинтезе гемо- и биогенных аминов, гормонов щитовидной железы и других биологически активных соединений. Помимо каталитического действия, пиридоксальфосфат участвует в процессе активного транспорта некоторых аминокислот через клеточные мембраны, ему присуща функция регулятора конформационного состояния гликоген- фосфорилазы -- главного регулируемого фермента, осуществляющего распад гликогена[7].

1.4.1 Источники витамина В6

Таблица 3 Источники витамина В6

Растительные	Животные	Синтез в организме
Неочищенные зерна злаковых, зеленые листовые овощи, дрожжи, гречневая и пешеничная крупы, рис, бобовые, морковь, авокадо, бананы, грецкие орехи, патока, капуста, кукуруза, горчица полевая, картофель, соя. Травы: подорожник, люцерна, котовник кошачий, солома овса.	Мясо, рыба, устрицы, молоко, печень трески и крупного рогатого скота, почки, сердце, яичный желток.	Синтезируется микрофлорой кишечника.

1.4.2 Признаки гипо- и гипервитаминоза

Признаки гиповитаминоза:

· поведение - общая слабость, утомляемость, раздражительность, беспокойство, подавленность, депрессия;

· кожа - сухой себорейный дерматит, шелушение в области носогубных складок и лба, кожные высыпания, экзема, себорея и угри у подростков;

· глаза - конъюктивит;

· неврология - спастические параличи и судороги, судороги у детей до 2 лет, периферический неврит, жжение в стопах;

· ЖКТ - снижение аппетита, тошнота, рвота, гингивит, стоматит, хейлоз;

· слизистые - глоссит, некротическая ангина, кровотечения то рта и полости носа;

· у детей раннего возраста - задержка роста, желудочно-кишечные расстройства, повышенная возбудимость, эпилептоидные судороги, микроцитарная анемия.

Признаки гипервитаминоза:

· рвота;

· эрозивный гастрит[8].

1.4.3 Суточная потребность в витамине В6

Таблица 4 Рекомендуемая суточная потребность в витамине В6 в зависимости от возраста

	Грудные дети	Дети
Возраст	0 - 1/2	1/2 - 1	1 - 3	4 - 6	7 - 10
Россия	0,5	0,6	0,9	1,3	1,6

Таблица 5

	Мужчины	Женщины
Возраст	11-14	15-18	19-59	60-74	>75	11-14	15-18	19-59	60-74	>75	Беременные	Кормящие
Россия	1,8	2,0	2,0	2,2	2,2	1,6	1,6	1,8	2,0	2,0	+0,3	+0,5

Потребность в пиридоксине повышается при приеме антидепрессантов и оральных контрацептивов, во время стресса и повышенных нагрузок, а также у лиц, употребляющих алкоголь и курильщиков.

Повышенное содержание в пище белков, богатых триптофаном, метионином, цистеином, а также кишечные инфекции также повышают потребность в пиридоксине.

Повышенные дозы витамина В6 необходимы больным СПИДом, гепатитами, лучевой болезнью[9].



Глава 2. Методы количественного определения витамина В6

Определение витамина В6 в биологическом материале представляет трудности ввиду наличия нескольких форм витамина, обладающих биологической активностью, но различающихся по свойствам.

2.1 Колориметрические методы

Разработан ряд колориметрических методов определения пиридоксина и его производных, основанных на способности их образовывать окрашенные комплексы с различными соединениями. Они используются для определения витамина В6 в растворах, а также для идентификации различных форм его после разделения методами хроматографии и электрофореза на бумаге. К методам этой группы относятся, например, реакции на фенольный гидроксил.

В присутствии хлорного железа и реактива фолина витамин В6 образует окрашенные продукты. Колориметрические методы с использованием диазотированных растворов сульфаниловой кислоты, n-нитроанилина, 2,6-дихлорхинонхлоримида или n-аминоацетофенона зависят от присутствия в молекуле витамина В6 фенольного гидроксила в n-положении. Из методов этой группы наиболее широко, особенно в сочетании с хроматографией и электрофорезом, используются реакции с дихлорхинон-хлоримидом, преимущественно с пиридоксином, при которой появляется синее окрашивание (проба Гиббса).

Разработаны колориметрические методы, связанные с наличием формильной группы в положении 4 у пиридоксаля и пиридоксальфосфата. В этом случае для получения окрашенных комплексов используют ряд реактивов: м-оксипропадрин, этаноламин, тиофен, фенилгидразин.

Wada и Snell (1961) разработали количественный метод раздельного определения пиридоксаля и пирлдоксальфосфата в биологическом материале, определяя их в виде фенилгидразонов. Образование циангидрина при взаимодействии цианистого калия с формильной группой пиридоксальфосфата используют в одном из спектро-фотометрических методов его определения[10].

2.2 Спектрофотометрические методы

Известно, что все формы и производные витамина В6 имеют характерные спектры поглощения, претерпевающие сдвиги при изменениях рН и других воздействиях. По характеру спектра при различных значениях рН пиридоксальфосфат значительно отличается от других форм витамина В6. При рН 7,0 все формы витамина В6 имеют два максимума поглощения. Для каждой формы витамина B6 определены коэффициенты молярной экстинкции, позволяющие при различных значениях рН рассчитать их количественное содержание. При исследовании спектров пиридоксалевых ферментов обнаружено наличие у большинства из них максимума поглощения в области 410--430 нм, характерного для пиридоксальфосфата, связанного с NН2-группой апофермента. Изучение изменений спектров поглощения высокоочищенных препаратов различных пиридоксалевых ферментов в присутствии субстратов и ингибиторов нашло широкое применение при выяснении механизмов их действия, а также характера связи кофермента с апоферментами.

2.3 Флуорометрические методы

Флуорометрические методы определения витамина В6 основаны на измерении флюоресценции раствора непосредственно при освещении его лучами с определенной длиной волны либо после предварительного превращения витамина В6 в производное, обладающее более высокой степенью флюоресценции (например, 4-пиридоксиловая кислота и ее лактон; циангидрин пиридоксаля). Флуорометрические методы отличаются высокой чувствительностью, превышающей в 10--100 раз чувствительность колориметрических и спектрофотометрических определений. Использование спектрофлуориметров позволит точно измерять избирательное поглощение и определять максимальную интенсивность флюоресценции, что позволяет определять витамин В6 в концентрации 0,002 мкг/мл и выше. При нагревании пиридоксиловой кислоты в кислой среде происходит превращение ее в соответствующий лактон, обладающий сильной голубой флюоресценцией, по интенсивности значительно (примерно в 25 раз) превосходящей флюоресценцию кислоты[11].

2.4 Ферментативные методы

Определение коферментных форм витамина В6 ферментативными методами основано на реакции взаимодействия фосфорилированных форм витамина - пиридоксальфосфата и пиридоксаминофосфата, присутствующих в исследуемом материале, с апоферментами некоторых пиридоксалевых ферментов. В определенных интервалах скорости ферментативных реакций пропорциональны концентрации исследуемых коферментов. Впервые для определения пиридоксальфосфата в биологическом материале использован апофермент тирозиндекарбоксилазы Str. faecalis, выращенного на синтетической среде, лишенной витамина В6. Позже для этой цели был предложен апофермент триптофаназы из Е. coli, полученный в условиях, обеспечивающих максимальную диссоциацию кофермента. Наиболее чувствительным методом является определение фосфорилированных форм витамина В6. с помощью апофермента аспартаттрансаминазы, полученного из дрожжей. Этот метод позволяет определять до 0,00001 мкг/мл суммы пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата.



2.5 Микробиологические методы

При изучении биологической роли витамина В6, в частности как ростового фактора для микроорганизмов, установлено, что в нем нуждаются главным образом молочнокислые бактерии и дрожжи. Различные формы витамина В6 одними и теми же микроорганизмами используются по-разному. Это дало возможность разработать методы дифференциального микробиологического определения различных форм витамина В6, используя молочнокислые бактерии и дрожжи. Поскольку микроорганизмы в противоположность животным для роста могут использовать только свободные, не связанные с белками формы витамина В6, перед применением микробиологических методов исследуемый образец необходимо подвергать автоклавированию в кислой среде. Дрожжи Saccharomyces carlsbergensis способны использовать для роста в одинаковой степени пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин, поэтому дрожжевой метод нашел применение для количественного определения суммарного содержания витамина В6 в исследуемом материале.

2.6 Методы хроматографии и электрофореза

Известен ряд методов разделения производных витамина В6 на колонках с ионообменным смолами, а также путем хроматографии на бумаге с последующим определением в виде окрашенных комплексов или по интенсивности флюоресценции. Для определения различных форм витамина В6 предложен метод электрофореза на бумаге, разработанный для чистых растворов. Ряд авторов применили этот метод для качественного определения производных витамина В6 в моче. Попытка использовать его для количественного и дифференцированного определения витамина В6 в моче и крови встречает ряд трудностей[12].



2.7 Методы, рекомендуемые ГФ

Для количественного определения витамина В6 в препарате ГФ рекомендует два метода:

1. Метод кислотно-основного титрования в неводных средах.

2. Метод нейтрализации по связанной хлороводородной кислоте.

Метод кислотно-основного титрования в неводных средах

Около 0,15 г препарата (точная навеска) растворяют в 20 мл безводной уксусной кислоты при слабом нагревании. Раствор охлаждают, прибавляют 5 мл раствора ацетата окисной ртути и титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до появления изумрудно-зеленого окрашивания (индикатор - кристаллический фиолетовый).

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 н. раствора хлорной кислоты соответствует 0,02056 г С8H11NO3 * HCl, которого в пересчете на сухое вещество должно быть не менее 99,0%[13].

Метод нейтрализации по связанной хлороводородной кислоте

Около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 50 мл и доводят объем раствора водой до метки. К 20 мл полученного раствора прибавляют 2-3 капли раствора бромтимолового синего и титруют из микробюретки 0,1 н. раствором едкого натра до первого появления голубой окраски.

1 мл 0,1 н. раствора едкого натра соответствует 0,003545 г Cl, которого в пересчете на сухое вещество должно быть не менее 17,1% и не более 17,35%/[14].



Заключение

Оба метода количественного определения витамина В6, предложенные в Государственной Фармакопее, являются спектрофотометрическими. В результате изучения литературных источников по данной теме можно утверждать, что спектрофотометрия является самым перспективным методом анализа, который позволяет на относительно несложном оборудовании быстро и точно проводить количественный анализ веществ.

Этот метод используют на всех этапах фармацевтического анализа лекарственных препаратов (испытание подлинности, доброкачественности, количественное определение).



Список литературы

1. Витамин B6 (пиридоксин) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://hnb.com.ua/articles/s-zdorovie-vitamin_b6_piridoksin-317. - Загл. с экрана. (20.04.2014)

2. Авакумов В.М. Современное учение о витаминах / В.М. Авакумов. М. : Знание, 1971. С.214.

3. Алексенцев В.Г. Витамины и человек. М.: Дрофа, 2006. С.156.

4. Пиридоксин, полное описание [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://sportswiki.ru/%D0%92%D0%B8%D1%82%D0%B0%D0%BC%D0%B8%D0%BD_%D0%926- Загл. с экрана. (20.04.2014)

5. Спиричев В.Б. Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.1 / М.1988. С.386.

6. Биохимические свойства витамина B6 (пиридоксина) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://polyvita.ru/bioximicheskie-svojstva-vitamina-b6-piridoksina. html. - Загл. с экрана. (20.04.2014)

7. Мамонтов С. Г. Биология для поступающих в вузы / Мамонтов С.Г. / М.: Дрофа, 1994. С.480.

8. Витамин B6 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.vitamini.ru/vitamin_18.html- Загл. с экрана. (20.04.2014)

9. Теоретические и клинические аспекты науки о питании, т. 8 - Методы оценки обеспеченности населения витаминами, под ред. М.Н. Волгарева, М., 1987. С.91.

10. Витамины и методы их определения. Горький, ГГУ,1981. С.212.

11. Мелентьева Г. А. Фармхимия. М.: Медицина, 1976. С.475.

12. Мелентьева Г. А. Фармхимия. М.: Медицина, 1976. С.489.

13. Государственная фармакопея, 10 издание. М: Медицина, 1968. С.573.

14. Государственная фармакопея, 11 издание. М: Медицина, 1987. С.48.

Размещено на Allbest.ru