Иммобилизация и стабилизация ферментов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГБОУ ВПО МЗ РФ «Сибирский государственный медицинский университет»

Кафедра фармацевтической технологии

Курсовая работа

Иммобилизация и стабилизация ферментов

Выполнил: студент 6 курса

С. В. Ящук

Проверил: доцент

В. В. Шейкин

Томск 2014

Содержание

Введение

1. История изучения ферментов

2. Функции ферментов

3. Классификация ферментов

4. Иммобилизация ферментов

5. Методы иммобилизации ферментов

6. Ферментные электроды

7. Применение ферментных электродов

8. Стабилизация ферментов

Заключение

Список использованной литературы

Введение

В последние годы в клинической медицине достигнуты определенные успехи в лечении ряда заболеваний внутренних органов, внедряются новые методы терапии в ревматологии, гинекологии, урологии, ангиологии, травматологии и др. При этом продолжается поиск таких препаратов, которые были бы высокоэффективными при лечении больных с различными заболеваниями, обладали малым спектром побочных эффектов и легко переносились при длительном приеме.

Весьма перспективной в решении данной проблемы является системная энзимотерапия. Внедренная в клиническую практику за рубежом более 25 лет тому назад М. Вольфом и К. Рансбергером, она показала свою эффективность при лечении и профилактике многих заболеваний. В последнее время в нашей стране она начинает приобретать все большую известность. В настоящее время накоплен опыт отечественных ученых в использовании системной энзимотерапии и в ревматологии (при ревматоидном артрите, ювенильном ревматоидном артрите, системной красной волчанке, системных васкулитах и др.), в сосудистой хирургии (для лечения тромбофлебитов, перифлебитов, атеросклеротическом поражении сосудов и др.), в гинекологии и урологии (при урогенитальных хламидиозах, хронических аднекситах и др.), травматологии и ортопедии (в лечении травм, переломов костей, эндопротезировании тазобедренных суставов и др.), спортивной медицине (при спортивных травмах и др.).

Метод системной энзимотерапии основан на кооперативном терапевтическом воздействии целенаправленно составленных смесей гидролитических ферментов растительного и животного происхождения. Благодаря влиянию на ключевые патофизиологические процессы в организме, препараты системной энзимотерапии обладают противовоспалительным, противоотечным, фибринолитическим иммуномодулирующим и вторично анальгезирующим действием.

Кроме того, назначение энзимных препаратов приводит к снижению активности воспалительных процессов и модуляции физиологических защитных реакций организма.

При непосредственном участии гидролитических ферментов уменьшается инфильтрация интерстициального пространства белками плазмы и увеличивается элиминация белкового детрита и депозитов фибрина в области воспаления. Это обеспечивает улучшение микроциркуляции в зоне повреждения и уменьшение локального отека. Благодаря комплексному воздействию на отдельные компоненты иммунопатологических процессов посредством влияния на клеточный (субполяции Т-лимфоцитов, лимфокины) и гуморальный (В-лимфоциты, иммуноглобулины) иммунитет, способности расщеплять циркулирующие в крови и фиксированные в тканях иммунные комплексы, оказывать регулирующее влияние на компоненты комплемента и адгезивные молекулы, а также выраженному противовоспалительному эффекту и улучшению реологических свойств крови энзимы широко используются в лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Доказана способность энзимных препаратов повышать локальную концентрацию антибиотиков в тканях, а также улучшать переносимость полихимиотерапии при онкопатологии.

Многочисленные клинические испытания показали, что энзимные препараты удовлетворяют всеобщему терапевтическому принципу: надежность и высокая эффективность при общей хорошей переносимости, что и определяет их широкий спектр клинического использования.

1. История изучения ферментов

Более ста лет назад термины «фермент» и «энзим» отражали различные точки зрения в теоретическом споре Л. Пастера с одной стороны, и М. Бертло и Ю. Либиха - с другой, о природе спиртового брожения. Собственно ферментами (от лат. fermentum - закваска) называли «организованные ферменты» (то есть сами живые микроорганизмы), а термин «энзим» (от греч. ?н- - в- и жэмз - дрожжи, закваска) предложен в 1876 году В. Кюне для «неорганизованных ферментов», секретируемых клетками, например, в желудок (пепсин) или кишечник (трипсин, амилаза). Через два года после смерти Л. Пастера в 1897 году Э. Бухнер опубликовал работу «Спиртовое брожение без дрожжевых клеток», в которой экспериментально показал, что бесклеточный дрожжевой сок осуществляет спиртовое брожение так же, как и неразрушенные дрожжевые клетки. В 1907 году за эту работу он был удостоен Нобелевской премии. Впервые высокоочищенный кристаллический фермент (уреаза) был выделен в 1926 году Дж. Самнером. В течение последующих 10 лет было выделено ещё несколько ферментов, и белковая природа ферментов была окончательно доказана.

Ферментные белки, обладая малостойкой структурой, весьма чувствительны к изменениям рН и температуры. Для каждого фермента существует оптимум значения рН, при котором скорость катализируемой реакции максимальна. Так, активность трипсина имеет оптимум при значении рН 7,8; панкреатической амилазы - при рН 6,4-7,2. Отклонение значения рН в ту или иную сторону ведет к снижению скорости ферментативной реакции. Ферменты, оптимальное значение которых находится в нейтральной или щелочной средах, полностью инактивируются кислым содержимым желудка.

Оптимальное значение температуры для большинства ферментов - 20-40°С. Повышение температуры до 40-50°С, как правило, приводит к падению ферментативной активности, а иногда и к полной денатурации ферментов.

При производстве ферментных препаратов наряду с применением высокоэффективных научно обоснованных способов получения особенно необходима высокая культура производства, строгое соблюдение режимов технологии. Большое внимание уделяется стабилизации ферментов, как на стадии получения субстанции, так и в лекарственной форме. В настоящее время используют три основных приема стабилизации:

- защита лабильных центров ферментов, ответственность за их активность, химической модификацией (в том числе иммобилизацией);

- защита от воздействия инактивирующих факторов нанесением оболочки;

- введением в субстанцию или лекарственную форму добавок, ингибирующих деструкцию ферментов.

Термин «фермент» предложен в XVII веке химиком ван Гельмонтом при обсуждении механизмов пищеварения.

В конце XVIII - начале XIX вв. уже было известно, что мясо переваривается желудочным соком, а крахмал превращается в сахар под действием слюны. Однако механизм этих явлений был неизвестен.

В XIX в. Луи Пастер, изучая превращение углеводов в этиловый спирт под действием дрожжей, пришёл к выводу, что этот процесс брожения катализируется некой жизненной силой, находящейся в дрожжевых клетках.

2. Функции ферментов

Ферменты присутствуют во всех живых клетках и способствуют превращению одних веществ (субстратов) в другие (продукты). Ферменты выступают в роли катализаторов практически во всех биохимических реакциях, протекающих в живых организмах. К настоящему времени было описано более 5000 разных ферментов. Они играют важнейшую роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ организма.

Подобно всем катализаторам, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакцию, понижая энергию активации процесса. Химическое равновесие при этом не смещается ни в прямую, ни в обратную сторону. Отличительной особенностью ферментов по сравнению с небелковыми катализаторами является их высокая специфичность - константа связывания некоторых субстратов с белком может достигать 10^?10 моль/л и менее. Каждая молекула фермента способна выполнять от нескольких тысяч до нескольких миллионов «операций» в секунду.

Например, одна молекула фермента ренина, содержащегося в слизистой оболочке желудка телёнка, створаживает около 10⁶ молекул казеиногена молока за 10 мин при температуре 37 °C.

При этом эффективность ферментов значительно выше эффективности небелковых катализаторов - ферменты ускоряют реакцию в миллионы и миллиарды раз, небелковые катализаторы - в сотни и тысячи раз.

3. Классификация ферментов

По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов согласно иерархической классификации. Классификация была предложена Международным союзом биохимии и молекулярной биологии. Каждый класс содержит подклассы, так что фермент описывается совокупностью четырёх чисел, разделённых точками. Например, пепсин имеет название ЕС 3.4.23.1. Первое число грубо описывает механизм реакции, катализируемой ферментом.

· Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа.

· Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ.

· Гидролазы, катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза.

· Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов.

· Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.

· Лигазы, катализирующие образование химических связей между субстратами за счёт гидролиза АТФ. Пример: ДНК-полимераза.

Будучи катализаторами, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакции, поэтому, например, лиазы способны катализировать и обратную реакцию - присоединение по двойным связям.

Специфичность ферментов.

Ферменты обычно проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам (субстратная специфичность). Это достигается частичной комплементарностью формы, распределения зарядов и гидрофобных областей на молекуле субстрата и в центре связывания субстрата на ферменте. Ферменты обычно демонстрируют также высокий уровень стереоспецифичности (образуют в качестве продукта только один из возможных стереоизомеров или используют в качестве субстрата только один стереоизомер), региоселективности (образуют или разрывают химическую связь только в одном из возможных положений субстрата) и хемоселективности (катализируют только одну химическую реакцию из нескольких возможных для данных условий). Несмотря на общий высокий уровень специфичности, степень субстратной и реакционной специфичности ферментов может быть различной. Например, трипсин эндопептидаза разрывает пептидную связь только после аргинина или лизина, если за ними не следует пролин, а пепсин гораздо менее специфичен и может разрывать пептидную связь, следующую за многими аминокислотами.

Модель «ключ-замок»

В 1890 г. Эмиль Фишер предположил, что специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата. Такое предположение называется моделью «ключ-замок». Фермент соединяется с субстратом с образованием короткоживущего фермент-субстратного комплекса. Однако, хотя эта модель объясняет высокую специфичность ферментов, она не объясняет явления стабилизации переходного состояния, которое наблюдается на практике.

Регуляция работы ферментов.

У некоторых ферментов есть места связывания малых молекул, они могут быть субстратами или продуктами метаболического пути, в который входит фермент. Они уменьшают или увеличивают активность фермента, что создает возможность для обратной связи.

Влияние условий среды на активность ферментов.

Активность ферментов зависит от условий в клетке или организме - давления, кислотности среды, температуры, концентрации растворённых солей (ионной силы раствора) и др.

Медицинское значение.

Связь между ферментами и наследственными болезнями обмена веществ была впервые установлена А. Гэрродом в 1910-е гг. Гэррод назвал заболевания, связанные с дефектами ферментов, «врожденными ошибками метаболизма». фермент оксидоредуктаза иммобилизация лиаза

Если происходит мутация в гене, кодирующем определенный фермент, может измениться аминокислотная последовательность фермента. При этом в результате большинства мутаций его каталитическая активность снижается или полностью пропадает. Если организм получает два таких мутантных гена (по одному от каждого из родителей), в организме перестает идти химическая реакция, которую катализирует данный фермент. Например, появление альбиносов связано с прекращением выработки фермента тирозиназы, отвечающего за одну из стадий синтеза темного пигмента меланина. Фенилкетонурия связана с пониженной или отсутствующей активностью фермента фенилаланин-4-гидроксилазы в печени.

В настоящее время известны сотни наследственных заболеваний, связанные с дефектами ферментов. Разработаны методы лечения и профилактики многих из таких болезней.

Болезни, связанные с нарушением выработки ферментов.

Отсутствие или снижение активности какого-либо фермента (нередко и избыточная активность) у человека приводит к развитию заболеваний (энзимопатий) или гибели организма. Например, передаваемое по наследству заболевание детей - галактоземия (приводит к умственной отсталости) - развивается вследствие нарушения синтеза фермента, ответственного за превращение галактозы в легко усваиваемую глюкозу. Причиной другого наследственного заболевания - фенилкетонурии, сопровождающегося расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности синтезировать фермент, катализирующий превращение аминокислоты фенилаланина в тирозин. Определение активности многих ферментов в крови, моче, спинномозговой, семенной и других жидкостях организма используется для диагностики ряда заболеваний. С помощью такого анализа сыворотки крови возможно обнаружение на ранней стадии инфаркта миокарда, вирусного гепатита, панкреатита, нефрита и других заболеваний.

В медицине используются следующие ферменты:

1) Ферменты коррекции пищеварения.

Липазы, протеазы из различных источников используются как дополнительные ферменты, облегчающие разложение жиров и белков на составные части в процессе пищеварения.

2) Ферменты наружного применения.

На основе иммобилизованных протеаз различного происхождения созданы перевязочные материалы, улучшающие заживление ран.

3) Тромболитические ферменты.

Существенный прогресс в лечении сердечно-сосудистых заболеваний связывают с применением ферментов, растворяющих фибриновые тромбы. Это направление обеспечивается большим набором протеолитических ферментов. Активация плазминогена на фибриновом сгустке обеспечивает основной естественный процесс тромболизиса. Созданы химически модифицированные по активному центру производные плазминогена, пролонгирующие действие фермента и регулирующие процесс тромболизиса. Для растворения фибриновых тромбов используются протеазы бактериального происхождения - стрептокиназа и стафилокиназа. Создание эффективных тромболитических агентов связывают с тканевым активатором плазминогена и протеолитическим ферментом - урокиназой. Получены генно-инженерные варианты урокиназы, и на этой основе создан фармакологический препарат.

4) Ферменты противоопухолевой терапии.

Торможение роста опухолей в этом случае основано на селективной ферментативной модификации ряда аминокислот, используемых раковыми клетками для пролиферации роста. Терапевтически значимыми ферментами этого направления являются лизиноксидаза, аспарагиназа и др. Сдерживающим фактором широкого применения ферментов как медицинских препаратов является их иммуногенность. Многократное введение чужеродного белка в систему крови человека может вызвать синтез соответствующих антител и развитие иммунного ответа. Инженерная энзимология находит решение этой проблемы в использовании растворимых конъюгатов ферментов с синтетическими полимерами. Показано, что во многих случаях при соответствующем подборе полимера иммуногенность белка может быть существенно снижена.

Существуют также вещества-антиферменты.

Антиферменты (от греч. анти "против", "наоборот" и ферменты) - представляют собой специфические вещества имеющие белковое происхождение. Они выделяются в результате процессов жизнедеятельности организма. Главное их функциональное предназначение - это тормозить или полностью блокировать действие ферментов, что достигается путём образования при взаимодействии с ферментами неактивных комплексов. Те антиферменты, которые присутствуют в различных органах и тканях организма, предохраняют эти органы и ткани от негативных воздействий соответствующих ферментов. В качестве примера можно привести антиферменты, обеспечивающие устойчивость стенок желудка и кишечника и предохраняющие их от разъедающего действия достаточно агрессивных пищеварительных ферментов, содержащихся в желудочном соке. Научное изучение свойств антиферментов также помогает учёным получать новые медикаменты, обладающие свойствами антиферментов. К ним можно отнести такие препараты как эзерин, прозерин, фокурит (диакарб), трасилол и др.

4. Иммобилизация ферментов

За последние 15-20 лет ферменты стали полноправными компонентами технологических схем производства. Это было достигнуто путем развития методов иммобилизации ферментов, то есть фиксации их на каких-то нерастворимых материалах. Иммобилизация предотвращает разрушение ферментов, увеличивают срок их действия, превращает их в гетерогенный катализатор (например, в виде зерен).

Под иммобилизацией понимают такую процедуру, в результате которой молекула фермента тем или иным способом прикрепляется к определенным объектам (носителям), нерастворимых в воде (англ. immobilis - неподвижный). Эти объекты вместе с ферментом легко отделяются от раствора после завершения реакции. Химическое «пришивание» фермента к носителю закрепляет конформацию фермента, и является причиной повышения устойчивости и снижения лабильности.

Иммобилизованные ферменты есть вроде модели структурно организованных в клетке ферментов (мембрана - это то же нерастворимое основание для сообщения с ферментом). Примерно в 70-х гг. XX в. на стыке определенных химических и биологических дисциплин сформировалось новое научно-инженерное направление: инженерная энзимология (важнейший раздел биотехнологии), стремительное развитие которой обусловил создание новых типов гетерогенных биоорганических катализаторов - иммобилизованных ферментов.

По сравнению с нативными предшественниками иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ при их использовании с прикладной целью.

Во-первых, иммобилизованный фермент как гетерогенный катализатор можно легко удалить с реакционной среды, что дает возможность:

- остановить в нужный момент реакцию;

- еще раз использовать катализатор;

- получить продукт, не загрязненный ферментом, что особенно важно для пищевого и фармацевтического производства.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет осуществлять ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колонках, и регулировать скорость реакции, которую катализируют, а также регулируют выход продукта путем изменения скорости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализаторов, в том числе его специфичности, зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, и, что очень важно, его стабильности относительно разного рода денатурирующих воздействий.

В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под влиянием некоторых физических факторов (свет, звук и др.).

Основные требования, которым должны соответствовать носители:

- высокая химическая и биологическая стойкость;

- высокая механическая прочность;

- достаточная проницаемость для фермента и субстратов;

- высокая пористость;

- возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т.д.);

- легкий перевод в реакционно-способную форму (активация):

- высокая гидрофильность, которая обеспечивает возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде;

- невысокая стоимость.

Материалы (носители) для иммобилизации ферментов.

По Дж. Порату (1974), идеальные материалы используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими свойствами:

1.Нерастворимостью;

2.Высокой химической и биологической стойкостью;

3.Значительной гидрофильностью;

4.Достаточной проницаемостью как для ферментов, так и для субстратов и продуктов реакции;

5. Способностью носителя легко активироваться.

В зависимости от природы носители делятся на:

1. Органические материалы;

2. Неорганические материалы.

Органические полимерные носители можно разделить на 2 класса:

а) природные;

б) синтетические.

В свою очередь, каждый из классов органических полимерных носителей подразделяется на группы в зависимости от их строения. Среди природных полимеров выделяют: белковые; полисахаридные; липидные носители, а среди синтетических:

- полиметиленовые;

- полиамидные;

- полиэфирные.

К преимуществам природных носителей относят

1. Доступность;

2. Полифункциональность;

3. Гидрофильность

Из недостатков - высокая стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют: целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости их линейные цепи поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сетчатые структуры легко вводят различные ионогенные группировки.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных количествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие как: кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена - желатин. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в больших количествах, дешёвы и имеют большое число функциональных групп для связывания фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании иммобилизованных ферментов для биотехнологических целей.

Синтетические полимерные носители включают полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта, полиамидные и полиуретановые полимеры.

Их преимущества:

1.Механическая прочность;

2.Возможность варьирования в широких пределах величины пор и введения различных функциональных групп.

Синтетические полимеры воспроизведены в таких изделиях, как трубы, волокна, гранулы. Все эти свойства полезны для разных способов иммобилизации ферментов.

Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости. Итак, к настоящему времени создано огромное число разнообразных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каждого индивидуального фермента, используемого в конкретном технологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные варианты как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

Иммобилизованные ферменты долговечны и в десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65° С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом.

Это обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Иммобилизация осуществляется путем физической адсорбции ферментов на нерастворимом материале, включением ферментов в ячейки геля, а также ковалентным связыванием фермента с нерастворимым материалом или молекул фермента между собой с образованием нерастворимых полиферментных комплексов. Как адсорбенты используют стекло, силикагель, гидроксиапатит, целлюлозу и ее производные, хитин, декстран и др. Для включения фермента в ячейки геля используют разнообразный гелеобразующий материал, чаще полиакриламидный гель. Как материал для ковалентного связывания ферментов применяют полипептиды, белки, производные стирола, полиакриламид, нейлон, различные производные целлюлозы, крахмал, агар, агарозу, а также стекло, силикагель и т.п. При ковалентной связке ферменты находятся на химическом поводке у нерастворимого носителя.

При иммобилизации ферментов используют те же принципы, что и при аффинной хроматографии. Аффинная хроматография основывается на биоспецифическом взаимодействии выделяемого биополимера или группы полимеров с определенным веществом. Этот вид хроматографии применяется у ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков, которые способны избирательно по типу комплементарности связываться с субстратами, рецепторами, антигенами, ингибиторами, кофакторами. Принцип этого метода хроматографии состоит в том, что на нерастворимом носителе закрепляют вещество, способное специфически связываться с белком. Это вещество называют лигандом. Обработанный таким образом носитель (адсорбент) помещают в колонку и через нее пропускают смесь белков. С адсорбентом связывается только тот белок, который имеет сродство со специфическим лигандом. Затем белок снимают с колонки раствором, вызывая диссоциацию комплекса, который образовался между белком и лигандом.

Как известно, в клетках ферменты находятся не в растворённой форме, а прикреплены к определённым структурам и локализованы в органеллах. Это связано с тем, что ферменты не стабильные соединения и при воздействии ряда физических и химических факторов могут инактивироваться.

5. Методы иммобилизации ферментов

Как мы уже говорили, иммобилизованные ферменты (от лат. immobiiis - неподвижный), препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняют свои каталитические свойства полностью или частично. Иммобилизованные ферменты обычно не растворяются в воде. Между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитической реакции, ингибиторов и активаторов. Существует несколько основных способов иммобилизации ферментов:

1) адсорбционный метод

1) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей;

2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присутствии фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера - обычно геля;

3) электростатическое взаимодействие противоположно заряженных групп фермента и матрицы;

4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;

5) связыванием фермента и матрицы в результате нековалентных взаимодействий - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;

6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, например, включением фермента в липосомы;

7) сшиванием молекул фермента между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром адипиновой кислоты.

Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов:

1.Без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации);

2.С образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации).

Каждый из этих методов осуществляется разными способами (рис. 1).

Рис. 1.

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов, начало ей было положено еще в 1916 г. Этот способ достаточно прост и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки не адсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важный фактор - простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента, а также невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации может произойти десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида).

Иммобилизация ферментов путем включения в гели.

Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды.

Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объёме носителя. Все гели обладают высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивают возможность многократного использования фермента, включённого в его структуру.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры (инкапсулирование и включение ферментов в липосомы).

Сущность этих способов иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано две модификации этого направления, которые представляют собой микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Метод инкапсулирования разработан Т. Чангом в 1974 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером или мембраной. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонсистенции двух соединений, одно из которых растворено в воде, а другое - в органической фазе.

Размер получаемых капсул составляет сотни микрометров, а толщина мембраны - сотые доли микрометра.

Достоинство метода микрокапсулирования - простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента, поскольку он может быть отделён от непрореагировавшего субстрата процедурой простого фильтрования. Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию вариантом иммобилизации является метод включения водных растворов ферментов в липосомы, т. е. двойные липидные (жировые) шарики. Впервые данный метод был применён для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 году. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую плёнку липидов выдерживают в водном растворе, содержащем фермент. В процессе выдержки происходит самовпитывание (самосборка) липидных структур липосомы. Ферменты, иммобилизованные путём включения в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и биотехнологических целях.

Химические методы иммобилизации ферментов. Эти методы представляют иммобилизацию ферментов путём образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических вариантов, эти методы иммобилизации обеспечивают прочную и необратимую связь фермента с носителем и сопровождаются стабилизацией молекулы энзима. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создаёт трудности в осуществлении каталитического процесса. Ферменты отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, или спейсер), в роли которой чаще всего выступают полифункциональные агенты бромциан, гидразин, глутаровый диальдегид. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединённые между собой ковалентными связями.

Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.

6. Ферментные электроды

Классический потенциометрический ферментный электрод представляет собой комбинацию ионно-селективных электродов (ИСЭ) с иммобилизованным (нерастворимым) ферментом, который обеспечивает высокую селективность и чувствительность определения конкретного субстрата. Достоинством таких потенциометрических сенсоров являются простота оборудования (требуется только рН-метр), низкая стоимость, доступность большого числа хороших и надежных базовых ИСЭ. Концепция «растворимого» ферментного электрода впервые была выдвинута Кларком и Лайонсом в 1962 г. Однако лишь в 1971 г. был создан первый ферментный электрод на основе глюкооксидазы, иммобилизованной в геле на поверхности полярографического кислородного электрода, который позволяет определять глюкозу в биологических жидкостях и тканях. Ферментные электроды могут работать и как вольтамперометрические, и как амперометрические датчики, то есть измеряется ток при приложенном постоянном напряжении. В 1969 г. Гилболт и Монталв предложили первый потенциометрический (измеряется потенциал системы без наложения внешнего напряжения) ферментный электрод для определения мочевины. В ферментных электродах ферменты обычно иммобилизуют, что позволяет уменьшить расход материалов для проведения анализов и исключить частую проверку ферментного препарата для получения воспроизводимых результатов. Кроме того, устойчивость фермента часто увеличивается при введении его в подходящий гелевый носитель. Например, электрод для определения мочевины с химически связанной уреазой на поверхности аммонийного ИСЭ может работать более 300 дней. Для иммобилизации фермента используют два метода: химическую модификацию фермента введением групп, снижающих его растворимость, и физический захват фермента инертным носителем, например крахмалом или полиакриламидом. Для изготовления электродных датчиков более всего подходит химическая иммобилизация. Функционирование ферментного электрода можно рассматривать как пятистадийный процесс, включающий:

1) подвод субстрата к поверхности электрода;

2) диффузию субстрата через мембрану активного центра;

3) реакцию в активном центре;

4) перенос продукта ферментативной реакции через мембрану к поверхности электрода;

5) определение продукта вблизи поверхности электрода.

Первая стадия - подвод субстрата - сильно зависит от скорости перемешивания раствора. Интенсивное перемешивание обеспечивает быстрый перенос субстрата к поверхности электрода. Если сделать мембрану очень тонкой и использовать высокоактивный фермент, то 2-я и 4-я стадии исключаются или оказывают минимальное влияние. Стадия 3 также является очень быстрой, поэтому время отклика ферментного электрода теоретически должно быть близким к времени отклика базового электрода. Многие исследователи приводят экспериментальные данные, показывающие, что это достижимо при использовании тонкой мембраны и быстром перемешивании.

7. Применение ферментных электродов

Ферментные электроды представляют собой биосенсоры, которые позволяют быстро и селективно проводить определение целого ряда компонентов в сложных по составу объектах. На основе использования ферментов созданы различные экспресс-тесты. Многие из них чрезвычайно просты. Например, тест-устройство для определения токсичных фосфорсодержащих пестицидов в продуктах питания представляет собой бумажную полоску, один конец которой пропитан раствором хромогенного субстрата, а второй содержит иммобилизованную холинэстеразу. При анализе концы полоски совмещают и обмакивают в воду или в выжатый из фруктов или овощей сок. Т. к. пестициды в больших, чем предельно допустимых концентрациях (ПДК), количествах ингибируют холинэстеразу, то отсутствие окраски свидетельствует о превышении ПДК пестицидов.

Аналогичные бумажные тесты предложены для определения глюкозы в моче и крови. Широкое распространение получают иммуноферментные методы - разновидность иммунных методов анализа (радиоактивная или флуоресцентная метка заменяется ферментом). Их используют для определения иммуноглобулинов, гормонов, стероидов, лекарственных средств, пестицидов. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью. Для повышения воспроизводимости, экспрессности и производительности в ферментном методе анализа применяют автоматические анализаторы разного типа. Каталитические реакции с участием растворимых и иммобилизованных ферментов, а также ферментных реакторов все чаще используют в проточно-инжекционном анализе. Ферментный метод анализа применяют в химическом анализе, но по сравнению с другими методами анализа, недостаточно широко. Из более чем 1800 полученных ферментов используют около 50.

Ферментные методы анализа позволяют определить селективно, а в некоторых случаях специфично такие биологически активные субстраты как глюкоза, мочевина и мочевая кислота, различные аминокислоты, липиды, холестерин, антибиотики, этиловый спирт и многие другие.

Разработаны чрезвычайно чувствительные методы определения многих ферментов (пероксидазы в крови, креатинфосфатазыв крови при диагностике инсульта и инфаркта миокарда и др.) и коферментов (никотинамиддинуклеотид, флавинмононуклкотид, АТФ и др.).

Основные области применения ферментных методов анализа - клиническая медицина и биохимия. С помощью ферментов в крови, моче, тканях и других биологических объектах определяют малые количества физиологически активных веществ, ферментов, мутагенов, канцерогенов, лекарственных препаратов. Высокочувствительный и специфический метод определения АТФ позволяет разрабатывать методики измерения количества клеток микроорганизмов, обнаружения микробных заражений, определения антибиотиков в биологических тканях и жидкостях по степени ингибирования микробных клеток.

8. Стабилизация ферментов

Исследователи из Швейцарии разработали способ стабилизации ферментов в условиях, характерных для пищеварительного тракта. Такая стабилизация достигается за счет связывания ферментов с полимерами.

Новый подход предлагает способ разработки лекарств белковой структуры, которые могут применяться перорально, не разрушаясь при таком приеме. Результаты работы также могут стать основой для разработки новой терапевтической стратегии, необходимой при лечении ряда заболеваний, связанных с аномальной активностью ферментов - например, глютеновой болезни.

Модификация ферментов полимерами для применения в фармацевтике не является чем-то новым - такой подход уже несколько лет применяется для увеличения времени жизни ферментов в организме и подавления любого иммунного отклика, связанного с работой ферментов. Тем не менее, даже такие модифицированные ферменты обычно вводятся в организм с помощью инъекций или другим способом, позволяющим обойти движение по желудочно-кишечному тракту.

Исследования, посвященные влиянию модификации ферментов на активность, которую они проявляют при пероральном приеме, проводились гораздо реже. Это связано с тем, что в ряде случаев модификация каталитически активного белка с целью защитить его от жестких условий, характерных для пищеварительной системы человека приводит к деградации белка или утрате им его биологической активности.

Жан-Кристоф Леру с коллегами из Швейцарского федерального технологического института решили продемонстрировать, что некоторые модификации полимеров могут стабилизировать ферменты в различных частях желудочно-кишечного тракта. Леру отмечает, что полученные в его группе результаты весьма важны, поскольку существует целый ряд болезней, для лечения которых важно разработать способ перорального введения лекарства. К таким заболеваниям относятся недостаточность поджелудочной железы, фенилкетонурия и глютеновая болезнь.

В течение нескольких лет исследователи из группы Леру работали над способами лечения глютеновой болезни - генетического аутоиммунного расстройства, связанного с неспособностью кишечника переваривать клейковину злаковых (глютен) и, в частности, один из основных компонентов глютена - глиадин. Решив первоначально выяснить, какое влияние оказывает модификация полимерами ферментов на их активность, исследователи модифицировали несколько ферментов, способных разрушать глютен различными полимерами и отслеживали, как такая модификация влияла на стабильность белков.

Как отмечает Леру, хотя и ожидалась некоторая степень стабилизации белков, исследователи к своему удивлению обнаружили, что дендронизированный полимер (полимер, обладающий линейной главной цепью и щеткообразными боковыми группами), значительно увеличивает стабильность глютеназы в желудочно-кишечном тракте.

Исследователи пока еще не до конца разобрались в механизме стабилизации фермента дендронизированным полимером. Одним из предположений является, что причиной повышения устойчивости является комбинация неспецифических взаимодействий фермент-полимер с действием муцина, присутствующего в пищеварительном тракте. Модифицированные ферменты более устойчивы к денатурации и деградации пепсином.

Заключение

Таким образом, при использовании ферментов в иммобилизованном виде в значительной степени могут быть устранены следующие недостатки:

- высокая лабильность ферментов к различным факторам окружающей среды (значение рН, температура и др.);

- быстрая инактивация в организме и выделение из организма (что повышает расход ферментов);

- наличие антигенных свойств чужеродных организму белков.

Список использованной литературы

1. Биотехнология: учеб. пособие / сост. Ю.О. Сазыкин. - М.: Издательский центр «Академия», 2007.-256 с.

2. Торчилин В.П. Иммобилизованные ферменты в медицине / В.П. Торчилин // Новое в жизни, науке, технике. Сер. Химия. 1986.

-№9. - С. 4-30.

3. Иммобилизованные ферменты / под ред. И.В. Березина; пер. с англ. Е. Майзеля. -М.: Мир, 1983. -С. 11-23; 89-93; 98-105.

4. Вудворг Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. -М.: Мир, 1983. -С.110-147; 180-195.

5. Биотехнология: учеб. пособие / сост. А.А. Баев. -Москва: «Наука», 1984. -257 с.

6. Вакула. В.Л. Биотехнология, что это такое? / В.Л. Вакула. -М: Мир, 1989. -320 с.

Размещено на Allbest.ru