Особливості біохімічних змін та молекулярно-генетичний аналіз в сім’ях з високим ризиком хвороби Гоше

Размещено на http://allbest.ru

Размещено на http://allbest.ru

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Особливості біохімічних змін та молекулярно-генетичний аналіз в сім'ях з високим ризиком хвороби Гоше

1.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кінець ХХ сторіччя ознаменувався бурхливим розвитком молекулярної біології, значними науково-практичними досягненнями генної інженерії та клонування, появою нових перспектив для лікування навіть таких хвороб, що раніше вважались невиліковними і сублетальними (Басистова А.А. с соавт.,1999). Одним з найважливіших завдань сучасної медичної генетики є розробка підходів до корекції спадкових захворювань обміну речовин, в тому числі на доклінічному етапі (Chakrapani A. et all, 2001). Особливо помітні досягнення у вивченні лізосомних хвороб накопичення (ЛХН) - тяжких, нейродегенеративних захворювань, що пов'язані зі спадковими порушеннями роботи лізосомних гідролаз (Горбунова В.Н., Баранов В.С., 1997).

Серед найрозповсюдженіших і найбільш досліджених ЛХН з розробленим ефективним методом корекції особливе місце займає хвороба Гоше (ХГ). Саме науково-практичний підхід до лікування цієї хвороби став основою, моделлю для подальших розробок терапії інших ЛХН (Beutler E., Grabowski G.A., 2001).

Головною передумовою ефективного лікування ХГ є рання і точна діагностика цього захворювання. Характерною особливістю ЛХН взагалі, та ХГ зокрема, є значний клінічний поліморфізм, що суттєво ускладнює встановлення діагнозу на підставі клінічних і параклінічних даних. Наявність специфічних морфологічних маркерів (клітин Гоше) в кістковому мозку та в інших тканинах з високим ступенем вирогідності підтверджує діагноз хвороби, але не може бути основним критерієм тому, що ці клітини також виявляють і при інших спадкових та набутих захворюваннях, а саме при хворобі Німана-Піка, таласемії, лейкозах та ін. (Sidransky E. et all, 1995). Основним підтверджуючим методом діагностики ХГ вважається біохімічне виявлення зниженої глюкоцереброзидазної активності в тканинах організму - первинного біохімічного дефекту, що лежить в основі патологічного процесу і обумовлений мутаціями в гені глюкоцереброзидази (GBA) (Cox T.M., 2001). Разом з тим мутації у різних ділянках гену виникають з різною частотою та суттєво відрізняються за тяжкістю фенотипового прояву: або взагалі переривають роботу ферменту, або лише змінюють його структуру, що призводить до наявності високої залишкової активності (Hodanova K. et all). Це іноді значно ускладнює інтерпретацію результатів біохімічних досліджень, особливо при пограничних з нормою значеннях. Останнім часом обговорюється можливість використання в якості допоміжного біохімічного маркеру для діагностики ХГ хітотриозидазної активності плазми крові, збільшення якої є наслідком патологічного процесу накопичення нерозщеплених метаболітів у макрофагах (Бейер Е.М. с соавт., 2000). Але це збільшення теж не є специфічним і зустрічається при інших ЛХН (Guo Y., 1995). Остаточне підтвердження діагнозу ХГ можливе завдяки виявленню мутацій в обох алелях гену глюкоцереброзидази. Проте, особливості структури і розташування цього гену на хромосомі обумовлює існування багатьох рідкісних і ймовірність виникнення нових мутацій, що потребує залучення високо вартісних молекулярно-генетичних технологій для їх виявлення.

Дослідження генетичних особливостей та розповсюдженості мажорних мутацій ХГ серед різних східно-європейських популяцій мають велике наукове та практичне значення. Лише за умов визначення цих особливостей стає можливою розробка максимально ефективної діагностичної програми скринінгу пацієнтів певної популяції. В Україні генетична характеристика ХГ досі не вивчалась.

Таким чином, виникають складності при аналізі клінічних, параклінічних, морфологічних, імунологічних, біохімічних та молекулярно-генетичних методів дослідження для остаточного встановлення діагнозу хвороби Гоше та подальшого вчасного призначення специфічного лікування. У зв'язку з тим, що специфічне лікування є високовартісним, хибнопозитивна діагностика призводить до невиправданих витрат на діагностичні та лікувальні заходи при відсутності діагнозу ХГ (Germain D.P., 2004). З іншого боку, хибнонегативна та пізня діагностика ХГ призводить до незворотних патологічних процесів у організмі, і надалі лікування не є ефективним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу проведено в рамках тематичного плану науково-дослідних робіт Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика “Визначення ролі ендогенних та екзогенних факторів у виникненні та перебігу генної та хромосомної патології на різних етапах онтогенезу ” ( номер держреєстрації 0101U000231, 2001-2005рр.)

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було вивчення біохімічної та молекулярно-генетичної характеристики у осіб з підозрою на наявність хвороби Гоше серед родин високого ризику на Україні для розробки стратегії ранньої діагностики цієї патології.

Для досягнення мети, були поставлені такі завдання:

1. Розробити нормативні значення глюкоцереброзидазної та хітотриозидазної активності для населення України.

2. Визначити рівень глюкоцереброзидазної та хітотриозидазної активностей у пацієнтів з ХГ та у членів їх родин.

3. Провести скринінг мажорних мутацій у гені глюкоцереброзидази серед пацієнтів з ХГ.

4. Провести аналіз деяких морфологічних, біохімічних та молекулярно-генетичних маркерів при ХГ та оцінити їх значення для ранньої діагностики захворювання.

5. Розробити алгоритм лабораторного обстеження хворих з підозрою на наявність ХГ та осіб з групи ризику.

Об'єкт дослідження - спадкове моногенне захворювання - хвороба Гоше.

Предмет дослідження - особливості біохімічної діагностики та спектр мажорних мутацій у гені GBA в Україні.

Методи дослідження - біохімічні методи визначення глюкоцереброзидазної та хітотриозидазної активностей з використанням синтетичного флюорогенного субстрату; виділення та очистка ДНК, полімеразна-ланцюгова реакція, рестрикційний аналіз, метод електрофорезу; статистична обробка результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Серед населення України вперше визначено нормативний показник глюкоцереброзидазної активності, який склав 7,2±2,1 нмоль/год/мг білку. Вперше досліджено хітотриозидазну активність плазми крові серед пацієнтів України з ХГ та осіб групи контролю і рекомендовано цей показник до включення в алгоритм лабораторного обстеження, як один з основних критеріїв підтверджуючої діагностики при ХГ. На цю розробку отримано патент України (№ 63743А, дата видачі 15.01.04р.), щодо обов'язкового визначення хітотриозидазної активності у пацієнтів з підозрою на ХГ у випадках пограничних значень глюкоцереброзидазної активності. Вперше було проведено скринінг мажорних мутацій в гені GBA (N370S, L444P, 84GG) у пацієнтів з ХГ в Україні, використовуючи “гніздову ПЛР” і встановлено, що сумарна частота цих мутацій складає майже 58%, що є близькою до частот в інших європейських популяціях. Вперше розроблено та запропоновано для використання алгоритм лабораторного обстеження при підозрі на наявність ХГ.

Практичне значення отриманих результатів. У ході виконання цієї роботи проведено аналіз літературних та власних даних щодо частоти та спектру мажорних мутацій в гені GBA в різних популяціях світу, що дозволило розробити стратегію молекулярно-генетичного обстеження хворих на ХГ. Аналіз генотип-фенотипових кореляцій довів можливість прогнозування клінічного типу і характеру перебігу захворювання в залежності від генотипу. Відпрацьовано метод біохімічного визначення глюкоцереброзидазної активності у лейкоцитах крові, який є менш травматичним та більш точним в порівнянні з дослідженням пунктату кісткового мозку. Обов'язкове визначення хітотриозидазної активності в плазмі крові, що є основою патенту України “Спосіб діагностики хвороби Гоше”, було включено до реєстру галузевих нововведень МОЗ України (№ 77/20/04, № реєстру 20-21 від 2004р.) та впроваджено у практику установ системи охорони здоров'я МОЗ України. Ідентифікація мутантних алелів у пацієнтів з ХГ дає можливість проведення пренатальної діагностики у сім'ях, обтяжених цією патологією та, в майбутньому, народження здорових дітей.

Розроблено алгоритм лабораторного обстеження, який дозволяє проводити верифікацію хвороби Гоше за допомогою специфічних біохімічних обстежень та молекулярної діагностики, що суттєво підвищує ефективність діагностики та медико-генетичного консультування при ХГ.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було виконано під керівництвом завідувача кафедри медичної генетики НМАПО ім.П.Л.Шупика член-кор. АМН України, д.мед.н., професора Н.Г. Горовенко. Планування дослідження, обговорення, аналіз та інтерпретацію отриманих даних, підготовку патенту, публікацій до друку, формулювання висновків проводили разом з науковим керівником.

Здобувачем особисто проаналізовано літературу за темою дисертаційної роботи, проведено виділення ДНК, здійснено постановку полімеразно ланцюгової реакції, детекцію мажорних мутацій у гені GBA у всіх пацієнтів з хворобою Гоше. Особисто проаналізовано розповсюдженість мажорних мутацій та генотип-фенотипові кореляції для українських пацієнтів з ХГ, виконано роботу по визначенню глюкоцереброзидазної та хітотриозидазної активності плазми крові, розроблено алгоритм лабораторного обстеження при підозрі на ХГ. Самостійно проведено статистичний аналіз результатів, написано і оформлено всі розділи дисертації. Здобувач висловлює особливу подяку завідуючій лабораторією медичної генетики медико-генетичного центру, к.б.н. Ольхович Н.В. за методичну та практичну допомогу на всіх етапах виконання даної роботи. Автор щиро вдячна професору Роналду Скутту (лабораторія молекулярної діагностики дитячого госпіталю та регіонального медичного центру в Сієтлі, США) за допомогу в проведенні секвенування гену GBA у частини пацієнтів.

Клінічне обстеження хворих, зразки крові яких досліджувались та аналізувались у дисертаційній роботі, проводили співробітники медико-генетичного центру (завідуюча МГЦ, д.мед.н. Галаган В.О.) к.м.н. Пічкур Н.О., Циганкова М.А., Радзіховська О.В., а також онко-гематологічного центру УДСЛ “ОХМАТДИТ” к.м.н. Дроздова В.Д., завідуюча педіатричним відділенням Кочнєва О.М. Також особлива подяка заступнику генерального директора з лікувальної роботи Івановій Т.П. за організаційне сприяння в проведенні даної роботи.

Отримані результати досліджень обговорено та опубліковано у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи та висновки доповідались на ІІІ з'їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), І та ІІ Українських конгресах з клінічної генетики з міжнародною участю “Метаболічні спадкові захворювання” (Харків, 2003, 2005), на 38-му Європейському з'їзді з генетики людини (Амстердам, 2006), Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні лабораторні методи дослідження спадкової патології” (Київ, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Генетика мультифакторіальної патології” (Київ, 2004), Міжнародній науковій конференції “Сучасні проблеми генетики” (Мінськ, 2005), Міжнародній науково-практичній конференції “Генетичні аспекти діагностики та лікування в сучасній медицині” (Київ, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 друкованих праць, з них зокрема 3 статті у фахових виданнях, 1 стаття у збірнику наукових праць НМАПО ім.П.Л.Шупика, 8 тез, опублікованих у матеріалах з'їздів та науково-практичних конференцій та отримано 1 деклараційний патент України на винахід.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку використаних літературних джерел. Текст дисертації проілюстровано 17 таблицями та 15 рисунками. Перелік використаних джерел нараховує 192 найменування, з них 26 кирилицею та 166 латиницею. Дисертаційну роботу викладено на 122 сторінках машинописного тексту.

1.ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Клінічна характеристика хворих була надана лікарями-генетиками медико-генетичного центру та лікарями-гематологами центру дитячої онкогематології Української дитячої спеціалізованої лікарні “ОХМАТДИТ”. Матеріалом для дослідження були зразки периферичної крові осіб трьох груп:

Група пошуку - 100 осіб. Цю групу склали дорослі та діти віком від 4 місяців до 51 року (61 особа жіночої статі та 39 осіб чоловічої статі) Це пацієнти з усіх регіонів України, які були направлені в період з 2000 по 2006 роки до медико-генетичного центру Української дитячої спеціалізованої лікарні “ОХМАТДИТ” з попереднім діагнозом хвороби Гоше. В анамнезі у них відзначались такі клінічні симптоми: гепато- або/та спленомегалія, профузні носові кровотечі, анемія, тромбоцитопенія, болі у кістках. Усім особам групи пошуку проводили біохімічне визначення глюкоцереброзидазної активності. При виявленні зниженої ферментативної активності у пацієнта додатково проводили біохімічне дослідження хітотриозидазної активності та молекулярно-генетичний аналіз.

Другу досліджувану групу склали батьки та сибси пацієнтів з групи пошуку- 132 особи. Середній вік цієї групи склав 32 роки. Всім їм було проведено біохімічне визначення глюкоцереброзидазної активності.

Група контролю біохімічних досліджень - 76 осіб. Цю групу склали здорові донори з різних регіонів України (35 чоловіків та 41 жінка віком від 8 до 65 років), які добровільно брали участь у обстеженнях та не були кровними родичами дітей з групи пошуку.

Глюкоцереброзидазну активність в гомогенаті лейкоцитів визначали з використанням флюорогенного субстрату 4-метилумбелліферил (МУФ)-в-D-глюкопіранозиду (MU--Glc; MW 338.3; SIGMA) за методом (Beutler E., Kuhl W., 1970). Флюоресценцію вивільненого 4-метилумбелліферону вимірювали на багатофункціональному аналізаторі Victor (Wallac Oy) при довжині хвилі збудження 365 нм та емісії 448 нм. Специфічну активність ферменту виражали у 1 нмоль субстрату, гідролізованого 1 мг білка за 1 годину.

Хітотриозидазну активність плазми крові визначали з використанням флюорогенного субстрату 22 мкМ 4-метилумбелліферил--D-N`,N``,N```-триацетилхітотриозиду (SIGMA) в цитрат-фосфатному буфері рН 5,2 (Beutler E., 2001). Кількість вивільненого субстрату визначали шляхом вимірювання флюоресценції на багатофункціональному аналізаторі Victor (Wallac Oy) при довжині хвилі збудження 365 нм та емісії 448 нм. Результати виражали у нмоль/год/мл плазми.

Зразки із активністю хітотриозидази, більшою ніж 100 нмоль/год/мл плазми, піддавали повторному дослідженню (Dodelson de Kremer R., 1997). Для цього плазму розводили в 50 разів 0,2% розчином альбуміну сироватки людини (HSА) та інкубували з субстратом протягом 15 хвилин.

Виділення та очищення препаратів ДНК із свіжої крові з антикоагулянтом (ЕДТА) проводили з використанням комерційного набору “ДНК-сорб-В” (ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ). ДНК із замороженої крові з великим терміном давності виділяли за допомогою стандартного методу - шляхом гідролізу лізатів клітин протеїназою К з наступною фенольною екстракцією (Маниатис и др., 1985).

Ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) проводили в автоматичному режимі на термоциклері “Perkin Elmer” 2400 (США) Дослідження мажорних мутацій N370S та L444P в гені GBA проводили за методом “гніздової” ПЛР. Спочатку синтезували великий фрагмент ДНК, який був комплементарний лише функціональному гену, в зв'язку з тим, що вказані мутації локалізовані в регіоні, який охоплює 8-11 екзони гену GBA, то синтезували фрагмент відповідно до цієї ділянки (Stone D.L. et all, 2000, Horowitz M. et all, 1989).

Ампліфікацію проводили у об'ємі 50 мкл при стандартних умовах з використанням “гарячого” старту за допомогою автоматичного ампліфікатора Perkin Elmer (США).

Далі здійснювали другу ампліфікацію, використовуючи в якості матриці продукт першої ампліфікації. Олігонуклеотидні послідовності було синтезовано в ЦНДІ епідеміології МОЗ РФ. Аналіз продуктів ампліфікації проводили в 1,5%-му агарозному гелі.

Рестрикційний аналіз продуктів ПЛР проводили для виявлення мажорних мутацій в гені GBA. У роботі використовували ендонуклеази рестрикції виробництва фірми “ MBI Fermentas” Роботу виконували за стандартним методом з використанням ендонуклеаз рестрикції: Xho1, Msp1, Bsa B1. Аналіз продуктів рестрикції здійснювали у 1,5% агарозному гелі та у 8% поліакриламідному гелі. Візуалізацію та реєстрацію результатів електрофорезу проводили за допомогою УФ-трансілюмінатору та відеосистеми з комп'ютерною програмою аналізу зображення “Біотест-А” (Біоком, Росія).

Мутації P178S, W184R, G377S, c 999G>A, D409H, R120W, G202R та RecNciI були виявлені у поодиноких випадках в лабораторії молекулярної діагностики Дитячого госпіталю та регіонального медичного центру в Сієтлі, США.

Для статистичної обробки результатів використовували програму STATISTICA 6.0 та пакет програм для Microsoft Office Exel 2003. Перевірку достовірності відмінності серій даних виконано відповідно методу Манна-Уітні для непараметричних критеріїв. Відмінність вважалась достовірною при 95% рівні значущості (р<0,05). Рівень кореляції результатів оцінювали за коефіцієнтом Пірсона.

Результати дослідження та їхнє обговорення. З метою внутрішньолабораторної перевірки ступеню відтворюваності методики визначення ферментативних активностей було проведено оцінку внутрішньосерійної та загальної відтворюваності методик.

Для перевірки відповідності внутрішньосерійної відтворюваності методики встановленим нормам точності було проведено по 10 вимірювань глюкоцереброзидазної та хітотриозидазної активності в одному і тому ж зразку донорської крові з нормальними значеннями цих ферментативних активностей в одній і тій же аналітичній серії. В результаті отримані нами коефіцієнти були нижчими за гранично допустиме значення, що свідчило про відповідність обраної методики встановленим нормам точності та доводило можливість використання методик визначення глюкоцереброзидазної активності гомогенату лейкоцитів та хітотриозидазної активності плазми крові для лабораторної діагностики хвороби Гоше.

Визначення рівня глюкоцереброзидазної активності серед населення України. Перший етап нашого дослідження потребував визначення нормальної глюкоцереброзидазної активності для населення України. Для цього було проведено визначення глюкоцереброзидазної активності у 76 осіб групи контролю. Статистична обробка значень глюкоцереброзидазної активності у осіб групи контролю дозволила визначити середнє значення цього показника в нормі, що склало 7,2 ±2,1 нмоль/год/мг білка. Діагностика ХГ базується на виявленні дефіциту ферментативної активності, тому, найважливішу інформацію несе саме нижня гранична межа норми - М - 1у, тобто 5,1 нмоль/год/мг білка.

Після встановлення нормальних значень глюкоцереброзидазної активності лейкоцитів для населення України та контрольних меж цього показника, нами було проведено дослідження глюкоцереброзидазної активності лейкоцитів периферичної крові у пацієнтів групи пошуку. Всі вони мали клінічні прояви ХГ. Ця група була розділена на дві підгрупи згідно отриманих результатів. До підгрупи А були віднесені особи з глюкоцереброзидазною активністю нижчою ніж 5,1 нмоль/год/мг білка (26 осіб), а до підгрупи Б - особи з глюкоцереброзидазною активністю вищою ніж 5,1 нмоль/год/мг білка (74 особи).

Як видно з рис.1, 26 пацієнтів з підгрупи А мали суттєво знижену глюкоцереброзидазну активність, на підставі чого та, враховуючи клінічні та параклінічні дані, їм було підтверджено діагноз ХГ. Вирішення питання про скасування діагнозу ХГ у пацієнтів підгрупи Б групи пошуку (глюкоцереброзидазна активність >5,1 нмоль/год/мг білка) потребувало ретельного вивчення всієї сукупності клінічних, параклінічних та лабораторних даних. У більшості випадків, на підставі такого аналізу, ХГ була виключена. Але для трьох пацієнтів (В.В., З.А. та П.С.) рішення про скасування діагнозу ХГ було ускладнене невідповідністю результатів визначення глюкоцереброзидазної активності та даних клінічного та параклінічного обстеження.

Тобто, за результатами проведеного статистичного дослідження було доведено, що за середніми значеннями усі три групи значень є різними групами.

Але, схематичне зображення розподілу значень глюкоцереброзидазної активності пацієнтів з ХГ, їхніх батьків та здорових осіб (група контролю), що представлене на рис. 2, яскраво демонструє, що всі ці три групи мають спільні інтервали значень, тобто перекриваються між собою. Особливо суттєвим є перекривання інтервалів значень ферментативної активності у батьків пацієнтів з ХГ та у здорових осіб.

Це призводить до того, що при інтерпретації конкретного результату визначення глюкоцереброзидазної активності, який припадає на зону перекривання, стає неможливим віднесення цього результату до тієї або іншої групи. Суттєве перекривання інтервалів значень між собою робить неможливим ізольоване використання лише цього одного показника для діагностики ХГ та визначення гетерозиготного статусу. Таким чином, отримані результати глюкоцереброзидазної активності у конкретної особи не дозволяють підтвердити діагноз ХГ навіть при наявному клінічному симптомокомплексі. Тому постало питання про пошук допоміжних критеріїв діагностики ХГ, які б дозволили з більшою достовірністю підтверджувати чи скасовувати діагноз ХГ.

Визначення рівня хітотриозидазної активності у плазмі крові різних контингентів населення України. З метою визначення рівня хітотриозидазної активності у плазмі для населення України було обстежено 76 осіб групи контролю. Середнє значення хітотриозидазної активності було визначено як 29 ± 21 (4 - 95 нмоль/год/мл плазми). Цей показник було прийнято нами як нормальна хітотриозидазна активність для населення України.

На першому етапі було проведено визначення хітотриозидазної активності плазми крові в двох групах осіб. До першої групи увійшли пацієнти зі встановленим діагнозом ХГ, глюкоцереброзидазна активність яких становила менш, ніж 5,1 нмоль/год/мг білка (підгрупа А з групи пошуку). Другу групу склали здорові донори з різних регіонів України, які добровільно брали участь у дослідженнях (група контролю).

На діаграмі логарифмічного розподілу хітотриозидазної активності, що представлена на рис.3, помітно, що межі значень хітотриозидазної активності у пацієнтів з ХГ суттєво відрізняються від рівня активності в контрольному матеріалі. Крім того, області значення цього показника у двох обстежених нами групах взагалі не перекриваються, що значно полегшує інтерпретацію результатів досліджень. Таким чином, визначення хітотриозидазної активності може виступати додатковим критерієм в діагностиці ХГ.

Пацієнтам з сумнівними результатами глюкоцереброзидазної активності нами було визнано за доцільне провести додаткове визначення хітотриозидазної активності в плазмі крові.

На рис. 4. схематично показано розподіл значень хітотриозидазної активності плазми крові вищезазначених осіб. З рисунку видно, що серед обстежених осіб групи контролю з сумнівними результатами в жодному випадку хітотриозидазна активність не була підвищеною, що підтвердило відсутність у них захворювання.

Обстежені нами пацієнти з підгрупи Б групи пошуку за результатами визначення хітотриозидазної активності розділились на дві частини:

· У більшості обстежених пацієнтів (13 осіб) хітотриозидазна активність плазми крові виявилась в межах нормальних значень, що, у сукупності з високою залишковою глюкоцереброзидазною активністю, дозволило остаточно відхилити діагноз ХГ у цих пацієнтів. Слід зазначити, що до цієї групи осіб увійшов і пацієнт П.С., у якого в аспіраті кісткового мозку були знайдені Гоше-подібні клітини. Але висока глюкоцереброзидазна активність лейкоцитів та нормальна хітотриозидазна активність плазми не дозволила підтвердити діагноз ХГ у цього пацієнта;

· У двох пацієнтів з високою залишковою активністю глюкоцереброзидази (В.В. та З.А.), хітотриозидазна активність виявилась значно підвищеною. На підставі цього та комплексу клінічних і морфологічних даних пацієнтам В.В. та З.А. було підтверджено діагноз ХГ.

Таким чином, визначення хітотриозидазної активності плазми крові виявилось ефективним допоміжним критерієм, який дозволяє остаточно підтвердити або відхилити діагноз ХГ особливо у складних випадках з невідповідністю клінічних, параклінічних та біохімічних даних.

Визначення мажорних мутацій в гені GBA. Особливість молекулярної діагностики ХГ полягає в існуванні поруч з функціональним геном GBA псевдогену (psGBA), що призводить до можливості утворення кросоверних обмінів між ними. Тому виникає необхідність чіткої локалізації виявленого мутантного алеля - він може знаходитись як у функціональному гені, так і у псевдогені. Тобто, при виявленні такої мутації у пацієнта без підтвердження її локалізації саме у функціональному гені виникає ймовірність хибнопозитивної діагностики ХГ, що підвищує невиправдані витрати на діагностичні і подальші лікувальні заходи.

У 1989 році Horowitz M. et all проведено детальне дослідження структури гену GBA та псевдогену psGBA. Автори показали, що ці два гени мають до 96% гомології в кодуючій частини, тоді як деякі фрагменти інтронів гену GBA відсутні в psGBA. До них відносяться фрагменти 313 п.н. у другому інтроні, 626 п.н. у четвертому, 320 п.н. у шостому та 277 п.н. у сьомому інтроні. Крім того, по всій довжині псевдогену зустрічаються однонуклеотидні заміни по відношенню до послідовності функціонального гену. Це дає можливість підібрати праймери для ампліфікації таким чином, щоб їхній віджиг гарантовано відбувався лише в гені GBA.

У ході молекулярно-генетичного аналізу у пацієнтів з ХГ особливу увагу було сконцентровано на регіоні, який охоплює ділянку з 8-го по 11-й екзони. У цьому регіоні локалізовані дві найчастіші мутації, асоційовані з ХГ - N370S та L444P. Для уникнення впливу псевдогену psGBA на результати молекулярно-генетичного аналізу мутацій в гені GBA було використано метод “гніздової” ПЛР, перша ампліфікація якої проходить виключно на функціональному гені GBA. В інтроні 7 функціонального гену у позиції 5202 локалізується цитозин, тоді як у відповідній позиції псевдогену - тимін. Ця однонуклеотидна заміна не дозволяє проходити віджигу праймеру А на матриці псевдогену. Отже, віджиг праймеру проходить виключно на матриці функціонального гену GBA. Отриманий фрагмент ДНК використовували для подальшого скринінгу мажорних мутацій у гені GBA.

На рис.5. зображено електрофореграму детекції мутації N370S в гені GBA. В результаті проведення реакції ампліфікації утворюється фрагмент розміром 106 п.н., який в нормі не має сайту впізнавання для рестриктази Xho1. Заміна аденіна на гуанін у позиції 1226 кДНК призводить до утворення сайту впізнавання для цієї рестриктази, в результаті чого фрагмент розщеплюється на дві частини: 86 п.н. та 20 п.н. Експресія іn vitro гену з цією мутацією у клітинах комах показала, що зниження специфічної активності продукту гену обумовлено активацією негативно заряджених фосфоліпідів.

На рис.6 зображено електрофореграму детекції мутації L444P у гені GBA. В результаті проведення реакції ампліфікації утворюється фрагмент розміром 583 п.н., який в нормі не має сайту впізнавання для рестриктази Msp I. Заміна тиміну на цитозин в позиції 1448 кДНК призводить до утворення сайту впізнавання для цієї рестриктази, в результаті чого фрагмент розщеплюється на дві частини: 495 п.н. та 88 п.н.

Проаналізувавши результати проведеного нами молекулярного обстеження пацієнтів з ХГ з України було встановлено, що частка алелів, які несуть мутацію N370S, була найбільшою і склала 22/52 (42,3%). Чотири пацієнти були гомозиготами по цьому алелю, 14 пацієнтів - компаундними гетерозиготами і мали в другому алелі іншу мутацію. У восьми пацієнтів не було виявлено жодного алелю з мутацією N370S. Частка алелів, які несуть мутацію L444P у обстежених нами пацієнтів з ХГ склала 8/52 (15,4%). В нашій групі не було знайдено жодного пацієнта гомоалельного за мутацією L444P. Компаундних гетерозигот серед наших пацієнтів було 8 осіб, 6 з них мали генотип N370S/L444P.

Сумарна частка алелів, які несли мажорні мутації N370S та L444P, знайдених в українських пацієнтів склала майже 58%.

Молекулярно-генетичний аналіз, проведений нами у пацієнтів з ХГ з України, не виявив жодного алелю з мутацією 84GG.

Таблиця 1

Характеристика генотипів пацієнтів з ХГ із України.