Дизайн, синтез та дослідження регуляторних властивостей похідних 6 – азапіримідинів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Дизайн, синтез та дослідження регуляторних властивостей похідних 6 - азапіримідинів

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Необхідність створення лікарських препаратів нового покоління є нагальною проблемою у зв'язку з поширенням нових небезпечних захворювань, таких як СНІД і гострий респіраторний синдром, та виникненням стійких до існуючих ліків штамів низки патогенних агентів та форм тяжких недуг.

Відомо, що азотовмісні гетероцикли (азоли, азини, тіазини, тіазоли, оксазоли тощо) відіграють важливу роль у функціонуванні живої клітини. Їхні фрагменти присутні у найважливіших біомакромолекулах будь-якого організму. Крім того, ці сполуки та їхні похідні є ефективними фармакофорами. Тому пошук біологічно ефективніших представників цього класу сполук є актуальним як з наукової (інструментарій молекулярно-біологічних досліджень), так і з практичної (хіміотерапевтичні препарати) точки зору.

Препарати, отримані на основі азапіримідинів, мають широкий спектр біологічної дії. Так, зокрема, похідним 6-азацитозину притаманні противірусні, протипухлинні та антимікробні властивості. Останнім часом поновився інтерес до ненуклеозидних інгібіторів (ННІ) - модифікованих піримідинів та їхніх азааналогів і нині на основі триазинових та піримідинових сполук вже синтезовано кілька серій інгібіторів зворотної транскриптази вірусу імунодефіциту людини (ЗТ ВІЛ). Виявилося, що ці препарати здатні суттєво пригнічувати ЗТ мутантних форм ВІЛ, які вже втратили чутливість до класичних інгібіторів.

Сучасний рівень наукових знань передбачає якісно нові, комплексні підходи до дизайну селективних і ефективних хіміотерапевтичних препаратів: комп'ютерне моделювання просторової структури ліганду, його докінг із моделлю сайту зв'язування ферментативної мішені та подальше вдосконалення базової молекули введенням фармакофорних замісників, покликаних підвищувати селективність дії вибраних сполук та їхню ефективність. Скринінг перспективних лігандів на ферментативних та клітинних модельних системах дозволяє виявити найперспективніші молекулярні структури. Такі комплексні підходи дозволяють значно скоротити та здешевити хімічний синтез та доклінічні дослідження на тваринах і підвищити ступінь розуміння механізмів біологічної дії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційний матеріал відповідає планові науково-дослідних робіт відділу синтетичних біорегуляторів Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Її виконано за бюджетною темою «Розробка нових інгібіторів синтезу нуклеїнових кислот на основі кон'югатів функціонально заміщених триазинів та феназинів» (№ держреєстрації 0103U000071, 2003-2007 рр.) та в рамках науково-дослідних проектів: «Створення нового противірусного і протимікоплазменного препарату на основі субстанції 6-азацитидину» (програма «Фонд прикладних досліджень» ДКНТ України, № держреєстрації 0197U016205, 1997-2000 рр.), «Дослідження фізико-хімічних особливостей внутрішньомолекулярної організації нуклеозидів триазинового ряду, що зумовлюють їхню біологічну активність» (програма НАН України «Молекулярні основи функціонування геному та його регуляція», № держреєстрації 0104U000436, 2002-2006 рр.) та «Високоефективні інгібітори для боротьби із збудниками мікозів та мікотоксикозів людини на основі заміщених амідів триазиніл-6-пропанкарбонової кислоти» (цільова програма НАН України, № держреєстрації 0106U000541, 2004-2006 рр.).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - комплексний дизайн низки біологічно активних сполук - низькомолекулярних регуляторів синтезу нуклеїнових кислот (НК) на основі азапіримідинових основ, триазинів з оксо-, тіоксо- і аміногрупами та їхніх кон'югатів з фармакофорними молекулами.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Розробити ефективні методи синтезу похідних азапіримідинів, заміщених різними фармакофорами, та їхніх кон'югатів з феназин-1-карбоновою кислотою (ФКК-1). Отримати ці сполуки у кількостях, необхідних для експериментальних досліджень, та підтвердити їхню будову фізико-хімічними методами.

2. На модельній системі транскрипції експериментально проаналізувати біорегуляторні властивості отриманих сполук та встановити зв'язок «структура-біоактивність.»

3. Сучасними методами квантової хімії здійснити конформаційний аналіз синтезованих азапіримідинів та їхніх феніламінопохідних, а також дослідити структурно-енергетичні властивості таутомерних форм. Встановити структуру енергетично найвигідніших комплементарних пар зазначених похідних з природними нуклеозидами.

4. Квантово-хімічним методом функціоналу густини змоделювати структуру молекулярної мішені - каталітичного сайту ДНК-залежної РНК полімерази фага Т7 (Т7-РНКП), та вивчити особливості взаємодії з нею базових азапіримідинових сполук.

5. Неемпіричними квантово-хімічними методами вивчити конформаційні можливості 6-азацитидину і деяких його аналогів та дослідити взаємодію цих сполук з модельним каталітичним сайтом Т7-РНКП.

Об'єкт дослідження: механізм взаємодії молекулярної моделі каталітичного центру Т7-РНКП та похідних 6-азацитозину і 6-азацитидину.

Предмет дослідження: комплексний дизайн та синтез низькомолекулярних біорегуляторів.

Методи дослідження: напівемпіричні (РМЗ) і неемпіричні (МР2 6-311++G (3df, 3pd), МР2-6-311++-G (d, p), MP2/6-31G (d, p), DFT/6-31G (d, p) і НF/6-31G (d, p)) квантово-хімічні методи; метод молекулярної механіки у силовому полі ММFF, органічний синтез; УФ-, ІЧ - та ¹H ЯМР-спектрометрія; тонкошарова хроматографія (ТШХ).

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано серію раніше не описаних в літературі функціонально заміщених похідних азапіримідинових основ та їхніх кон'югатів з ФКК-1. В результаті вперше проведених досліджень низки нових фенілзаміщених похідних азапіримідинових основ та їхніх кон'югатів на модельній системі транскрипції in vitro виявлено їхні біорегуляторні властивості. Вперше проведено конформаційний аналіз низки нових амінопохідних 6-азапіримідинів, кон'югатів на основі похідних ФКК-1 і триазинів та аномального нуклеозиду 6-азацитидину квантово-хімічним методом ab initio на рівні теорії B3LYP/6-31G (d, p) //HF6-31G (d, p).

Отримані результати істотно розширюють і поглиблюють існуючі уявлення про конформаційну варіабельність та протонну рухливість похідних азапіримідинових основ, та про можливі молекулярні механізми біологічної дії останніх. Виявлені особливості сполук дозволяють стверджувати, що досліджені структури мають «універсальний» характер, оскільки утворюють водневі зв'язки як з канонічними пуриновими, так і з піримідиновими основами ДНК.

Сучасними методами обчислювальної біології вперше створено молекулярну модель каталітичного сайту Т7-РНКП та in silico вивчено особливості взаємодії створених сполук з цією молекулярною мишенню. Встановлено можливий молекулярний механізм дії на мішень амінопохідних 6-азапіримідинів, композитних сполук та нуклеозидів 6-азацитозину. Застосування цього підходу дозволило виявити втручання азануклеозиду у тонкий механізм відбору «правильного» нуклеотиду, яке відіграє вирішальну роль у пригніченні транскрипції, що підтверджене в експериментах in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено високоефективні та технологічно зручні методи синтезу біологічно активних похідних азапіримідинових основ та їхніх кон'югатів з ФКК-1. На модельній системі транскрипції in vitro вперше виявлено групу ефективних регуляторів біосинтезу РНК. Встановлено, що саме замісники у 2 - та 4-положеннях гетероциклу відповідають власне за біорегуляторні властивості сполук, а природа фармакофорного замісника визначає рівень їхнього прояву. Отримані результати щодо таутомерних та конформаційних властивостей досліджених сполук і особливостей взаємодії цих речовин з каталітичним сайтом ферменту можуть бути корисними для планування експериментів з конструювання нових біологічно-активних сполук. Скринінг синтезованих препаратів на різних тест-системах дає підстави сподіватися на можливість використання їх як перспективних антимікробних та протипухлинних засобів.

Результати роботи підтверджують продуктивність обраного комплексного підходу: він може бути корисним як при дизайні нових біологічно-активних сполук, так і при вивченні їхніх молекулярних механізмів дії.

Особистий внесок здобувача. У всіх опублікованих у співавторстві наукових працях за темою дисертації особистий внесок здобувача полягає у власноруч проведених хімічних експериментах, комп'ютерних обчисленнях, аналізі та інтерпретації отриманих результатів і зіставленні їх із літературними даними, обговоренні результатів, написанні наукових праць та оприлюдненні отриманих результатів на наукових конференціях, з'їздах тощо. Дослідження протипухлинної активності проводилися у Національному інституті раку (США) та в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Е. Кавецького НАН України. Дослідження на бактеріях та міцеліальних і дріжджеподібних грибах проведено на кафедрі мікробіології ветеринарного факультету Національного аграрного університету УААН. Тестування іn vitro з використанням Т7-РНКП виконані в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України у відділі синтетичних біорегуляторів. Постановку наукових завдань дослідження та подальшу інтерпретацію результатів здійснено спільно з науковим керівником к.х.н. Пальчиковською Л.Г. та науковим консультантом д.б.н. Шведом А.Д. Розробку методик хімічного синтезу проводили спільно з к.х.н. Алексєєвою І.В. Консультацію з постановки розрахункових експериментів та аналізу їхніх результатів проведено з д.б.н., проф., член-кор. НАНУ Говоруном Д.М. Тестування на бактеріях та міцеліальних і дріжджеподібних грибах проведено спільно з к.б.н. Баштою Е.В.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на XVIII Українській конференції з органічної хімії (Дніпропетровськ, 1998), XII Міжнародному симпозіумі з хімії природних сполук (Бухара, Узбекістан, 1998), Міжнародній конференції «Хімія азотовмісних гетероциклів» (Харків, 2000), 1 Міжнародній конференції «Біологія та генетика» (Київ, 2001), XIII Міжнародному симпозіумі «Молекулярні аспекти хіміотерапії» (Гданськ, Польща, 2001), 8-му Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), 4-ій Парнасівській конференції «Молекулярні механізми клітинної активації: біологічні сигнали та їх ферментативні мішені» (Вроцлав, Польща, 2002), Молодіжній конференції з молекулярної біології (Київ, 2003) та Міжнародній конференції «Сучасні проблеми теоретичної фізики» (Київ, 2003), ІІІ Міжнародній конференції «Зв'язок та молекулярна взаємодія» (Київ, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 19 наукових праць, із них - 8 статей у фахових журналах, та тези 11 доповідей у збірниках матеріалів з'їздів і конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини, узагальнення одержаних результатів, висновків і списку використаних джерел. Повний обсяг дисертації складає 124 сторінки, містить 30 рисунків і 15 таблиць. Cписок використаних джерел складає 138 найменувань.

Основний зміст роботи

азацитидин азапіримідин фармакофор феназин

Матеріали і методи дослідження. Низькомолекулярні біорегулятори на основі функціонально заміщених 3 (5) - амінотриазинонів одержували реакцією вихідних 3 (5) - алкілмеркаптопохідних з відповідним амінозамісником. Феназино-триазинові кон'югати отримували конденсацією натрієвої солі 5-меркапто-6-азаурацилу з галоїдвмісними похідними ФКК-1 та 4-алкілмеркапто-6-азаурацилу з N₁ - (2-аміноетил) - амідом або гідразидом ФКК-1. Перебіг реакцій контролювали методом ТШХ на пластинах «Merck» (Німеччина). Індивідуальність та чистоту синтезованих сполук контролювали сукупністю фізико-хімічних методів, а саме - УФ, ІЧ - та ЯМР-спектроскопією. Оптичні спектри електронного поглинання записували на спектрофотометрі Specord UV - VIS («Сarl Zeiss», Німеччина). Спектри ¹Н ЯМР реєстрували на спектрометрі «VARIAN» - 300 (США) в DMSO-d6 з використанням тетраметилсилану як внутрішнього стандарту.

Напівемпіричні квантово-хімічні розрахунки проводили методом РМ3, неемпіричні - методом ab initio на рівні теорії МР2 6-311++G (3df, 3pd) // МР2-6-311++-G (d, p). Коливальні спектри розраховували в гармонійному наближенні, використовуючи масштабний множник для частот 0,94. Застосовано вільно поширювані програмні пакети GAMESS (US) та NWChem 4.5. Використано такі просторові моделі Т7-РНКП, PDB ID: 1QLN, 1S77, 1S0V, 1MSW, 1CEZ та 1H38. До моделі активного центру полімерази залучали найближчі амінокислотні залишки, а саме - TYR 639, HIS 788, ARG 423, ARG 425, HIS 811 і TYR 422 (PBI ID: 1S0V).

Усі обчислювальні експерименти виконано на високопродуктивному кластері Інформаційно - обчислювального центру Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Результати досліджень та їх обговорення.

Синтез похідних 6-азапіримідинонів та їхніх кон'югатів з феназин-1-карбоновою кислотою. Введення функціональних груп в електронодефіцитні положення 6-азапіримідинового циклу здійснювали нуклеофільним заміщенням реакційноздатних метилмеркапто - або бензилмеркаптогруп відповідними аміно замісниками (В). Використання як вихідного 2-бензилмеркапто-6-азатиміну (A) дозволило синтезувати його 2-амінопохідні 1-11 з достатньо високими виходами.

Отримані сполуки - кристалічні, безбарвні, з високою температурою плавлення, стабільні при зберіганні, розчинність речовин у воді та спиртах обмежена, фізико-хімічний аналіз підтвердив можливість їхнього існування в аміно - та іміно - таутомерних формах.

Встановлено нееквівалентність протонів екзо-аміногрупи 6-азацитозину. Імовірне пояснення - утворення одним з атомів водню Н-зв'язку з сусіднім атомом азоту у положенні 3 циклу. Натомість екзо-циклічна група 5-метил-6-аза-ізоцитозину не має такої аномалії.

Аналізуючи спектральні дані синтезованих 2-бензиламінопохідних базової сполуки 1 суттєвих змін у ЯМР - та УФ - спектрах, які слугують джерелом інформації про таутомерний статус сполук, не зафіксовано. Сигнал протонів метиленової групи у складі С2-замісника розщеплений екзо-амінопротоном (спектр ¹Н ЯМР) і реєструється у вигляді дублету, що виключає існування іміноформи. Порівнюючи зареєстровані нами величини хімічних зсувів амінопротонів триазинового кільця і протонів екзо-NH груп з літературними даними, можна припустити, що вищезгадані сполуки існують у формі пара-хіноїдних таутомерів (рис. 1). УФ-спектри одержаних похідних також свідчать про пара-хіноїдну структуру. Основна смуга поглинання амінопохідних 3 - 11 знаходиться поблизу максимуму 6-aza-isoCyt або має прихований максимум поблизу 250 нм, що збігається з даними для відповідних амінопохідних триазин-нуклеозидів з фіксованою парахіноїдною структурою. У такий же спосіб доведено існування 4-бензиламіно-таутомерів для досліджуваних похідних 6-азацитозину.

Щодо арилзаміщених аміно-похідних базових основ 1 і 12, то вплив природи і положення замісника у фенільному радикалі значно ускладнює визначення таутомерної форми амінопохідних 3-5, 14-16, 18-22 через значні розбіжності у перерозподілі електронної густини у таких структурах порівняно з базовою молекулою. Це суттєво відбивається як на положенні максимумів поглинання УФ спектрів, так і значеннях хімзсувів сигналу протону груп NH.

Властивість похідних феназину «обманювати» множинну резистентність до лікарських препаратів спонукала нас до залучення ФКК-1 як другого композиційного фрагмента при створенні кон'югатів феназин-1-карбонової кислоти (28) та похідних 6-азапіримідинів. Це передбачає конструювання лінкерного ланцюжка, що з'єднує обидва гетероцикли. Спейсер нарощували за рахунок введення різних алкілдіаміногруп до молекули ФКК-1. Для формування триазинового фрагмента використано 4 - та 5 - меркаптопохідні (38, 39) 6-азаурацилу, 38 - для конденсації з сполуками 31 та 32, які мають вільну NН₂ групу, 39 - з галоїд похідними ФКК-1 30 та 36 (рис. 2). Такому підходу було надано перевагу, беручи до уваги структурні особливості феназинового гетероциклу, які дозволяють отримувати монозаміщені аміди, застосовуючи симетричні алкілдіаміни. Подальша модифікація амідів ФКК-1 подовжує спейсерний ланцюг і утворює нову групу галоїдвмісних реакційноздатних синтонів.

Кон'югати з найкоротшим та найдовшим спейсерним ланцюгом (33 та 37) отримано конденсацією натрієвої солі 5-меркапто-6-азаурацилу з галоїдвмісними похідними ФКК-1. Кон'югати 34 та 35 одержували конденсацією відповідно N₁ - (2-аміноетил) - аміду ФКК-1 (31) та її гідразиду (32) з 4-метилмеркапто-6-азаурацилом.

Запропонована нами схема синтезу забезпечує відносну швидкість та продуктивність процесу конденсації. Одержані кон'югати - кристалічні, забарвлені (смуга поглинання при 370 - 400 нм) сполуки з високими температурами плавлення.

Розчинність синтезованих сполук у воді та спирті при кімнатній температурі обмежена; будову одержаних речовин підтверджено фізико-хімічними методами. В сполуках 35 і 37, що містять гідразогрупи, амінопротони реєструють у вигляді слабких розширених сигналів в ділянці 12,5-11,5 м.ч., тобто знаходяться у частковому обміні, і не можуть бути визначені достеменно. В той же час протон екзо-аміногрупи триазину потрапляє, на нашу думку, у ділянку екранування неподіленою парою електронів сусіднього атому азоту і реєструється при 8,6 м.ч.

За даними конформаційного аналізу встановлено принципові ознаки формування «складеної» просторової структури композитів - це внутрішньомолекулярні водневі зв'язки та стекінг-взаємодія ароматичних систем обох гетероциклів, що стабілізують конформації молекул.

Дані ¹Н-ЯМР- і УФ - спектроскопії підтверджують, що основними чинниками утворення «складеної» структури композитів є взаємодія між структурними елементами композитних доменів через Н-зв'язки.

Конформаційний аналіз модельних структур 6-азапіримідинів та їхніх феніламінопохідних. Модельні молекули мають арил - та арилалкільні фрагменти у положеннях 2 та 4 гетероциклу: N-феніл - та N-бензилпохідні 6-азацитозину (6-azaCyt), 6-аза-ізоцитозину (6-aza-isoCyt) і 5-метил-6-аза-ізоцитозину (5Me-6-aza-isoCyt).

Встановлено, що бензиламінопохідне 6-аza-іsоСyt посідає особливе місце поміж досліджуваних структур. Вісім енергетично найвигідніших його ізомерів - чотири прототропні таутомери та їхні чотири поворотні конформери - (6а-г, 6а* - г*, рис. 4) мають близькі значення відносних енергій, що лежать у межах 0:1,7 ккал / моль. Інші амінозаміщені 6-аza-іsоСyt і 6-аzaСyt такого широкого спектра енергетично близьких таутомерів не мають.

Енергетично найвигідніші таутомери досліджуваних сполук реалізуються завдяки міграції атома водню між атомами азоту N2 і N4 триазинового гетероциклу та екзоциклічним атомом азоту, утворюючи, в тому числі (поряд з іншими), парахіноїдні структури. Енольні таутомери виявилися менш поширені.

Для моделювання специфічної взаємодії амінопохідних 6-азаоснов з природними нуклеозидами відбирали їхні низькоенергетичні таутомери з найбільш вигідним і зручним для Н-зв'язування розміщенням донорних і акцепторних центрів та гідрофобного фрагмента у молекулах чотирьох модельних амінопохідних (3, 6, 14, 17) 6-аза-основ.

Відносна енергія утворення комплексів свідчить про реальну можливість їхнього існування. Пари, стабілізовані двома Н-зв'язками, мають енергію взаємодії (ДЕвз) у межах 15-18 ккал / моль, що відповідає енергії пари А:Т(U) (10,8 - 14,4 ккал / моль); пари з трьома водневими зв'язками (рис. 5) мають ДЕвз у межах 22-32 ккал / моль, що відповідає або перевищує енергію пар C:G (23-28 ккал / моль), а пара V має винятково високу ДЕвз - 40 ккал / моль.

Коли тип водневого зв'язку повністю збігається з існуючим у канонічній парі G:C, ДЕвз у парі найбільша, попри її конфігурацію (Вотсон-Криківська - V, IX, XII, XIII; перевернута Вотсон-Криківська - IV); просторове розташування гідрофобного фрагмента у комплексах V і IX відповідає положенню арильного замісника у парі Козарелі-Райта ХІV.

Таутомери аза-основ 3б і 6б, утворюючи комплекси, що імітують А:Т взаємодію, здатні і до нетрадиційного спарювання (Wobblе-пари). Їхня ДЕвз дорівнює або перевищує верхню межу значень енергії канонічної А:Т пари, орієнтація гідрофобного фрагмента у цих парах відповідає очікуваній.

Більшість амінозаміщених триазинів, залучених до утворення пар, надають перевагу Н-зв'язуванню з канонічними пуринами (рис. 5). Проте бензиламінопохідне 6 (у формі таутомерів 6а, 6а*, 6б, 6в) може виступати у ролі «універсальної основи», взаємодіючи як з піримідинами, так і з пуринами, що, на наш погляд, є наслідком низького енергетичного бар'єру інтерконверсії таутомерів (наприклад, перехід 6а* у 6в, тобто перенесення протону із положення N2 у N3 «коштує» всього лише 0,2 ккал / моль).

Таким чином, поєднання теоретичних та експериментальних досліджень виявило, що 2-амінопохідні 6-aza-isoCyt найбільше корелюють із структурними можливостями 6-ариламіноурацилу. Два таутомери феніл - та бензиламінопохідних 6-aza-isoCyt (3г* та 6в), імітуючи пуринову основу, утворюють доволі сильні Н-зв'язки з цитозином. Відносна енергія утворених пар дорівнює 40,1 та 28,0 ккал / моль відповідно.

Модельювання ділянки каталітичного сайту ДНК-залежної РНК полімерази фага Т7. За очікуваним механізмом дії ариламіди азаоснов мають формувати непродуктивний комплекс з матрицею і полімеразою. При цьому передбачається, що азапіримідинова основа утворює три Н-зв`язки з цитозином матричного ланцюга, імітуючи гуанін, а арильний фрагмент зв'язується з гідрофобною ділянкою ферменту і у такий спосіб стабілізує комплекс, що утворюється, перешкоджаючи нормальному перебігу ферментативної реакції.

Синтезовані сполуки, що відповідали змодельованим структурам, показали очікувану пригнічувальну дію на транскрипцію у безклітинній системі із використанням Т7-РНКП.

РНК-полімерази вивчають тривалий час, але механізм дії цих ферментів сформульовано лише в загальних рисах. Це пов'язано з наявністю багатьох субодиниць у складі більшості РНК-полімераз, що ускладнює їхнє вивчення. У зв'язку з цим, для вирішення дослідницьких завдань, зручно використовувати міні-РНК-полімерази - ферменти, здатні здійснювати повний транскрипційний цикл, які мають більш просту будову, як наприклад, Т7-РНКП.

Спираючись на дані рентгеноструктурного аналізу, нами побудовано молекулярну модель активного центру комплексу Т7-РНКП з матрицею, як найбільш вірогідну ділянку для контакту з ариламідами азаоснов. До її складу входять канонічна пара C:G та амінокислотні залишки Tyr 639, His 784, Arg 423, Arg 425, His 811, Tyr 427, які безпосередньо оточують та/або взаємодіють з нею і, як відомо, беруть участь у впізнаванні полімеразою «правильної» пари. Потім у модельному комплексі G було замінено на інгібітор, який утворює Wobble-пару з цитозином матричного ланцюга, та проведено розрахунки, які визначили характер взаємодії неканонічної пари з амінокислотним оточенням (рис. 6).

За аналізом модельного комплексу встановлено, що His784, Arg 425 та Tyr 639 безпосередньо взаємодіють з бензиламіно-6-аза-ізоцитозином, стабілізуючи потрійний непродуктивний комплекс інгібітор:матриця: полімераза завдяки водневим зв'язкам та стекінг-взаємодіям. Відносна стабільність утвореного комплексу підтверджується результатами біологічного тестування, при якому спостерігається пригнічення синтезу РНК в безклитинній системі за участі Т7-РНКП.

Конформаційні можливості аномального нуклеозиду 6-азацитидину (6-azaCyd). Конформаційний аналіз глікозидного похідного 6-азацитозину, для якого встановлено противірусну та протипухлинну дію, проводили у два етапи. Спочатку на рівні теорії HF/6-31G (d, p) в режимі повної оптимізації сканували гіперповерхню потенціальної енергії 6-azaCyd. Було виявлено усі локальні мінімуми -11 конформерів (включаючи глобальний мінімум - основний конформаційний стан), які лежать у діапазоні відносних енергій ? Е< 8,5 ккал / моль. П'ять енергетично найвигідніших із них утворюють такий ряд стабільності (отриманий на рівні теорії MP2/6-31++G (d, p) // MP2/6-31G (d, p). Відносна енергія включає нульову коливальну енергію, яку розраховано у гармонійному наближенні): С2' - endo-syn* = С2'-endo-syn < С3'-endo-anti < С3'-endo-syn < С2'-endo-anti.

Ці конформації є високополярними - їхні дипольні моменти лежать у діапазоні 4,4 - 10,4 D. Характерно, що перехід із основного конформаційного стану С2'-endo-syn* у вироджений з ним за енергією стан С2'-endo-syn відбувається шляхом синхронного повороту гідроксилів у положеннях С2' і С3' на кут 180^о навколо ординарних зв'язків C2'-O2' і C3'-O3' відповідно (рис. 7).

Також зафіксовано суттєву залежність пірамідалізації аміногрупи основи від конформації нуклеозиду. Оскільки на відміну від ізольованої основи, де пірамідалізація аміногрупи має дзеркально-симетричний характер, у нуклеозиді ці властивості порушуються, то можна говорити про неплощинну будову фрагмента > C4NH₂ гетерооснови 6-azaCyd. Ми розцінюємо таку поведінку амінного фрагмента як прояв далекосяжного аномерного ефекту за участі вільної електронної пари аміногрупи та дипольного моменту цукрового залишку. Наголосимо, що всі ці структурні особливості 6-azaCyd мають внутрішньомолекулярне походження.

Цікаву інформацію отримано щодо внутрішньомолекулярних Н-зв'язків, які стабілізують енергетично найвигідніші конформації 6-azaCyd в ізольованому стані. Всі без винятку конформації 6-azaCyd мають внутрішньомолекулярний H-зв'язок О3'H…O2' (О2'H…O3' для конформації С2'-endo-syn*), локалізований у цукровому залишку. Найсильніший внутрішньомолекулярний Н-зв'язок O5'H…О2 спостерігається у конформації 6-azaCyd С2'-endo-syn*: вірогідно для цього тут складаються найсприятливіші стереоелектронні умови, внаслідок чого частота коливання н (О5'H) знижується на 120 см ^-1 порівнянно з незбуреним значення (середнє значення 80 см ^-1).

Крім того, показано, що конформація С3'-endo-anti/ар, яка є найближчою до тієї, що стабілізується у кристалі, має у вільному стані на 5,8 ккал / моль вищу енергію, ніж основні конформації С2'-endo-syn* і С2'-endo-syn 6-azaCyd. Таким чином, рентгеноструктурний аналіз дає обмежене уявлення про конформаційні можливості 6-azaCyd.

Нарешті, останній висновок стосується біохімічного значення одержаних даних. Як засвідчують отримані нами результати, немає вагомих підстав пов'язувати біологічну активність 6-azaCyd з конформацією, що спостерігається у кристалічному стані, як це нерідко зустрічається у літературних джерелах. Конформаційні можливості цього аномального нуклеозиду значно ширші - існує принаймні п'ять його конформацій з помітно нижчою енергією, ніж вищезгадана у кристалі, - що можуть бути найімовірнішими кандидатами на біологічно-активну «робочу» конформацію.

Порівняльний аналіз поведінки 6-азацитидину та його глікозидного аналога - ксилофуранозиду 6-азацитозину - у модельній системі ДНК залежної РНК полімерази фага Т7. Аналіз, проведений методом молекулярної механіки (ММ) у силовому полі MMFF для ксилофуранозиду 6-азацитозину, з урахуванням оточення свідчить про те, що положення гетероциклу у модельній системі майже не змінюється, порівняно з рибофуранозидом (за даними рентгеноструктурного аналізу). Що ж стосується цукрового залишку, то він, маючи свободу обертання навколо глікозидного зв'язку, утворює 3 неканонічні координаційні зв'язки з іоном Mg²⁺, які стабілізують інше положення глікозиду цього азануклеозиду в каталітичному сайті.

Оптимізація геометрії комплексу Mg²⁺ - ксилофуранозид 6-азацитозину показала, що іон Mg²⁺ координований атомами О3`, О4`, О5` та N6 азануклеозиду з довжиною координаційних зв'язків 2,05; 1,99; 2,09 та 2,12 ?, відповідно. Значення заряду на атомі азоту N6 гетероциклічної основи при такій конфігурації комплексу становить 0,418е, що майже на порядок перевищує аналогічний заряд для молекули у вільному стані - 0,053е. Тобто, атом азоту N6 набуває властивості утворювати сильні координаційні зв'язки.

Ускладнення системи введенням залишку тирозину, призводить до додаткової координації іона Mg²⁺ фенільним гідроксилом тирозину, утворюючи «павутину» відповідних координаційних зв'язків з атомами О3`, О4, О5, N6 ксилофуранозиду та гідроксилом тирозину на відстанях - 2,08; 2,08; 2,19; 2,26 та 2,01 ? відповідно. У такій конфігурації ароматичне кільце тирозину та 6-азацитозину є планарними і лежать майже в одній площині (рис. 8), що є важливим для комплементарної взаємодії з відповідною нуклеотидною основою.

У випадку рибофуранозиду 6-азацитозину ми отримали іншу картину: координація іона Mg²⁺ в утвореному комплексі здійснюється чотирма, а не п'ятьма, як у попередньому випадку, центрами - О4', О5' рибози, N6 основи та ОН тирозину, оскільки атом О3' цукрового фрагмента просторово недоступний. Площини ароматичних кілець основи і тирозину розміщуються під кутом одна до одної.

Таким чином, методами обчислювальної біології на моделі каталітичного сайту Т7-РНКП вперше виявлено, що азануклеозиди можуть втручатися в механізм відбору правильного субстрату для синтезу НК. Низка сильних координаційних зв'язків іона Mg²⁺ з азануклеозидом і з ОН групою Tyr 639 перешкоджають або значно ускладнюють як впізнавання субстрату, так і подальшу участь металу у каталітичному акті. Це має суттєве значення у пригніченні процесу транскрипції, яке спостерігається в експерименті іn vitro.

Дослідження біологічної активності змодельованих та синтезованих похідних 6 - азапіримідинів. Скринінг синтезованих похідних азапіримідинів та кон'югатів виявив серед похідних 5-метил-6-аза-ізоцитозину низку перспективних інгібіторів росту деяких видів бактерій та міцеліальних і дріжджеподібних грибів.

Протипухлинну активність сполук досліджували на 60 лініях пухлинних клітин. Найбільш виражений цитотоксичний ефект отримано для кон'югатів 6 - (2-оксо-2-феназин-1-іл-етил)-2H - [1,2,4] триазин - 3,5 - діон, феназин-1-карбонова кислота [2 - (3,5 - діоксо - 2,3,4,5 - тетрагидро - [1,2,4] триазин-6-іламіно) - етил] - амід (33 та 37) щодо деяких клітинних ліній лейкемії, меланоми, пухлин передміхурової залози та головного мозку.

Тестування похідних азапіримідинів та їхніх кон'югатів в безклітинній системі транскрипції з використанням Т7-РНКП (матриця pTZ19, зі вставкою 341 н.п.) виявило інгібіторні властивості вищезгаданих сполук. Ефективність пригнічення синтезу істотно залежить від структури та положення замісників у фармакофорних фрагментах.

Як РНК-, так і ДНК - полімерази каталізують одну й ту ж хімічну реакцію - утворення фосфодіефірного зв'язку при взаємодії 3' - гідроксильної групи з -фосфатом субстратної молекули (d) NTP. Досягнутий останнім часом прогрес в галузі рентгеноструктурного аналізу ферментів обміну нуклеїнових кислот виявив значну топологічну подібність тривимірних структур еволюційно далеких і функціонально різних полімераз. Особливо подібні субдомени ?долоні?, де зосереджено саме консервативні мотиви А і С, що здійснюють каталітичну функцію ферментів і присутні в усіх без винятку РНК- і ДНК-полімеразах. На нашу думку біологічна активність змодельованих та синтезованих сполук може реалізуватися через синтез РНК і ДНК.

Висновки

Використання підходу, що охоплює комплексне моделювання інгібіторів з урахуванням структури потенційної мішені та синтезу змодельованих сполук, дозволило виявити декілька серій нових сполук - регуляторів синтезу РНК. Запропоновано молекулярний механізм їхньої дії на прикладі модельної (Т7-РНКП) полімерази.

1. Синтезовано серію (близько 100) нових функціонально заміщених похідних азапіримідинових основ та їхніх кон'югатів з ФКК-1. Розроблено високоефективні та технологічно зручні методи синтезу біологічно активних представників сполук цієї серії.

2. Виявлено «універсальний» характер амінопохідних 6-азапіримідинів, а саме - здатність утворювати водневі зв'язки як з канонічними пуриновими, так і піримідиновими основами ДНК.

3. Встановлено, що формування «сендвічевої» просторової структури композитів залежить від довжини спейсерного ланцюга і визначається внутрішньомолекулярними Н-зв'язками та стекінг-взаємодією ароматичних систем обох гетероциклів.

4. Вперше змодельовано взаємодію синтезованих сполук з ділянкою каталітичного сайту ДНК-залежної РНК - полімерази фага Т7 та встановлено, що стабілізація потрійного непродуктивного комплексу інгібітор:матриця: полімераза відбувається за рахунок безпосередньої взаємодії бензиламіно-6-аза-ізоцитозину з His784, Arg 425 та Tyr 639. Вперше зафіксовано також здатність азануклеозидів втручатися у механізм відбору «правильного» субстрату, координуючи разом з ОН групою Tyr 639 іон Mg²⁺, що перешкоджає або ускладнює подальшу участь металу у каталітичному акті.

5. На модельній системі транскрипції in vitro та на тест-культурах деяких видів бактерій та міцеліальних і дріжджеподібних грибів зафіксовано інгібіторні властивості нових фенілзаміщених похідних азапіримідинових основ та їхніх кон'югатів. Цитотоксичний ефект виявлено для кон'югатів та глікозидних аналогів 6-азацитидину щодо деяких клітинних ліній лейкемії, меланоми, пухлин молочної і передміхурової залози та пухлин головного мозку.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Башта О.В., Платонов М.О. Фунгістатична активність сполук азапіримідинового ряду по відношенню до мікофлори колосу озимої пшениці // Бюлетень Інституту сільскогосподарської мікробіології УААН. - 2000. - №7. - С. 90-91. Особистий внесок: Синтез похідних азапіримідинів.

2. Алексеева И.В., Пальчиковская Л.И., Харченко С.Н., Башта Е.В., Платонов М.О., Костина В.Г., Усенко Л.С., Лысенко Н.А., Малько В.А. Новые производные 6-азаурацила - амиды as-триазинкарбоновых кислот: синтез и антимикробная активность // Біополімери і клітина. - 2002. - Т.18, №3. - С. 237 - 242. Особистий внесок: синтез амідів 6-азаурациліл-5-тіооцтової кислоти, розробка нових методик синтезу.

3. Пальчиковська Л.Г., Платонов М.О., Алексєєва І.В., Швед А.Д. Композитні біорегулятори на основі похідних феназин-1-карбоновоі кислоти і триазинів. Синтез та структурні характеристики // Біополімери і клітина -2003. - Т.19, №3. - С. 281-286. Особистий внесок: синтез композитних біорегуляторів, квантово-хімічні розрахунки їхніх структур, обговорення результатів.

4. Платонов М.О., Говорун Д.М., Алексєєва І.В., Судаков О.О., Бойко Ю.В., Пальчиковська Л.Г. Неемпіричний квантово-хімічний конформаційний аналіз 6-азацитидину - модифікованого нуклеозиду широкого спектра біологічної дії // Доповіді НАН України. - 2004. - №3. - C. 163-169. Особистий внесок: квантово-хімічні розрахунки, обговорення результатів.

5. Пальчиковська Л.Г., Платонов М.О., Алексєєва І.В., Швед А.Д. Дизайн потенційних інгібіторів транскрипції на основі похідних 6-аза-цитозину та 6-аза-ізоцитозину. 1. Квантово-хімічний структурний аналіз, синтез та фізико-хімічні дослідження // Біополімери і клітина. - 2004. - Т.20, №1-2. - С. 131 - 142. Особистий внесок: синтез похідних 6-аза-цитозину та 6-аза-ізоцитозину, квантово-хімічні розрахунки таутомерів, моделювання комплементарної взаємодії з канонічними основами.

7. Пальчиковська Л.Г., Платонов М.О., Алексєєва І.В., Швед А.Д. Механізм взаємодії N1-глікозидів 6-азацитозину з каталітичним сайтом ДНК-залежної РНК-полімерази фага Т7: модельне квантово-хімічне дослідження // Біополімери і клітина. - 2005. - Т.21, №6. - С. 559-561. Особистий внесок: моделювання каталітичного сайту, квантово-хімічні обчислення і аналіз та інтерпретація результатів.

8. Карпова І.С., Пальчиковська Л.Г., Корецька Н.В., Платонов М.О., Коваленко Е.О., Гетьман К.І. Лектини модулюють цитостатичну дію композитних біорегуляторів - кон'югатів аза-аналогів піримідину та феназин-1-карбонової кислоти в тест-системі Bacillus subtilis // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т.78, №5. - С. 93-100. Особистий внесок: синтез кон'югатів азаоснов та феназин - карбонової кислоти.

9. Платонов М.О., Пальчиковська Л.Г., Башта Е.В., Іванов А.А., Шумейко Е.О. Синтез та біологічна активність нових похідних 6-азаурацилу та 6-азацитозину // Тези доп. конф. «Хімія азотовмісних гетероциклів». - Харьків (Україна). - 2000. - С. 228. Особистий внесок: синтез похідних азапіримідинів.

10. Palchikovskaya L.I., Platonov M.O., Burjanovsky L.I., Alexeeva I.V., Shved А.D. New 6-azapyrimidine derivatives as nonnuсleoside inhibitors (NNI) of nucleic acid biosynthesis: modelling, synthesis and biological activity // Abstract book 8^th International symposium on Molecular aspect of chemotherapy. - Gdansk (Poland). - 2001. - P. 154. Особистий внесок: синтез кон'югатів, квантово-хімічні розрахунки, аналіз залежності «хімічна структура-біоактивність».

11. Platonov M.O., Palchikovskaya L.I., Burjanovsky L.I., Alexeeva I.V., Shved A.D. Sandwich-like 6-azapyrimidine - phenazine-1-carboxylic acid (PCA) conjugates: correlation between structure and bioactivity // Abstracts book of conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. - 2001. - Kyiv (Ukraine). - P. 114. Особистий внесок: квантово-хімічні розрахунки, QSAR аналіз.

12. Пальчиковська Л.Г., Китам О.Е., Платонов М.О., Алексєєва І.В., Швед А.Д. Застосування Т7 РНК - полімеразної системи для скринінгу інгібіторів біосинтезу нуклеїнових кислот // Матеріали Укр. біохім. з'їзду.-Чернівці (Україна). - 2002 - С. - 34. Особистий внесок: синтез біорегуляторів, аналіз залежності «хімічна структура-біоактивність».

13. Карпова І.С., Корецька Н.В., Пальчиковська Л.І., Платонов М.О., Алексєєв І.В. Сумісна дія лектинів та інгібіторів матричних процесів на ріст мутантів Bacillus subtilis з нормальною та пошкодженою системою репарації // ІХ Укр.біохім. з'їзду. - Чернівці (Україна). - 2006. - С. 96 - 97. Особистий внесок: синтез біорегуляторів.

14. Platonov M.O., Sudakov O.O., Palchykovska L.H., Alexeeva I.V., Boyko Y.V., Hovorun D.M. Non-empirical quantum-mechanical conformational analysis of 6-azacytidine - a modifited nucleoside of wide spectrum of biological activities // Abstracts book Internat. Conf. «Modern problem of theoretical physics». - Kyiv (Ukraine). - 2002. - P. 68. Особистий внесок: квантово-хімічні розрахунки та аналіз результатів.

15. Karpova I.S., Palchykovska L.H., Platonov M.O., Koretskaya N.V., Alexeeva I.V. Study of the combined effects of lectins and inhibitors of nucleic acid biosynthesis on microbial groth // Abstracts book of 4^th Parnas conference «Mol. Mechanisms of Cell activation». - Wroclaw (Poland). -2002. - P. 66. Особистий внесок: синтез біорегуляторів.

16. Platonov M.O., Palchykovska L.I., Alexeeva I.V. Prototropic tautomerism of the arylamino derivatives of 1,2,4 - triazine and their complementary binding to canonical DNA bases: comprehensive analysis // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. - Kyiv (Ukraine). - 2003. - Р. 194.

Особистий внесок: квантово-хімічні розрахунки та аналіз результатів.

17. Platonov M.O., Palchykovska L.I., Alexeeva I.V., Hovorun D.M. Prototropic tautomerism of 6-azacytosine molecule and its possible biological importance: post Hartee-Fock ab initio study at the level of theory MP2/6-311++G (3df, 3pd) // MP2/6-311++G (d, p) // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. - Kyiv (Ukraine). - 2003. - Р. 193. Особистий внесок: квантово-хімічні розрахунки.

18. Платонов М.О. Комп'ютерне моделювання потрійного непродуктивного комплексу Т7 РНК полімераза:матриця: бензиламіно-6-аза-ізоцитозин // Укр. биoхим. журн. - 2004 - Т.76, №4. - C. 22. Особистий внесок: квантово-хімічні розрахунки, створення моделі молекулярної мішені Т7-РНКП.

19. Platonov M.O., Palchikovska L.H., Alexeeva I.V., Shved A.D. Mechanism of 6-azacytosine N1-glycosides interaction with phage T7 DNA-dependent RNA polymerase catalytic site: nonempirical quantum-chemical study // Abstracts book of ІІІ Internat. Conference on Bonding and Molecular Interactions. - Kyiv (Ukraine). - 2006. - P. 136. Особистий внесок: квантово хімічні розрахунки глікозидів 6-азацитозину, створення моделі їхнього зв'язування в активному сайті Т7-РНКП.

Размещено на Allbest.ru