Методы генетической инженерии в аквакультуре

Размещено на http://www.allbest.ru/

11

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ

Федеральное государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет (ДАЛЬРЫБВТУЗ)

Институт рыболовства и аквакультуры

Кафедра «Водные биоресурсы и аквакультура»

РЕФЕРАТ

Тема: «Методы генетической инженерии в аквакультуре»

Владивосток 2014 г

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ - ИНСТРУМЕНТ БИОТЕХНОЛОГИЙ

Отечественный и мировой опыт показывает, что научно-технический прогресс в любой отрасли определяется наличием «пионерных» проектов, разработка и реализация которых осуществляется в государственных научно-производственных центрах. Успешное развитие аквакультуры во многом определяется эффективным научным обеспечением функционирования всего комплекса разведения, выращивания, вылова и переработки рыбы и других гидробионтов. К сожалению, многие научно-технические проблемы остались нерешенными до настоящего времени. К ним, в частности, относятся:

v разработка методов реконструкции ихтиофауны водоемов в направлении повышения их продуктивности и хозяйственной ценности;

v введение в аквакультуру новых высокопродуктивных видов рыб и других гидробионтов;

v разработка и совершенствование биотехнологий культивирования рыб, моллюсков и ракообразных, адаптированных к морской среде прибрежных вод России;

v разработка методов повышения качества и безопасности продукции, произведенной в аквакультуре;

v выведение новых и совершенствование существующих пород, а также формирование ремонтно-маточных стад рыб с использованием целевой селекции на базе молекулярно-генетических методов;

v разработка методов обнаружения, профилактики и лечения заболеваний рыб в условиях интенсивного выращивания на основе достижений генной инженерии.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология. Поэтому, на мой взгляд, наиболее подходит следующие определение этого направления исследований: Генетическая инженерия (генная инженерия) -- совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы[17].

В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК ; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в реципиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования[5] .

Обычно используют два термина -- генетическая и генная инженерия. Первый из них используется в более широком смысле, т.е. в него входит и понятие генной инженерии. При этом к последней не относятся перестройки генома обычными генетическими методами (мутациями и рекомбинациями).

Известно, что генетический материал всех живых организмов сосредоточен в молекулах ДНК. Все клетки организма имеют идентичные копии таких молекул. Поэтому основой проведения генно-инженерных исследований является именно молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты. Классический подход подразумевает использование генетических методов, позволяющих судить о функции генов, анализируя фенотипы мутантных организмов и их потомства. Этот подход по-прежнему эффективен, но в последнее время он дополнен набором методов, которые в сумме известны как "технология рекомбинантных ДНК"[9,18]. Эти методы существенно расширили возможности генетических исследований, поскольку с их помощью удается проводить как прямой контроль, так и детальный химический анализ генетического материала. Используя методологию рекомбинантных ДНК, удается даже минорные клеточные белки получать в больших количествах и, следовательно, проводить тонкие биохимические исследования структуры и функции белка. Технология рекомбинантных ДНК включает в себя набор методов - как новых, так и заимствованных из других дисциплин, например из генетики микроорганизмов. Наиболее важные среди них это:

v специфическое расщепление ДНК рестрщирующими нуклеазами, что существенно ускоряет выделение и манипуляции с различными генами;

v быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

v гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большой точностью и чувствительностью на основании их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

v генетическая инженерия, посредством которой последовательности ДНК изменяют с целью создания модифицированных версий генов, которые затем вновь внедряют в клетки или организмы.

Рассмотрим основные генно-инженерные подходы, которые могут быть использованы в аквакультуре. Итак, основой проведения генноинженерных исследований является и молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты. При этом придерживаются такой последовательности: сначала выделяют гены из отдельных клеток или синтезируют их вне организма, потом включают новые гены в вектор (молекула ДНК, имеющая собственный аппарат репликации и способная поставлять в клетку необходимые гены и реплицировать их), соединяют ДНК гена и вектора и получают рекомбинантную ДНК; затем переносят определенные гены в геном хозяина, проводят их клонирование в составе вектора и получают генный продукт путем экспрессии чужеродного гена в реципиентной клетке[10].

Известны два способа выделения генов и создания рекомбинантной ДНК. Первый -- с помощью химического синтеза, второй, более распространенный, с помощью особых ферментов (рестриктаз), которые имеют способность распознавать чужеродную ДНК, проникающую в организм и расщеплять ее в соответствующих участках. В результате создаются фрагменты разнообразных размеров подлине. Известны более 500 рестриктаз и каждая специфически расщепляет ДНК. Они лишены всякой видовой специфичности. Благодаря этому можно объединять в одно целое фрагменты ДНК любого происхождения и преодолевать природные видовые барьеры[18].

Части и разрывы нитей ДНК склеивают с помощью фермента лигазы. Особенностью выделенных генов (нуклеотидов) являются так называемые липкие концы, которыми их можно присоединить к участкам фагов (для животных). Таким образом создается вектор для переноса выделенных генов в клетку-реципиент. Необходимо заметить, что наличие и даже введение гена в хромосому организма-хозяина еще не дает возможность получать продукты его синтеза. Для того, чтобы ген мог функционировать, он должен наряду с участком, где закодирована информация, иметь еще регуляторный участок. Эти участки называются, соответственно, промотором и терминатором. С промотора начинается считывание информации (транскрипция), а в терминаторе закодировано окончание транскрипции сданного гена. Создан целый арсенал клонированных промоторов, которые дают возможность обеспечить проявление генов в разных типах клеток[11,18].

Первый банк генов был создан для кишечной палочки, потом для других, в том числе и для рыб. Также были сформированы библиотеки клонов ДНК гипофиза и гормона роста.

Первыми генно-модифицированными (ГМ) рыбами стали радужная форель Oncorhynchus mykiss и серебряный карась Carassius auratus gibelio [11,15]. В настоящее время таких видов более 30, причем ГМО-группа включает как модельные организмы, так и объекты товарного выращивания [14,16].

Известны трансгенная семга Salmo salar, кижуч Oncorhynshus kisutch, чавыча O. tschawytscha, лосось Кларка O. сlarkii сlarkii, тиляпии (нильская Oreochromis niloticus и мозамбикская O. mossambicus), медака (рисовая рыбка) Oryzias latipes, карп Cyprinus carpio, канальный сомик Ictalurus punctatus, африканский сомик Clarias gariepinus, мешкожаберный сом Heteropneustes fossilis, караси -- серебряный (золотая рыбка) и его подвид Carassius auratus grandoculis, а также золотой C. carassius, светлоперый (желтый) судак Sander vitreus, обыкновенная щука Esox lucius, амурский сом Parasilurus asotus, вьюны (обыкновенный Misgurnus fossilis и амурский M. anguillicaudatus), дорада Sparus aurata, красный пагр (красный морской карась) Pagrus major, лещ черный Melanobrama amblycephala, данио (дамский чулочек) Brachydanio rerio. В России исследования по введению ГМО в аквакультуру выполняются с представителями пяти видов. Получена рекомбинантная конструкция, обеспечивающая сайт-специфическую интеграцию гена зеленого флюоресцирующего белка (GFP), с помощью которой можно маркировать породы рыб [13,14,16].

Большая часть (65 %) ГМ рыб, используемых в этих экспериментах, представляют собой ценные объекты пресноводной (радужная форель, тиляпия, карп и др.) и морской (семга, чавыча) аквакультуры [4,7 ]. Декоративные виды удобны как модельные формы в исследованиях структурно-функциональных изменений генома при встраивании генных конструкций (трансгенов), что необходимо для дальнейшего эффективного применения биотехнологических методов в промышленном рыбоводстве . В коммерческой аквариумистике под торговой маркой GloFish уже используется трансгенная рыбка данио, флюоресцирующая зеленым, красным или оранжевым цветом [16,18]. Таблица1.

В экспериментальной аквакультуре в основном применяются генные конструкции (кассеты), обеспечивающие ускорение роста (ген гормона роста -- ГР) или устойчивость организма к неблагоприятным условиям (ген антифризного белка -- АФБ) (табл. 1) [7, 12, 13, 15]. В числе первых была разработана векторная конструкция для введения в геном карпа гена ГР белого толстолобика Hypophthalmichthys molitrix под контролем промотора гена металлотионеина радужной форели и NOS-терминатора (терминатор нопалинсинтетазы Agrobacterium tumephaciens) [7,16]. При внедрении в геном конструкций с геном ГР зарегистрировано 11-30-кратное увеличение скорости роста у трансгенного лосося [7,11]. К 2012 году более 10 лабораторий из разных стран заявили об успешном создании быстрорастущих рыб нескольких видов [7].

МЕТОДЫ ПРОТИВОДЕЙСТВИЯ ВИДАМ-ИНВАЙДЕРАМ

Управление численностью чужеродных видов является сложной, но важной задачей в комплексе мер по сохранению биологического разнообразия природных экосистем из-за значительного потенциального экономического и экологического ущерба от вселенцев. Человек не только проводит массовую акклиматизацию определённых растений и животных, но и вызывает случайные интродукции «попутных» видов (перенос дрейссены судами, случайные интродукции рыб при акклиматизации объектов аквакультуры). Также вследствие деятельности человека изменяются условия среды, в результате чего создаются условия для увеличения ареала некоторых видов (пример - экспансия черноморско-каспийской тюльки после строительства каскада водохранилищ на Волге [3]. В США более 40% нативных видов находятся под неблагоприятным воздействием интродуцентов [1,7,11]. Около половины рыб ихтиофауны Австралии связаны своим происхождением и изменением ареала с деятельностью человека, а ущерб от интродуцентов биоразнообразию и экономике этой страны не менее серьёзен, чем в США [4,11]. Генетические особенности видов-инвайдеров обеспечивают им малую чувствительность к инбридингу и быструю адаптацию к изменению условий обитания [11,12].

Особую озабоченность у экологов вызывает возможность побегов из садков генетически модифицированных рыб. Для контроля за распространением трансгенных организмов было предложено включать в их геном дополнительный ген, блокирующий размножение или раннее развитие организма таким образом, чтобы блокировку можно было снять только искусственно, в условиях рыбоводного хозяйства. С целью реализации этой программы была получена радужная форель, в геном которой был включён ген, кодирующий последовательность РНК, комплементарную информационной РНК гонадотропин-рилизинг гормона (то есть, искусственно синтезированный ген, кодирующий антисмысловую РНК). [ 8,11]По замыслу исследователей, взаимодействие смысловой и антисмысловой РНК должно было приводить к отсутствию в клетках свободной РНК-матрицы для синтеза гонадотропин-рилизинг гормона, а при отсутствии данного гормона созревание рыб становится невозможным. Однако эксперимент показал, что научные знания, касающиеся процесса регуляции созревания у рыб пока ещё неполны. Хотя включённый в геном ген экспрессировался, удалось добиться лишь незначительного нарушения процесса созревания экспериментальных рыб. Более удачны были аналогичные опыты с тиляпией (Oreochromis niloticus) и карпом (Cyprinus carpio), но и в них не удалось добиться полной стерильности трансгенных особей [1,3,11].

Крайне перспективный, но ещё практически не опробованный метод подавления популяций чужеродных рыб - метод нарушения полового состава популяции путём внедрения особей, несущих «троянскую» Y-хромосому. По этой технологии в водоёмы, заселённые чужеродными видами, вселяют рыб с двумя Y-хромосомами, но фенотипических самок. Изменение пола обеспечивается обработкой икринок синтетическими эстрогенами, например DES - диэтилстильбэстролом [4,8,12].

В настоящее время идентифицирован гаплотип митохондриальной ДНК атлантического лосося, носители которого устойчивы к паразиту Gyrodactylus salaris [4,7,12]. Стоит отметить также, что современные биотехнологии позволяют достаточно легко вводить чужеродные митохондрии в икринки рыб. Таким образом, с целью защиты атлантического лосося от паразита может оказаться целесообразным трансплантировать митохондрии рыб, устойчивых к гиродактилёзу, в икринки рыб из популяций, подвергшихся заражению [1,5,12]. Этот способ привлекателен тем, что позволяет сохранить практически весь набор генетических адаптаций, уже имеющихся в популяции, и добавить к ним новую адаптацию. Однако следует иметь в виду, что в данном случае идёт речь о создании трансгенного организма.

ВЫВОДЫ

Для мировой аквакультуры характерно постоянное расширение производства. В индустриальных условиях основные хозяйственно ценные признаки животных -- жизнестойкость, скорость роста, усвояемость и стоимость кормов, нормальное развитие и функционирование репродуктивной системы, болезнеустойчивость, однако при традиционной селекции желаемые качества у рыб (как и у других видов животных и растений) проявляются медленно. Прогресс в этой области связывают с высокоэффективными методами генной инженерии (или биотехнологии), появившимися относительно недавно. Интеграция трансгенной конструкции позволяет получать уникальные варианты генома, которых раньше у вида не существовало. Создаваемые таким образом генно-модифицированные объекты (ГМО) способны синтезировать определенные вещества, характерные для других видов микроорганизмов, растений, животных.

Приходится с сожалением констатировать, что генетические методы борьбы с чужеродными видами в настоящее время ещё недостаточно развиты, а многие из них не вышли из стадии теоретических разработок и экспериментов. Инженеры- генетики нацелены на изменение генофонда хозяйственно-ценных организмов.

Экологи и специалисты по природоохранной генетике фиксируют распространение чужеродных видов и изменение генофонда природных популяций. Необходимо соединение усилий этих направлений и создание нового вектора в науке, использующего те же методы, что традиционная селекция и генетическая инженерия, но нацеленной не на изменение, а на сохранение природного генофонда.

геном рыба продуктивность ихтиофауна водоем

ЛИТЕРАТУРА

1.Абрамова Н.Б., Буракова Т.А., Корж В.П., Нейфах А.А. Инъекция митохондрий в ооциты и оплодотворенные яйца // Онтогенез.1979. Т. 10. № 4. С. 401-404.

2.Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях: 3-е изд., перераб. и доп. М.: ИКЦ «Академкнига», 2003. 431 c.

3.Артамонова В.С., Махров А.А. Неконтролируемые генетические процессы в искусственно поддерживаемых популяциях: доказательство ведущей роли отбора в эволюции // Генетика. 2006. Т. 42. № 3. С. 310-324.

4.Артамонова В.С., Махров А.А., Шульман Б.С., Хаймина О.В., Лайус

Д.Л., Юрцева А.О., Широков В.А., Щуров И.Л. Реакция популяции атлантического лосося (Salmo salar L.) реки Кереть на инвазию паразита

Gyrodactylus salaris Malmberg // Российский журнал биологических

инвазий. 2011. № 1. С. 2-14.

5.Барминцев В.А., Шан Л., Рекубратский А.В., Дума Л.В., Зиновьева Н., Хонг Ю., Шартл М., Брэм Г., Эрнст Л.К. Получение трансгенных карпов (Cyprinus carpio L.) методом микроинъекций растворов конструкции ptMTa-scGH, содержащей ген гормона роста белого толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix), в бластодиск оплодотворённых in vitro яйцеклеток. Сб. науч. тр. ВНИИПРХ (Дмитров) «Вопросы генетики, селекции и племенного дела в рыбоводстве», 2000, т. 76: 5-26.

6.Доклад об основных результатах научных рыбохозяйственных исследований в 2013 году. М., 2014: 347-351.

7.Заславский В.А. Экологические последствия генетического взаимодействи популяций // Журнал общей биологии. 1967. Т. 28. № 1. С. 3-11.

8.Картавцев Ю.Ф. Молекулярная эволюция и популяционная генетика. Учебное пособие. ДВГУ, Владивосток, 2005. 236 с.

9.Маслев Н. Н. Регулирование и эксплуатации трансгенов в рыбе. Наука. Ред., 1998, 399: 255-256

10.Микодина Е.В. Генетически модифицированные организмы (ГМО) и биологическая безопасность рыб в аквакультуре. Мат. II Межд. науч.-практ. конф. «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». М., 2008: 167-170.

11.Махров А.А., Карабанов Д.П. , Кодухова Ю.В. Генетические методы борьбы с чужеродными видами. // Российский журнал биологических инвазий. 2014. № 2. С. 110-125.

12.Орлова М.И. Биологическая инвазия - горнило для эволюции? //Экологическая генетика. 2011. Т. 9. № 3.С. 33-46.

13.Beaumont A.R., Hoare K. Biotechnology and genetics in fisheries and aquaculture. Blackwell Sciеnсе Ltd, 1998

14.Melamed P., Gong Z., Fletcher G., H e w C.L. The potential impact of modern biotechnology on fish aquaculture. Aquaculture, 2002, 204: 255-269

15.Pandian T.J. Guidelines for research and utilization of genetically modified fish. Cur. Sci., 2001, 81(9): 1172-1178

16.https://ru.wikipedia.org/wiki/Генетическая_инженерия

17.http://vitawater.ru/aqua/papers/gm-fish2.shtml

Размещено на Allbest.ru