Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

КАРАГАНДИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Кафедра биологической химии

МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

По теме «Строение и функции белков»

СОСТАВИТЕЛИ: зав. каф. проф. Л.Е. Муравлева, доцент Т.С. Омаров, преподаватель Д.А. Клюев

Караганда 2004

БЕЛКИ или ПРОТЕИНЫ - это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, линейные гетерополимеры, структурным компонентом которых являются аминокислоты, связанные пептидными связями.

В природе встречаются десятки тысяч различных белков. И все они отличаются друг от друга по пяти основным признаком.

Основные различия в строении белковых молекул

1. По количеству аминокислот

2. По соотношению количества различных аминокислот. Например, в белке соединительной ткани коллагене 33% от общего количества аминокислот составляет глицин, а в молекуле белкового гормона инсулина, вырабатываемого в поджелудочной железе, содержание глицина гораздо меньше - всего 8%.

3. Различная последовательность чередования аминокислот. Это означает, что даже при одинаковом соотношении разных аминокислот в каких-нибудь двух белках порядок их расположения этих аминокислот различен, то это будут разные белки.

4. Количество полипептидных цепей в различных белках может варьировать от 1 до 12, но если больше единицы, то обычно четное (2, 4, 6 и т.п.)

5. По наличию небелкового компонента, который называется «ПРОСТЕТИЧЕСКАЯ ГРУППА». Если ее нет, то это - простой белок, если есть - сложный белок

Протеиногенными называются 20 аминокислот, которые кодируются генетическим кодом и включаются в белки в процессе трансляции.

КЛАССИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ.

Физико-химическая - основана на различиях в физико-химических свойствах аминокислот.

1) Гидрофобные аминокислоты (неполярные).

2) Гидрофильные незаряженные (полярные) аминокислоты.

3) Отрицательно заряженные аминокислоты. Сюда относятся аспарагиновая и глутаминовая кислоты.

4) Положительно заряженные аминокислоты: аргинин, лизин и гистидин.

Такие свойства характерны для свободных аминокислот. В белке же ионогенные группы общей части аминокислот участвуют в образовании пептидной связи, и все свойства белка определяются только свойствами радикалов аминокислот.

Химическая классификация - в соответствии с химической структурой радикала аминокислоты

Биологическая классификация.

а) Незаменимые аминокислоты, их еще называют "эссенциальные". Они не могут синтезироваться в организме человека и должны обязательно поступать с пищей. Их 8 и еще 2 аминокислоты относятся к частично незаменимым. Незаменимые: метионин, треонин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, триптофан, фенилаланин. Частично незаменимые: аргинин, гистидин.

б) Заменимые (могут синтезироваться в организме человека). Их 10: глутаминовая кислота, глутамин, пролин, аланин, аспарагиновая кислота, аспарагин, тирозин, цистеин, серин и глицин. Из них 2 аминокислоты - цистеин и тирозин, называются условно заменимыми, так как синтезируются из незаменимых аминокислот метионина и фенилаланина.

По биохимической роли: аминокислоты делятся на

1) гликогенные - через ряд химических превращений поступают на путь гликолиза (окисления глюкозы) - Гли, Ала, Тре, Вал, Аск, Глк, Арг, Гис, Мет.

2) кетогенные - участвуют в образовании кетоновых тел - Лей, Илей, Тир, Фен.

Биологические функции аминoкислoт

В живых организмах аминокислоты выполняют ряд функций.

Стpуктуpные элeменты пeптидов и белков. В состав белков входят 20 протеиногенных аминокислот, которые кодиpyютcя генетичеcким кодом и постоянно oбнapyживaютcя в белкax. Некоторые из них пoдвеpгaютcя посттрансляционной модификации, т.е. мoгyт быть фocфopилиpовaны, aцилиpoваны или гидpoксилирoваны.

2. Структурные элeмeнты дpyгих природных соeдинeний. Аминoкиcлoты и их производные входят в cocтaв коферментов, желчных кислот, антибиотиков.

3. Пepeнoсчики сигналов. Некоторые из aминoкиcлoт являются нейромедиаторами или предшественниками нейромедиаторов, медиаторов или гормонов.

4. Метаболиты. Аминoкиcлоты -- важнейшие, а некоторые из них жизненно важные компоненты питания. Некоторые aминoкиcлoты принимают участие в обмене веществ, нaпpимep, cлyжaт донорами азота. Непротеиногенные aминoкиcлoты oбpaзyютcя в качестве прoмeжyточныx продуктов при биоcинтeзе и деградации протеиногенных аминокислот или в цикле мочевины.

Пептидная связь

Главными структурными единицами белкой и пептидов являются остатки аминокислот, связанные карбоксамидной пептидной связью между б-карбоксильной группой одной кислоты и и б-аминогруппой другой аминокислоты.

ТИПЫ СВЯЗЕЙ МЕЖДУ АМИНОКИСЛОТАМИ В МОЛЕКУЛЕ БЕЛКА

2 группы:

1.КОВАЛЕНТНЫЕ СВЯЗИ - обычные прочные химические связи.

а) пептидная связь

б) дисульфидная связь

2.НЕКОВАЛЕНТНЫЕ (СЛАБЫЕ) ТИПЫ СВЯЗЕЙ: а) Водородная связь; б) ионная связь; в) Гидрофобное взаимодействие

ПЕПТИДНАЯ СВЯЗЬ.

Формируется за счет COOH-группы одной аминокислоты и NH₂-группы соседней аминокислоты. В названии пептида окончания названий всех аминокислот, кроме последней, находящейся на «С»-конце молекулы меняются на «ил». Например, тетрапептид: валил-аспарагил-лизил-серин

Пептидная связь формируется только за счет альфа-аминогруппы и соседней cooh-группы общего для всех аминокислот фрагмента молекулы. Если карбоксильные и аминогруппы входят в состав радикала, то они никогда не участвуют в формировании пептидной связи в молекуле белка.

Сама пептидная связь является частично двойной в силу лактим-лактамной таутомерии. Поэтому вокруг нее невозможно вращение, а сама она по прочности в полтора раза превосходит обычную ковалентную связь. К ковалентным связям в молекуле белка помимо пептидной, относится также ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ.

Дисульфидная связь - это ковалентная связь. Однако биологически она гораздо менее устойчива, чем пептидная связь. Это объясняется тем, что в организме интенсивно протекают окислительно-восстановительные процессы. Дисульфидная связь может возникать между разными участками одной и той же полипептидной цепи, тогда она удерживает эту цепь в изогнутом состоянии. Если дисульфидная связь возникает между двумя полипептидами, то она объединяет их в одну молекулу.

СЛАБЫЕ ТИПЫ СВЯЗЕЙ

В десятки раз слабее ковалентных связей. Слабые типы связей - это физико-химические взаимодействия. Поэтому они очень чувствительны к изменениям условий среды (температуры, pH среды, ионной силы раствора и так далее).

ВОДОРОДНАЯ СВЯЗЬ - это связь, возникающая между двумя электроотрицательными атомами за счет атома водорода, который соединен с одним из электроотрицательных атомов ковалентно.

Водородная связь примерно в 10 раз слабее, чем ковалентная. Если водородные связи повторяются многократно, то они удерживают полипептидные цепочки с высокой прочностью. Водородные связи очень чувствительны к условиям внешней среды и присутствию в ней веществ, которые сами способны образовывать такие связи (например, мочевина).

ИОННАЯ СВЯЗЬ - возникает между положительно и отрицательно заряженными группировками (дополнительные карбоксильные и аминогруппы), которые встречаются в радикалах лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот.

ГИДРОФОБНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ - неспецифическое притяжение, возникающее в молекуле белка между радикалами гидрофобных аминокислот - вызывается силами Ван-дер-Ваальса и дополняется выталкивающей силой воды.

Номенклатура пептидов

Пептидная цепь имеет одно направление и два разных конца -- N-конец, несущий свободную аминогруппу первой аминокислоты, и С-конец, несущий карбоксильную группу последней аминокислоты. Напомним, что в белках и пептидах аминокислотные остатки связаны в цепочку последовательно. Для того чтобы назвать конкретный пептид, достаточно перечислить (начиная с N-конца) последовательность входящих в его состав аминокислотных остатков в трехбуквенном или однобуквенном коде. Например, аминокислотная последовательность пептидного гормона ангиотензина Il читается следующим образом: Asp-Аrg-Vаl-Туr-Ile-His-Pro-Phe.

При названии пептидов к сокращенному названию аминокислоты добавляют суффикс -ил, за исключением последней С-концевой аминокислоты. Например, тетрапептид Сер-Гли-Про-Ала читается как срилглицилпрлилаланин.

Цепь повторяющихся групп --NH--CH--CO-- называется пептидным остовом. Какой бы длины ни была бы полипептидная цепь, всегда в основе ее - стержень молекулы, абсолютно одинаковый у всех белков. На этом стержне сидят как боковые веточки радикалы аминокислот. Числом, соотношением и чередованием этих радикалов один белок отличается от другого. Мономеры аминокислот, входящие в состав пептидов и белков, называются аминокислотными остатками.

Общая характеристика пептидов.

Пептид состоит из 2 и более аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. Пептиды, содержащие менее чем 10 аминокислотных остатков, называются олигопептидами. Пептиды, содержащие более чем 10 аминокислотных остатков, называются полипептидами. Столько же аминокислот могут содержать и некоторые небольшие белки. Условная граница между полипептидами и белками лежит в области молекулярной массы 6000.

Полипептиды млекопитающих содержат пептидные связи, образованные между альфа-аминогруппой и альфа карбоксильной группой протеиногенных аминокислот. Однако в состав некоторых полипептидов могут входить и другие аминокислоты или производные протеиногенных аминокислот. Атипичным пептидом является трипептид глутатион (гамма-глутамилцистеинилглицин), в котором N- концевой глутамат и цистеин не связаны альфа-пептидной связью.

Биологическая роль пептидов.

1. Пептидами являются многие важнейшие гормоны человека, например, глюкагон, окситоцин, вазопрессин.

2. Пептиды, регулирующие процессы пищеварения, например, гастрин, холецистокинин.

3. Пептиды, регулирующие тонус сосудов и артериальное давление, например, ангиотензин II, брадикинин.

4. Пептиды, регулирующие аппетит, например, лептин, -эндорфины.

5. Пептиды, обладающие обезболивающим действием, например, опиоидные пептиды (энкефалины и эндорфины).

6. Пептиды, участвующие в регуляции высшей нервной деятельности, в биохимических процессах, связанных с механизмами сна, памяти, обучения и т.д.

7. Трипептид глутатион выполняет функцию защиты клетки от окислительных повреждений свободными радикалами.

Медицинское значение.

Пептиды используются в качестве лекарственных препаратов, например, пептидами являются некоторые антибиотики, противоопухолевые препараты.

В процессе распада эндогенных белков образуются среднемолекулярные пептиды (СМП). Основная часть СМП представлена полипептидами с молекулярной массой 300--5000 Д. СМП обладают разнообразной биологической активностью. В физиологических условиях 95% среднемолекулярных пептидов удаляются главным образом путем гломерулярной фильтрации.

Ослабление экскреторной функции почек и неполный распад белков (протеолиз) приводят к увеличению концентрации СМП в плазме (сыворотке) крови. Причем концентрация средних молекул в сыворотке больного может в 8--10 раз превышать норму.

Накопление СМП приводит к нарушению микроциркуляции, а также транспорта ионов натрия и калия через мембраны, подавлению иммунного ответа организма, угнетению активности ряда ферментов. В клинической практике СМП определяют как критерий интоксикации.

Уровни организации белка

Последовательность аминокислотных остатков, соединенных между собой пептидной связью называют первичной структурой белковой молекулы. Она кодируется структурным геном каждого белка.

Вторичная структура - это упорядоченное строение полипептидных цепей, обусловленное водородными связями между группами С=О и N-H разных аминокислот.

Наиболее рапространенные способы укладки вторичной структуры:

1) Альфа-спираль - имеет определенные характеристики: ширину, расстояние между двумя витками спирали. Для белков характерна правозакрученная спираль. В этой спирали на 10 витков приходится 36 аминокислотных остатков. У всех пептидов, уложенных в такую спираль, эта спираль абсолютно одинакова. Фиксируется альфа-спираль с помощью водородных связей между NH-группами одного витка спирали и С=О группами соседнего витка. Эти водородные связи расположены параллельно оси спирали и многократно повторяются, поэтому прочно удерживают спиралеобразную структуру.

Бета-складчатая структура - или структура складчатого листа. Фиксируется также водородными связями между С=О и NH-группами. Фиксирует два участка полипептидной цепи. Эти цепи могут быть параллельны или антипараллельны. Если такие связи образуются в пределах одного пептида, то они всегда антипараллельны, а если между разными полипептидами, то параллельны.

3) Нерегулярная структура (синонимы: беспорядочный клубок, аморфные области) - тип вторичной структуры, в котором расположение различных участков полипептидной цепи относительно друг друга не имеет регулярного (постоянного) характера, поэтому нерегулярные структуры могут иметь различную конформацию.

Третичная структура белка - это пространственная конформация полипептида, имеющего вторичную структуру, и обусловленная взаимодействиями между радикалами. Третичная структура полностью задается первичной.

Выделяют два общих типа третичной структуры:

1) В фибриллярных белках (например, коллаген, эластин) молекулы которых имеют вытянутую форму и обычно формируют волокнистые структуры тканей, третичная структура представлена либо тройной альфа-спиралью (например, в коллагене), либо бета-складчатыми структурами.

2) В глобулярных белках, молекулы которых имеют форму шара или эллипса (латинское название: GLOBULA - шар), встречается сочетание всех трех типов структур: всегда есть нерегулярные участки, есть бета-складчатые структуры и альфа-спирали. Третичная структура глобулярных белков представляет ориентацию в пространстве полипептидной цепи, содержащей ? -спирали, ? -структуры и участки без периодической структуры (беспорядочный клубок). Дополнительное складывание скрученной полипептидной цепи образует компактную структуру. Это происходит, прежде всего, в результате взаимодействия между боковыми цепями аминокислотных остатков.

Связи, стабилизирующие третичную структуру:

1. электростатические силы притяжения между R-группами, несущими противоположно заряженные ионогенные группы (ионные связи);

2. водородные связи между полярными (гидрофильными) R-группами;

3. гидрофобные взаимодействия между неполярными (гидрофобными) R-группами.Гидрофобное ядро существует у большинства белков.

4. дисульфидные связи между радикалами двух молекул цистеина. Эти связи ковалентные. Они повышают стабильность третичной структуры, но не всегда являются обязательными для правильного скручивания молекулы. В ряде белков они могут вообще отсутствовать.

Структурным белком, построенным преимущественно в виде б-спирали, является б-кератин. Волосы (шерсть), перья, иглы, когти и копыта животных состоят главным образом из кератина. Кератин (цитокератин) является важнейшей составной частью цитоскелета. В кератинах большая часть пептидной цепи свернута в правую б-спираль. Две пептидные цепи образуют единую левую суперспираль (или димер). Димеры кератина объединяются в тетрамеры, которые агрегируют с образованием протофибрилл диаметром 3 нм. Наконец, восемь протофибрилл образуют микрофибриллы диаметром 10 нм.

Волосы построены из таких же фибрилл. Так, в отдельном волокне шерсти диаметром 20 мкм переплетены миллионы фибрилл. Отдельные цепи кератина скреплены поперечно многочисленными дисульфидными связями, что придает им дополнительную прочность.

Коллаген

В организме млекопитающих коллаген -- преобладающий в количественном отношении белок: он составляет 25% общего белка. Коллаген присутствует в различных формах прежде всего в соединительной ткани. Этот белок имеет необычный аминокислотный состав: 1/З составляв глицин (Gly). примерно 10% пролин (Рrо), а также гидроксипролин (Hyp) и гидроксилизин (Hyl). Последние две аминокислоты образуются после биосинтеза коллагена путем посттрансляционной модификации. В структуре коллагена постоянно повторяется триплет Gly-X-Y, причем положение X часто занимает пролин, а Y -- гидроксилизин. Коллаген повсеместно присутствует в виде правой тройной спирали, скрученной из трех первичных левых спиралей. В тройной спирали каждый третий остаток оказывается в центре, где помещается только глицин. Вся молекула коллагена имеет длину около 300 нм.

Фиброин шелка

Шелк получают из коконов гусениц тутового шелкопряда (Воmbух mori) и родственных видов. Ocновной белок шелка, фиброин, обладает структурой антипараллельного складчатого листа, причем сами листы располагаются параллельно друг другу, образуя многочисленные пласты. Так как в складчатых структурах боковые цепи аминокислотных остатков ориентированы вертикально вверх и вниз, в промежутках между отдельными слоями могут поместиться лишь компактные группировки. Фактически фиброин состоит на 80% из глицина, аланина и серина, т.е. из трех аминокислот, характеризующихся минимальными размерами боковых цепей. Молекула фиброина содержит типичный повторяющийся фрагмент (Gly-Ala-GIy-AIa-GIy-Ser)_n . Установлено, что в фиброине промежуток между складчатыми слоями составляет 0,35 и 0,57 нм. В первом случае в промежуток ориентирован глицин (R = H). Промежуток 0,57 нм создается за счет отталкивания боковых цепей серина и аланина.

В отличие от нерастворимых фибриллярных белков растворимые белки имеют почти сферическую (глобулярную) форму. Глобулярным белкам свойственна высокоупорядоченная пространственная структура (конформация), которая способствует выполнению специфических биологических функций. Рассмотрим особенности строения глобулярных белков на примере небольшого белка инсулина.

Молекула функционально активного инсулина состоит их двух полипептидных цепей (А- и В-цепи), соединенных дисульфидными мостиками. В молекуле инсулина участки, имеющие форму б-спирали, составляют 57%, 6% приходится на в-складчатую структуру, 10% построено в виде в-петли, оставшиеся 27% не имеют упорядоченной структуры.

Понятие о доменах

Длинные полипептидные цепи часто складываются в несколько компактных, относительно независимых областей. Они имеют самостоятельную третичную структуру, напоминающую таковую глобулярных белков, и называются доменами. Благодаря доменной структуре белков легче формируется их трехмерная структура. Центры связывания белка с лигандом часто располагаются между доменами. Разные домены в белке могут перемещаться относительно друг друга при взаимодействии с лигандом. В некоторых белках домены выполняют самостоятельные функции, связываясь с различными лигандами. Такие белки называются многофункциональными.

Четвертичная структура белка

Многие белки имеют в своем составе несколько полипептидных цепей. Такие белки называют олигомерными. а отдельные цепи -- протомерами. Протомеры в олигомерном белке соединены множеством слабых, нековалентных связей (гидрофобных, ионных, водородных). Взаимодействие протомеров осуществляется благодаря комплементарности их контактирующих поверхностей. Количество протомеров в белках может сильно варьировать: фермент аспартаттранскарбамоилаза содержит 12 протомеров, в белок вируса табачной мозаики входит 2120 протомеров, соединенных нековалентными связями. Гемоглобин (Hb) -- сложный олигомерный белок, содержащийся в эритроцитах. Гемоглобин содержит 4 протомера, соединенных нековалентными связями. Каждый протомер гемоглобина в белке связан с небелковой частью -- гемом и 3 другими протомерами. Следовательно, белки с четвертичной структурой могут иметь очень большую молекулярную массу.

Количество и порядок соединения протомеров в белке называется четвертичной структурой.

Олигомерные белки могут содержать разное количество протомеров (например, димеры, тетрамеры, гексамеры и т. д.). В состав олигомерных белков могут входить одинаковые или разные Протомеры, например гомодимеры -- белки содержащие 2 одинаковых протомера, гетеродимеры -- белки, содержащие 2 разных протомера. Различные по структуре протомеры могут связывать разные лиганды. Взаимодействие одного протомера со специфическим лигандом вызывает конформационные изменения всего олигомерного белка и изменяет сродство других протомеров к лигандам. Это явление носит название кооперативных изменений конформации протомеров. У олигомерных белков появляется новое по сравнению с одноцепочечными белками свойство -- способность к аллостерической регуляции их функций.

Формирование трехмерной стуктуры белков и сборка олигомерных белков осуществляется при участии семейства белков - шаперонов. Кроме того, в клетке шапероны участвуют в таких фундаментальных процессах, как:1) восстановление (ренативация) частично денатурированных белков; 2) узнавание денатурированных белков и транспорт их в лизосомы; 3) синтез белков; 4) транспорт белков через мембраны; 5) функционирование белковых комплексов.

Активный центр белка

На поверхности глобулы образуется участок, который может присоединять к себе другие молекулы, называемые лигандами. Примеры лигандов: лиганд белка-фермента - субстрат; лиганд траспортного белка - транспортируемое вещество; лиганд антитела (иммуноглобулина) - антиген; Лиганд рецептора гормона или нейромедиатора - гормон или нейромедиатор.

Центр связывания с лигандом, или активный центр, формируется из радикалов аминокислотных остатков, сближенных на уровне третичной структуры. В линейной пептидной цепи они могут находиться на расстоянии, значительно удаленном друг от друга.

Белки проявляют высокую специфичность (избирательность) при взаимодействии с лигандом. Высокая специфичность взаимодействия белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра структуре лиганда. Комплементарность -- это пространственное и химическое соответствие взаимодействующих поверхностей. В основе функционирования белков лежит их специфическое взаимодействие с лигандами. 50 000 индивидуальных белков, содержащих уникальные первичные структуры, формируют уникальные активные центры, способные связываться только со специфическими лигандами и благодаря особенностям строения активного центра проявлять свойственные им функции.

Физико-химические свойства белков. Растворимость белков в воде.

Индивидуальные белки различаются по физико-химическим свойствам: 1) форме молекул; 2) молекулярной массе; 3) суммарному заряду, величина которого зависит от соотношения анионных и катионных групп аминокислот; 4) соотношению полярных и неполярных радикалов аминокислот на поверхности молекул; 5) степени устойчивости к воздействию различных денатурирующих агентов.

Растворы белка относятся к растворам высокомолекулярных соединений и обладают рядом свойств гидрофильных коллоидов: медленной диффузией, высокой вязкостью, опалесценцией, дают конус Тиндаля. Эффект Тиндаля вызывается рассеянием тонкого пучка света при прохождении через белковый раствор.

Амфотерность связана с наличием в молекуле белка катионообразующих групп - аминогрупп и анионообразующих - карбоксильных группу. Знак заряда молекулы зависит от количества свободных групп. Если преобладают карбоксильные группы то заряд молекулы отрицательный (проявляются свойства слабой кислоты), если аминогруппы - то положительный (основные свойства). Заряд белка также зависит от рН среды. В кислой среде молекула приобретает положительный заряд, в щелочной - отрицательный. Растворы белков обладают буферными свойствами за счет их амфотерности.

Несмотря на большую величину, многие белковые молекулы не осаждаются в водных растворах. Осаждению белковых молекул препятствуют факторы стабилизации белкового раствора.

Факторы стабилизации белка в растворе.

1) Гидратная оболочка - это слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи молекул воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами.

Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Вода гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, а связана с белковой молекулой. Это - “связанная” вода. Она принадлежит белку, и поэтому имеет особые свойства.

Свойства воды гидратной оболочки

а) Температура кипения выше 100⁰С.

б) Температура замерзания ниже 0^ОС.

в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества.

г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок.

При удалении гидратной оболочки белков происходит коагуляция, т.е. склеивание белковых частиц и выпадение их в осадок. Для этого достаточно изменить структуру частицы белка, так, чтобы ее гидрофильные группы, которые связывают воду растворителя, оказались внутри частицы.

2) заряд белковой молекулы. На поверхности белковой молекулы имеются как положительно, так и отрицательно заряженные радикалы аминокислот. Количество этих групп, а следовательно, и суммарный заряд белков зависят от рН среды. Значение рН, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ количество положительно и отрицательно заряженных групп одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии. Величина заряда белков -- один из факторов, увеличивающий их растворимость. При потере заряда в изоэлектрической точке белки легче агрегируют и выпадают в осадок. Это особенно характерно для денатурированных белков, у которых на поверхности появляются гидрофобные радикалы аминокислот.

Реакции осаждения балка в растворе делятся на две группы: обратимые (высаливание) и необратимые (денатурация).

Денатурация белков -- это разрушение их нативной конформации, вызванное разрывом слабых связей, стабилизирующих пространственные структуры, при действии денатурирующих агентов. Денатурация сопровождается потерей биологической активности белка.

1. Уникальная трехмерная структура каждого белка разрушается, и все молекулы одного белка приобретают случайную конформацию, т.е. отличную от других таких же молекул.

2. Радикалы аминокислот, формирующие активный центр белка, оказываются пространственно удаленными друг от друга, т.е. разрушается специфический центр связывания белка с лигандом.

3. Гидрофобные радикалы, обычно находящиеся в гидрофобном ядре глобулярных белков, при денатурации оказываются на поверхности молекулы, тем самым создаются условия для агрегации белков. Агрегаты белков выпадают в осадок. При денатурации белков не происходит разрушения их первичной структуры.

Факторы, вызывающие денатурацию белков

Факторы, которые вызывают денатурацию белков, можно разделить на физические и химические.

Физические факторы

1. Высокие температуры. Для разных белков характерна различная чувствительность к тепловому воздействию. Часть белков подвергается денатурации уже при 40-50⁰С. Такие белки называют термолабильными. Другие белки денатурируют при гораздо более высоких температурах, они являются термостабильными.

2. Ультрафиолетовое облучение

3. Рентгеновское и радиоактивное облучение

4. Ультразвук

5. Механическое воздействие (например, вибрация).

Химические факторы

1. Концентрированные кислоты и щелочи. Например, трихлоруксусная кислота (органическая), азотная кислота (неорганическая).

2. Соли тяжелых металлов (например, CuSO₄).

3. Органические растворители (этиловый спирт, ацетон)

4. Растительные алкалоиды.

5. Мочевина в высоких концентрациях

6. Другие вещества, способные нарушать слабые типы связей в молекулах белков.

Воздействие факторами денатурации применяют для стерилизации оборудования и инструментов, а также как антисептики (фенол и его производные), лекарственные препараты (например, березовый деготь входит в состав мази Вишневского, ляпис, коллоидное серебро - колларгол)

Обратимость денатурации

Удаление денатурирующих агентов диализом приводит к восстановлению конформации и функции белка, т.е. к ренативации (ренатурации). белок аминокислота пептид домен

В пробирке (in vitro) чаще всего это - необратимый процесс. Если же денатурированный белок поместить в условия, близкие к нативным, то он может ренатурировать, но очень медленно, и такое явление характерно не для всех белков.

In vivo, в организме возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации. Такие специфические белки известны как «шапероны».

Белки--шапероны обладают способностью связываться с частично денатурированными, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии белками и восстанавливать их нативную конформацию. Шапероны образуют комплекс, внутри которого находится полость. Белок, имеющий на своей поверхности фрагменты, обогащенные гидрофобными аминокислотными остатками, попадает в полость шаперонинового комплекса. В этой полости в условиях изолированности от других молекул цитозоля клетки выбор возможных конформаций белка происходит до тех пор, пока не будет найдена энергетически наиболее выгодная конформация. Шаперонзависимое формирование нативной конформаций связано с расходованием значительного количества энергии, источником которой служит АТР.

Классификации белков

Удовлетворительной универсальной классификации белков пока нет. Существующие классификации зачастую противоречат друг другу и имеют ограниченную ценность. Существуют системы классификации белков, основанные на их растворимости, конформации, химическому строению, по функциям.

По растворимости. Введена в 1907-1908 гг. Продолжает использоваться и до настоящего времени. Согласно этой классификации белки делятся на водорастворимые (альбумины), солерастворимые (глобулины), спирторастворимые (проламины) и нерастворимые (склеропротеины). Однако строго установленных границ между группами белков не существует.

По конформационной структуре: фибриллярные, глобулярные и мембраносвязанные. Примером мембраносвязанного белка является калий, натрий - АТФза.

По химическому строению: простые белки или протеины - состоят только из аминокислот, сложные белки - протеиды - помимо аминокислот имеют в составе небелковую часть (углеводы, липиды, металлы, нуклеиновые кислоты).

К простым белкам относятся: альбумины, глобулины, гистоны, протамины, склеропротеины (коллагены) и т.д.

Альбумины составляют большую часть белков плазмы крови. Благодаря высокому содержанию дикарбоновых аминокислот альбумины удерживают катионы и играют основную роль в сохранении коллоидно-осмотического давления. Также альбумины транспортируют некоторые гидрофобные метаболиты и лекарственные средства.

Глобулины - гетерогенная сложная смесь белковых молекул с большой молекулярной массой. Выполняют транспортную, защитную и другие функции. Глобулины часто содержат углеводную часть.

Гистоны - низкомолекулярные белки с высоким содержанием аргинина и лизина. Входят в состав хроматина.

Протамины - белки с очень большим содержанием аргинина. Образуют комплексы с ДНК, выступают как регуляторные и репрессорные белки.

Склеропротеины (коллагены) - фибриллярные белки. Пептидная цепь коллагена содержит около 1000 аминокислотных остатков, из которых каждая третья аминокислота - глицин, 20% составляют пролин и гидроксипролин, 10% аланин, 40% - остальные аминокислоты. Основная функция - структурный белок.

Сложные белки состоят из белковой части (апопротеин) и небелковой части (простетическая группа) и называются холопротеинами. К сложным белкам относятся:

1)Нуклеопротеиды - простетическая группа - нуклеиновые кислоты. Среди многочисленных классов нуклеопротеидов наиболее изученными являются рибосомы, состоящие из нескольких молекул РНК и рибосомных белков, и хроматин - основной нуклеопротеид эукариотических клеток, состоящий из ДНК и структурообразующих белков - гистонов.

2)Гемопротеиды - небелковый компонент этих протеидов - гем, построен из четырех пиррольных колец, с ними связан ион двухвалентного железа (через атомы азота). К таким белкам относятся: гемоглобин, миоглобин, цитохромы. Этот класс белков еще называют хромопротеиды, поскольку гем является окрашенным соединением. Функции гемоглобин - транспорт кислорода, функция миоглобина - запасание кислорода в мышцах. Функции цитохромов (ферменты) - катализ окислительно-восстановаительных реакций и электронный транспорт в дыхательной цепи.

3) Металлопротеиды - в состав простетической группы входят металлы. Примеры: цитохром а - содержит медь.

4) Липопротеиды - содержат липиды (триацилглицериды, фосфолипиды, холестерол)

5) Фосфопротеиды - содержат остаток фосфорной кислоты

6) Глюкопротеиды - содержат сахара (нейтральные сахара, аминосахара, кислые производные моносахаридов);

В любом живом организме содержатся тысячи белков, выполняющих разнообразные функции (рис ). Чтобы дать представление о многообразии белков, на схеме с увеличением примерно 1 х 1500000 приведен общий вид молекул (с соблюдением формы и размера) ряда вне- и внутриклеточных белков. Функции, выполняемые белками, распределяются примерно следующим образом.

Структурообразующие функции. Структурные белки отвечают за поддержание формы и стабильности клеток и тканей. В качестве примера структурного белка на схеме представлен фрагмент молекулы коллагена. В заданном масштабе целая молекула коллагена размером 1500000 * 300 нм заняла бы три страницы. К структурным белкам можно отнести также гистоны, функцией которых является организация укладки ДНК в хроматине. Структурные единицы хроматина, нуклеосомы, состоят из октамерного комплекса гистонов, на который навита молекула ДНК (DNA).

Транспортные функции. Наиболее известным транспортным белком является гемоглобин эритроцитов (слева внизу), ответственный за перенос кислорода и диоксида углерода между легкими и тканями. В плазме крови содержатся множество других белков, выполняющих транспортные функции. Так, преальбумин переносит гормоны щитовидной железы -- тироксин и трииодтиронин, трансферрин переносит железо. Ионные каналы и другие интегральные мембранные белки осуществляют транспорт ионов и метаболитов через биологические мембраны.

Защитные функции. Иммунная система защищает организм от возбудителей болезней и чужеродных веществ. В качестве ключевого компонента этой системы здесь представлен иммуноглобулин G, который на эритроцитах образует комплекс с мембранными гликолипидами.

Регуляторные функции. В биохимических сигнальных цепях белки осуществляют функции сигнальных веществ (гормонов) и гормональных рецепторов. В качестве примера здесь представлен комплекс гормона роста соматотропина с соответствующим рецептором. При этом внеклеточные (экстрацеллюлярные) домены двух молекул рецептора связывают одну молекулу гормона. Связывание с рецептором активирует цитоплазматические домены комплекса и тем самым обеспечивает дальнейшую передачу сигнала. В регуляции обмена веществ и процессов дифференцировки принимают решающее участие ДНК-ассоцированиые белки (факторы транскрипции).

Катализ. Среди белков наиболее многочисленную группу составляют ферменты. Самые низкомолекулярные из них имеют мол. массу 10-15 кДа. Белки среднего размера, как, например, приведенная на схеме алкогольдегидрогеназа, имеют мол.массу 100-200 кДа. Молекулярная масса высокомолекулярных ферментов, к которым относится глутаминсинтетаза, построенная из 12 мономеров, могут достигать 500 кДа. Эта функция в 1982 году перестала считаться уникальной. Выяснилось, что некоторые РНК тоже обладают каталитической активностью. Их называют РНКзимами или рибозиами.

Двигательные функции. Взаимодействие актина с миозином ответственно за мышечное сокращение и другие формы биологической подвижности. Миозин (слева) длиной 150 нм -- один из наиболее крупных белков. Нитевидный актин (F-актин) образуется путем полимеризации относительно небольших молекул глобулярного актина (G-актин). Процессом сокращения управляют ассоциированный с F-актином тропомиозин и другие регуляторные белки.

Запасные функции. В растениях содержатся запасные белки, явлющиеся ценными пищевыми веществами, например, глиадин - белок зерен пшеницы. В организмах животных мышечные белки служат резервными питательными веществами, которые мобилизуются при крайней необходимости. В молоке содержится белок казеин.

Опорная - сухожилия, поверхности суставов соединения костей образованы в значительной степени белками, например, коллаген, эластин.

Энергетическая - аминокислоты белков могут поступать на путь гликолиза, который обеспечивает клетку энергией.

Трансформация энергии. Белки сечатки глаза родопсин и ретинен трансформируют световую энергию в электрическую.

Любой белок - амфотерный полиэлектролит. Белки способствуют поддержанию определенных значений рН в разных отсеках клетки, обеспечивая этим компартментализацию.

Изофункциональные белки - это семейства белков, выполняющие одинаковую или близкую функцию, но имеющие небольшие особенности в строении, что придает им свои физиологические особенности. Например, гемоглобины человека.

Гемоглобин А -- тетрамер: (22). Составляет около 98% гемоглобина эритроцитов взрослого человека.

Гемоглобин А₂ -- тетрамер (22). Его содержание в эритроцитах взрослого человека равно 2%.

Гемоглобин эмбриональный -- тетрамер (22). Обнаруживается на ранних этапах развития плода.

Гемоглобин F -- тетрамер (22). Приходит на смену раннему гемоглобину плода на 6-м месяце развития.

Таким образом, все типы гемоглобина содержат одинаковую -цепь и различаются по второй цепи. Гемоглобины выполняют одну функцию - транспорт кислорода, но благодаря особенностям строения различаются по степени сродства к кислороду. У гемоглобина F сродство к кислороду выше, это обеспечивает диффузию кислорода от гемоглобина А крови матери к гемоглобину F плода.

Изобелки - это множественные формы белка, обнаруживаемые в организме одного вида. Например, коллагены.

Гомологичные белки - это белки, выполняющие одинаковые функции в организме разных видов.

Семейства родственных белков. В ходе эволюции в пределах одного и того же вида биохимические замены аминокислот могут приводит к возникновению разных белков, выполняющих сходные функции и имеющих незначительные различия по аминокислотной последовательности. Например, белки суперсемейства иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины (Ig), или антитела, являются семейством Y-образных (по пространственной структуре) гликопротеинов, у которых обе вершины («буквы Y») могут связывать антиген. Иммуноглобулины находятся в виде мембранных белков на поверхности лимфоцитов и в свободном виде в плазме крови. На схеме показана структура наиболее важного из них -- иммуноглобулина класса G (IgG). Молекула представляет собой крупный тетрамер (Н₂L₂ с 150 кДа) из двух идентичных тяжелых цепей (Н-цепей) и двух идентичных легких цепей (L-цепей). В обеих H-цепях имеется ковалентно связанный олигосахарид.

Иммуноглобулины расщепляются протеиназой папаином на два F_ab-фрагмента и один F_c-фрагмент. Оба F_ab-фрагмента (от англ. antigen binding fragment -- антиген-связывающий фрагмент) состоят соответственно из одной L-цепи и N-концевой части H-цепи. Изолированные F_ab-фрагменты сохраняют способность связывать антиген. F_с-Фрагмент (от англ. fragment crystallizable -- способный кристаллизоваться) состоит из С-концевой половины обеих H-цепей. Эта часть IgG выполняет функции связывания с клеточной поверхностью, взаимодействия с системой комплемента и участвует в переносе антител клетками.

Несмотря на большое разнообразие в иммуноглобулинах соблюдается общий принцип строения. Обе тяжелые пептидные цепи (Н-цепи) IgG состоят из четырех глобулярных доменов V_H, С_H1, С_H2 и С_H3, обе легкие (L- цепи) -- из двух глобулярных доменов C_L и V_L. При этом буквы С и V соответственно обозначают константные (англ. constant) и вариабельные (англ. variable) области. Обе тяжелые цепи, а также тяжелая цепь с легкой, связаны дисульфидными мостиками. Дисульфидные мостики внутри доменов стабилизируют третичную структуру. Домены имеют длину около 110 аминокислот и обладают взаимной гомологией. Такая структура антител, очевидно, возникла благодаря дупликации гена.

В центральной области молекул иммуноглобулинов расположен шарнирный участок, который придает антителам внутримолекулярную подвижность.

Классы иммуноглобулинов

Иммуноглобулины человека по структуре тяжелых цепей делятся на пять классов. Различия между IgA (с двумя подклассами), IgD, IgE, IgG (с четырьмя подклассами) и IgM определяются H-цепями, которые обозначаются греческими буквами -- б, в, е, г и м. L-Цепи имеют только две разновидности (к и л). IgM могут существовать в различных формах. Секретируемые IgM состоят из пяти взаимосвязанных димеров. IgA могут быть образованы из одного, двух или трех димеров. Олигомерные IgM и IgA удерживаются вместе благодаря связывающему J-пептиду (от англ. joining).

Иммуноглобулины всех пяти классов являются секретируемыми белками. Они поставляются в кровь зрелыми В-клетками, Ранние варианты IgM и IgD найдены также в виде интегральных мембранных белков на поверхности В-клеток.

Антитела имеют различные функции. При контакте с чужеродным антигеном первыми образуются lgM-антитела. Ранние формы IgM связаны с поверхностью В-клеток, более поздние формы секретируются в виде пентамеров плазматическими клетками. Антитела IgM особенно активны против микроорганизмов. В количественном отношении больше всего антител IgG. Они находятся в крови и в интерстициальной жидкости; с помощью рецепторов они могут также проходить в плаценту и вследствие этого переноситься от матери к плоду. IgA обнаруживаются преимущественно в кишечном тракте и секретах. IgE присутствуют в плазме здорового человека лишь в незначительных, концентрациях. Повышение уровня IgE наблюдается при аллергических реакциях и паразитарных инфекциях. Количества в плазме IgD, функция которого еще не выяснена, также весьма малы.

Высаливание

Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в осадок (высаливание). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, например (NН₄)₂SО₄, разделить (фракционировать) смесь белков.

Диализ

Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.

Гель-фильтрация.

Гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов (1а). Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля, будут перемещаться с высокой скоростью. Средние и небольшие белки будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

В настоящее время электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) [ДСН-ПААГ-электрофорез (SDS-PAGE)] является общепринятым методом определения гомогенности белковых препаратов. Метод основан на свойстве заряженных частиц (молекул) перемещаться под действием электрического поля. Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда. Поэтому предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфа-том натрия [ДСН (SDS)] (C₁₂H₂₅OSO₃Na), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН (примерно 0,4 г/г белка) и приобретают отрицательный заряд. Для полной денатурации в среду добавляют тиолы, которые расщепляют дисульфидные мостики.

Электрофорез проводят в тонком слое полиакриламида. После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя, В качестве примера на схеме 3 приведена электрофореграмма трех препаратов: клеточного экстракта, содержащего сотни белков; выделенного из экстракта гомогенного белка; контрольной смеси белков с известными молекулярными массами.

Изменение белкового состава организма. В процессе развития организма белковый состав значительно меняется. В специализированных тканях появляются специфические белки. Например, гемоглобин в эритроцитах, родопсин в клетках сетчатки глаза. Специализированные клетки отличаются и по количеству белков, присутствующих во всех или во многих тканях организма. Белковый состав организма здорового взрослого человека относительно постоянен. Вариации количества отдельных белков могут определяться составом пищи, режимом питания, физиологической активностью.

При различных заболеваниях происходит изменение белкового состава тканей. Эти изменения называют протеинопатиями. Различают наследственные и приобретенные протеинопатии. Пример наследственной протеинопатии - гемоглобинопатии. В зависимости от роли дефектного белка в жизнедеятельности организма наследственные протеинопатии могут вызывать болезни или летальный исход. При наследственных протеинопатиях нарушается первичная структура белка.

Приобретенные протеинопатии развиваются в результате болезни. В этом случае первичная структура белка не нарушается, а происходит

1. количественное изменение белков в пораженном органе или ткани.

2. изменение биологической активности белков из-за нарушения нативной конформации:

– при сдвигах рН среды в щелочную или кислую сторону;

– при присоединении низкомолекулярных веществ к белкам, например, при сахарном диабете к белкам крови присоединяется глюкоза;

Изменение белкового состава крови и мочи используется для диагностики ряда заболеваний.

Литература

1. Биохимия: учебник /Под ред. Е.С. Северина. - 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004.- 784 с;

2. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами /под редакцией Е. С. Северина и А.Я. Николаева - М.:ГЭОТАР-МЕД, 2001.- 448 с. Гринстейн Б., Гринстейн А.

3. Наглядная биохимия: Пер. с англ. - М.:ГЭОТАР-МЕД, 2000.- 119 с.- («Экзамен на отлично»)

Размещено на Allbest.ru