Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Миксобактерии (лат. Myxococcales) -- порядок класса дельта-протеобактерий. Миксобактерии распространены в почвах, способны к скользящему движению и обладают относительно большими для бактерий геномами, состоящим из 9--10 миллионов пар нуклеотидов. Sorangium cellulosum (Polyangium cellulosum) обладает геномом в 13 с лишним миллионов пар нуклеотидов, на 2007 год это был самый крупный из известных бактериальных геномов.

Миксобактерии образуют специфические колонии-швармы, способные передвигаться по поверхности среды. Колонии миксобактерий синтезируют многочисленные экзоферменты (лизоцим, протеазы и целлюлазы). Из-за того, что миксобактерии совместно разрушают органические субстраты, в том числе и бактерии других видов, их часто сравнивают с волчьей стаей.

При недостатке питательных субстратов на твёрдой поверхности и при числе клеток не менее 105 запускается особый цикл развития, включающий в себя формирование плодового тела и миксоспор. При голодании каждая клетка синтезирует определённое количество т. н. А-фактора. При большом числе клеток достигается пороговый уровень концентрации (около 10 мкмоль/л) и начинается образование плодового тела, которое регулируется С-фактором (белок с массой 17 кДа).

1. Морфологические и цитологические особенности

Миксобактерии и цитофаги - это грамотрицательные скользящие бактерии, которые относят соответственно к порядкам Myxobacteriales и Cytophagales.

Грамотрицательные бактерии -- это бактерии, которые не окрашиваются кристаллическим фиолетовым при окрашивании по Граму. В отличие от грамположительных бактерий, которые сохранят фиолетовую окраску даже после промывания обесцвечивающим растворителем (спирт), грамотрицательные полностью обесцвечиваются. После промывания растворителем при окрашивании по Граму добавляется контрастный краситель (обычно сафранин), который окрашивает всех грамотрицательных бактерий в красный или розовый цвет. Это происходит из-за наличия внешней мембраны, препятствующей проникновению красителя внутрь клетки. Сам по себе тест полезен при классификации бактерий и разделении их на две группы относительно строения их клеточной стенки. Из-за своей более мощной и непроницаемой клеточной стенки грамотрицательные бактерии более устойчивы к антителам чем грамположительные.

Обычно патогенность грамотрицательных бактерий связывают с определёнными компонентами их клеточных стенок, а именно, с липополисахаридным слоем (ЛПС или эндотоксический слой). В человеческом организме ЛПС вызывает иммунный ответ, который характеризуется синтезом цитокинов и активацией иммунной системы. Обычной реакцией на синтез цитокинов является воспаление, что также может привести к увеличению количества токсичных веществ в организме хозяина.

Общие признаки, свойственные большинству грамотрицательных бактерий:

Наличие двух мембран, между которыми находится клеточная стенка и периплазматическое пространство

Более тонкий, по сравнению с грамположительными бактериями, пептидогликановый слой

Наружная мембрана содержит липополисахариды (состоит из липида А, полисахаридного ядра и антигена О снаружи и из фосфолипидов изнутри)

В наружной мембране присутствуют порины, функционирующие подобно порам для определённых молекул

S-слой прикреплен к наружной мембране, а не к пептидогликановому слою

Если есть жгутик, он имеет четыре поддерживающих кольца, а не два

Отсутствуют тейхоевая и липотейхоевая кислоты

Обычно не образуют спор (примечательным исключением является Coxiella burnetii, образующая спороподобные структуры)

Липопротеины прикреплены непосредственно к полисахаридной основе.

Большинство содержат липопротеин Брауна, который связывает наружную мембрану и цепочки пептидоглюканов ковалентной связью.

Химический состав и структура клеточных покровов

Далее рассмотрены слои клеточных покровов грамотрицательных прокариотов, начиная с самого внутреннего:

Клеточная стенка

У грамотрицательных эубактерий строение клеточной стенки намного сложнее, чем у грамположительных. В ее состав входит гораздо большее число макромолекул разного химического типа. Пептидогликан образует только внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегая к ЦПМ. Для разных видов грамотрицательных эубактерий содержание этого гетерополимера колеблется в широких пределах. У большинства видов он образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся весьма редкими поперечными связями между гетерополимерными цепями.

Некоторые скользящие бактерии (миксобактерии, флексибактерии) способны в процессе перемещения по твердому субстрату периодически менять форму клеток, например путем изгибания, что говорит об эластичности их клеточной стенки, и в первую очередь ее пептидогликанового слоя. Электронно-микроскопическое изучение, однако, обнаружило у них клеточную стенку, типичную для грамотрицательных эубактерий. Наиболее вероятное объяснение гибкости клеточной стенки этих бактерий -- чрезвычайно низкая сшитость ее пептидогликанового компонента [ 25, с. 92].

Периплазматическое пространство

Появление у грамотрицательных эубактерий дополнительной мембраны в составе клеточной стенки фактически привело к созданию обособленной полости (периплазматического пространства), отграниченной от цитоплазмы и внешней среды специфическими мембранами и несущей важную функциональную нагрузку. Периплазматическое пространство, куда погружен пептидогликановый слой. заполнено раствором, в состав которого входят специфические белки, олигосахариды и неорганические молекулы. Периплазматические белки представлены двумя типами: транспортными белками и гидролитическими ферментами.

Было обнаружено также, что многие бактерии способны в больших количествах вырабатывать ферменты (гликозидазы, протеазы, липазы и проч.), гидролизующие все типы полимерных молекул. Последними могут быть как молекулы, синтезируемые самой клеткой, так и чужеродные, попавшие в клетку извне. Отрицательные последствия гидролиза собственных молекул (самопереваривание) очевидны. В то же время прокариоты нуждаются в гидролитических ферментах, так как это расширяет круг используемых ими веществ, включая в него полимеры разного типа. Становится понятна необходимость изолирования этих ферментов от цитоплазматического содержимого. Грамположительные эубактерии выделяют гидролитические ферменты во внешнюю среду, у грамотрицательных -- они локализованы в периплазматическом пространстве.

Внешняя мембрана

Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки -- наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида. Специфическим компонентом наружной мембраны является липополисахарид сложного молекулярного строения, занимающий около 30--40 % ее поверхности и локализованный во внешнем слое.

Белки наружной мембраны можно разделить на основные и минорные. Основные белки представлены небольшим числом различных видов, но составляют почти 80 % всех белков наружной мембраны. Одна из функций этих белков -- формирование в мембране гидрофильных пор диаметром примерно 1-15 нм и длиной 50-70 нм, наклонённых к поверхности клеточной стенки по углом 30-40°. Через них осуществляется неспецифическая диффузия молекул с массой до 600--900 Да. Это означает, что через такие поры могут проходить сахара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды. Белки, пронизывающие наружную мембрану насквозь и образующие гидрофильные поры, называют поринами. Минорные белки наружной мембраны представлены гораздо большим числом видов. Их основная функция -- транспортная и рецепторная. Примером минорных белков могут служить белки, ответственные за специфический транспорт в клетку железосодержащих соединений.

Разнообразные функции выполняют макромолекулы, локализованные частично или полностью на внешней стороне клеточной стенки, контактирующей с окружающей средой; это специфические рецепторы для фагов и колицинов; антигены; макромолекулы, обеспечивающие межклеточные взаимодействия при конъюгации, а также между патогенными бактериями и тканями высших организмов.

S-слой и осцилиновые фибриллы

S-слой или зубчатый слой -- слой из волоскоподобных фибрил, находится за пределами наружной мембраны в клеточной стенке цианобактерий способных к скольжению. Похожие на волоски фибриллы верхнего слоя состоят из стержнеподобного гликопротеина, называемого осцилин.

Скольжение происходит посредством секреции слизи через поры на внешнюю сторону клеточных покровов. Слизь проходит вдоль поверхности из осцилиновых фибрил наружного слоя клетки и по расположенному рядом субстрату, продвигая фибриллы вперёд. Совокупность организованных волоскоподобных фибрилл таким образом, действует как пассивный винт, в то время как слизь проходит по их поверхности в процессе скольжения.

К этому порядку относят грамотрицательных бактерий, вегетативные клетки которых обладают большой гибкостью и способны к скользящему движению в слизи, продуцируемой ими в большом количестве. Клетки имеют палочковидную или веретенообразную форму с острыми концами. Большинство миксобактерии - аэробы, гетеротрофы.

Аэробные микроорганизмы осуществляют окисление белков, жиров, углеводов и других сложных органических соединений, входящих в состав растительных и микробных остатков, до аммиака, воды и углекислого газа. Важная роль в превращении органических веществ принадлежит также грибам и актиномицетам. Минерализации подвергаются не только органические остатки растительного и животного происхождения, но и специфические органические вещества почвы -- ее гумус.

Аэробной стабилизации могут быть подвергнуты избыточный активный ил и сырой осадок из первичных отстойников. На стабилизацию лучше направлять неуплотненный избыточный активный ил, продолжительность аэрации которого составляет 7--10 сут. За. это время распад беззольного вещества ила составляет 20--30%, а удельный расход воздуха 1 м3/(м3-ч). В результате аэробной стабилизации активного ила достигается также снижение бактериальных загрязнений: бактерий кишечной палочки--на 95--99%, а всего бактерий сапрофитов--на 25--60%. При последующем отстаивании стабилизированного ила в течение 1,5--2 ч он уплотняется до влажности 98% и имеет удельное сопротивление фильтрации порядка 100--200-1010 см/г [32, с. 121].

Аэробное дыхание -- процесс, обратный «нормальному» фотосинтезу (см. словесную формулу фотосинтеза, приведенную выше). С помощью этого процесса все высшие растения и животные, а также большинство бактерий и простейших получают энергию для поддержания жизнедеятельности и построения клеток. В итоге завершенного дыхания образуются СО2, Н2О и вещества клетки, однако процесс может идти не до конца и в результате такого незавершенного дыхания образуются органические вещества, еще содержащие некоторое количество энергии, которая может быть в дальнейшем использована другими организмами.

Аэробные бактерии имеют систему цитохромов -- пигментированных окислительно-восстановительных ферментов. Благодаря цитохромам аэробные бактерии могут в качестве конечного акцептора водорода использовать кислород воздуха.

Существенным отличием миксобактерии от истинных бактерий является их способность передвигаться за счет активного сгибания тела (жгутики отсутствуют). Такая особенность строения (эластичная клеточная стенка) свойственна простейшим животным организмам. Другой особенностью миксобактерии является образование плоских стелющихся по поверхности слизистых колоний, образующих выросты - псевдоплазмодий. Многие из них способны к образованию плодовых тел, напоминающих плодовые тела простейших. Эти тела, имеющие причудливую форму, но небольшие размеры (около 7 мм), являются разновидностью колониальной формы (рис. 1) и представляют собой стадию образования цист.



Рис.1.1 Myxococcus stipitatus (высота колонии 0,1 мм); 2 - Podangium erectum (высота 50 мкм); 3 - Myxococcus fulvus (высота 150 мкм); 4 - Chondromyces sp. (высота 0,5 мм)

Систематическое положение миксобактерии до сих пор вызывает споры. Одни специалисты их считают родственными сине-зеленым водорослям, другие - простейшим.

Как бы ни обстояло дело с таксономией, но та группа микроорганизмов со скользящим движением, которая образует плодовые тела, в цикле своего развития претерпевает смену форм, сходную со сменой форм у простейших: стадии роения и образования цист. На стадии псевдоплазмодия миксобактерии размножаются путем поперечного деления, выделяя обильную слизь, в которой живут и перемещаются. Эта стадия продолжается 1-7 дней, после чего палочки начинают образовывать скопления, растущие над поверхностью субстрата. У некоторых видов палочки передвигаются в верхней части этих сложных структур. Там палочки укорачиваются, переходя в состояние покоящихся клеток. У миксококков они, например, становятся овальными, окрашиваются в темный цвет, приобретают толстые оболочки и становятся похожими на хламидоспоры (микроцисты) (рис. 2). При увлажнении покоящиеся вегетативные клетки прорастают и снова переходят к стадии псевдоплазмодия [ 15, с. 109.

Рис. 2 Цикл развития миксобактерий из рода Chondromyces (по Щлегелю, 1972)

Истинные миксобактерии, образующие плодовые тела, представлены в природе следующими родами: миксококкус (Myxococcus), сорангиум (Sorangium), хондромицес (Chondromyces), хондрококкус (Chondrococcus), архангиум (Archangium), полиангиум (Polyangium), мелитангиум (Melittangium), подангиум (Podangium), стелангиум (Stelangium), синангиум (Synangium), ангиококкус (Angiococcus).

По способности к скользящему движению, форме клеток с миксобактериями сходны два рода целлюлозоразлагающих бактерий - цитофага (Cytophaga) и спороцитофага (Sporocytophaga). Эти бактерии не образуют плодовых тел. Веретенообразные вегетативные клетки Sporocytophaga могут переходить в кокковидные микроцисты.

По ряду признаков подобны миксобактериям флексибактерии - обитатели пресной и морской воды. Клетки представителей рода Flexibacter имеют вид длинных гибких нитей толщиной менее 1 мкм, способных к скользящему движению.

2. Физиологические особенности

миксобактерия цитологический морфологический почва

Myxococcus xanthus -- миксобактерии, которые были обнаружены в верхнем слое почвы. Там они питаются органическими веществами самой почвы, а также другими микроорганизмами путем секреции гидролитических ферментов и антимикробных веществ. В присутствии большого числа питательных веществ формируют совместно питающиеся колонии. Клетки, образующие колонию, передвигаются в сторону потенциальной жертвы (колонии другого вида) распознавая изменения эластических и механических свойств поверхности, вызванные жизнедеятельностью колонии-жертвы. После чего Myxococcus окружает жертву, и осуществляется переваривание. В ответ на снижение количества питательных веществ в среде неструктурированная масса вегетативных клеток Myxococcus xanthus реорганизуется в плодовые тела, в которых образуются споры необходимые для переживания неблагоприятных условий.

Myxococcus xanthus -- хемоорганотрофы, строгие аэробы. Имеют вегетативные клетки с утонченными концами и образуют сферические или овальные микроцисты. Клетки Myxococcus представляют собой палочки, которые передвигаются посредством скольжения.

Клетки M. xanthus передвигаются двумя способами: по одиночке (A-motility), и группами (S-motility). A-motility осуществляется благодаря слизи, выделяемой по реактивному принципу, из Nls структур гомологичных таковым у некоторых цианобактерий, осуществляющим такой тип передвижения. S-motility обеспечивается посредством сокращения пилей четвертого типа (Tfp). Это полярно расположенные структуры, в основном представленные на одном полюсе клетки. Клетки двигаются по субстрату периодически останавливаясь и меняя направление движения на противоположное. Предполагается, что в момент остановки происходит деградация пилей на одном полюсе и синтез пилей на другом de novo. Tfp зависимое движение опирается на два последовательно происходящих события: синтез пилей, присоединение пилей к полисахаридным фибриллам гликокортекса соседней клетки, после чего начинается совместное передвижение (S от social).

Spormann и Kaiser обнаружили MglA белок, который контролирует переключение типов движения с одного полюса на другой. Было продемонстрировано, что мутанты синтезирующие уменьшенные количества MglA обладают повышенной скоростью такого переключения. Помимо этого, контроль за переключениями осуществляет Frz система. Она состоит из FrzCD, метилсвязывающего белка; FrzE, гистидиновой протеинкиназы; FrzA, FrzB -- адаптерных белков; FrzF, метилтрансферазы; FrzG, метилэстеразы. У мутантов с выключенной Frz системой наблюдается повышенное число переключений [20, с. 121].

Образование плодового тела в условиях голодания -- это сложный процесс относящийся к категории плотность зависимых. На ранних этапах образования агрегаций ведущую роль играет фактор А, затем фактор С. С сигнал становится важным на 3 час голодания. В низких концентрациях с сигнал вызывает сползание клеток: они начинают двигаться в одном направлении. Более высокие концентрации вызывают образование плодовых тел и споруляцию. Образование плодовых тел включает несколько этапов: сползание клеток, формирование клеточных агрегатов, формирование плодовых тел, преобразование вегетативных клеток центральной части плодовых тел в споры.

С сигнал, воздействуя на Frz систему, ускоряет движение клеток и уменьшает частоту переключений, что делает возможным образование клеточных агрегатов. При S-движении клетки соединяются друг с другом, образуя цепочки. Если одна из клеток цепочки меняет направление движения, то вся цепочка разрушается.

За синтез С сигнала отвечает csgА ген. Мутанты по этому гену не способны образовывать плодовые тела. Способность восстанавливается при совместном развитии со штаммом дикого типа. CsgA белок существует в двух формах: полноразмерный 25-kD белок (p25), гомологичный короткоцепочечной алкогольдегидрогеназе, и 17-kD белок (p17). Оба белка ассоциированы с внешней мембраной. P17 представляет собой концевой участок p25. Рекомбинантный p17 с отсутствующим N-концевым участком, ответственным за связывание NAD+, имеет С-сигнальную активность. Эти данные доказывают, что активность белка не связана с алкогольдегидрогеназной активностью.

Миксобактерии имеют относительно крупные клетки шириной 0,6-2,0 мкм и длиной 1,2-10 мкм двух морфологических типов: 1) тонкие гибкие палочки с более или менее суженными концами и 2) относительно толстые палочки цилиндрической формы с закругленными концами. Клетки миксобактерий обычно окрашены в желтый, оранжевый или красный цвет за счет каротиноидных пигментов.

Миксобактерии передвигаются путем скольжения по твердой поверхности и способны также проникать в субстрат, продвигаясь внутри, например, плотных 1,2-1,5 % агаровых гелей. В результате скользящего движения клеток колонии миксобактерий разрастаются распространяются по поверхности субстрата и поэтому называются швармы (т.е. это колонии миксобактерий). Внутри шварма клетки обычно распределены неравномерно, большая часть их находится концентрируясь в радиальных тяжах, а иногда в массивных складках по периферии шварма. В условиях голодания клетки скапливаются и агрегируют в определенных участках шварма, образуя крупные глобулярные или гребневидные массы, которые затем дифференцируются в структуры, которые называются плодовые тела.

Плодовые тела варьируют в размерах от 100 до 600 мкм и хорошо заметны благодаря яркой окраске и блестящей поверхности. Плодовые тела имеют разную форму: от микроскопического бугорка до сложных древоподобных структур, они могут располагаться концентрическими кругами либо радиальными тяжами. Внутри созревающего плодового тела вегетативные клетки превращаются в покоящиеся миксоспоры. Они устойчивы к высыханию и довольно устойчивы к нагреванию: выживают при температуре 58-60 єС на протяжении 10-60 мин. Миксоспоры могут иметь сферическую или овальную (например, у представителей родов Myxococcus, Nannocystis и др.) и палочковидную (например, у представителей родов Cystobacter, Polyangium, Stigmatella и др.) форму.

Миксобактерии - облигатные аэробы. Большинство из них мезофиллы. Все представители - хемоорганотрофы, способные использовать самые разнообразные органические вещества в качестве источников энергии и углерода. В зависимости от источников питания различают бактериолитические и целлюлозолитические виды.

К бактериолитическим относятся миксобактерии, входящие в род Myxococcus. Представители этого рода синтезируют различные экзоферменты, которые могут разрушать клетки бактерий, дрожжей и других микроорганизмов и использовать полученные вещества в своих метаболических процессах. в качестве источников энергии и углерода. Такой тип взаимоотношений между микроорганизмами относится к хищничеству.

Целлюлозолитические виды содержит род Polyangium, так как его представители способны гидролизовать целлюлозу. Следует отметить, что некоторые миксобактерии способны синтезировать в значительных количествах стеролы (например, бактерии рода Nannocystis).

3. Методы выделения и изучения

В лабораторной практике для учета микроорганизмов в почве используют разные методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

Наиболее полно отражает численность клеток в почве метод прямого подсчета под микроскопом, требующий высокой квалификации исследователя. Для подсчета зародышей методом Виноградского в модификации Шульгиной на предметное стекло наносят определенный объем суспензии, готовят из него мазок на определенной площади, затем мазок фиксируют, красят и подсчитывают под микроскопом количество клеток микроорга-низмов. Фиксация препарата не дает возможности выявить- количество жизнеспособных клеток. В какой-то мере этот недостаток можно устранить при использовании метода флуоресцентной микроскопии.

Значительно меньшее число зародышей обнаруживается при посеве почвенной суспензии на жидких средах методом предельных разведений, но он более удобен и требует меньших затрат времени.

Широко применяется метод Коха для учета почвенных микроорганизмов. При этом почвенную суспензию из определенного разведения высевают на плотных питательных средах. Этот метод дает возможность убедиться в наличии живых зародышей, выявить их качественный состав и выделить чистые культуры. Этим методом выявляется больше зародышей, чем методом предельных разведений на жидких средах.

Для определения относительной заселенности той или иной группы микроорганизмов в почве используют метод обрастания ими комочков почвы. В зависимости от физиологической группы микроорганизмов используют соответствующие элективные питательные среды.

Группы микроорганизмов, учитываемые на жидких средах (методом предельных разведений). Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы количественно можно учесть на среде Имшенецкого и Солнцевой, содержащей (в %): NaN03--0,25; К2НРО4-- 0,1; MgS04--0,03; NaCl--0,1; СаС12--0,01; СаС03--0,5; добавлять мел не обязательно.

По 5 мл среды разливают в пробирки, а в качестве источника углерода опускают полоску фильтровальной бумаги (длиной 7--10 см), не содержащей крахмала (реакция с раствором Люголя). Полоска на 4--5 см должна выступать над средой [ 5, с. 83].

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы. Для определения качественного состава и относительной оценки населенности их в почве используют гелевые пластины или пластины из «голодного» агара.

На пластинах помещают кружок стерильной фильтровальной бумаги, увлажненной стерильной средой Виноградского (стр. 105) или средой Гатчинсона, затем по фильтровальной бумаге раскладывают (дотрафарету) 50 комочков почвы диаметром 1--2 мм.

Аэробные целлюлозоразлагающие микроорганизмы наиболее полно выявляются методом почвенных пластинок.

Почву обогащают соединениями калия и азота (2 мл 1,5%-ного раствора KNO3 на 50--60 г почвы). Обогащенную навеску размешивают, увлажняют и помещают в чашку Петри, на дно которой предварительно кладут стерильные обеззоленные фильтры или фильтровальную бумагу. На поверхность почвенной пластинки также накладывают кружок фильтровальной бумаги и плотно прижимают его к поверхности пластинки. Чашки с пластинками инкубируют во влажной камере. Срок инкубации варьирует в зависимости от свойств почвы. Для дерново-подзолистой почвы этот срок можно ограничить несколькими неделями, в черноземе срок инкубации должен быть увеличен.

Результаты опыта оценивают по степени разложения бумаги. В дерново-подзолистой почве целлюлозоразлагающие микроорганизмы представлены обычно грибами, в черноземе -- миксобактериями.

Для выделения миксобактерий из почвы используется следующий метод.

Чашка Петри наполняется почвой, которая увлажняется до полной влагоемкости. В почву вносят автоклавированный кроличий помет. Инкубируют при 30°. Через 10 дней на комочках помета под микроскопом видные плодовые тела миксобактерий. Используется также метод накопительных культур. В этом случае применяют среду Гетчинсона (г/л): КН2S04 - 0,1; NaCI - 0,1; CaCl2 -0,1; FeCI3 - 0,1; MgS04 . 7H20 - 0,3; NaNO3 - 2,5, дистиллированная вода. Среду наливают в колбочки или пробирки, куда в качестве источника углерода помещают фильтровальную бумагу: В колбочки опускают складчатый бумажный фильтр, в пробирки -- полоски фильтровальной бумаги.

После стерилизации колбочки и пробирки засевают комочками почвы.

Условия накопительной культуры для целлюлозоразлагающих микроорганизмов можно создать, используя метод комочков. На поверхность пластинок кремнекислого геля или голодного агара накладывают кружки фильтровальной бумаги, смоченные раствором Гетчинсона. Затем на поверхность бумаги раскладывают 25 комочков почвы. Чашки инкубируют в термостате при 25--30° во влажной камере и наблюдают за развитием микроорганизмов. Через несколько недель подсчитывают процент комочков, вокруг которых наблюдается разложение клетчатки, и составляют характеристику развивающихся микроорганизмов на основе их микроскопического исследования.

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы на гелевых пластинах учитывают на 8--10-й день инкубации. Кроме общего подсчета обросших комочков почвы, отдельно определяют процент комочков, обросших бактериями, актиномицетами и грибами.

Среда Гетчинсона (в г на 1 л дистиллированной воды): NaN03--2,5; КН2Р04--1,0; MgS04-7H20-- 0,3; NaCl--0,1; СаС12--0,1; FeCl3--0,01; pH среды доводят до 7,2 добавлением 20% раствора Na2C03.

ВЗЯТИЕ СРЕДНЕЙ ПОЧВЕННОЙ ПРОБЫ И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ровный, волнистый, склон и т. д.) и площади. Н. К. Красильников (1966) рекомендует с площади 100 м2 брать пробу из трех точек, с более 100 м2-- из пяти, с гектара и более -- из 15. При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний двухсантиметровый слой, при изучении микрофлоры почвенного профиля -- по генетическим горизонтам (снизувверх).

Почвенный образец берут стерильным буром, стерильной лопатой и стерильным ножом в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной ватой, или в стерильные полиэтиленовые мешки, или в мешки из пергаментной бумаги. На пакеты или банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, горизонта и других необходимых сведений.

Бур, лопату и нож в поле перед взятием образца тщательно очищают, затем обжигают горящим спиртом [21, с. 95].

Почвенные образцы анализируют в первые сутки. В случае необходимости допускается хранение их в холодном помещении (в холодильнике) в течение двух дней. Для большей однородности среднего образца, соблюдая все условия асептики, его тщательно перемешивают, вынимают корни растений, различные включения (камни).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОЧВЕННОЙ СУСПЕНЗИИ

На стерильное часовое стекло стерильным шпателем (или алюминиевой ложкой) помещают 10 г почвы и взвешивают. Чтобы при взвешивании в почву не попали бактерии из воздуха, часовое стекло накрывают другим часовым стеклом (предварительно стекла тарируют). Часовые стекла, шпатели и ложки стерилизуют проведением их над пламенем (фламбированием).

Навеску почвы переносят в колбу емкостью 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывают в течение 10 мин, лучше на механической качалке (рис. 32), и дают отстояться грубым частицам почвы.

Затем методом разведения готовят суспензии, содержащие разные количества почвы.

Одновременно со взятием 10 г почвы для анализа из средней пробы отбирают 10--20 г почвы для определения влажности, так как полученные данные пересчитывают на 1 г абсолютно сухой почвы.

Д. Г. Звягинцев (1966) установил, что значительно больше зародышей выявляется в почве, если навеску ее предварительно поместить в стерильную фарфоровую чашку или ступку, увлажнить (0,4--0,8 мл воды или 0,1%-ным раствором пирофосфата Na4P207на 1г почвы) й в течение 5 мин растирать стерильным резиновым пестиком или пальцем в стерильной резиновой перчатке до пастообразного состояния. Перед приготовлением суспензии для каждого образца готовят две стерильные колбы емкостью 250 мл; одна содержит 100 мл стерильной водопроводной воды, другая -- пустая. Водой из первой колбы растертую почвенную массу смывают в пустую стерильную колбу. Колбу с почвенной суспензией встряхивают на протяжении 5 мин, оставляют на 30 с и готовят разведения, содержащие разные концентрации почвы. Последующие колбы встряхивают в течение 1 мин.

1 мл суспензии в первой колбе, приготовленной тем или иным методом, соответствует разведению 10-1. Последующие разведения (10~2; 10_3; ICh4; 10-5; 10~6 и т. д.) лучше делать в колбах на 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды.

Из каждого предыдущего разведения отдельной стерильной пипеткой берут 10 мл почвенной суспензии и переносят в следующую колбу, содержащую 90 мл воды. Каждый раз пипетку ополаскивают и отставляют. Последующие колбы встряхивают в течение 1 мин.

Из полученных разведений проводят посев на плотных и жидких средах. Набор этих сред зависит от задач, которые ставят перед собой исследователи при бактериологическом анализе почвы.

УЧЕТ

Учет миксобактерий (на картофельном агаре) -- колонии амебовидные, так как бактерии по среде продвигаются «всем фронтом». Вегетативные клетки расположены на слизи по краю колонии, а плодовые тела -- ближе к центру концентрическими кольцами. Дифференцировка видов, родов и семейств основывается на бедной среде (нитритном агаре): а ~ сем. Micromonosрогасеае.

Однако не все виды миксобактерий при выращивании на агаровых средах образуют плодовые тела

Род Archangium-- колонии или псевдоплазмодии не образуют закругленных цист, но скручиваются, формируя брыжейкоподобные массы.

Род Sorangium-- колонии образуют оформленные угловатые цисты, соединенные в закругленные плодовые тела.

Род Polyangium-- колонии или псевдоплазмодий образуют закругленные или сферические цисты, окруженные мембраной или тесно сжатые, погруженные в слизистый слой.

Род Myxococcus -- плодовые тела сферические или удлиненные (колонкоподобные). У основания образуют обилие слизи. В плодовых телах палочки укорачиваются, формируя круглые микроцисты.

Наличие аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов определяют на 8--10-й день инкубации в термостате по образованию колоний и разрушению клетчатки на границе между жидкой средой и воздухом.

Материалы и оборудование. Питательные среды в колбах (МПА и КАА), жидкие среды в пробирках: среда для аэробных целлюлозо- разрушающнх бактерий, среда Гильтая, среда для аиаэробных азотфиксаторов (Clostridium pasteurianum);силикагелевые пластины, пропитанные питательной средой для азотобактера и аэробных целлюлозообразующих бактерий, стерильные чашки Петри, колбы со стерильной водопроводной водой по 90 мл, стерильные моровские пипетки на 10 мл, стерильные градуированные пипетки на 1 мл, стерильные шпатели Дригальского, часовые стекла, стеклянные палочки с оттянутыми концами, свежие почвенные пробы (почвы разных типов), чайные ложки, пинцеты, трафареты, счетные камеры Вольфюгеля, лупы, микроскопы, предметные стекла н все необходимое для приготовления окрашенных препаратов, препаратов в раздавленной капле для микроскопирования.

4. Роль и распространение в природе

Миксобактерии привлекли к себе внимание способностью образовывать плодовые тела, состоящие из экскретируемых ими полисахаридов и входящих в них устойчивых миксоцист (или, иначе, микроцист). Миксобактерии обладают не только индивидуальной способностью к дифференциации от вегетативной клетки до покоящихся микроцист, но и коллективной дифференциацией, приводящей к образованию из колонии оформленного плодового тела, как у эукариотных миксомицетов. Вегетативные клетки Миксобактерии представлены одиночными скользящими палочками с заостренными или тупыми концами, размножающимися делением перетяжкой и образующими координированно движущуюся колонию (шварм), подобно миксомицетам и акразиям. Передовые клетки выделяют слизь, и последующие движутся за ними по слизистому следу. Опознаются колонии миксобактерий по ярко окрашенным плодовым телам, составляющим спорангии, иногда приподнятые над поверхностью на стебельках и имеющие размеры до 1 мм [13, с. 112 ].

Миксобактерий - аэробные органотрофы с выраженной гидролитической активностью. Особенностью миксобактерий является их способность коллективно лйзировать твердые частицы с помощью гидролитических ферментов. Часть из них обладает протеолитической способностью и лизирует клетки бактерий, попадающие под шварм. Поэтому миксобактерий относят к хищным бактериям. Однако некоторые миксобактерий способны лйзировать также целлюлозу. Часто они развиваются на навозе. В чистой культуре поддерживать удается только часть родов, и в природе их идентифицируют по спорангиям.

Основные роды миксобактерий следующие: не образующие спорангиев миксобактерий с веретеновидными клетками рода Myxococcus, у которого наиболее подробно изучена дифференциация в круглые микроцисты; Archangium с палочковидными микроцистами; Cystobacter, образующий спорангии без стебелька; Mellitangium и Stigmatella, - на стебельке. Клетки с прямыми концами имеет целлюлозолитический Polyangium, образующий округлые спорангии. Сложные плодовые тела имеют Nannocystis и Chondromyces.

Миксобактерии присутствуют повсеместно. Особенно обильно встречаются, по-видимому, в теплых, полусухих и сухих местообитаниях, таких как степи и полупустыни. Типичные местообитания миксобактерий - почвы с нейтральным рН и нормальным содержанием солей, разлагающийся органический материал, включая помет травоядных животных и гниющую древесину, кора живых и отмерших деревьев, а также пресная вода.

Миксобактерий в природе играют очень важную роль. Многие представители этой группы активно разрушают мертвые растительные остатки (целлюлозу) и соединения, содержащиеся в наружных покровах насекомых и ракообразных (хитин), превращая их в вещества, пригодные для питания растений.

Многие плодоносящие бактерии способны к внеклеточному паразитизму. Не проникая внутрь клеток жертв других бактерий и некоторых высших грибов, они вызывают их разрушение (лизис), используя освобождающиеся при этом вещества как пищу. Известны также случаи паразитизма флексибактерии на водорослях.

Заключение

Итак, Миксобактерии (Myxococcales) - ряд бактерий, живущих преимущественно в почве. Миксобактерии имеют очень большие геномы сравнению с другими бактериями, достигая 9 - 10 миллионов пар нуклеотидов. Миксобактерия Polyangium cellulosum имеет самый известный (на 2003 год) бактериальный геном, в 12,2 миллиона пар нуклеотидов. Миксобактерии относитесь к типу протеобактериям (Proteobacteria), большой группы грамотрицательных бактерий. Наиболее известный член этой группы - миксобактерия Myxococcus xanthus, так популярна у исследователей благодаря простоте выращивания в лабораторных условиях.

Миксобактерии активно двигаются с помощью скольжения, которое включает в себя два независимых механизма: A-движение (от англ. Adventurous) и S-движение (от англ. Social). A-движение позволяет каждому бактерии передвигаться изолированно от других бактерий и потребует выделения слизи, хотя его точный механизм еще не известен. S-движение эффективно используется для передвижения в крупных группах и требует использования ворсинок IV типа. При этом методе движения ворсинки протягиваются из одного полюса бактерии, связываются с подкладкой или иной бактерией, и втягиваются обратно.

Миксобактерии питаются за счет охоты на других бактерий. Они обычно путешествуют в больших группах, составленных из многих бактерий, содержащихся вместе межклеточными молекулярными сигналами и ворсинками. Такая высокая концентрация бактерий необходима, чтобы обеспечить высокую концентрацию внеклеточных ферментов для того, чтобы убивать и переваривать добычу. Миксобактерии производят и выделяют целый ряд химических веществ полезных для биомедицинской промышленности, например некоторые антибиотики.

Когда пищи не хватает, миксобактерии создают фруктовые тела, составленные из сотен тысяч бактерий, где они превращаются в микроспоры, способные выдерживать периоды засухи и других неблагоприятных условий. Этот процесс контролируется многими химическими сигналами, которые они выделяют. Эти фруктовые тела могут принимать различные формы и цветов, зависимости от разновидности миксобактерий. Когда условия становятся более благоприятными, эти споры превращаются обратно на палочковидных бактерий, с одной фруктового тела могут уже сформировать большую группу, способную для охоты. Подобные жизненные циклы развитые среди определенных амеб.

Список литературы

1. Альф С.А., Мишустин Е.Н., Перцовский М.Ш., Хлебников Н.И. Показатели санитарного состояния почвы населенных мест. 1957, "Медгиз", 95 - 110.

2. Альф С.А., Мишустин Е.Н., Перцовский М.Ш., Хлебников Н.И. Показатели санитарного состояния почвы населенных мест. 1957, "Медгиз", 95 - 110.

3. Асонов Н.Р. Микробиология: Учебник -4-е изд., перераб. и доп.- М.: КолосC,2007.-352с.

4. Белясова,Н.А. Микробиология: Учебник / Н.А. Белясова. - Мн.: Вышэйшая шк., 2012. - 443 c.

5. Брюханов А.Л. Молекулярная микробиология: Учебник для вузов / А.Л. Брюханов, К.В. Рыбак, А.И. Нетрусов. - М.: МГУ, 2012. - 480 c.

6. Быков А.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебник для студентов среднего профессионального образования / А.А. Воробьев, А.С. Быков, Е.П. Пашков; Под ред. А.А. Воробьев. - М.: ИЦ Академия, 2009. - 288 c.

7. Воробьев А.А. Основы микробиологии и иммунологии: Учебник для студентов среднего профессионального образования / В.В. Зверев, Е.В. Буданова, А.А. Воробьев; Под ред. В.В. Зверев. - М.: ИЦ Академия, 2012. - 288 c.

8. Горбов В.А., Рябов В.Н., Пероцкая А.С., Чернаенко Т.Д. Микрофлора почвы и ее санитарное значение, в кн. "Основные вопросы санитарной охраны почвы". 1965, Из-во "Медицина", 94 - 110.

9. Горбов В.А., Рябов В.Н., Пероцкая А.С., Чернаенко Т.Д. Микрофлора почвы и ее санитарное значение, в кн. "Основные вопросы санитарной охраны почвы". 1965, Из-во "Медицина", 94 - 110.

10. Гордейчик В.И. Основы микробиологии, санитарии и гигиены: Учебное пособие / В.И. Гордейчик. - Мн.: Беларуская Энц., 2010. - 199 c.

11. Горохова С.С. Основы микробиологии, производственной санитарии и гигиены: Учебное пособие / С.С. Горохова, Н.А. Прокопенко, Н.В. Косолапова. - М.: ИЦ Академия, 2012. - 64 c.

12. Госманов Р.Г. Микробиология: Учебное пособие / Р.Г. Госманов, А.К. Галиуллин, А.Х. Волков. - СПб.: Лань, 2011. - 496 c.

13. Джей, Д.М. Современная пищевая микробиология / Д.М. Джей, М.Д. Лесснер; Пер. с англ. Е.А. Баранова. - М.: БИНОМ. ЛЗ, 2012. - 886 c.

14. Долганова Н.В. Микробиология рыбы и рыбных продуктов: Учебное пособие / Н.В. Долганова, Е.В. Першина, З.К. Хасанова. - СПб.: Лань, 2012. - 288 c.

15. Донецкая Э.Г. Клиническая микробиология: Руководство для специалистов клинической лабораторной диангостики / Э.Г. Донецкая. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 480 c.

16. Емцев В.Т. Микробиология: Учебник для вузов / Емцев В.Т Мишустин Е.Н. - 5-е изд.; перераб. и доп. - М.Дрофа.2008. - 448 с.

17. Зыкин Л.Ф. Современные методы в ветеринарной микробиологии / Л.Ф. Зыкин, З.Ю. Хапцев, Т.В. Спиряхина. - М.: КолосС, 2011. - 109 c.

18. Ивчатов А.Л. Химия воды и микробиология: Учебник / А.Л. Ивчатов, В.И. Малов. - М.: НИЦ ИНФРА-М, 2013. - 218 c.

19. Инструкция по санитарно-бактериологическому исследованию почвы населенных мест. Москва, 1958.

20. Инструкция по санитарно-бактериологическому исследованию почвы населенных мест. Москва, 1958.

21. Камышева К.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие / К.С. Камышева. - Рн/Д: Феникс, 2012. - 281 c.

22. Караулов А.В. Иммунология, микробиология и иммунопатология кожи / А.В. Караулов, С.А. Быков, А.С. Быков. - М.: БИНОМ, 2012. - 328 c.

23. Кисленко В.Н. Ветеринарная микробиология и иммунология. Практикум: Учебное пособие / В.Н. Кисленко. - СПб.: Лань, 2012. - 368 c.

24. Колычев Н.М. Ветеринарная микробиология: Учебник для вузов, - 3-е изд., перераб. и дп. - М.:Колос, 2009; М.: Колос, 2009. - 432 с.

25. Колычев Н.М., Госманов Р.Г., Ветеринарная микробиология и иммунология: учебник для вузов - 3-е издание. - М.: Колос, 2006. - 432 с.

26. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для медицинских вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - СПб.: СпецЛит, 2012. - 760 c.

27. Красникова Л.В. Микробиология: Учебное пособие / Л.В. Красникова. - СПб.: Троицкий мост, 2012. - 296 c.

28. Лоранский Д.Н. (под ред.). Руководство по санитарной охране почвы. М., "Медицина", 1972.

29. Лоранский Д.Н. (под ред.). Руководство по санитарной охране почвы. М., "Медицина", 1972.

30. Мармузова Л.В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности: Учебник для начального профессионального образования / Л.В. Мармузова. - М.: ИЦ Академия, 2013. - 160 c.

31. Мартинчик А.Н. Микробиология, физиология питания, санитария: Учебник для студентов сред. проф. учебных заведений / А.Н. Мартинчик, А.А. Королев, Ю.В. Несвижский. - М.: ИЦ Академия, 2012. - 352 c.

32. Мартинчик А.Н. Микробиология, физиология питания, санитария: Учебник для студентов сред. проф. учебных заведений / А.Н. Мартинчик, А.А. Королев, Ю.В. Несвижский. - М.: ИЦ Академия, 2013. - 352 c.

33. Мац Л.И., Маркина-Перцовская М.И. Почва, в кн. "Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования" под ред. М.О. Биргера, М., 1973, 394 - 404.

34. Мац Л.И., Маркина-Перцовская М.И. Почва, в кн. "Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования" под ред. М.О. Биргера, М., 1973, 394 - 404.

35. Микробиология: Учебник дл вузов / О.Д.Сидоренко, Е.Г.Борисенко, А.А.Ванькова, Л.И.Войнова. - М.: Инфа_М, 2008. - 287 с.

36. Нетрусов А.И. Микробиология. Университетский курс: Учебник для студентов учреждений высшего профессионального образования / А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. - М.: ИЦ Академия, 2012. - 384 c.

37. Перцовская М.И. Санитарная микробиология почвы. В кн. "Санитарная микробиология" (под ред. Г.П. Калины и Г.Н. Чистовича). 1969, Из-во "Медицина".

38. Перцовская М.И. Санитарная микробиология почвы. В кн. "Санитарная микробиология" (под ред. Г.П. Калины и Г.Н. Чистовича). 1969, Из-во "Медицина".

39. Перцовская М.И., Васильева О.И. Почва населенных мест. В кн. "Методы санитарно-бактериологических исследований внешней среды" (под ред. Г.П. Калины), 1966, 238 - 241.

40. Перцовская М.И., Васильева О.И. Почва населенных мест. В кн. "Методы санитарно-бактериологических исследований внешней среды" (под ред. Г.П. Калины), 1966, 238 - 241.

41. Прозоркина Н.В. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений / Н.В. Прозоркина, Л.А. Рубашкина. - Рн/Д: Феникс, 2013. - 378 c.

42. Просеков А.Ю. Общая биология и микробиология: Учебное пособие / А.Ю. Просеков. - СПб.: Просп. Науки, 2012. - 320 c.

43. Рубина Е.А. Микробиология, физиология питания, санитария: Учебное пособие / Е.А. Рубина, В.Ф. Малыгина. - М.: Форум, НИЦ ИНФРА-М, 2013. - 240 c.

44. Скокан Л.Е. Микробиология основных видов сырья и полуфабрикатов в производстве кондитерских изделий / Л.Е. Скокан, Г.Г. Жарикова. - М.: ДеЛи принт, 2006. - 148 c.

45. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов: Учебник дя вузов. - М., 2009. - 415 с.

46. Lars Jelsbak, Lotte Sшgaard-Andersen. «Pattern formation by a cell surface-associated morphogen in Myxococcus xanthus». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, vol. 99, p. 2032--2037.

47. Lars Jelsbak, Lotte Sшgaard-Andersen. «The cell surface-associated intercellular C-signal induces behavioral changes in individual Myxococcus xanthus cells during fruiting body morphogenesis». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol. 96, p. 5031-5036.

48. Lotte Sшgaard-Andersen, Dale Kaiser. «C factor, a cell-surface-associated intercellular signaling protein, stimulates the cytoplasmic Frz signal transduction system in Myxococcus xanthus». Developmental Biology, 1996, vol. 93, p. 2675--2679.

49. Lotte Sшgaard-Andersen. «Cell polarity, intercellular signalling and morphogenetic cell movements in Myxococcus xanthus». Current Opinion in Microbiology, 2004, vol. 7, p. 587--593.

50. Sune Lobedanz, Lotte Sшgaard-Andersen. «Identification of the C-signal, a contact-dependent morphogen coordinating multiple developmental responses in Myxococcus xanthus». Genes and Developement, 2003, vol. 17, p. 2151--2161.

51. Thomas Kruse, Sune Lobedanz, Nils Berthelsen, Lotte Sшgaard-Andersen. «C-signal: a cell surface-associated morphogen that induces and co-ordinates multicellular fruiting body morphogenesis and sporulation in Myxococcus xanthus». Molecular Microbiology, 2001, vol. 40, p. 156.

52. Размещено на Allbest.ru