Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

03.00.07 - Мікробіологія

Робота виконана у відділі мікоплазмології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України

Ястребова О.В. Позаклітинна фруктозо-1,6-бісфосфатаза Bacillus subtilis 668. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07. - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена виділенню та дослідженню властивостей позаклітинної фруктозо-1,6-бісфосфатази (ФБФази) Bacillus subtilis 668.

Розроблено спосіб очищення цього ферменту за допомогою фракціонування сульфатом амонію її препаратів з культуральної рідини, та гідрофобної та субстратзалежної хроматографії . Встановлено вплив джерел вуглецю і температури на динаміку накопичення і активність ферменту. Здійснена очистка у 165 разів до гомогенного стану та отримано ферментний препарат позаклітинної ФБФази з активністю 52,9 од/мг білку.

Досліджені фізико-хімічні та молекулярні властивості, кінетичні параметри взаємодії позаклітинної ФБФази з субстратом з метою класифікувати фермент. Встановлено, що позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 відноситься до "лужних" фосфатаз, активність якої залежить від двохвалентних катіонів металів та регулюється АМФ і ФЕП. Позаклітинна ФБФаза - тетраметр, з молекулярною масою субодиниці 630000 Да. Чутливість ФБФази В. subtilis 668 до дії АМФ, ФЕП, двовалентних і моновалентних катіонів, розміру субодиниці та інших факторів дали підставу віднести її до ІІІ класу ФБФаз.

Встановлено серологічну спорідненість між позаклітинними ФБФазами B. subtilis 668 та молікута Achоlерlasma laidlawii var. granulum шт. 118, що підтверджує філогенетичні зв"язки цих мікроорганізмів. Показано, що позаклітинна і клітинна ФБФази B. subtilis 668 серологічно ідентичні.

Виявлено цитотоксичну активність in vitro позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 відносно пухлинних клітин саркоми 37. Даний ферментний препарат знімає пухлиноасоційовані антигени з поверні клітини.

Ключові слова: фруктозо-1,6-бісфосфатаза, хроматографічні та фізико-хімічні властивості, каталітична активність, дія активаторів, цитотоксична активність, серологічна спорідненість, Bacillus subtilis.

Ястребова Е.В. Внеклеточная фруктозо-1,6-бисфосфатаза Bacillus subtilis 668. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07.- микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена выделению и изучению свойств ферментного препарата внеклеточной фруктозо-1,6-бисфосфатазы (ФБФази) Bacillus subtilis 668.

Было изучено влияние источников углерода и температуры на динамику накопления и активность внеклеточного фермента. Выделено внеклеточную ФБФазу В. subtilis 668 с активностью 52,9 ед/мг и очищенной в 165 раз. Разработанный метод очистки фермента состоит из последовательных этапов фракционирования и осаждения белков из культуральной жидкости с помощью (NH₄)₂SO₄, гидрофобной хроматографии на колонке с Toyopearl TSK HW-60, десальтации на колонке с Sephadex G-10 и субстратзависимой хроматографии на колонке с CM-Sephadex.

Были изучены физико-химические и молекулярные свойства, кинетические параметры взаимодействия внеклеточной ФБФазы с субстратом с целью классифицировать фермент. Установлено, що внеклеточная ФБФаза В. subtilis 668 относиться к "щелочным" фосфатазам; интервал значений температур, при которых проявляется наибольшая активность ФБФазы, находится в пределах 45-50⁰С. Максимум активности фермента наблюдали при концентрации субстрата (фруктозоди-фосфата) 2х 10^-3М. Активность внеклеточной ФБФазы абсолютно зависима от двухвалентных катионов Mg²⁺ или Mn²⁺. При этом на активность ФБФазы в большей степени влияли катионы Mg²⁺ чем Mn²⁺, активность также регулируется АМФ и ФЕП. Цинк в зависимости от рН и присутствия катионов Mg²⁺ по-разному влиял на активность внеклеточной ФБФази. При низких концентрациях катионов Zn²⁺ (2,0-4,0 мМ) наблюдается активация фермента в щелочном рН среды. В отсутствии катионов Mg²⁺ при этом же рН цинк ингибирует активность ФБФазы B. subtilis 668. При низких концентрациях в кислом рН катионы цинка проявляют себя как активаторы. Но в этих же условиях в присутствии катионов магния цинк выступает как ингибитор. В присутствии катионов Mg²⁺ и ЕДТА, цинк увеличивает активность внеклеточного фермента почти в 2 раза при кислом рН. При концентрации 10^-4 М катионы тяжелых металлов не ингибиторовали активность ФБФазы в присутствии катионов Mg²⁺. Установлено, что моновалентные катионы только в низких концентрациях являются незначительными еффекторами внеклеточной ФБФазы.

Из-за чувствительности внеклеточной ФБФазы В. subtilis 668 к АМФ, ФЕП, двухвалентным и одновалентным катионам металлов, а также размера субъединицы она отнесена к ІІІ классу ФБФаз.

Фермент представляет собой тетрамер. Молекулярная масса субъединицы, определенная методом электрофореза в ПААГ с DS-Na, составляет 63000 Да. При гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-200 молекулярная масса составляет 230000±5000 Да.

Серологические свойства внеклеточных ФБФаз B. subtilis 668 и молликута Achоlерlasma laidlawii var. granulum шт. 118 были изучены в сравнительном аспекте с помощью реакции двойной диффузии в геле по Оухтерлони. Установлено, що в серологическом отношении их внеклеточные ферменты представлены гомологичными молекулами, состоящими из двух антигенов, один из которых является подобным для этих микроорганизмов, а второй проявляет частичную идентичность. На это указывает то, что в антисыворотках к этим ферментам есть антитела как к общим детерминантам антигенов, которые сравниваются, так и к детерминанте, отсутствующей у каждого из них. Исходя из результатов сделан взвод, что внеклеточная ФБФаза B. subtilis 668 серологически родственна, но не идентична внеклеточной ФБФазе Achоlерlasma laidlawii var. granulum шт. 118. Внеклеточная и клеточная ФБФазы B. subtilis 668 не имеют серологических отличий.

Установлено, что внеклеточная ФБФаза B.subtіlіs 668 проявляет іn vіtro цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам саркомы 37. Показано, что данный ферментый препарат снимает опухольассоциированные антигены с поверхности опухолевых клеткок.

Ключевые слова: фруктозо-1,6-бисфосфатаза, хроматографические и физико-химические свойства, каталитическая активность, влияние активаторов, цитотоксическая активность, серологическое родство, Bacillus subtilis.

Yastrebova O.V. Extracellular fructose bisphosphatase of Bacillus subtilis 668. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree in biology speciality 03.00.07. - microbiology. - The Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

Candidat's thesis is focused on the isolation and investigation the properties of extracellular fructose bisphosphatase (FBFase) of Bacillus subtilis 668.

The purification method of this enzyme by means of hydrophobic and substratspecific chromatography from cultural liquid with 40% satiation of (NH₄)₂SO₄ was elaborated. Influence carbon sources and temperature on accumulate dynamics and enzyme activity was studied. Extracellular FBPase was purified about 165-fold to homogeneous state and specific activity of enzyme preparation were 52,9 un/mg of protein.

Physico-chemically and molecular properties, kinetic characteristic interaction of extracellular FBPase with substrate in order for clasificated enzyme was investigated. It was established that extracellular FBPase of B. subtilis 668 is related to the group of the "alkaline" of these enzymes. The extracellular FBPase is dependent of bivalent cations (Mg²⁺, Mn²⁺), was regulated AMP and PEP. Extracellular FBPase are a tetramer with molecular weight of subunit equal to 63 kDa. Sensitivity of extracellular FBPase of B. subtіlіs 668 to influence AMP, PEP, bivalent and monovalent cations, subunit size and another factors for reasons given refer to a class III FBFases.

Was established serologically related between of extracellular FBFase of B. subtіlіs 668 and mollicut Achоlерlasma laidlawii var. granulum st. 118, what confirm genetical relation of this microorganisms. Extracellular and intracellular FBFases of B. subtіlіs 668 serologically identical was shown.

The extracellular FBPase of B. subtіlіs 668 shows citotoxicity activity in relation to tumors cells of as the sarcoma 37 іn vіtro. It is shown that the preparations remove TA antigenes from a surface of a tumors cell.

Key words: fructose bisphosphatase, chromatographical and physical-chemically properties, catalytic activity, effect of activators, serological affinity, citotoxity activity, Bacillus subtilis.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Фруктозо-1,6-бісфосфатаза (ФБФаза) є одним із чотирьох головних ферментів глюконеогенезу, що каталізують незворотні реакції (Choe et al., 2005). Глюконеогенез - це процес синтезу глюкози із не вуглеводних попередників. Регуляція глюконеогенезу в клітині відбувається шляхом контролю хімічних реакцій, що його складають. А контроль за окремими реакціями процесу - специфічними для них факторами. В регуляції глюконеогенезу, як і будь-якого іншого метаболічного процесу, вирішальна роль належить ключовим ферментам і зміна кількості цих ферментів (шляхом синтезу або деградації) чи зміна їх внутрішньоклітинної активності в значній мірі визначає швидкість процесів обміну (Erion, 2005). На сьогоднішній день багато робіт присвячено дослідженню властивостей внутрішньоклітинних ФБФаз тварин, рослин, комах, мікроорганізмів. Звертаючи увагу на існуючі результати при дослідженні беззаперечно важливої ролі внутрішньоклітинного ферменту в метаболічній активності організмів, визначенні взаємозв'язку молекулярної структури ферменту і властивостей, до нинішнього часу залишалася не виявленою і не вивченою саме позаклітинна ФБФаза: не встановлена її наявність, не відомо класифікаційне положення, не вивчені фізико-хімічні та біологічні властивості. За даними літератури, лише для одного представника класу Mollicutes - Achоlерlasma laidlawii var. granulum шт. 118 охарактеризовано позаклітинну ФБФазу (Скрипаль та співав., 2004-2006). Бактерії роду Bacillus вважаються філогенетичними попередниками молікутів (Woose, 1987; Kunst, 1997; Скрипаль, 2000). В зв'язку з цим виникає особлива зацікавленість до існування і властивостей означеного позаклітинного ферменту у бацил. Тому особливо важливо дослідити наявність і молекулярні механізми дії позаклітинного ферменту, механізми структурно-функціональних відносин між позаклітинним ферментом і субстратом, які визначають ефективність і специфічність ферментативних реакцій. Проведення зазначених досліджень дозволить розширити уявлення про складні метаболічні шляхи, які є основою життєзабезпечення і регуляції функцій мікробного організму. Велике теоретичне значення має встановлення спорідненості між позаклітинними ФБФазами бацил і молікутів. Відомо, що перехресні реакції, які засновані на філогенетичній спорідненості, можуть бути використані як один з підходів в класифікації різних видів мікроорганізмів додатково із загальноприйнятими методами таксономії. Встановлення філогенетичної спорідненості між бацилами і молікутами на фізіолого - біохімічному і серологічному рівнях буде сприяти не лише розв'язанню питання походження означених груп мікроорганізмів, а й допоможе більш повно розкрити їх еволюційні зв'язки.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно плану наукових робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України м. Київ (ІМВ) за темою № 14/64 "Фруктозо-1,6-бісфосфатаза молікутів та їх філогенетичних предків - спороносних бактерій (порівняльне вивчення)", номер держреєстрації 0101U003060 (2001-2005 pр.), що виконувалась за постановою Бюро ВББЕКФ НАН України, протокол № 12 від 20.11.2000 р.

Матеріали і методи досліджень

Об'єкт дослідження: Bacillus subtilis 668 ІМВ, депонований в Депозитарії ІМВ НАН України за № В-7014. Культивування B. subtilis 668 здійснювали періодичним способом на качалках (220 об/хв) в колбах Ерленмейєра з робочим об'ємом 100 мл. Температура культивування становила 37^оС. Культуру бацили вирощували на рідкому мінеральному середовищі такого складу: 0,48 г/л сульфат магнію; 0,00453 г/л сульфат марганцю; 0,00912 г/л сульфат заліза (ІІ-го валентного); 0,4023 г/л хлориду калію; 1,7374 г/л фосфорнокислого калію; 0,5088 г/л цитрату калію; 0,0625 г/л хлориду амонію; рН середовища 6,9 (Fujita, Freese, 1970). Крім того клітини вирощували на рідкому середовищі Гаузе такого складу, г/л: бульон Хоттінгера - 30,0 мл; пептон - 5,0; NaCl - 5,0; рН середовища 6,0; до якого як біостимулятор додавали 1% автолізату харчових дріжджів, виготовленого в лабораторних умовах. Дослідні середовища вміщували як джерело вуглецю (1% до об'єму) гліцерин, галактозу, мальтозу, глюкозу. Матеріалом для посіву слугувала 21-но годинна, культура вирощена на МПА. Інокулюм, що вміщував 5·10⁹ клітин на 1 мл, вносили в середовище в кількості 1% від об'єму. Культуральну рідину звільняли від клітин за допомогою центрифугування при 8000 g протягом 10 хв і використовували для одержання позаклітинної ФБФази. Бактеріальна біомаса, осаджена при центрифугуванні, була використана для одержання клітинного ферменту.

Процес виділення ферменту складався із основних 5 етапів: одержання культуральної рідини, фракціонування білків за допомогою (NH₄)₂SO₄, гідрофобної хроматографії на колонці з Тоyopearl TSK HW-60, знесолення препаратів ферменту на колонці із Sephadex G-10, субстратзалежної хроматографії на колонці із СМ-Sephadex.

Визначення білку на всіх стадіях виділення і очистки проводили за методом Бредфорда (Bradford, 1976).

Визначення активності ФБФази на всіх етапах її очистки визначали за методом Фіске-Суббароу по швидкості накопичення неорганічного фосфору (Ф_н) при рН 8,6 і 30⁰С (Fiske, Subbarow, 1925; Лурьє, 1985). Кількість утвореного неорганічного фосфору встановлювали за допомогою мікроколориметру МКМФ-1 при D₆₁₀ нм (Калинин, 1971). Реакційна суміш (2 мл) вміщувала 0,05 М Тріс-НСl-буфер, рН 8.6, 0,01 мМ ЕДТА, 0,2 мМ фруктозо-1,6-бісфосфату, 2 мМ MgCl₂ і 20-50 мкл ферментного препарату (35-50 мкг білку). За одиницю активності вважали таку кількість ферменту, що забезпечувала звільнення 1,0 мкМ Ф_н за 1хв при 30⁰С в умовах досліду.

Питому активність виражали кількістю одиниць ФБФази на 1 мкг білку.

Чистоту виділених препаратів позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 та її молекулярну масу в денатуруючих умовах визначали за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі з 0,1% додецилсульфату натрію за методикою Laemmli (Laemmli, 1970). Визначення молекулярної маси ферменту в нативних умовах здійснювали за допомогою його гель-фільтрації на колонці з наповнювачем Sephadex G-200 ("Pharmacia", Швеція).

рН-оптимум дії позаклітинної ФБФази B.subtilis 668 визначали при різних значеннях рН від 5,5 до 10,5 в Тріс-буфері (Калинин, 1971).

Залежність активності позаклітинної ФБФази від температури проводили при рН 8,5, в діапазоні температур від 25^о С до 100^о С протягом 15 хвилин.

Максимальну швидкість гідролізу і константу Міхаеліса (К_m) визначали, використовуючи рівняння Міхаеліса-Ментен в зворотніх координатах Лайнуівера-Берка (Кретович, 1986).

Вплив ефекторів (інгібіторів та активаторів) на активність позаклітинної ФБФази визначали в діапазоні концентрацій реагентів від 0,1 мМ до 50 мМ в реакційній суміші при рН 8,5. За контроль був результат реакції без внесення в реагуючу суміш того чи іншого ефектора.

Серологічні властивості клітинної і позаклітинної ФБФаз B.subtilis 668 вивчали методом подвійної імунодифузії в агарі за Ouchterlony (Ouchterlony, 1958).

Вивчення цитотоксичної активності позаклітинної ФБФази проводили на базі Інституту експериментальної патології, онкології і радіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України, м. Київ. Цитотоксичну активність позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 по відношенню до пухлинних клітин вивчали на пухлинних клітинах саркоми 37 in vitro (Takasuki, 1970). Контролем слугували здорові клітини селезінки, на які ФБФаза не проявляла цитолітичну дію. Цитотоксичну активність препаратів оцінювали в камері Горяєва за здатністю загиблих клітин фарбуватися вітальним барвником - 1%-ним розчином трипанового синього.

Електрофорез білків пухлинних клітин до та після обробки позаклітинною ФБФазою B. subtilis 668 проводили за Laemmli (Laemmli, 1970).

Статистичну обробку результатів проводили, використовуючи t - критерій Стьюдента, рівень вірогідності становив 95%. Графічні результати, а також розрахунок кінетичних характеристик ферменту проводили, використовуючи комп'ютерні програми - прикладний пакет Microsoft Excel 2000 та MatCad 2000.

Результати досліджень та їх обговорення

Відомо, що до зовнішніх факторів, які впливають на біосинтетичну активність бактерій відносяться склад поживного середовища, природа і концентрація джерел вуглецю, а також фізико-хімічні умови (температура, час культивування тощо). Для визначення умов, за яких клітинами B. subtilis 668 в середовищі культивування інтенсивно накопичується ФБФаза, були використані мінеральне середовище (Fujita, Freese, 1970) і середовище Гаузе з різними джерелами вуглецю (галактозою, глюкозою, мальтозою, гліцерином).

Нами встановлено, що найбільша кількість позаклітинної ФБФази продукується клітинами досліджуваного штаму бацили при вирощуванні їх на середовищі Гаузе з 1% гліцерину. Тому в подальших дослідженнях ми використовували середовище Гаузе з 1% гліцерину, так як на цьому середовищі спостерігається найбільший вихід позаклітинної ФБФази з максимальною активністю.

Після встановлення факту наявності ФБФази в середовищі культивування, ми приступили до вивчення динаміки накопичення ферменту в культуральній рідині. Знання динаміки накопичення ФБФази дає нам можливість визначення того оптимального часу культивування бацил, при якому утворюється максимальна кількість ферменту.

Нами виявлено, що активність позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 збільшувалась паралельно накопиченню біомаси. Максимальне накопичення ферменту спостерігали у фазі уповільнення росту культури (21 год росту) на середовищі Гаузе з 1% гліцерину як джерела вуглецю.

Відхилення температури культивування від оптимального значення (37^оС), як правило негативно впливало на біосинтетичну активність B. subtilis 668.

Вирощування клітин досліджуваного штаму при супраоптимальній температурі (42^оС) дещо знижувало рівень активності ізольованого ферменту ФБФази. При субоптимальній температурі (30^оС) теж спостерігали зниження активності ферменту, але ще в більшій мірі. Температура 37⁰С для досліджуваного представника роду Bacillus являлась оптимальною як для росту, так і для біосинтезу позаклітинної ФБФази.

Умови виділення та очищення позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 ми вибирали на основі результатів експериментальної перевірки описаних в літературі методів отримання клітинного ферменту ФБФази B. subtilis (Fujita, Freese, 1970). Але за основу була взята методика виділення позаклітинної ФБФази Acholeplasma laidlawii var. granulum шт. 118 (Скрипаль та співав., 2004), яку адаптували в процесі виконання цієї роботи для виділення позаклітинного ферменту B. subtilis 668 - на всіх хроматографічних етапах очищення для елюції ферментного препарату з колонок ми застосовували Na-малонатний буфер (рН 5,8), оскільки використання забуференого фізіологічного розчину при елюції ферментного препарату з колонки з Toyoperl TSK HW-60 ("TOYO SODA", Японія), на наш погляд, перешкоджало визначенню активності ферменту.

Одним з перших етапів виділення ферменту було фракціонування білків культуральної рідини B. subtilis 668 за допомогою (NH₄)₂SO₄ (СА). В культуральну рідину вносили СА до концентрації 1,6 М (40 % насичення), витримували 6-8 год при температурі +4⁰С. Було встановлено, що в осад при цьому, випадали білки, що не мали ФБФазної активності. Від цих білків звільнялися центрифугуванням при 15000 g протягом 20 хв. Надосадову рідину наносили на колонку з Toyoperl TSK HW-60, попередньо урівноважену Na-малонатним буфером з 40 % СА. Колонку відмивали цим же буфером до зникнення слідів білку на її виході. Елюцію проводили градієнтно знижуючи концентрацію СА в буфері. При хроматографії на Toyoperl TSK HW-60 найвища активність ФБФази спостерігалась в 9-11 фракціях в діапазоні концентрації 0,8-0,9 М СА. Активні фракції, що елюювали в діапазоні концентрації сульфату амонію 0,8-0,9 М, об'єднували. Фермент з них осаджували СА до 70% насичення. Осад, отриманий після центрифугування, розчиняли в мінімальному об'ємі (до 3 мл) Na-малонатного буферу, рН 5,8 і наносили тонким шаром (до 1 мм) на колонку з Sephadex G-10 ("Pharmacia", Швеція). Найбільша активність обезсоленого ферменту була виявлена в 6-8 фракціях, які об'єднували, наносили на колонку, заповнену СМ-Sephadex ("Pharmacia", Швеція). Основний пул ФБФази звільнявся з колонки, коли концентрація субстрату (фруктозодифосфату) в елююючому буфері була 0,2 мМ. Виявилось, що фермент з високим ступенем активності і чистоти знаходився лише в трьох фракціях.

Для визначення чистоти і молекулярної маси позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 в нативних умовах як молекулярне сито був використаний Sephadex G-200 ("Pharmacia", Швеція). Встановлено, що молекулярна маса такого ферменту складала 230000 ± 5000 Да.

За допомогою електрофорезу очищеної позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 в 10 %-ному поліакріламідному гелі (ПААГ) в денатуруючих умовах (денатуруючим фактором був 0,1 % додецилсульфат натрію) виявлено одну чітку білкову лінію, що свідчить про те, що фермент очищений до гомогенного стану і складається з чотирьох ідентичних субодиниць з молекулярною масою субодиниці 63000±500 Да (табл.1.)

Таблиця 1. Електрофоретична рухливість (R_f) маркерних білків та позаклітинної фруктозо-1,6-бісфосфатази B. subtilis 668 і їх молекулярні маси

Дослідження властивостей позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 показали, що активність ферменту в найбільшій мірі проявляються при рН 9,0. За цією ознакою досліджуваний фермент був віднесений нами до групи "лужних" ферментів. Встановлений оптимум рН позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 не змінювався при визначенні його як в Тріс-, так і в гліциновому буферах. При дослідженні стабільності ферменту в залежності від рН середовища ми визначили, що активність ферменту практично не змінюється протягом 3-х год при оптимальних значеннях рН (9,0). Більш ніж 40 % активності зберігається при нейтральних значеннях рН протягом 1 години.

Інтервал значень температур, при якій проявляється найбільша активність позаклітинної ФБФази, складає 45-50⁰ С. Показано також, що позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 при температурі 45⁰ С була стабільна протягом 1 год, а через 2 год втрачала вже 47 % від максимальної активності. При збереженні ферменту при температурі -4⁰ С він не втрачав активності протягом 30 діб.

Позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 гідролізує фруктозо-1,6-дифосфат. Інгібуюча концентрація субстрату (20,0 мМ) значно перевищує концентрації, за яких виявляється максимальна активність ферменту (2,0 мM). Проте при наявності катіонів Mg^2+, хелатуючого агента ЕДТА і рН 8,0 - 8,5, інгібування субстратом активності зменшувалось майже вдвічі.

Константу Міхаеліса вирахували шляхом апроксимації експериментальних величин лінійною функцією у зворотних координатах Лайнуївера-Берка. К_m для позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 становить 3,8•10^-3 М.

Залежність активності позаклітинного ферменту від концентрації деяких хімічних реагентів і металів наведені в табл.2. Так, катіони Mg²⁺ являються більш значними активаторами ферментативної активності, ніж катіони Mn²⁺ . Наявність Mg²⁺ в реакційній суміші в діапазоні концентрацій від 2,0 мМ до 20,0 мМ підвищувала активність ферменту на 40%. Катіони Mn²⁺ в концентрації 5,0 мМ підвищували активність лише на 15%. Не виявлено впливу на активність позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 таких катіонів як Ca²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺.

Таблиця 2. Вплив деяких хімічних реагентів на ФБФазну активність ферментного препарату B. subtilis 668

Zn²⁺ в залежності від рН та наявності іонів Mg²⁺ по-різному впливав на активність ФБФази. При низьких концентраціях іонів Zn²⁺ (2,0-4,0 мМ) ми спостерігали активацію ферменту при лужному рН середовища. За відсутності катіонів Mg²⁺ цинк виступав як інгібітор позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 при цьому ж рН. При низьких концентраціях в кислому рН катіони цинку проявляють себе активаторами активності позаклітинної ФБФази. Але в тих же умовах в присутності катіонів магнію цинк проявляє себе як інгібітор. Цікаво, що в присутності Mg²⁺ і ЕДТА, Zn²⁺ збільшує активність ферменту майже в 2 рази в кислому рН порівняно з дослідами при лужному рН.

Моновалентні катіони Tl⁺, Na⁺, K⁺ i NH⁺₄ виявилися незначними активаторами активності позаклітинної ФБФази при низьких концентраціях, а при високих - вони виступали як інгібітори. Так, K⁺ підвищував ферментативну активність ФБФази B. subtilis 668 на 13% при концентрації катіонів 1 мМ, а при подальшому збільшенні концентрації катіону в реагуючій суміші дія його як активатора помітно зменшувалась. Найбільше зростання активності ФБФази (до 20%) спостерігали під впливом NH₄⁺ при концентрації його 0,01 мМ. Li⁺ в концентрації 1,0 мМ на 4% інгібував активність ферменту, а при концентрації 5,0 мМ - майже на 10%.

Аденозинмонофосфат (АМФ) в концентрації 0,2 мМ інгібував активність ферменту на 46%. Внесення ж в реакційну суміш фосфоенолпірувату (ФЕП) в тих же кількісних співвідношеннях, "знімало" інгібуючу дію АМФ. Катіони магнію в концентрації 5,0-7,0 мМ знижували чутливість позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 до АМФ.

Гістидин і цитрат (в концентрації 1,0-2,5 мМ) активували позаклітинну ФБФазу В. subtilis 668 на 4-8 %, при цьому не спостерігали зміни оптимуму рН. ЕДТА має інгібуючий вплив на активність позаклітинної ФБФази В. subtilis 668. Так, в концентрації 0,1 мМ ЕДТА інгібував позаклітинну ФБФазу на 44%, а в концентрації 1мМ - на 28%.

Отже, найкращими активаторами активності позаклітинної ФБФази виступають катіони магнію, амонію і натрію, а інгібіторами - ЕДТА, катіони цинку і літію.

Відомо, що перехресні реакції, які грунтуються на філогенетичній спорідненості можуть бути використані додатково до загальноприйнятих методів таксономії як один з підходів в класифікації різних видів мікроорганізмів. З цією метою ми вивчили серологічну спорідненість двох різних за походженням позаклітинних ферментів - молікутів і бацил, оскільки бактерії роду Bacillus вважаються філогенетичними предками молікутів, в тому числі і роду Acholeplasla (Woose, 1980, 1987; Weisburg, 1989; Скрипаль, 2000).

Реакція преципітації в гелі за методом подвійної дифузії за Оухтерлоні виявила антигенну ідентичність досліджуваних препаратів клітинної та позаклітинної ФБФаз B. subtilis 668.

Те, що позаклітинна і клітинна ФБФази цього мікроорганізму є одним і тим же ферментом, свідчить також їх однакове реагування з антисироваткою до ФБФази Acholeplasma laidlawii var. granulum шт. 118.

Встановлено, що позаклітинні ФБФази Acholeplasma laidlawii var. granulum шт. 118 і B. subtilis 668 подібні, але неідентичні, оскільки, крім спільних для них антигенів, вони мають також індивідуальні антигени для кожного з них.

Так, на підставі одержаних результатів ми зробили висновок, що позаклітинна і клітинна ФБФази B. subtilis 668 є одним і тим же ферментом. Позаклітинні ФБФази B. subtilis 668 і Acholeplasma laidlawii var. granulum шт. 118 є філогенетично спорідненими на що вказує наявність у них спільних антигенів, що є полідетермінантними, а антисироватки до них, відповідно - поліклональними

Оскільки, позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 має молекулярну масу рівну молекулярній масі речовин з цитотоксичною активністю, що продукуються B. subtilis АБ 56 (Потебня та співавт., 1999, 2002; Диденко та співавт., 2003), нам цікаво було перевірити, чи проявляє позаклітинна ФБФаза B. subtilis 668 цитоксичну дію на пухлинні клітини саркоми 37. При цьому було встановлено, що препарат позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 проявляє активну цитолітичну дію при співвідношенні 30 мкг препарату на 10⁶ пухлинних клітин саркоми 37.

На представленій електрофореграмі і денситограмах видно, що після інкубації клітин саркоми 37 протягом однієї години з позаклітинною ФБФазою, з пухлинних клітин "знімається" комплекс антигенів з молекулярними масами від 4 до 80 кДа, які переходять в розчин. Точку відшарування антигенів добре видно на елекрофореграмі під номером 4.

Дослідження процесу цитолітичної дії на клітини саркоми 37 позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 в динаміці показало, що протягом першої години дії ФБФази, відбувається збільшення пухлинної клітини у розмірі.

Вакуолізація цитоплазми, розсмоктування ядерця та майже у всіх клітин спостерігається вип'ячування мембрани (мішкоподібні утвори). Протягом наступних 30 хв спостерігається подальший процес фрагментації цитоплазми клітин саркоми 37 з утворенням апоптичних тілець та загибель пухлинних клітин. Під кінець другої години дії препаратів відбувається розрив оболонки пухлинної клітини з виходом її вмісту в зовнішнє середовище.

Таким чином, позаклітинна ФБФаза у представників роду Bacillus може бути одним з чинників, що згубно діє на злоякісні клітини.

Висновки

1. Вперше у представника спороносних бактерій - Bacillus subtilis 668 виявлено здатність продукувати у середовище культивування фермент, класифікований як фруктозо-1,6-бісфосфатаза.

2. Позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 очищена у 165 разів до гомогенного стану і має питому активністю 52,9 од/мг білку.

3. Встановлено, що позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 має молекулярну масу 230000±5000 Да в нативному стані і є тетраметром, що складається з рівноцінних субодиниць з молекулярною масою 63 000 Да.

4. Показано, що позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 має високу афінність і специфічність до субстрату, що доведено за допомогою субстратзалежної елюції. Її активність залежить від наявності двовалентних катіонів та регулюється фосфоенолпіруватом та АМФ.

5. Чутливість ФБФази В. subtilis 668 до дії АМФ, ФЕП, двовалентних і моновалентних катіонів, молекулярна вага дали підставу віднести її до ІІІ класу ФБФаз. Вона віднесена до групи "лужних" ФБФаз.

6. Визначено, що за серологічними, фізико-хімічними і молекулярними властивостями позаклітинна ФБФаза В. subtilis 668 є подібною тій, що функціонує в клітині, забезпечуючи основні етапи гліколізу і глюконеогенезу.

7. Порівняльним вивченням серологічних властивостей встановлено, що ФБФази В. subtilis 668 і його філогенетичного нащадка молікута A. laidlawii var. granulum шт. 118 подібні, але не ідентичні, що вказує на зміну фенотипових ознак цих мікроорганізмів в процесі еволюції.

8. Вперше встановлено цитотоксичну активність in vitro позаклітинної ФБФази B. subtilis 668 відносно клітин саркоми 37. Її препарати знімають пухлиноасоційовані антигени з поверхні клітини.

9. Запропонований метод одержання препаратів позаклітинної ФБФази В. subtilis 668 створює можливість її біотехнологічного напрацювання в необхідних кількостях для наукових цілей, відпрацювання способів регуляції її активності у людей хворих на діабет ІІ-типу, та вирішення проблем злоякісного росту клітин.

Список робіт, опублікованих за темою дисертаціЇ

1. Панченко Л.П., Ястребова О.В., Скрипаль І.Г. Позаклітинна фруктозобісфосфатаза Вacillus subtilis: виділення та очищення // Допов. нац. акад. наук Укр. - 2006.- № 6 - с.171 - 174. (Здобувачем особисто проведено виділення і очистка препарату ферменту з культурального фільтрату, підготовлено матеріали статті до друку).

2. Yastrebova O.V., Panchenko L.P., Korobkova K.S., Skripal' I.G. Extracellular fructose bisphosphatase of Bacillus subtilis: purification and some properties // Наук. вісн. Ужгород. універ., сер. Біологія.-2006. - вип. 18. - стор. 187-191. (Здобувачем особисто проведено виділення і очистка препарату ферменту з середовища культивування, досліджено вплив деяких інгібіторів і активаторів на ферментативну активність позаклітинної фруктозо-1,6-бісфосфатази Bacillus subtilis, проаналізовано отримані результати, підготовлено матеріали статті до друку).

3. Ястребова О.В., Панченко Л.П., Коробкова К.С., Скрипаль І.Г. Молекулярні та імунологічні властивості позаклітинної фруктозо-1,6-бісфосфатази Bacillus subtilis // Наук. вісник Чернівец. універ. - 2006. - вип. 297. - стор.143-149. (Здобувач безпосередньо приймав участь у плануванні експерименту, та обробляв отримані дані, досліджено деякі імунологічні властивості позаклітинного ферменту, встановлено молекулярні властивості в нативних і денатурованих умовах).

4. Скрипаль І. Г., Малиновська Л.П., Токовенко І.П., Ястребова О.В.,Панченко Л.П. Порівняльне вивчення фруктозобісфосфатаз Bacillus subtilis та збудника блідо-зеленої карликовості зернових культур в реакції подвійної дифузії в гелі за Оухтерлоні // Мікробіол. журн. - 2007. - т. 69, № 2. - с. 9-15. (Здобувач безпосередньо приймав участь у плануванні експерименту, проводив вакцинацію тварин, особисто проводив реакції подвійної дифузії в гелі за Оухтерлоні).

5. Діденко Г.В., Дворщенко О.С., Ястребова О.В., Потебня М.Г., Панченко Л.П., Скрипаль І.Г. Протипухлинні властивості позаклітинної фруктозо-1,6- бісфосфатази Bacillus subtilis 668 та препарату, виділеного з культуральної рідини B. subtilis В 7025 // Мікробіол. журн. - 2007. - т. 69, № 3. - с.68-73. (Здобувачем особисто проведено визначення цитотоксичної активності препаратів позаклітинної ФБФази, підготовлено матеріали статті до друку).

6. Скрипаль І. Г., Ястребова О.В. Фруктозо-бісфосфатаза мікроорганізмів // Мікробіол. журн. - 2002. - 64, № 2. - С.84-104.

7. Ястребова О.В. Особливості функціонування у мікроорганізмів фруктозо-1,6-бісфосфатази - головного ферменту глюконеогенезу // Укр. біохім. журн.- 2002.- 74, № 4.- С.24 - 32.

8. Ястребова О.В., Панченко Л.П., Скрипаль І.Г. Молекулярно-біологічні властивості позаклітинної фруктозо-1,6-бісфосфатази Bacillus subtilis // Тези. Конференція молодих учених "Сучасні проблеми фізіології рослин та біотехнології", 1-3 грудня 2005р, Ужгород. - Наук. вісн. Ужгород. універ. - 2005. - с. 135.

9. Ястребова Е.В., Панченко Л.П. Характеристика внеклеточной фруктозобисфосфатазы Bacillus subtilis // Тезисы. 9-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", 18-22 апреля 2005 г., Пущино. - Сб. тезисов. - с. 106

10. Yastrebova O.V., Panchenko L.P., Skripal I.G. Extracellular fructose bisphosphatase of Bacillus subtilis: purification and some properties // 5^th Parnas conference "Molecular mechanisms of cellular signaling", 26 - 29 april 2005, Kyiv. - Укр. біохім. журн. - 2005. - т. 77. - с. 152.

11. И.Г. Скрипаль, Е.С. Коробкова, Л.П. Панченко, Л.П. Малиновская, И.П. Токовенко, Е.В. Ястребова. Внеклеточная фруктозобисфосфатаза моликутов и спороносных бактерий как маркер их филогенетического родства // Материалы научной конференции, посвященной 35-летию со дня организации РУП "Институт защиты растений" НАН Беларуси / 28 февраля - 2 марта 2006 г, Минск. - Сб. научн. трудов. - 2006. - вып. 30, ч. 1. " Стратегия и тактика защиты растений". - стр. 47-52.

12. Панченко Л.П., Ястребова О.В., Коробкова К.С.,Скрипаль І.Г. Вплив окремих ефекторів на ферментативну активність позаклітинної фруктозо-1,6-бісфосфатази Bacillus subtilis 668 // Матеріали ІХ Українського біохімічного з"їзду, 24 - 27 жовтня 2006р., Харків. - с. 159-160.

13. Ястребова Е.В., Диденко Г.В., Дворщенко Г.С. Цитотоксическая активность внеклеточных фруктозо-1,6-бисфосфатазы Bacillus subtilis 668 и гликопротеида B. subtilis В 7025 // International conference of young researchers IV edition (Chiєinоv, November 10, 2006.) - Chiєinоv, Moldova, - 2006, - с. 58.

14. Tokovenko I.P., Skripal I.G., Jastrebova E.V., Malinovskaja L.P., Panchenko L.P. Comparative studing fructosebisphosphatases of the Bacillus subtilis 668 and the activator pale-green dwarf grain crops in reaction of double diffusion in gel by Ouchterlony // International conference of young researchers IV edition (Chiєinоv, November 10, 2006.) - Chiєinоv, Moldova, - 2006, - с. 60.

Размещено на Allbest.ru