Ауксотрофность микроорганизмов в твердой и питательной среде

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

1. Особенности строения клетки представителей отдела Mollicutes

2. Объясните термин ауксотрофность

3. Карбонатное дыхание как форма анаэробного дыхания прокариот

4. Микрофлора почвы и методы её оценки

5. Объясните значение термина «титр микроорганизма

1. Особенности строения клетки представителей отдела Mollicutes

Mollicutes - прокариоты без клеточной стенки, не способные синтезировать a-Е-диаминопимелиновую кислоту. В силу этого они осмотически неустойчивы и проявляют пластичность и разнообразие форм.

На твердой питательной среде эти микроорганизмы образуют колонии с плотным врастающим в агар центром и более светлой периферией, размер колоний варьирует от 50 до 500 мкм. В литературе вид этих колоний обычно сравнивают с яичницей-глазуньей ("fried-eggs"). Формы, растущие таким образом, называли PPLO (pleuropneumonia-like organisms). Поверхностную часть колонии обычно составляют более крупные, иногда вакуолизированные клетки, а центральную, более глубинную часть - мелкие, оптически более плотные клетки. На уровне световой микроскопии в окрашенном по методу Романовского-Гимзы препарате видны полиморфные клетки микоплазм: глобулы, зерна, иногда нити. Фазово-контрастная микроскопия выявляет гетерогенность популяции не только по величине, но и по оптической плотности отдельных клеток.

Микоплазмы чрезвычайно полиморфны. Форма и размеры всех микоплазм изменяются в зависимости от возраста культуры, условий и сред культивирования. По данным фильтрации и электронной микроскопии диаметр сферических клеток Mollicutes варьирует чаще всего в пределах 0,1-0,25 мкм. Некоторые виды микоплазм представлены клетками грушевидной или гантелевидной формы (например, M. pneumoniae и M. gallisepticum). С глобулярными структурами связаны нитевидные мицеллярные формы, у некоторых видов, например, M. mycoides, - ветвящиеся. Их диаметр 0,2-0,3, длина - 100-150 мкм. Способность клеток микоплазм сохранять свою форму в отсутствие клеточной стенки долгое время рассматривалась как доказательство наличия у них цитоскелета, что и было подтверждено после исследования генома M.pneumoniae. Некоторые виды микоплазм способны к движению по субстрату, но механизм этого движения до сих пор неизвестен.

Размножение микоплазм происходит путем обычного деления клеток, распада нитей на кокковидные клетки, а также процесса, сходного с почкованием. Процесс деления микоплазм в общем не отличается от такового у других бактерий. Однако надо заметить, что микоплазмы лишены клеточной стенки, хотя ей отводится важная роль в процессе деления. У микоплазм процесс деления цитоплазмы часто значительно отстает от процесса репликации генома, что приводит к появлению мультиядерных филаментов.

Структура клеток Mollicutes типична для прокариот: цитоплазматическая мембрана толщиной 10 нм с двумя электронно-плотными и внутренним электронно-прозрачным слоями, в цитоплазме - нуклеоид, диффузно распределенный в виде нитей ДНК, рибосомы, и иногда трех- и пятислойные внутрицитоплазматические мембранные структуры, функция которых окончательно не выяснена.

2. Объясните термин ауксотрофность

Ауксотрофность (греч. auxф выращивать + trophз питание) -- неспособность микроорганизмов или клеточных культур синтезировать необходимые для их роста вещества.

Ауксотрофность, в большинстве случаев, является следствием действия точечных мутаций, нарушающих экспрессию генов, ответственных за биосинтетические процессы. В результате мутанты утрачивают способность к синтезу конкретного фермента, участвующего в биосинтезе. Для роста такому организму необходимо наличие конечного продукта того пути биосинтеза, который был блокирован из-за утраты функции фермента. Кроме того, ауксотрофные мутанты способны расти не только в присутствии конечного продукта, но и промежуточных метаболитов, образующихся в результате реакций между блокированным этапом и конечным продуктом. Это важно в микробных сообществах, поскольку объясняет выживание организмов с летальными мутациями. По данным Reimers и Schmidt (2004), ауксотрофность по аргинину и лейцину у Escherichiacoli влияет на скорость синтеза мРНК и мутирования. Mariganti и Imlay (1999) выявили, что мутанты E. coli, не способные синтезировать серосодержащие, разветвленные и ароматические аминокислоты, не имеют цитоплазматической SOD и не используют несбраживаемые источники углерода. Таким образом, способность синтезировать аминокислоты является важной характеристикой и взаимосвязана с биосинтетическими, защитными, адаптационными и другими процессами.

С целью анализа ауксотрофности E. coliпо 22 аминокислотам исследовано 165 изолятов из 7 источников, отличающихся селективными и дисгенетическими факторами среды. Учитывая полигастальность и убиквитарность объекта, источниками служили водопроводная вода, поверхностные водоемы и кишечник здоровых людей (опыт), центральная часть Онежского озера (контроль). Для количественной характеристики ауксотрофности использовали полиауксотрофность (ПА) - ауксотрофность по 5 и более аминокислотам и маркер ауксотрофности (МА) - (количество аминокислот, в которых нуждается тестируемый штамм). Данные обрабатывали методами вариационной статистики и рассчитывали индексы генного разнообразия.

В эксперименте выявлены достоверные отличия эшерихий по ПА и МА, что, по-видимому, связано с источниками их изоляции. По всем аминокислотам обнаружены ауксотрофные линии по 5 и более аминокислотах, что свидетельствует о высоком проценте ПА изолятов. Выделены также варианты, нуждающиеся сразу во всех 22 аминокислотах, но их максимальное количество не превышало 16% и в среднем составляло 5%.

3. Карбонатное дыхание как форма анаэробного дыхания прокариот

Карбонатным дыханием называют анаэробное дыхание, где конечным акцептором электронов служит углекислота (или СО). Такой вид дыхания присутствует у гомоацетогенных микроорганизмов. Второй большой физиологической и систематической группой, получающей энергию с помощью карбонатного дыхания, являются образующие метан микроорганизмы, или метаногены. Это самая большая группа архей из филума Euryarchaeota, повсеместно распространенных в анаэробных местообитаниях. прокариот клеточный синтез анаэробный

Считают, что метаногены - это древнейшие организмы в истории Земли, когда атмосфера состояла из СО2, Н2 и СО. По морфологии они варьируют от простых палочек, кокков и сарцин до спиральных форм и нерегулярных коккоидов. В их клеточных стенках содержится псевдомуреин, пептиды и/или полисахариды.

Род Methandarcina - первоначально органические вещества, через ряд промежуточных этапов збраживаются до ацетата СО2 и Н. Эти продукты метаболизма первоначальных и вторичных деструкторов используются металообразующими бактериями -- строгие аэробы, т.е. кислород убивает их у них католазы и других ферментов. Основным субстратов для образования метана- ацетат. Метанобразующие бактерии последнее звено в пищевой цепи. Вначале находятся полисахариды, белки, жиры в цепи участвуют бактерии сбраживающие целюлозу до сукцита пропината, бутерата, лактата, спиртов, СО2, Н. Ацетогенные бактерии, сбраживающие эти первичные продукты брожения до ацетата, формиата, СО2 и Н а эти вещества - субстраты для метан образующих бактерий. Бактерии находятся в тесном взаимодействии с бактериями выделяемые водород. Водород, выделяемый бактериями, и в растворимой среде сразу поглащается метанобразующими видами. Известно, что высокое порциальное давление водорода подавляет метаболизм и рост многих бактерий, образующих водород. Метанобразующие бактерии способны активизировать водород и осуществлять его окисление связанные с восстановлением СО2. Этот способ существования бактерий - хемоавтотрафильный. Здесь для получения энергии СО2 используется как акцептор водорода, что ведёт к образованию метана. Метанобразующие виды характеризуются как анаэробные автотрофные виды, окисляющие водород 4Н2+СО2=СН4+2Н2О. Эта реакция сопровождается синтезом АТФ. Металобразующие бактерии синтезируют АТФ путём окислительного фосфорелирования в анаэробных условиях. Карбонатному дыханию способны ацетогенные бактерии - это анаэробные хемоавтотрофные организмы, которые окисляют водород и получают температуру с помощью корбонатного дыхания. Синтез клеточного вещества идёт через ацитил коэнзил А и пируват. При таком синтезе ацетата СО2 восстанавливается через стадию форминагеза при участии тетрагидрофолиевой кислоты дометил FH4. В дальнейшем восстановление карбоксилирование ацетилкоэнзима А приводит к образованию пирувата, из каторого синтезируются клеточные вещества. Бактерии, способные к карбонатному дыханию при росте на среде с водородом и СО2, выделяют большое количество уксусной кислоты.

Виды карбонатного дыхания

4. Микрофлора почвы и методы её оценки

Почва -- это смесь частиц органических и неорганических веществ, воды и воздуха.

Неорганические частицы почвы -- это минеральные вещества, окруженные пленкой коллоидных веществ органической или неорганической природы.

Органические частицы почвы -- остатки растительных и животных организмов, т.е. гумус. Почва обильно заселена микроорганизмами, так как в ней есть все необходимое для жизни: органические вещества, влага, защита от солнечных лучей.

В почве встречаются все формы микроорганизмов, которые есть на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие, растения.

Общее микробное число в 1 г почве может достигать 1-- 5 млрд. В 1 га почвы содержится 1 тонна живого веса бактерий, однако в разных слоях количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое почвы микроорганизмов очень мало (слой « 0,5 см). На глубине 1--2--5 см до 30-- 40 см число микроорганизмов больше всего. В этом слое ОМЧ в среднем 10--50 млн в 1 г. В относительно чистых почвах этот показатель равен 1,5--2 млн в 1 г. Глубже 30-- 40 см число микроорганизмов снижается и в более глубоких слоях их опять мало.

На численность и вещевой состав микроорганизмов влияют следующие факторы: тип, влажность, температура почвы, аэрация, адсорбционная способность почв.

В составе микрофлоры почвы принято выделять физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ.

Бактерии-аммонификаторы, являющиеся гнилостными микроорганизмами, вызывают гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины. В процессе гниения участвуют аэробные бактерии - B. Subtilis, B. Mesentericus, бактерии рода Proteus, грибы рода Aspergillus, Mucor и др.

Нитрифицирующие бактерии, которые обладают автотрофными свойствами и исключительной специфичностью. При их деятельности азотистая кислота окисляется до азотной и превращается в нитраты.

Азотфиксирующие бактерии, которые обладают исключительной способностью усваивать из воздуха атмосферный азот и в процессе жизнедеятельности образуют из молекулярного азота белки и другие органические соединения азота, которые используются растениями.

Бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожений, наблюдаемые при разложении микробами органических соединений углерода (молочно-кислое, спиртовое, масляно0кислое, уксусное, пропионовое).

Бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов - серобактерии, железобактерии, разнообразные виды которых осуществляют окисление и восстановление этих соединений в природе.

С выделениями человека и животных, с различными хозяйственно-бытовыми и промышленными отходами в почву поступает большое количество разнообразных микроорганизмов. Преобладающе флорой являются анаэробы до 96% всех видов: бифидобактерии, лактобактерии, пептококки, бактероиды; в меньшем количестве встречаются эшерихии, энтерококки, протей, клостридии и другие микроорганизмы.

Попадая в почву, представители нормальной микрофлоры тела человека и животных, а также и патогенные микроорганизмы, как правило, длительно не выживают и рано или поздно погибают. Одноко многие представители нормальной флоры человека вступают в биоценоз почвы, участвуют в ее биохимических процессах, а отдельные виды бактерий остаются постоянными обитателями почвы. На сроки выживания патогенных бактерий в почве оказывают влияние многие факторы: состав и тип почвы, температура, влажность, воздействие атмосферных осадков.

К первой группе патогенных микроорганизмов. Постоянно обитающих в почве, относится небольшое количество микроорганизмов. Среди особое внимание заслуживают клостридии ботулизма, которые попадают в почву с испражнениями человека и животных, образуя споры, остаются в ней неопределенно долго.

Вторая группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы (бациллы сибирской язвы, клостридии столбняка, газовой гангрены), которые попадают в почву с фекалиями человека и животных, а также с трупами погибших животных. Почва для них является вторичным резервуаром, поскольку при благоприятных условиях клостридии могут размножаться и сохраняться в виде спор длительное время.

В третью группу включены патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями человека и животных и сохраняющиеся в течение нескольких недель и месяцев. Все эти микроорганизмы- сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, бруцеллы, лептоспиры и др. не образуют спор и поэтому быстро гибнут в результате воздействия различных физических и биологических факторов. Особенное влияние на выживание патогенных микроорганизмов оказывают антагонистические свойства представителей микрофлоры почвы. Именно на этом свойстве микрофлоры основаны работы, направленные на повышение антибиотических свойств почвы. Простое озеленение травами территорий населенных мест, способствующее размножению бактерий-актиномицетов, улучшает антибактериальные свойства и повышает активность самоочищения почвы.

Таким образом, естественные процессы, протекающие в почве под влиянием ее микрофлоры, обусловливают самоочищение почвы от попавших в нее микроорганизмов, обезвреживание и уничтожение нечистот. При правильном управлении этими процессами опасность передачи инфекционных болезней через почву может быть сведена к минимуму.

Основная масса патогенной микрофлоры в почве постепенно отмирает, однако длительность переживания патогенной микрофлоры зависит от следующих факторов: свойств микроба, типа почв, температуры и влажности почв, микробов биоцинеозов, бактериофагов, антагонистов-сапрофитов, микроорганизмов, продуцирующих антибиотики, от токсикоза почв.

В почвах периодически появляются токсические вещества, их природа не совсем изучена, но предполагается, что это метаболиты некоторых микроорганизмов. Токсические вещества почвы губительно действуют на микроорганизмы почвы, в том числе и на полезную микрофлору.

Дизентерийная палочка при 18°С выживает в различных типах почв от 3 до 65 дней, S. typhi и paratyphi -- 19--101 день.

Споровая микрофлора сохраняется дольше, даже годами и, напротив, холерные вибрионы, палочки чумы, бруцеллеза, вирусы полиомиелита -- от нескольких часов до нескольких месяцев.

К методам определения микробиологических показателей, характеризующих фекальное загрязнение почвы, относятся следующие:

1. Определение количества бактерий группы кишечных палочек, энтерококков, энтеровирусов.

2. Определение кишечных палочек в почве титрационным методом.

3. Определение кишечных палочек в почве методом мембранных фильтров.

4. Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета кишечных палочек в почве.

5. Определение в почве общего количества бактерий,

6. Определение Clostridium perfringens в почве.

7. Определение термофильных бактерий.

8. Определение в почве нитрифицирующих бактерий.

Определение в почве бактерий.

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10) берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидких сред (Кес-слера или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида ТТХ). Посев меньших количеств (0,1 г, 0,01 гит. д.) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл тех же сред.

Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном прибавляют по 0,3 мл 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон-- по 1,5 мл. Методика с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ с трифенилформазаном, выпадающим в виде осадка и придающим среде коричневато-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры тормозится.

Посевы на среде Кесслера выращивают 48 часов при 43 °С или 37°С. Отсутствие через 48 часов газообразования и помутнения в бродильных сосудах дает окончательный отрицательный ответ на наличие бактерий группы кишечных палочек. Отрицательный ответ на лактозном бульоне с ТТХ дается через 24 часа в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился.

При наличии в сосудах со средой Кесслера газообразования и помутнения или только помутнения производят высев на среду Эндо. Чашки с посевами помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°С.

Отсутствие роста на чашках дает окончательный отрицательный ответ.

При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и причисляют к бактериям группы кишечных палочек после подтверждения ферментации глюкозы. Для этого засевают 2--3 колонии каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4--5 и 18 часов инкубации при 37°С. Если за это время в среде происходит образование кислоты и газа, то это подтверждает наличие кишечных палочек в исследуемом разведении почвы. Результаты анализа выражают коли-титром.

Определение в почве общего количества бактерий.

Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, присущих на мясопептонном агаре при 37°С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5% мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы для посева должно быть использовано не менее двух различных разведений. Берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки. Из каждого разведения посев производят минимум на 2 параллельные чашки. После в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15--20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа.

После инкубации подсчитывают выросшие колонии.

Определение в почве общего количества бактерий.

Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, растущих на мясопептонном агаре при 37 °С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5 % мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений. После тщательного перемешивания берут по 1 мл суспензии и переносят на дно двух стерильных чашек Петри. В каждую чашку вливают питательный агар в количестве 15--20 мл расплавленного и остуженного до 45°С. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После инкубации при температуре 37 °С 24 часа подсчитывают выросшие колонии.

Определение клостридиум перфрингенс в почве.

Из всех приготовленных почвенных разведений (до 1 : 1000 000) по 1 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80°С в течение 15 минут или при 90°С -- 10 минут. Затем во все пробирки наливают по 9--10 мл среды Вильсон--Блер. Инкубация посевов производится при 37° С в течение 24 часов.

Cl. perfringens образуют колонии черного цвета, в мазках -- грамположительные палочки.

Определение в почве нитрифицирующих бактерий.

Нитрифицирующие бактерии завершают цикл превращения в почве азотсодержащих соединений, окисляя аммиак до нитритов и нитратов. Поэтому численность этих микроорганизмов довольно четко указывает на степень органического загрязнения, скорости и окончания распада органики в почве.

Определение нитрификаторов.

Определение нитрификаторов можно производить посевом разведений почвенной суспензии на плотных или жидких средах. Чаще всего для этих целей применяется среда Виноградского. Для этого производят посев почвенных разведений во флаконы со средой, разлитой тонким слоем. В опыт рекомендуется включать два незараженных флакона со средой, служащей контролем на чистоту среды. Посевы инкубируют при 28°С в течение 14--15 суток.

При развитии нитрифицирующих бактерий в среде постепенно образуются азотистая и азотная кислоты. Образование окисных соединений азота рекомендуется проверять на 5--7-й день после посева и вторично на 14--15-й день. Титр нитрифицирующих бактерий чаще всего устанавливают с помощью качественной пробы с дифенилаланином; в присутствии азотистой и азотной кислот этот реактив дает синее окрашивание. Для этого пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносятся на стеклянную пластинку. Затем добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Появление синего окрашивания указывает на присутствие в среде нитратов, как результат размножения нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов не должна давать изменения окраски.

Почву всех образцов одного участка высыпали на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивали стерильным шпателем, убрали камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределили на месте ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву разделили на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбросили, а оставшуюся вновь перемешали. Перед посевом почву диспергировали, т.е. почву с соблюдением условий стерильности просеивают через сито диаметром 3 мм. При просеивании сито сверху покрывают стерильной бумагой.

Сделали навеску 1г почвы и разбавили в дистиллированной воде соотношением 1 : 4. Тщательно перемешали на механической мешалке более 30 мин. Для определения кишечных палочек в почве взяли 1 мл суспензии и перенесли на дно стерильной чашки. После чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15--20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа.

Для микроскопирования приготовили 3 мазка. Мазки зафиксировали на предметных стеклах и окрасили, используя раствор бриллиантового зеленого. Готовый мазок микроскопировали.

5. Объясните значение термина «титр микроорганизма»

Титр бактерий - максимальное разведение водной взвеси бактерий, при посеве которой наблюдается их рост. Чтобы установить титр бактерий, определённое количество исследуемого материала (почва, вода, пищевые продукты) вносят в пробирку со стерильной водой и тщательно размешивают. Затем 1 мл из первой пробирки разводят в 10 раз в следующей пробирке. Повторяя эту операцию многократно, получают дальнейшие разведения. Высевая пробы с различным разведением на элективные или дифференциально-диагностические питательные среды, предназначенные для роста определённой физиологической группы бактерий, можно получить данные о количестве в исследуемом материале гнилостных, нитрифицирующих, денитрифицирующих, целлюлозных, анаэробных и др. бактерий.

При санитарно-гигиенической оценке воды и пищевых продуктов большое значение имеет титр кишечной палочки -- так называемый коли-индекс. Коли-индекс, количественный показатель фекального загрязнения воды или пищевых продуктов. Определяется числом микробов -- нормальных обитателей кишечника человека (главным образом кишечной палочки -- Escherichia coli) в 1 л или 1 кг субстрата. Коли-индекс -- важный критерий санитарно-гигиенического контроля.

Литература

1. Гусев М.В., Минеева Л. А. Микробиология. -- М.: Изд-во МГУ, 2004.

2. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах / Й. Ленглера, Г. Древса, Г. Шлегеля. -- М.: Мир, 2005. -- ISBN ISBN 5-03-003706-3

3. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. В 3 т.. -- 3 изд.. -- М.: Мир, 2004.

4. Елинов Н.П. Химическая микробиология. М.: Высшая школа, 1989.

5. Олескин А.В., И.В. Ботвинко, Е.А. Цавкелова Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология, 2000. - Т. 69.

6. Большая советская энциклопедия. -- М.: Советская энциклопедия. 1969--1978.

7. Прозоркина Н.В., Рубашкина Л. А. П 78 Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии -- Ростов нД: Феникс, 2002.

Размещено на Allbest.ru