Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Факультет естественных наук

Кафедра ботаники и генетики

КУРСОВАЯ РАБОТА

Методы исследования вирусов

Выполнила: Евтеева Д.С

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИРУСОВ

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ВИРУСОВ

ИММУНОЭЛЕКТРОННЫЙ МЕТОД

ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Вирусы как облигатные внутриклеточные паразиты не способны расти на искусственных питательных средах. Они могут размножаться только в организмах восприимчивых хозяев или в живых чувствительных к вирусу клетках.

Организм восприимчивого хозяина для исследования вирусов используется в тех случаях, когда нет экспериментальных систем для изучения патогенеза вирусных инфекций, при тестировании безопасности вирусных вакцин или специфической безвредности вирусных препаратов. Кроме очевидных достоинств, методы имеют недостатки и ограничения, связанные с трудностями стандартизации и воспроизводимости результатов, а также из за относительно высокой стоимости экспериментов.

Культуры клеток, введенные в исследовательскую практику в 1940 х годах, кардинально изменили методический арсенал вирусоло гии.

В настоящее время культуральные методы являются основными в экспериментальной и практической вирусологии.

Методы исследования, применяемые в вирусологии отличаются значительной сложностью, что связано прежде всего с абсолютным внутриклеточным паразитизмом вирусов и их малыми размерами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИРУСОВ

Методы исследования, применяемые в вирусологии отличаются значительной сложностью, что связано прежде всего с абсолютным внутриклеточным паразитизмом вирусов и их малыми размерами.

При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы:

· Методы электронной и иммуноэлектронной микроскопии;

· Метод молекулярной гибридизации;

· Метод иммунофлюоресценции;

· Выявление антител класса lgM.

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Электронная микроскопия -- это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1--5 A).
Действие электронного микроскопа (Прил.1.рис.1) основано на использовании направленного потока электронов, который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы).

Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз. В биологии и медицине в основном используются электронные микроскопы просвечивающего типа.

Электронная микроскопия возникла в 30-х годах, когда были получены первые изображения некоторых вирусов (вируса табачной мозаики и бактериофагов). В настоящее время электронная микроскопия нашла наиболее широкое применение в цитологии, микробиологии и вирусологии, обусловив создание новых отраслей науки. При электронной микроскопии биологических объектов применяют специальные методы приготовления препаратов. Это необходимо для выявления отдельных компонентов изучаемых объектов ( вируса ), а также для сохранения их структуры в условиях высокого вакуума под пучком электронов.

При помощи электронной микроскопии изучается внешняя форма объекта, молекулярная организация его поверхности, с помощью метода ультратонких срезов исследуется внутреннее строение объекта.

Электронная микроскопия в сочетании с биохимическими, цитохимическими методами исследования, иммунофлюоресценцией, а также рентгеноструктурным анализом позволяют судить о составе и функции структурных элементов клеток и вирусов.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (105в 1 мл и выше).

Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии.

Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки.

Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

ИММУНОЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Представляет собой непосредственную визуализацию взаимодействия антигена и антител методом электронной микроскопии, была впервые предложена для вирусологических исследований Дж. Альмейда и А. Ватерсоном в 1969г.

Методически тест ИЭМ выполняется в следующей последовательности:

1. Материал, в котором предполагается наличие искомого вируса, смешивается и инкубируется со стандартной иммунной сывороткой;

2. Комплекс вирус-антитело осаждается центрифугированием в подходящих для него режимах;

3. К ресуспендированному осадку добавляется контрастирующее вещество, и полученный препарат исследуется под электронным микроскопом.

В случае положительной реакции выявляются характерные агрегаты, состоящие из вирусных частиц, соединенных между собой мостиками из антител. Порог чувствительности ИЭМ невысок: надежное выявление вируса осуществимо, когда его концентрация в исходном материале составляет 10^4 -- 10^6 частиц в мл.

Преимуществом метода является возможность оценивать не только исход серологической реакции, но и идентифицировать ее морфологический субстрат, т. е. определить форму и размер вирусных частиц. При наличии препаратов вируса с известным содержанием частиц ИЭМ может применяться и для количественного определения антител в сыворотках, для чего предложена специальная система учета интенсивности взаимодействия вируса и антител.

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях :Реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются.

Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую -- через 2--3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно. Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг.

Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген -- антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков.

Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций -- изменчивость вирусных белков.

Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков.

Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

вирус молекулярный гибридизация микроскоп

ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД

Иммунофлюоресцентный метод, или реакция иммунофлюоресценции (РИФ), используется в микробиологических лабораториях, оборудованных люминесцентным микроскопом.

В исследовании применяются прямая и непрямая реакции иммунофлюоресценции.

При использовании для диагностики прямой реакции иммунофлюоресценции на предметное стекло наносят зафиксированный этанолом клинический материал.

Затем в него добавляют люминесцентную сыворотку. Проводят осмотр препарата под люминесцентным микроскопом.

Иммунологическая реакция антиген-антитело происходит непосредственно на предметном стекле. Например, гриппозный антиген, который соединился с меченым иммуноглобулином, под микроскопом имеет вид ярких светящихся частиц, размещенных в ядре и цитоплазме зараженных клеток. Метод простой, но для его выполнения необходимы люминесцентные сыворотки к каждому типу антигенов.

Суть непрямой реакции иммунофлюоресценции заключается в том, что сначала на предметном стекле антиген связывается со специфической (немеченой) сывороткой. К образованному на стекле комплексу антиген-антитело добавляют люминесцентную сыворотку.

Конечным этапом является микроскопия, которая выявляет меченые комплексы.

При этом методе расходуется небольшое количество люминесцентных сывороток, поэтому он широко используется для выявления бактериальных, риккетсиозных, пневмоцистных инфекций.

Он позволяет легко идентифицировать вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, цитомегаловирус. Диагностику легионеллезной и хламидийной инфекции следует также производить с помощью реакции иммунофлюоресценции на определение соответствующего антигена.

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных.

Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций.

Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1) Лабораторная диагностика вирусных инфекций, Н.Н. Носик, В.М. Стаханова