Інтенсивність окиснювальних процесів та активність компонентів системи детоксикації в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки попередньо опромінених щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

Кеца оксана Віталіївна

УДК 577.1+616.006.6

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Інтенсивність окиснювальних процесів та активність компонентів системи детоксикації в мікросомній фракції карциноми герена та печінки попередньо опромінених щурів

03.00.04. - біохімія

ЧЕРНІВЦІ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Марченко Михайло Маркович, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, біологічний факультет, завідувач кафедри біохімії, декан.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Остапченко Людмила Іванівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, декан;

доктор біологічних наук, професор Грубінко Василь Васильович, Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка, завідувач кафедри загальної біології.

Захист відбудеться „31” жовтня 2007 року о 12 ⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 в Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 25, корпус 3, біологічний факультет, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23.

Автореферат розісланий „ 29 ” вересня 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У зв?язку з погіршенням екологічної ситуації, внаслідок радіоактивного забруднення, гостро постало питання вивчення однієї з актуальних проблем експериментальної біології, а саме, дії малих доз іонізуючого опромінення на організм людини і тварин (Кудряшов Ю.Б., 2004). Вплив радіації призводить до посилення в організмі вільнорадикальних процесів внаслідок інтенсивної генерації активних форм кисню (АФК), які є ініціаторами ланцюгових вільнорадикальних реакцій пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) (Pant M.C. et al., 2003). Першим об?єктом, що піддається атаці АФК за умов оксидативного стресу, є компоненти біологічних мембран, порушення структури і функцій яких лежать в основі виникнення і розвитку багатьох патологічних захворювань, в тому числі й онкологічних (Jacob R.F. et al., 2005; Kakizoe T., 2003). Залишається відкритим питання розвитку новоутворення в опроміненому організмі, а також питання впливу злоякісно трансформованих клітин на органи організму пухлиноносія.

Вкрай недостатньо вивчені характер та механізми змін структурних компонентів та різноманітних функцій мембран ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) печінки та пухлини попередньо опроміненого організму пухлиноносія. Відомо, що в мембранах ЕПР розташовуються ферменти клітинної системи детоксикації токсичних речовин (Anken E.V. et al., 2005). Першу фазу біотрансформації токсичних речовин каталізують мікросомні монооксигенази, провідними серед яких є цитохроми Р-450 (КФ 1.14.14.1) (Inselmann G. et al., 2000). Учасниками ІІ-ої фази є ферменти кон'югації, серед яких найпоширенішими є глутатіонтрансферази (КФ 2.5.1.18) (Sweeney C. et al.,2003).

Висока активність системи детоксикації дозволяє клітинам уникати шкідливої дії токсичних речовин, однак, ця ж обставина лежить в основі високої резистентності пухлинних клітин та інтенсифікації онкогенезу (Meurette O. et al., 2005). Актуальним видається дослідити гетероциклічні сполуки - кумаринові похідні, які проявляють протипухлинну активність і є субстратами ключового ферменту клітинної системи детоксикації - цитохрому Р-450 (Born S.L. et al., 1997; Орленко И.В. и др., 2001; Baripo T.E. et al., 2002 ). Для постачання протипухлинного засобу у тканину новоутворення, запобігаючи його втраті під час транспортування та токсичної дії на інші органи, актуальним є дослідження впливу ліпосомної форми кумаринового похідного на стан клітинної системи біотрансформації. З огляду на це актуальність досліджень механізмів пошкодження внутрішньоклітинних мембран пухлини та печінки, внаслідок інтенсифікації ПОЛ, генерації супероксидного радикалу, за умов дії малих доз іонізуючого опромінення, зумовлена необхідністю встановлення біохімічних змін компонентів ЕПР, що має не тільки теоретичне, але й важливе практичне значення, оскільки спрямоване на пошук ефективних засобів профілактики та лікування онкозахворювань.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тему дисертаційної роботи затверджено на засіданні Вченої ради Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича МОН України, протокол №1 від 12.02.2004р. Дисертаційна робота виконана в розрізі наукових тематик кафедри біохімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича: держбюджетної теми „Біохімічні особливості онкогенезу при опроміненні та застосуванні протипухлинних комплексів” (номер державної реєстрації 0102U004994, 2003 - 2005 рр.); держбюджетної теми „Системний вплив злоякісних новоутворень на біохімічні характеристики органів попередньо опромінених пухлиноносіїв” (номер державної реєстрації 0106U001452, 2006 - 2008 рр.); кафедральної теми ”Біохімічна адаптація організмів за умов дії стресорних факторів різної природи” (номер державної реєстрації 0103U004526, 2003 - 2005 рр.); кафедральної теми ”Біохімічні особливості онкогенезу та його корекція речовинами природного та синтетичного походження ” (номер державної реєстрації 0103U012349, 2006 - 2008 рр.), де автор досліджувала метаболічні зміни активностей складових системи детоксикації карциноми Герена та печінки за умов попереднього фракціонованого опромінення в малих дозах та розробила селективні шляхи транспортування цитостатичних засобів синтетичного походження за допомогою фосфатидилхолінових ліпосом.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з'ясувати особливості функціонування компонентів клітинної системи біотрансформації токсичних речовин та інтенсивність окиснювальних процесів в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки на різних етапах онкогенезу у щурів за умов попереднього фракціонованого опромінення в малих дозах та за дії протипухлинного засобу гідробромід (5',6'-бензкумароїл-3')-метиламіноурацилу (БКУ) в ліпосомній формі.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Оцінити стан системи біотрансформації токсичних речовин та вільнорадикальні процеси карциноми Герена й печінки щурів-пухлиноносіїв на різних етапах онкогенезу (латентний, логарифмічний та стаціонарний періоди пухлинного росту) та за умов впливу попереднього опромінення.

2. Дослідити вплив кумаринового похідного БКУ в ліпосомній та неліпосомній формах на швидкість інактивації та зміни гідроксилазної активності цитохрому Р-450, як компонента першої фази клітинної системи детоксикації, в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки.

3. Вивчити зміни глутатіонтрансферазної активності, як компонента другої фази системи детоксикації генотоксичних факторів, в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки пухлиноносіїв за дії різних форм БКУ.

4. Дослідити білковий склад та охарактеризувати ізоформи цитохрому Р-450 мікросомної фракції карциноми Герена та печінки щурів-пухлиноносіїв на різних етапах онкогенезу та за дії різних форм БКУ.

5. Вивчити інтенсивність ПОЛ, окиснення сульфгідрильних груп білків та гененерацію супероксидного аніон-радикалу цитохромом Р-450 в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки щурів-пухлиноносіїв за дії різних форм протипухлинного засобу.

6. Дослідити вплив попереднього введення фосфатидилхолінових ліпосом за дві години до введення ліпосомної форми БКУ (лБКУ) на стан клітинної системи біотрансформації токсичних речовин та вільнорадикальні процеси карциноми Герена й печінки щурів-пухлиноносіїв та передбачити можливі механізми їх дії.

Об'єкт дослідження - онкогенез на фоні попереднього фракціонованого опромінення в малих дозах.

Предмет дослідження - біохімічні та функціональні властивості компонентів клітинної системи детоксикації, вільнорадикальне окиснення в мікросомній фракції.

Методи досліджень - методи експериментальної онкології (використання карциноми Герена як моделі пухлинного росту), радіобіологічні (фракціоноване опромінення тварин в малих дозах), диференційного центрифугування (виділення мікросомної фракції гомогенатів тканин), спектрофотометричні (визначення швидкості теплової інактивації, вмісту та гідроксилазної активності цитохрому Р-450, глутатіонтрансферазної активності, рівня сульфгідрильних груп білків, первинних та вторинних продуктів ПОЛ), метод електрофорезу (аналіз фракційного складу білків мікросом, ізоформ цитохрому Р-450) та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що, передуюче трансплантації пухлини, опромінення інтенсифікує роботу І та ІІ фаз біотрансформації токсичних речовин пухлинної тканини у період її активного росту, водночас пригнічує детоксикуючу функцію печінки. На фоні цих змін вперше досліджено ізоферментний склад цитохрому Р-450 та можливості його участі у процесах вільнорадикальної деструкції фосфоліпідів мікросомної фракції карциноми Герена та печінки щурів.

Вперше встановлено, що ліпосомна форма БКУ проявляє значний гальмівний ефект на розвиток карциноми Герена в організмі, який підсилюється при попередній фосфоліпідній терапії щурів-пухлиноносіїв. Механізм дії ліпосомної форми протипухлинного засобу проявляється у спрямованій дії на пухлинну тканину, за рахунок чого активується цитохром Р-450 внаслідок синтезу нових ізоформ. Вперше встановлено, що за появи ізоформ цитохрому Р-450 з визначеними молекулярними масами (56, 53 кДа) різко інтенсифікуються процеси ПОЛ, що свідчить про значну прооксидантну дію лБКУ на пухлинну тканину.

Показано, що фософоліпідна терапія за дві години до введення лБКУ проявляє корегуючу дію на внутрішньоклітинні мембрани печінки щурів-пухлиноносіїв, сприяє кращому функціонуванню компонентів І та ІІ фаз системи детоксикації печінки, підсилюючи дію лБКУ на тканину новоутворення, внаслідок зниження її детоксикуючої функції.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати, щодо функціонування ферментів клітинної системи детоксикації та ізоферментного складу цитохромів Р-450 карциноми Герена та печінки при онкогенезі в попередньо опромінених тварин розширюють уявлення про біохімічні механізми знешкодження токсичних речовин, що може бути використано на практиці для підсилення ефекту лікарських засобів при онкогенезі та для пошуку нових протипухлинних засобів.

Експериментально обґрунтовано можливість розробки ліпосомних форм протипухлинних засобів на основі кумаринових похідних для спрямованого транспорту хімічного засобу в пухлинну тканину, що є успішною моделлю для створення подібних протипухлинних препаратів.

Окремі положення роботи, матеріали та методи досліджень використовуються у навчальному процесі в курсах спеціальних дисциплін та лабораторно-практичних занять зі спеціальності „Біохімія” на біологічному факультеті Чернівецького національного університету ім. Юрія Федьковича.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження є самостійною роботою автора і виконане під науковим керівництвом доктора біологічних наук, професора Марченка М.М. Автором самостійно проаналізована література по темі дослідження, проведені експерименти, статистична обробка одержаних результатів, оформлення дисертаційної роботи. Аналіз одержаних результатів та формулювання основних положень і висновків дослідження обговорювалися спільно із науковим керівником. Разом із співавторами підготовлені рукописи опублікованих статей.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на: Конференції-конкурсі робіт молодих вчених „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2005, 2006, 2007); Міжнародній школі-конференції молодих вчених „Биология - наука ХХІ века” (Пущино, 2006); Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ біології” ( Львів, 2006, 2007); IX Всеукраїнському біохімічному з?їзді (Харків, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції ''Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения'' (Северск - Томск, 2007); XIV Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених „Ломоносов-2007” (Москва, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 17 наукових праць, з них 7 статей у фахових наукових виданнях, 1 патент на винахід та 9 тез доповідей у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів роботи та їх обговорення, узагальнення, висновків та списку використаних джерел літератури (206 найменувань, з яких 115 - іноземні). Робота викладена на 131 сторінках друкованого тексту та містить 36 рисунків і 6 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури проаналізовано сучасні уявлення щодо біологічної ролі цитохрому Р-450 та глутатіонтрансферази в детоксикації токсичних речовин та їх роль в активації та інактивації вільнорадикальних процесів. Детально проаналізовані шляхи реалізації ефектів радіаційного опромінення в малих дозах та патогенетичні аспекти пухлинного росту в організмі, а також хіміотерапевтична стратегія боротьби проти раку ліпосомними препаратами.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проводили на самках білих безпородних щурів масою 130 -150г. В якості моделі злоякісного новоутворення використовували карциному Герена. Трансплантацію карциноми здійснювали шляхом підшкірного введення в ділянку стегна 0,5 мл 30% суспензії ракових клітин у фізіологічному розчині. Для вивчення впливу передуючого трансплантації хронічного рентгенівського опромінення в малих дозах на біохімічні процеси в карциномі Герена та печінці щурів, тварини були розділені на групи: І - тварини з трансплантованою карциномою Герена (дослідний контроль); ІІ - опромінені тварини; ІІІ - пухлиноносії, яким карциному Герена прищеплювали на фоні дії фракціонованого рентгенівського опромінення в малих дозах. Контрольну групу складали інтактні щури. Опромінення проводили протягом 7-ми діб щоденно в дозі 36,12·10^-4 Кл/кг через 24 години на рентгенівській діагностичній установці 12П6 („Lachema”, Чехія) за таких умов: напруга 80кВ, сила струму 40мА, фільтри 0,5мм Cu, шкірно-фокусна відстань 40см, потужність дози 2,58·10^-4 Кл/кг. Евтаназію тварин проводили під легким ефірним наркозом на 1, 7, 14 та 21-у доби після припинення опромінення.

Для дослідження протипухлинного ефекту БКУ тварин, починаючи з 7-ої доби після перещеплення пухлини, було поділено на групи: І - щури з перещепленою карциномою Герена; ІІ - пухлиноносії, яким вводили суспензію фосфатидилхолінових ліпосом за дві години до введення лБКУ; ІІІ, ІV - пухлиноносії, яким вводили ліпосомну або неліпосомну форми БКУ відповідно. Контроль - інтактні тварини. Хімічний засіб вводили щоденно через 24 години per os, починаючи з 7-го дня після перевивки пухлини в розрахунку 6 мг хімічного засобу та 100 мг фосфоліпіду на 1кг маси тварини.

Протипухлинну активність БКУ та його ліпосомної форми оцінювали за двома критеріями: величина гальмування росту пухлини та збільшення тривалості життя щурів по відношенню до дослідного контролю (Софьина Э.Р. и др., 1980). Об'єм пухлини визначали за формулою: V = 0,4 ab², де а - більший діаметр пухлини, b - менший діаметр пухлини (Доненко Ф.Д., 1995).

Бішарові ліпосоми готували із суміші спиртових розчинів фосфатидилхоліну і холестеролу (Будкер В.Г. и др., 1987). Ступінь захоплення БКУ аналізували фотоколориметрично (Швидкий Б.І. та ін., 1991; Гаврилин М.В. и др., 2000).

Мікросомну фракцію гомогенатів карциноми Герена та печінки отримували за методом Shenkman J.B. et al., 1978. Для встановлення ступеня забруднення мікросомної фракції визначали Na⁺,K⁺-АТФ-азну активність (Carsten M.E. et al., 1980) та сукцинатдегідрогеназну активність (Coopеr T.G. et al., 1969). Гідроксилазну активність цитохрому Р-450 визначали за Арчаковим А.И., 1977, глутатіонтрансферазну активність - за методом Власової С.Н. та ін., 1990. Швидкість переходу мікросомного цитохрому Р-450 в неактивну форму Р-420 визначали шляхом реєстрації карбоксикомплексів гемопротеїну (Мохосоев И.М. и др., 1987). Вміст цитохрому Р-450 визначали спектрофотометрично (Omura Т., Sato R., 1964). Електрофорез мікросомних білків проводили в ПААГ за методом Laemmli U.K., 1970. Гелі сканували на апараті „GelDoc 2000” та аналізували з використанням програми „Quantity One” („Bio-Rad”, США).

В мікросомній фракції пухлини та печінки визначали вміст сполук з ізольованими подвійними зв'язками, кетодієнів, спряжених триєнів (Волчегорский И.А. и др., 1989) та ТБК-активних продуктів (Гаврилов В.Б. и др., 1987). В мікросомній фракції печінки визначали вміст загального холестеролу (Комышников В.С., 2000), фосфоліпідів (Пентюк А.А. и др., 1987) та глюкозо-6-фосфатазну активність (Jang W. et al., 2006). Вміст білкових SH-груп оцінювали з використанням реагенту Елмана (Murphy M.E., 1989), генерацію O₂^С- цитохромом Р-450 - нітросинього тетеразолія (Костенко В.О., 2000). Концентрацію білка визначали за Лоурі (Lowry O.H. et al, 1951), вміст загальних ліпідів методом Комышников В.С., 2000.

Достовірність різниці між групами тварин оцінювали з використанням критерію Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990). Розрахунки проводили на комп'ютері з використанням прикладної програми „Microsoft Excel 98”.

Результати досліджень та обговорення

Активність компонентів системи детоксикації мікросомної фракції карциноми Герена та печінки попередньо опромінених щурів-пухлиноносіїв. Результати дослідження активностей компонентів системи детоксикації мікросомної фракції пухлинної тканини показали, що в попередньо опроміненому організмі в період інтенсивного росту карциноми Герена спостерігається підвищення N-деметилазної та анілін-гідроксилазної активності цитохрому Р-450 та підвищення глутатіонтрансферазної активності порівняно з показниками групи неопромінених пухлиноносіїв.

Імовірно, попереднє опромінення організму малими дозами зумовлює збільшення каталітичної активності окремих ізоформ цитохрому Р-450 поряд із зменшенням індукції активності інших форм цього гемопротеїну.

Порівняльний аналіз гідроксилювання субстратів І та ІІ типів в мікросомній фракції печінки показав, що в період початкового росту карциноми Герена в організмі у 1,4 рази знижується гідроксилювання диметиланіліну (ДМА), однак у 1,9 рази підвищується гідроксилювання аніліну мікросомним цитохромом Р-450 порівняно з інтактними тваринами. Така відмінність у швидкості гідроксилювання субстратів І та ІІ типів може бути пов'язана із змінами ліпідного бішару мембран ЕПР печінки при рості в організмі новоутворення (Borgese N. Et al., 2001).

Оскільки, субстрати І типу взаємодіють з гідрофобною ділянкою апофермента гемопротеїну, то зміни в мембранах можуть інгібувати гідроксилювання ДМА (Soini Y. Et al., 1998), що призводить до компенсаторної активації n-гідроксилювання аніліну.

В мікросомній фракції печінки попередньо опромінених щурів спостерігається зниження ферментативної активності цитохрому Р-450 як в латентну, так і в логарифмічну фази онкогенезу порівняно із неопроміненими пухлиноносіями, що може бути пов'язано з переходом його в неактивну форму - цитохром Р-420.

Тенденція, яка виявлена для цитохрому Р-450 характерна і для глутатіонтрансферази.

Отже, на фоні посиленої детоксикації пухлинної тканини, в організмі пухлиноносія, а, зокрема, в основному детоксикуючому органі - печінці, активність системи біотрансформації знижується.

Інтенсивність вільнорадикальних процесів у мікросомній фракції карциноми Герена та печінки попередньо опромінених щурів-пухлиноносіїв. Аналіз електрофореграм білків мікросомної фракції карциноми Герена групи опромінених пухлиноносіїв в логарифмічну фазу онкогенезу дозволив ідентифікувати додаткові білкові смуги, в зоні розподілу цитохрому Р-450, з мол. масами 57, 56, 55 та 49 кДа, які ймовірно, є його ізоформами, що інтенсивно взаємодіють із субстратами І та ІІ типів, оскільки в даний період різко підвищується гідроксилазна активність цитохрому Р-450 на фоні зниженої інтенсивності вільнорадикальних процесів.

Поряд з цим в мікросомній фракції печінки попередньо опромінених пухлиноносіїв підвищуються вільнорадикальні процеси внаслідок генерації О₂^я- цитохромом Р-450 та окиснення SH-груп білків.

Отже, попереднє опромінення призводить до змін ізоферментного спектру цитохрому Р-450 пухлини та до посилення вільнорадикальних процесів мікросомної фракції печінки пухлиноносіїв.

Корекція ліпосомними засобами пошкоджених мембран печінки щурів у ході росту злоякісного новоутворення. Аналіз показників протипухлинної активності показав, що лБКУ призводить до гальмування росту пухлини до 89% та повної регресії карциноми Герена у 50% дослідних тварин. При попередньому застосуванні ненавантажених ліпосом з наступним введенням лБКУ гальмування росту пухлини досягає 93% та регресія пухлини у 65% дослідних тварин.

Таким чином, ліпосомна модифікація БКУ дозволяє вирішити дві проблеми: застосування кумаринових похідних для лікування злоякісних новоутворень, підвищуючи їх цитостатичну активність та зниження токсичної дії хімічного засобу на органи, які не задіяні пухлинним ростом.

Вплив різних форм протипухлинного засобу гідробромід 5-(5ґ,6ґ-бензкумароїл-3ґ)-метиламіноурацилу на стан системи детоксикації мікросомної фракції карциноми Герена та печінки щурів-пухлиноносіїв. При введенні ліпосомної форми БКУ активна дія протипухлинного засобу проявляється на 21-у добу росту пухлини.

При цьому на фоні підвищеного рівня продуктів ПОЛ в мікросомній фракції карциноми Герена інактивується детоксикуюча система. Водночас, в печінці ліпосомна форма БКУ здійснює протилежний ефект, а саме сприяє підвищенню ферментативних активностей компонентів системи детоксикації в стаціонарну фазу онкогенезу.

Застосування фосфатидилхолінових ліпосом за дві години до введення лБКУ має найбільший корегуючий вплив на досліджувані показники детоксикуючої системи печінки, які в стаціонарну фазу онкогенезу набувають контрольних значень. Разом з тим, застосування даного способу введення лБКУ характеризується жорстким впливом на тканину новоутворення, знижуючи ферментативну активність компонентів системи детоксикації, поряд із підвищенням вільнорадикальної деструкції фосфоліпідів.

Вплив різних форм гідробромід 5-(5',6' бензкумароїл-3')-метиламіноурацилу на білковий склад мікросомної фракції карциноми Герена та печінки щурів-пухлиноносіїв. Фракційний склад білків мікросомної фракції карциноми Герена у межах мол. мас, де розташовуються ізоформи цитохрому Р-450 зазнає змін.

Так, семиденне введення лБКУ призводить до індукції синтезу ізоформ цитохрому Р-450 з мол. масами 56 та 53 кДа, тоді як застосування БКУ призводить до утворення білкової смуги з мол. масою 56 кДа.

Імовірно, лБКУ в більшій концентрації потрапляє в пухлину, ніж його немодифікована форма, і призводить до інтенсивного синтезу зазначених ізоформ гемопротеїну. Встановлений факт може лежати в основі виявленої нами підвищеної гідроксилазної активності цитохрому Р-450, а через неї і глутатіонтрансферазної активності у мікросомній фракції карциноми Герена, за дії досліджуваних засобів. В стаціонарну фазу онкогенезу за дії лБКУ на фоні активації ПОЛ та зниження піку білків з мол. масою 56 кДа, знижується гідроксилазна активність цитохрому Р-450, що зокрема, продемонструвало наше дослідження, а через неї і глутатіонтрансферазна активність, як компонента наступної ланки єдиного метаболічного ланцюга.

Попереднє застосування фосфатидилхолінових ліпосом, а через дві години лБКУ підсилює деструктивну дію останнього на фракційний склад білків пухлини, яка найбільше виявленна в стаціонарну фазу онкогенезу.

Отже, отримані дані свідчать, що вплив лБКУ супроводжується порушенням детоксикуючої функції пухлини, тоді як в печінці щурів-пухлиноносіїв значно стабілізується активність компонентів системи детоксикації в стаціонарну фазу онкогенезу. Ефективними протекторами для печінки від деструкції, яка викликана модифікацією ліпідного оточення ферментів мікросомної фракції є застосування фосфатидилхолінових ліпосом з наступним введенням лБКУ.

ВИСНОВКИ

В дисертації вперше показано особливості функціонування компонентів системи детоксикації та інтенсивність окиснювальних процесів в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки щурів за умов попереднього фракціонованого опромінення в малих дозах та за дії ліпосомної форми гідробромід 5-(5',6'-бензкумароїл-3')-метиламіноурацилу.

1. За умов попереднього семиденного фракціонованого опромінення в щоденній дозі 36,12·10^-4 Кл/кг в період активного росту пухлини підвищується гідроксилазна активність цитохрому Р-450 та глутатіонтрансфезна активність у мікросомній фракції карциноми Герена, поряд із появою на електрофореграмах ізоформ цитохрому Р-450 з мол. масами 57, 56, 55 та 49 кДа. Ідентичність показників активностей ферментів І та ІІ фаз детоксикації у групи опромінених та неопромінених щурів-пухлиноносіїв у стаціонарну фазу онкогенезу свідчить про нівелювання фактора опромінення в даний період.

2. Попередня дія малих доз опромінення у сумарній дозі 25,3 мКл/кг призводить до зниження ферментативних активностей цитохрому Р-450 та глутатіонтрансферази поряд із підвищенням первинних (сполук з ізольованими подвійними зв'язками (ІПЗ)) та вторинних (кетодієнів (КД), спряжених триєнів (СТ) та ТБК-активних) продуктів ПОЛ, генерації супероксидного радикалу та окиснення SH-груп білків у мікросомній фракції печінки щурів-пухлиноносіїв у латентну та логарифмічну фази росту карциноми Герена порівняно з показниками характерними для групи неопромінених пухлиноносіїв. На подальших етапах онкогенезу (21 доба) наслідки впливу попереднього опромінення на досліджувані показники печінки не виявлені.

3. Протипухлинний ефект ліпосомної форми гідробромід 5-(5',6'-бензкумароїл-3')-метиламіноурацилу проявляється у зростанні гальмування росту пухлини до 89%, збільшенні тривалості життя до 71%, а також повною регресією карциноми Герена у 50% дослідних тварин. Попереднє введення ненавантажених фосфатидилхолінових ліпосом за дві години до введення лБКУ підсилює протипухлинну дію останнього, що проявляється у гальмуванні росту пухлини до 93%, підвищенні загальної тривалості життя до 82% та регресії пухлини у 65% дослідних тварин.

4. Чотирнадцятиденне введення ліпосомної форми БКУ в щоденній дозі 6 мг/кг маси тварин проявляє протипухлинну дію на тканину новоутворення, що виражається у зниженні ферментативних активностей цитохрому Р-450 та глутатіонтрансферази та в інтенсифікації вільнорадикальних процесів мікросомної фракції карциноми Герена, оскільки підвищується вміст первинних та вторинних продуктів ПОЛ, окиснення білкових SH-груп та генерація супероксидного радикалу цитохромом Р-450.

5. В печінці ліпосомна форма БКУ сприяє підвищенню гідроксилазної активності цитохрому Р-450 та глутатіонтрансферазної активності на 21-у добу експерименту порівняно із застосуванням БКУ. Зміни пероксидного окиснення фосфоліпідів спрямовані на зниження первинних - ІПЗ та вторинних - КД, СТ, ТБК-активних продуктів.

6. Попереднє введення фосфатидилхолінових ліпосом за дві години до введення лБКУ призводить до суттєвого зниження активностей компонентів системи детоксикації карциноми Герена в стаціонарну фазу онкогенезу. Водночас в печінці щурів-пухлиноносіїв ферментативна активність компонентів І та ІІ фаз системи детоксикації підвищується до показників інтактних тварин.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Кеца О.В. Білковий склад мікросомної фракції печінки попередньо опромінених щурів з карциномою Герена // Доповіді НАН України. - 2007. - №6. - С.170-174. (Дисертант опромінювала тварин, проводила перещеплення карциноми Герена, провела електрофоретичне дослідження білків мікросомної фракції печінки, провела статистичну обробку результатів та підготувала матеріал до друку, 80%).

2. Марченко М.М., Копыльчук Г.П., Шмараков И.А., Кеца О.В., Кушнир В.Н. Синтез и противоопухолевая активность гидробромида 5-(5?,6?-бензокумароил-3?)-метиламиноурацила и его липосомальной формы // Хим.-фарм. журн. - 2006. - Т. 40, № 6. - С. 55 - 56 (Дисертант готувала ліпосомну форму БКУ, проводила перещеплення карциноми Герена, вводила хімічний засіб, визначила ступінь гальмування росту пухлини, збільшення тривалості життя, провела статистичну обробку результатів та підготувала матеріал до друку, 60%).

3. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Кеца О.В., Шмараков І.О. Вплив ліпосомного протипухлинного препарату гідробромід 5-(5?,6?-бензокумароїл-3?)-метиламіноурацилу на цитохром Р-450 у мікросомній фракції печінки щурів-пухлиноносіїв // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т.78, №6. - С.86 - 92. (Дисертант готувала ліпосомну форму БКУ, проводила перещеплення карциноми Герена, вводила хімічний засіб, визначила вміст та швидкість інактивації цитохрому Р-450, вміст білкових SH-груп в мікросомній фракції печінки, провела статистичну обробку результатів та підготувала матеріал до друку, 70%).

4. Марченко М.М., Кеца О.В. Вплив ліпосомного протипухлинного засобу 5,6-бензкумарин-5-урацилу на інтенсивність вільнорадикальних процесів у мікросомній фракції клітин печінки та пухлини щурів із трансплантованою карциномою Герена // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т.77, №2. - С.141-146.

5. Пат.75784 Україна, МПК А61К 31/37, А61Р 35/00, С07D311/12 3-(5-Аміноурацил)-5,6-бензокумарину гідробромід та препарат на його основі: Пат.75784 Україна, МПК А61К 31/37, А61Р 35/00, С07D311/12/ М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, І.О. Шмараков, О.В. Кеца, В.М. Кушнір (Україна); Чернівецький національний університет. № 20040706070; Заявл. 21.07.2004; Опубл. 15.05.2006. Бюл №5. - 8с. (Дисертант готувала ліпосомну форму БКУ, проводила перещеплення карциноми Герена, вводила хімічний засіб, визначила ступінь гальмування росту пухлини, збільшення тривалості життя, підготувала матеріал до друку, 50%).

6. Марченко М.М., Кеца О.В. Корекція фосфатидилхоліновими ліпосомами пошкоджених мембран печінки щурів із трансплантованою карциномою Герена // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2006.-Вип.298, серія Біологія.- С.101-108.

7. Марченко М.М., Кеца О.В. Вміст продуктів ліпопероксидації мікросомальної фракції клітин печінки щурів-пухлиноносіїв у динаміці росту карциноми Герена // Клінічна та експериментальна патологія - 2004. - Т. 3, №2.- С.224 - 227.

8. Марченко М.М., Чорна О.В. Одержання ліпосомального протипухлинного лікарського препарату 5,6-бензкумарин-5-урацилу методом ультразвукової обробки // Науковий вісник Чернівецького університету. - 2003. -Вип.169, серія Біологія.- С. 9-14.

9. Кеца О.В., Марченко М.М. Активность ферментов детоксикации микросом печени предварительно облученных крыс-опухоленосителей // Материалы XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых „Ломоносов-2007”. - Москва, 2007. - С.58.

10. Кеца О.В., Марченко М.М. Активность цитохрома Р-450 и глутатион-S-трансферазы в микросомальной фракции печени крыс в условиях предварительного действия ''низких'' доз ионизирующего излучения // Материалы ІV международной научно-практической конференции „Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения” - Северск-Томск, 2007. - С. 111-112.

11. Кеца О.В., Гринчук О.І., Марченко М.М. Фракційний склад білків мікросомної фракції карциноми Герена щурів на різних етапах онкогенезу // Матеріали ІІІ міжнародної наукової конференції „Молодь і поступ біології”.-Львів, 2007.-С.60.

12. Кеца О.В., Марченко М.М. Вміст продуктів ліпопероксидації в мікросомній фракції печінки попередньо опромінених щурів-пухлиноносіїв// Тези доп. конференції-конкурсу робіт молодих учених ''Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2007''. - Київ, 2007. - С.19.

13. Кеца О.В., Марченко М.М. Порушення мікросомної монооксигеназної системи пухлини щурів за дії ліпосомного препарату // Матеріали конференції-конкурсу робіт молодих учених ''Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006''. - Київ, 2006. - Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, №6. - С.135.

14. Марченко М.М., Шмараков І.О., Кеца О.В. Активність компонентів клітинної системи детоксикації карциноми Герена попередньо опромінених щурів // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. - Харьків, 2006.-С.86.

15. Кеца О.В., Марченко М.М. Деструкция микросомной цитохром Р-450-зависимой детоксицирующей системы печени крыс с трансплантированной карциномой Герена // Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых „Биология - наука ХХІ века” - Пущино, 2006. - С. 77-78.

16. Кеца О.В., Марченко М.М. Вміст цитохрому Р-450 у мікросомній фракції печінки щурів із карциномою Герена, трансплантованою після фракціонованого рентгенівського опромінення в малих дозах//Матеріали ІІ міжнародної конференції „Молодь і поступ біології”.-Львів, 2006.-С.53-54.

17. Кеца О.В., Марченко М.М. Репарація внутрішньоклітинних мембран фосфатидилхоліновими ліпосомами при онкогенезі // Тези доп. конференції-конкурсу робіт молодих учених ''Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2005''. - Київ, 2005. - С.19.

АНОТАЦІЯ

Кеца О.В. Інтенсивність окиснювальних процесів та активність компонентів системи детоксикації в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки попередньо опромінених щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. - біохімія. - Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2007.

Дисертація присвячена вивченню особливостей протікання вільнорадикальних процесів, активності компонентів системи знешкодження генотоксичних факторів, фракційному складу білків в мікросомній фракції карциноми Герена та печінки щурів за умов попереднього фракціонованого опромінення в малих дозах та за дії різних форм гідробромід 5-(5ґ,6ґ-бензкумароїл-3ґ) - метиламіноурацилу. Встановлено, що попереднє опромінення організму сприяє підвищенню активностей детоксикуючої системи пухлини, поряд із зниженням активності системи детоксикації в печінці у логарифмічну фазу онкогенезу. В стаціонарну фазу онкогенезу наслідки впливу попереднього опромінення на досліджуванні показники не виявлені.

При введенні лБКУ активна дія протипухлинного засобу проявляється на 21-у добу росту пухлини. При цьому на фоні підвищеного рівня продуктів ПОЛ карциноми Герена спостерігається інактивація детоксикуючої системи.

Водночас, в печінці ліпосомна форма БКУ здійснює протилежний ефект, а саме сприяє підвищенню ферментативних активностей компонентів двох фаз системи детоксикації та зниженню первинних та вторинних продуктів ліпопероксидації. Попереднє застосування ненавантажених ліпосом, а через дві години лБКУ має найбільший корегуючий вплив на досліджувані показники печінки та характеризується жорстким впливом на тканину новоутворення.

Ключові слова: малі дози радіації, карцинома Герена, печінка, цитохром Р-450, глутатіонтрансфераза, 5-(5ґ,6ґ-бензкумароїл-3ґ)-метиламіноурацил.

АННОТАЦИЯ

Кеца О.В. Интенсивность окислительных процессов и активность компонентов системы детоксикации микросомной фракции карциномы Герена и печени предварительно облученных крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. - Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Черновцы, 2007.

В диссертации впервые показаны особенности протекания свободнорадикальных процессов и активность компонентов системы детоксикации карциномы Герена и печени в условиях предварительного фракционированного облучения в малых дозах, а также влияние гидробромид 5-(5ґ,6ґ-бензкумароил-3ґ)-метиламиноурацила (БКУ) и его липосомной формы. карцинома пухлиноносій щур герен

Показано, что предварительное 7-ми суточное фракционированное облучение организма интенсифицирует работу І и ІІ фаз биотрансформации токсических веществ карциномы Герена в период ее интенсивного роста. В то же время подавляется детоксикационная функция печени. На фоне этих изменений исследовано изоферментный состав цитохрома Р-450 и показано возможность его участия в свободнорадикальных процессах микросомной фракции опухоли и печени крыс. В стационарную фазу онкогенеза влияние предварительного облучения прекращается и доминирования приобретает развитие опухоли.

Установлено, что липосомная форма БКУ (лБКУ) проявляет значительный тормозной эффект на развитие карциномы Герена в организме. Отмечено, что при появление на электрофореграммах белковых полос с мол. массами 56, 53кДа, которые могут соответствовать изоформам цитохрома Р-450, повышается гидроксилазная активность гемопротеина и интенсифицируются процессы ПОЛ микросомной фракции карциномы Герена, что свидетельствует о значительном прооксидантном действие лБКУ. На 21-е сутки онкогенеза процессы ПОЛ преобладают над процессами детоксикации, что приводит к понижению детоксикационной функции опухоли, наряду с повышением ее в печени крыс. Введение фосфатидилхолиновых липосом за два часа до введения лБКУ проявляет корригирующее влияние на печень, сопровождающееся повышением гидроксилазной активности цитохрома Р-450 и глутатионтрансферазной активности. В опухоли активность компонентов детоксикации понижается.

Ключевые слова: малые дозы радиации, карцинома Герена, печень, цитохром Р-450, глутатионтрансфераза, 5-(5ґ,6ґ-бензкумароил-3ґ)-метиламиноурацил.

SUMMARY

Ketsa O.V. Oxidation process intensity and detoxication system components activity in microsomal fraction of Huerin's carcinoma and liver in the preliminary radiation-exposed rats'.- Manuscript.

Thesis for Ph.D. science degree of speciality 03.00.04 - biochemistry. - Chernivtsy national university named after Yuriy Fedkovich, Chernivtsy, 2007.

The thesis is dedicated to the studies of free radical processes passing peculiarities, activity of the genotoxic factors eliminating system components, protein fractional structure in microsomal fraction of Huerin's carcinoma and rats' liver in case of preliminaty frational low radiation-exposure and different forms of hydrobromide 5-(5',6'-benzcoumaroil-3)-methilamidnouracil effect. It has been found that preliminary organism exposure to radiation favors detoxication system activity in the liver in logarithmic oncogenesis phase. No effects of preliminary exposure to radiation on the factors under studies at the stationary oncogenesis phase have been found.

With BCU liposome form injection the anticancer drug active effect is appearing on the 21^st day of the tumor growth. Meanwhile, detoxication system inactivation is being found in Huerin's carcinoma microsomal fraction against the background of the hyper level of primary and secondary POL products.

At the same time, BCU liposome form in the liver has the opposite effect, namely it helps increasing the enzymatic activity of two phase detoxication system components and decreasing the primary and secondary lipoperoxidation products. Primary use of off-load liposomes with POL in two hours has the greatest correcting effect on liver characteristics under studies and is characterized with hard effect on the neoplasm tissue.

Key words: low doses radiation, Huerin's carcinoma, liver, cytochrome P-450, glutathione S-ransferases, 5-(5ґ,6ґ-benzocoumaroyl-3ґ)-methylaminouracil

Размещено на Allbest.ru