Ідентифікація та властивості іон-транспортувальних АТР-гідролаз сперматозоїдів чоловіків за умов олігозооспермії

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут біології тварин УААН

УДК 612.016.2.015.7

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Ідентифікація та властивості іон-транспортувальних АТР-гідролаз сперматозоїдів чоловіків за умов олігозооспермії

03.00.04 - біохімія

Кочешкова Наталія Сергіївна

Львів 2007

Загальна характеристика роботи

сперматозоїд олігозооспермія гідролазна система

Актуальність теми. Питання репродуктивного здоров'я населення сьогодні є особливо актуальним, оскільки число бездітних шлюбів постійно зростає. В Україні 10-15 % сімей є безплідними (Статистичний щорічник України, 2004 р). Причиною цього у 40-60 % випадків є порушення статевої функції чоловіків, зокрема олігозооспермія -- зниження вмісту сперматозоїдів в еякуляті менше 60 млн/мл (Нишлаг Э. и др., 2005).

Важливим показником функціонального стану сперматозоїдів є іонний гомеостаз. У спермальних мембранах наявні декілька АТРазних систем: Са²⁺, Mg²⁺-, Na⁺, K⁺-, “базальна” Mg²⁺-АТРази плазматичної мембрани (ПМ) (Woo A. L. et al., 2000), Н⁺-АТРаза мітохондрій (МХ) (Halangk W. et al., 1985), Са²⁺, Mg²⁺-АТРаза ендоплазматичного ретикулуму (ЕПР) (Dorval V. et al., 2002). Порушення їх функціонування призводить до пригнічення процесу Капа-цитації, акросомної реакції, зниження рухливості клітин (Schuh K. et al., 2004).

Численні функції сперматозоїдів також опосередковуються оксидом азоту (NO) та його стабільними метаболітами, які виступають модуляторами їх рухливості, стійкості до змін умов середовища тощо (Wu G. J. et al., 2004). Зміни їх концентрацій корелюють із розвитком багатьох патологічних станів, зокрема астено- та тератозооспермій (Ozbey I. et al., 2002).

Каліксарени (макроциклічні олігомери фенолів) здатні утворювати комплекси з молекулами та іонами (Dodds F. et al., 2005), що обумовлює їх вплив на активність АТРазних систем у певних тканинах, зокрема, в міометрії матки (Векліч Т. О. та ін., 2005). Питання впливу цих сполук на АТРазні системи у сперматозоїдах є мало вивченим, а вирішення його особливо актуальним.

Згідно офіційних статистичних даних майже у 30 % випадків причина чоловічого безпліддя залишається не встановленою (Нишлаг Э., 2005). Тому існує необхідність створення нових чутливих методів діагностики, що дозволить проводити ефективніше лікування даних патологій.

Вивчення особливостей функціонування АТР-гідролазних систем сперматозоїдів, їх ролі в розвитку олігозооспермії дозволить поглибити знання про механізми іонного гомеостазу в сперматозоїдах, особливості розвитку патологічних станів чоловічої репродуктивної системи, створить теоретичні основи для розробки нових методів їх діагностики, лікування та профілактики.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у рамках двох тем: “Роль іонів кальцію, калію, натрію і транспортних АТФаз у збереженні біологічної повноцінності сперматозоїдів” (шифр державної реєстрації № 0196U024411) та “Регуляторна роль іонів кальцію у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи клітин” (шифр теми: ІН.07.00.0001.04) в якій автор вивчала особливості функціонування АТР-гідролаз сперматозоїдів у нормі та при олігозооспермії.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було: на інтактних та пермеабілізованих сперматозоїдах чоловіків ідентифікувати АТР-гідролазні активності іон-транспортувальних систем, що мають зовнішньо- та внутрішньоклітинну локалізацію активних центрів, провести дослідження особливостей їх функціонування в нормі та при олігозооспермії, а також встановити зміни концентрації нітритів при розвитку даної патології.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити морфологічні та фізико-хімічні особливості еякуляту і сперматозоїдів чоловіків у нормі та при олігозооспермії.

2. Підібрати оптимальні умови для визначення “екто”- та “ендо”-АТРазних ферментативних активностей у сперматозоїдах.

3. Ідентифікувати та вивчити зміни ферментативних активностей Са²⁺-залежних та Са²⁺-незалежних “ендо”-АТРазних систем сперматозоїдів у нормі та при олігозооспермії, із використанням селективних інгібіторів.

4. Дослідити вплив макроциклічних сполук -- каліксаренів С-97, С-99 та С-107 на Na⁺, K⁺-АТРазну активність сперматозоїдів.

5. Вивчити зміни концентрації нітритів за умов деяких патологічних станів чоловічої репродуктивної системи.

6. Розробити біохімічний тест на наявність олігозооспермії.

Об'єкт дослідження. Функціонування іон-транспортувальних АТР-гідролазних систем у сперматозоїдах чоловіків.

Предмет дослідження. Роль Са²⁺-залежних та Са²⁺-незалежних АТРазних систем із зовнішньо- та внутрішньоклітинною орієнтацією їх активних центрів у сперматозоїдах чоловіків при олігозооспермії.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети використовувались методи препаративної біохімії (одержання відмитих від плазми еякуляту сперматозоїдів), ензимології (визначення АТРазної активності сперматозоїдів), спектрофотометрії (вимірювання вмісту неорганічного Р_і та концентрації білка), лазерно-кореляційної спектроскопії (ЛКС, визначення ефективного гідродинамічного діаметру та швидкості руху сперматозоїдів), світлової (встановлення показників якості сперми) та електронної мікроскопії (морфометричні дослідження), хімічної та біохімічної кінетики (визначення ефективності впливу ефекторів на АТРазну активність), статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексні дослідження з вивчення особливостей функціонування Са²⁺-залежних та Са²⁺-незалежних “ендо”-АТРаз сперматозоїдів чоловіків у нормі та при олігозооспермії. Виявлені зміни ферментативних активностей сперматозоїдів чоловіків при олігозооспермії, відносно фізіологічного стану розширюють уявлення про роль іон-транспортувальних АТРазних систем у збереженні біологічної повноцінності сперматозоїдів та механізми розвитку чоловічого безпліддя.

Вперше досліджено вплив циклічних олігомерів фенолів -- каліксаренів (С-97, С-99, С-107) на Na⁺, K⁺-АТРазну активність сперматозоїдів. Показано, що каліксарени С-97 та С-107 є ефективнішими, ніж уабаїн, селективними, високоафінними інгібіторами активності даної ферментативної системи.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, за допомогою методів електронної мікроскопії, ЛКС та ензимології, ефективність пермеабілізації спермальних мембран детергентом сапоніном. Модель перфорованих сперматозоїдів є зручним об'єктом для тестування впливу нових ефекторів АТРазних систем.

Розроблено, із залученням селективних та неселективних інгібіторів АТР-гідролазних систем (уабаїн, тапсигаргін, NaN₃, LaCl₃, п-ХМБ, о-ванадат, еозин Y), оптимальні умови тестування “екто”- та “ендо”-АТРазних активностей у чоловічих гаметах. Запропонована методологія є перспективною для проведення досліджень властивостей, механізмів регуляції та функціональної ролі мембранозв'язаних АТР-гідролаз сперматозоїдів чоловіків.

Зниження еозин Y-чутливої АТРазної активності сперматозоїдів при олігозооспермії у 2,5-3 рази відносно нормоспермії, може слугувати основою для розробки стандартизованого методу діагностики даного захворювання.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка самостійно опрацювала літературу за темою дисертаційної роботи, виконала експериментальну частину, за винятком методів електронної мікроскопії (виконано спільно з к. б. н. О. Р. Кулачковським на базі міжфакультетської лабораторії електронної мікроскопії, Львівського національного університету ім. І. Франка) та ЛКС (виконано спільно з к. ф.-м. н. В. Ф. Горчевим на базі лабораторії оптичних методів дослідження, Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна). Частина досліджень з вивчення АТРазних систем була виконана дисертанткою у відділі біохімії м'язів ІБХ ім. О. В. Палладіна НАН України (зав. відділу -- член-кор. НАНУ, проф. С. О. Костерін). Одержані результати висвітлено у спільних публікаціях. Дисертантка самостійно провела кінетичний та статистичний аналіз результатів, підготувала до друку матеріали за результатами дисертаційної роботи. Аналіз отриманих результатів, формулювання основних висновків було проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на: конференції-конкурсі робіт молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006” (Київ, 2006 р.), ХІ конгресі СФУЛТ (Полтава, 2006 р.), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006 р.), ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології” (Львів, 2007), V Міжнародному симпозіумі “Актуальные проблемы биофизической медицины” (Київ, 2007), 6-й Міжнародній Парнасівській конференції (м. Краків, Польща, 2007), Міжнародній конференції “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (м. Пущино, Росія, 2007 р.). Про результати роботи також доповідали на наукових семінарах в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (Київ, 2005) та Інституті біології тварин УААН (Львів, 2007).

Публікації. Результати досліджень висвітлено у 12 друкованих роботах, з них 5 статей у фахових наукових виданнях та 7 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів та результатів досліджень, їх аналізу й обговорення, висновків та списку використаної літератури із 224 джерел. Матеріал надруковано на 128 сторінках, проілюстровано 26 рисунками та 3 таблицями, які займають 16 сторінок.

Зміст роботи

Огляд літератури

Огляд літератури присвячений біохімічним, фізико-хімічним властивостям еякуляту і сперматозоїдів за фізіологічних та патологічних станів. Охарактеризовано системи транспорту іонів у сперматозоїдах. Проаналізовано основні властивості каліксаренів, описано роль оксиду азоту та його стабільних метаболітів у функціонуванні сперматозоїдів, а також біохімічні механізми функціональної активності чоловічих гамет.

Методи дослідження

Еякулят чоловіків відбирали від пацієнтів віком 25-44 роки з дотриманням правил безпеки для здоров'я обстежених, збережені прав та канонів людської гідності пацієнтів, а також морально-етичних норм.

Клінічний матеріал аналізували за основними показниками якості сперми (метод спермограм). Сперматозоїди чоловіків відмивали від плазми еякуляту 3-разовим центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв. Кількість білка в клітинному препараті визначали методом О. Lowry та ін. (Lowry О. et al., 1951).

Для електронно-мікроскопічних досліджень клітини фіксували та поміщали в епоксидну смолу Epon-812, зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-6. Перегляд і фотографування зразків проводили на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100 при прискорювальній напрузі 75 kV (Holstein A., 1975).

Визначення середнього гідродинамічного діаметра проводили на лазерно-кореляційному спектрофотометрі PCS 100 у суспензії сперматозоїдів концентрацією 1 мг білка/мл (Лебедев А. Д. и др., 1987).

АТР, Mg²⁺-залежну “екто”-АТРазну активність визначали у суспензії сперматозоїдів (0,5-1,5 мг білка/мл) у середовищі інкубації наступного складу (мМ): 120 NaCl, 30 KCl, 5 MgCl₂, 5 CaCl₂, 3 АТР, 30 Hepes-Трис-буфер (рН 7,4); так зване “зовнішньоклітинне” середовище (ЗКС).

Загальну Na⁺, K⁺, Mg²⁺-залежну “ендо”-АТРазну активність визначали у “внутрішньоклітинному” середовищі (ВКС) інкубації (мМ): 30 NaCl, 120 KCl, 5 MgCl₂, 3 АТР, 30 Hepes-Трис-буфер (рН 7,4), 0,5 % сапонін, 0,5-1,5 мг білка/мл. Визначення Са²⁺-залежних “ендо”-АТРазних активностей проводили в присутності 0,01 мМ СаCl₂, а Са²⁺-незалежних -- 1 мМ ЕГТА (Karaki Н. et al., 1997). Час інкубації -- 5 хв при 37 С. Вміст фосфату неорганічного Р_і визначали за методом W. Rathbun, V. Betluch (Векліч Т. О. та ін., 2002).

Для визначення впливу інгібіторів на АТРазну активність сперматозоїдів до середовища інкубації додавали їх аліквоту у відповідній концентрації (мМ): 1 еозин Y (Костерин С. А. и др., 1998), 1 LaCl₃ (Левицкий Д. О. и др., 1990), 1 орто-ванадат (о-ванадат (Robinson J. D., 1981)), 1 пара-хлор меркурій-бензоат (п-ХМБ (Костерин С. А., 1990)), 1 уабаїн (Valente R. C. et al., 2003), 1 NaN₃, 0,1 мкМ тапсигаргін (Flynn E. R. M. et al., 2001).

Уявні кінетичні параметри, щодо реакції Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР -- константу активації (K_a) та коефіцієнт Хілла (n_H) обчислювали за методом Хілла (Курганов В. И., 1978) у координатах {lg[(A_m-A)/ A]; lg[S]}, де A та A_m -- питомі ферментативні активності у відсутності та в присутності в середовищі інкубації досліджуваної речовини в концентрації [S]. При визначенні ефективності впливу інгібіторів на АТРазну активність (константи інгібування K_i та n_H) лінеаризовані криві концентраційних залежностей будували у координатах {lg[(А /(A₀-A)]; lg[І]}, де A та A₀ -- питомі ферментативні активності у відсутності та в присутності відповідного інгібітору в концентрації [І]. У випадку таких графіків значення коефіцієнта кореляції R² становило 0,95-0,99.

Статистичний аналіз одержаних даних проводили із використанням критерію Стьюдента (Кокунин В. А., 1975). Кінетичні та статистичні розра-хунки здійснювали в режимі програмного забезпечення на персональному комп'ютері IBM PC.

Вивчення морфологічних та фізико-хімічних особливостей еякуляту і сперматозоїдів чоловіків в нормі та при олігозооспермії

Аналіз спермограм. В умовах лабораторії дослідили 239 еякулятів чоловіків, що зверталися з проблемами безпліддя протягом 2004-2007 років. Вік пацієнтів становив 25-44 роки (30,9 ± 0,4 роки). Аналіз еякулятів за основними критеріями спермограм показав, що 94 еякуляти належать здоровим чоловікам (нормоспермія), а 145 зразків характеризуються наявністю патологій. З них 43 пацієнти страждали на олігозооспермію (29,7 % патологічних випадків). Серед комбінацій захворювань найпоширенішою виявилась оліготератозооспермія -- 12,9 % всіх еякулятів, а поєднання трьох видів патологій (олігоастенотератозооспермія) становить 5,4 % від загальної кількості досліджених зразків.

Для проведення досліджень еякуляти пацієнтів ділили на дві групи: контрольна група 1 (нормозооспермія) та група 2 (олігозооспермія). Середній вік у групах становив 31,6 ± 0,7 та 30,4 ± 0,5 років для груп 1 та 2 відповідно.

Морфометричні дослідження сперматозоїдів. Результати електронно-мікроскопічних досліджень показали, що як в нормі, так і при олігозооспермії основна частина сперматозоїдів характеризуються типовою будовою: плоска головка з чітко окресленою акросомою, джгутик рівний, з аксіальним типом прикріплення до головки, ПМ є суцільною, без розривів.

Для вивчення особливостей функціонування АТР-гідролазних систем, що мають внутрішньоклітинну орієнтацію активних центрів, необхідно перфорувати мембрану. При додаванні до суспензії сперматозоїдів 0,5 % розчину детергенту сапоніну виявилося, що ПМ втрачає свою структурованість, цілісність, відшаровується від акросоми та інших клітинних структур. Це спричиняє руйнування сперматозоїдів: головки відокремлюються від тіла, хвостики руйнуються, в результаті зменшуються їх розміри.

Ефективність впливу сапоніну на спермальні мембрани була також показана шляхом визначення середнього гідродинамічного діаметру сперматозоїдів методом ЛКС. Одержані результати свідчать на користь того, що ефективний діаметр сперматозоїдів здорових чоловіків становить 10-15 мкм. Додавання до клітинної суспензії 0,5 % розчину сапоніну призводить до зменшення їх розмірів до 2-3 мкм (середній розмір міцел суспензії детергенту -- 0,6-0,8 мкм), при чому для основної частини (37,1 %) утворених фрагментів діаметр становить 2,5 мкм.

Отже, відмиті від плазми еякуляту сперматозоїди зберігають свою структурну цілісність та функціональну активність, а детергент сапонін ефективно пермеабілізує спермальні мембрани, зменшуючи ефективний діаметр клітин. Такий експериментальний підхід є перспективним для вивчення “латентних” АТРазних активностей сперматозоїдів.

Пошук оптимальних умов для визначення “екто”- та “ендо”-АТР-гідролазних ферментативних активностей у сперматозоїдах чоловіків

Оптимальні умови визначення “екто”- та “ендо”-АТРазних активностей. У мембранах сперматозоїдів присутні “екто”-АТРази, що мають зовнішньоклітинну орієнтацію активних центрів та “ендо”-АТРази, активні центри яких розміщенні у внутрішньоклітинному просторі. Тому метою наступного етапу досліджень було підібрати оптимальні умови для визначення даних ферментативних активностей у випадку використання інтактних та пермеабілізованих сперматозоїдів, тобто двох експериментальних моделей для визначення “екто”- та “ендо”-АТРазних активностей відповідно.

В ході досліджень було встановлено, що оптимальним детергентом, який призводить до максимального зростання АТРазної активності пермеабілізованих сперматозоїдів відносно інтактних клітин у ЗКС є 0,05% розчин сапоніну, а при використанні ВКС інкубації -- 0,5 % розчин детергенту. Оптимальний час інкубації в обох типах середовищ для всіх досліджуваних АТРазних активностей - 5 хв., концентрація білка -- 0,5-1,5 мг/мл проби, [АТР]_опт. -- 3 мМ, [Mg²⁺]_опт. -- 5 мМ. Експерименти проводили при фізіологічних значеннях температури (37 С) та рН (7,4). Одержані результати дали змогу вивчати окремі АТР-гідролазні системи сперматозоїдів із використанням інгібіторів різного спектра дії при нормо- та олігозооспермії.

“Екто”-АТРазна активність сперматозоїдів чоловіків. Оскільки, достовірно не відома структура та хімічна природа АТР-гідролаз із зовнішньоклітинною локалізацією активних центрів, для їх дослідження використовували ЗКС інкубації та неспецифічні інгібітори АТР-гідролазної активності: еозин Y, лантану хлорид (LaCl₃), о-ванадат та п-ХМБ.

“Екто”-АТРазна активність інтактних сперматозоїдів здорових чоловіків (контрольне значення, прийнято за 100 %) становить 30,9 ± 4,5 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1, (M ± m, n = 9). Результати показали, що неспецифічний інгібітор активностей АТРазних систем різних типів еозин Y (Gatto C. et al., 1995), у концентрації 1 мМ інґібує “екто”-АТРазну активність сперматозоїдів на 38,8 ± 6,6 % відносно контрольного значення (M ± m, n = 9). Менш ефективними виявилися LaCl₃, о-ванадат та п-ХМБ, які знижували “базальну” Mg²⁺-залежну “екто”-АТРазну активність сперматозоїдів на 29,1 4,9 %, 23,5± 4,6 % та 18,8± 2,7 % відповідно відносно контролю (М ± m, n = 6). З одержаних результатів можна зробити висновки, що іони La вельми слабо конкурують з Mg²⁺ за утворення хелатного комплексу з нуклеотид три-фосфатом; чутливість “екто”-АТРаз до о-ванадату значно менша, ніж до Са²⁺-транспортувальних систем ЕПР та МХ, активність яких пригнічується о-ванадатом на 80-100 % (Костерин С. А. и др., 1996). А також SH-групи присутні в активних центрах “екто”-АТРаз сперматозоїдів у не значній кількості, оскільки чутливість їх актив-ності до п-ХМБ досить низька. Інгібітор-нечутлива компонента “екто”- АТРазної активності обумовлена наявністю таких АТРазних систем, які володіють високою активністю, але нечутливі до дії даних інгібіторів.

Як контроль на цілісність ПМ сперматозоїдів використовували селективні інгібітори активності Са²⁺, Mg²⁺-АТРази ЕПР -- тапсигаргін (Bassani R. A. et al., 2003) та мітохондріальної Н⁺-АТРази -- азид натрію (Bald D. et al., 1998), оскільки дані АТРази мають внутрішньоклітинну локалізацію активних центрів. Обидва інгібітори не чинили достовірного впливу на АТР-гідролазну активність не оброблених детергентом сперматозоїдів. Отже, можна стверджувати, що в даному випадку бар'єрна функція ПМ сперматозоїдів не порушена.

Ідентифікація та вивчення особливостей функціонування Са²⁺-залежних та Са²⁺-незалежних “ендо”-АТРаз сперматозоїдів чоловіків в нормі та при олігозооспермії із використанням селективних інгібіторів

Ідентифікація “ендо”-АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків. Згідно літературних даних у спермальних мембранах наявні Са²⁺-залежні (Са²⁺, Mg²⁺-АТР-гідролазні ферменти) (Schuh K. et al., 2004) та Са²⁺-незалежні (Na⁺, K⁺-, “базальна” Mg²⁺-АТРази ПМ, та Н⁺-АТРаза МХ сперматозоїдів) (Blanco G. et al., 2000; Woo A. L. et al., 2000) АТРазні системи. Тому подальші дослідження проводили відповідно у кальційвмісному та безкальцієвому ВКС інкубації.

“Загальна” АТРазна активність пермеабілізованих сперматозоїдів (контрольне значення, прийнято за 100 %) у кальцієвому середовищі інкубації становить 31,7 1,4 та 40,4 2,3 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 для груп 1 та 2 відповідно (M ±m, n = 5). Величина Са²⁺-незалежної АТРазної активності без додавання інгібіторів становить 68,7 ± 5,0 в контрольній групі 1 та 50,6 ± 3,5 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 для групи 2 (M ±m, n = 5-6). Отже, за умов розвитку олігозооспермії Са²⁺-залежна ферментативна активність має певну тенденцію до зростання, а Са²⁺-незалежна -- до зниження. У кальцієвому середовищі інкубації уабаїн та азид натрію не чинили достовірного впливу на дану ферментативну активність. При додаванні до аліквоти тапсигаргіну активність у групі 1 достовірно знижувалась на 15,3 1,6 %, а у групі 2 - на 27,2 2,2 % відносно контролю.

Додавання уабаїну до безкальцієвого середовища призводило до зниження ферментативної активності у сперматозоїдах здорових чоловіків на 21,3 ± 1,5 %. У випадку олігозооспермії (група 2) уабаїн-чутлива компонента є достовірно меншою, ніж у контрольній групі і становить 8,8 ± 1,2 % (р ? 0,05, M ± m, n = 5). Додавання до середовища інкубації азиду натрію (1 мМ) призводило до подальшого зниження АТРазної активності сперматозоїдів на 40,3 ± 2,1 та 20,3 ± 3,1 % в групах 1 та 2 відповідно, відносно контролю без інгібіторів, прийнято за 100 % (рис. 4, б, стовпчик 2). При цьому в дослідній групі 2 активність у 1,3-1,5 разів є меншою, ніж у контрольній (р ? 0,05, M ± m, n = 6). Тапсигаргін (100 нм) не чинив достовірного впливу на АТРазну активність в обох групах. Додавання еозину Y майже повністю знижувало ферментативну активність (залишкова активність становила 3-5 %) у всіх випадках.

Отже, ми виявили Са²⁺-залежну тапсигаргін-чутливу АТРазну активність, а також Са²⁺-незалежні уабаїн- та азид натрію-чутливі компоненти АТР-гідролазної ферментативної активності суспензії пермеабілізованих сперматозоїдів чоловіків в нормі та при олігозооспермії. Це дозволило ідентифікувати активності окремих АТР-гідролазних систем, що локалізовані у спермальних мембранах.

АТРазна активність ЕПР сперматозоїдів у нормі становить 4,3 ± 1,2 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1, що складає 10-12 % Са²⁺, Mg²⁺, АТР-залежної ферментативної активності. При олігозооспермії (група 2) активність Са²⁺, Mg²⁺-АТРази ЕПР достовірно зростає в 1,8-2 рази, відносно групи 1 (р 0,05, М ± m, n = 5).

Активність Са²⁺-незалежної Na⁺, K⁺-АТРази ПМ сперматозоїдів достовірно знижується (р 0,05) у 5-6 разів при олігозооспермії. У сперматозоїдах здорових чоловіків (група 1) вона дорівнює 18,7 ± 3,5 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 та складає лише 7-9 % від загальної Са²⁺-незалежної, Mg²⁺, АТР- залежної активності сперматозоїдів у випадку групи 2 (М ± m, n = 7). Активність Н⁺-АТРази МХ також знижується у 3-3,2 раза при олігозооспермії (стовпчик 3) від 12,5 ± 2,7 до 3,9 ± 0,8 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 (М ± m, n = 5). Також ідентифіковано уабаїн-, NaN₃-резистентну, так звану, “базальну” Са²⁺-незалежну, Mg²⁺-АТРазну активність ПМ, яка в нормі складає 52,4 ± 3,2 % від величини Mg²⁺,АТРазної активності сперматозоїдів та знижується при олігозооспермії у 2,5-3 рази до 6,9 ± 1,6 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 (М ± m, n = 5).

Вплив селективних інгібіторів на активність АТР-гідролаз сперматозоїдів. На наступному етапі досліджень вивчали концентраційні залежності впливу селективних інгібіторів на активність ідентифікованих нами АТРазних систем сперматозоїдів чоловіків.

Тапсигаргін (терпеновий лактон), зв'язуючись з трансмембранним сегментом М3 вільної від іонів Са формою Са²⁺, Mg²⁺-АТРази ЕПР, утворює каталітично неактивну конформацію помпи (Flynn E. R. M. et al., 2001). Результати наших досліджень показали, що тапсигаргін дозозалежно (в діапазоні концентрацій М) та ефективно інгібує активність Са²⁺, Mg²⁺-АТРази ЕПР сперматозоїдів чоловіків до рівня 3,6 2,5 % відносно контролю без інгібітору, прийнято за 100 % (M ± m; n = 5). Методом лінеаризації концентраційних залежностей у координатах Хілла було встановлено високу афінність тапсигаргіну до даного ферменту (K_і становить 7,1 ± 1,1 нМ) та практичну відсутність кооперативності у його дії (коефіцієнт Хілла n_H ? 1).

Уабаїн, кардіоактивний глікозид, є абсолютним інгібітором Na⁺,K⁺-АТРази, блокуючи фермент у стані Р-Е₂ і, таким чином, гальмуючи перехід на рівні конформерів Е₂>Е₁ (Valente R. C. et al., 2003). Результати досліджень показали, що уабаїн, в діапазоні концентрацій М дозозалежно та абсолютно пригнічує активність Na⁺, K⁺-АТРази сперматозоїдів чоловіків; для даного ефекту властива помірна спорідненість до ферменту (K_і = 117,7 ± ± 1,8 мкМ) та виражена позитивна кооперативність -- значення коефіцієнту Хілла n_H становить майже 2.

Азид натрію -- ефективний інгібітор електрон-транспортного ланцюга внутрішньої мембрани мітохондрій (Flynn E. R. M. et al., 2001). Результати показали, що інгібувальний ефект азиду натрію на активність Н⁺-АТРази МХ має місце в діапазоні концентрації М. Ефективність його впливу характеризується помірною спорідненістю (K_і = 240,2 45,1 мкМ) та практично відсутнім явищем кооперативності (n_H ? 1).

Дослідження впливу каліксаренів С-97, С-99 та С-107 на Na⁺, K⁺-АТРазну активність суспензії сперматозоїдів чоловіків

Каліксарени (макроциклічні олігомери фенолів), що мають внутрішньо-молекулярні ліпофільні порожнини, виступають ефекторами різних ферментативних систем (Gutsche C. D., 1998). Спираючись на літературні дані, ми підібрали три речовини: С-97, С-99 та С-107 (наведено шифри), оскільки вони є ефективнішими, ніж уабаїн, інгібіторами активності Nа⁺, K⁺-АТРази ПМ міометрію матки (Векліч Т. О. та ін., 2006). Препарати каліксаренів були синтезовані у відділі хімії фосфоранів Інституту органічної хімії НАН України (зав. відділу -- член-кор. НАН України, проф. В. І. Кальченко).

Nа⁺, K⁺-АТРазна активність розраховується по різниці між величинами “загальної” Mg²⁺, Nа⁺, K⁺- та “базальної” Mg²⁺-АТРазних активностей, тому також вивчався вплив досліджуваних каліксаренів на активність Mg²⁺-АТРази сперматозоїдів.

Результати досліджень показали, що каліксарени С-97 та С-107 (100 мкМ) повністю інгібують Na⁺, K⁺-АТРазну активність сперматозоїдів (залишкова активність -- 1-2 % відносно контрольного значення без інгібітору, прийнято за 100 %). Натомість каліксарен С-99, який за своїми хімічними властивостями є більш гідрофільним, не чинив достовірного впливу на активність даного ферменту, пригнічуючи Na⁺, K⁺-АТРазну активність сперматозоїдів лише до 80-85 % відносно контрольного значення (n = 7). При чому всі досліджувані каліксарени практично не впливають на “базальну” Mg²⁺-АТРазну активність (має місце зменшення активності лише до 90-95 % від контрольного значення).

При вивченні концентраційних залежностей впливу каліксаренів С-97 та С-107 на Nа⁺, K⁺-АТРазну активність сперматозоїдів було знайдено, що в діапазоні концентрацій М обидва дозозалежно та ефективно інгібують ([I_max] = М) дану ферментативну активність (рис. 8, а). Лінеаризовані криві концентраційних залежностей впливу досліджуваними каліксаренами Na⁺, K⁺-АТРазної активності сперматозоїдів дозволили розрахувати кінетичні показники їх впливу. Виявилося, що каліксарени С-97 та С-107 є ефективнішими, ніж уабаїн, високоафінними інгібіторами, оскільки константа інгібування для них становить близько 20-30 нМ, а для уабаїну -- 115-120 мкМ. При чому дія уабаїну характеризується наочною позитивною кооперативністю (n_H ? 2), каліксарену С-97 -- слабкою негативною (n_H ? 0,7), а ефект каліксарену С-107 практично некооперативний (n_H ? 1).

Вміст нітритів у сперматозоїдах за деяких патологічних станів

Особливої уваги серед вторинних месенджерів, що опосередковують численні функції сперматозоїдів, заслуговує оксид азоту та його стабільні метаболіти (нітрати, нітрити) (Balercia G. et al., 2004). Тому на наступному етапі досліджень вивчали вміст нітритів в нормі та при деяких патологіях.

Результати показали, що вміст нітритів у сперматозоїдах здорових чоловіків становить 0,4 ± 0,02 нмоль/10⁶ клітин, достовірно не змінюється при олігозооспермії, але при астенозооспермії (зниженні рухливості сперматозоїдів) їх вміст зростає до рівня 0,8 ± 0,1 нмоль/10⁶ клітин (М ± m, n = 5). Очевидно, що активні сполуки азоту суттєво впливають на функціональний стан ПМ, зокрема на мембранозв'язані іон-транспортувальні системи (Данилович Ю. В., 2001). Отже, можна зробити висновок, що встановлена нами зміна ферментативних активностей АТРазних систем сперматозоїдів чоловіків при олігозооспермії не пов'язана із впливом на них даних азотовмісних сполук. Натомість при астенозооспермії можливо саме за рахунок впливу на АТРазні системи зростання вмісту нітритів призводить до зниження рухливості гамет.

Розробка біохімічного діагностичного тесту на олігозооспермію

При олігозооспермії змінюється ліпідний склад спермальних мембран, що може призводити до змін функціонування АТРазних систем (Zarintosh R. J. et al., 1996). Тому доцільним є вивчення особливостей Mg²⁺-залежного гідролізу АТР в нормі та при олігозооспермії з метою розробки нових діагностичних тестів.

З літературних джерел відомо, що еозин Y (2,4,5,7-тетрабромфлуоресцеїн) ефективно пригнічує активність транспортних АТРаз за рахунок адсорбції на АТР-зв'язуючому центрі ферменту (Костерин С. А. и др., 1996). В подальшій роботі досліджували концентраційну залежність впливу еозину Y на Mg²⁺, АТР-залежний ферментативний процес у двох типах інкубаційних середовищ -- ЗКС та ВКС.

Виявилося, що еозин Y у діапазоні концентрацій 10^-6-10^-3 М дозозалежно та повністю пригнічує АТРазну активність в обох типах інкубаційних середовищ в нормі та при олігозооспермії. В усіх випадках були одержані біфазні залежності (точка перегину в діапазоні концентрацій 0,4-0,6 мМ). Із використанням лінеаризованих у координатах Хілла {ln[А/(A₀-A)]; ln[I]} кривих концентраційних залежностей було ідентифіковано фазу високої (K_i ? 100 мкМ) та низької спорідненості (K_i ? 200-400 мкМ) еозину Y до АТРазних систем сперматозоїдів (таблиця 1), при чому для високоафінної компоненти характерна вельми слабка позитивна кооперативність (n_H ? 1,1-1,3), а низькоафінної -- суттєва негативна (n_H ? 0,4-0,5).

Таблиця. Кінетичні показники впливу еозину Y на питому ферментативну АТРазну активність (M ± m; n = 5)

Група	Група 1	Група 2
Компонента	Високоафінна	Низькоафінна	Високоафінна	Низькоафінна
	Зовнішньоклітинне середовище
Ki, М	(0,1 ± 0,02)10-3	(0,4 ± 0,1)10-3	(0,1 ± 0,02)10-3	(0,2 ± 0,1)10-3
nН	1,3 ± 0,1	0,4 ± 0,04	1,1 ± 0,2	0,5 ± 0,1
	Внутрішньоклітинне середовище
Ki, М	(0,1 ± 0,01)10-3	(0,4 ± 0,1)10-3	(0,1 ± 0,01)10-3	(0,3 ± 0,1)10-3
nН	1,3 ± 0,1	0,4 ± 0,04	1,2 ± 0,1	0,4 ± 0,1

Результати показали, що величина “загальної” АТРазної активності при інкубації суспензії сперматозоїдів без додавання детергенту сапоніну (контрольне значення, прийнято за 100 %) у ЗКС становить 7,8 ± 1,0 та 7,7 ± 2,3 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 для груп 1 та 2 відповідно; а у ВКС -- 6,0 ± 1,2 та 11,7 ± 2,1 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 в групах 1 та 2 відповідно (М ± m, n = 5-8).

Рисунок 8. Концентраційна залежність впливу сапоніну на значення еозин Y-чутливої АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків у випадку використання внутрішньоклітинного середовища інкубації (М ± m, n = 5-8).

Контрольне (у відсутності обробки детергентом) значення ферментативної активності прийнято за 100 %. Концентрація еозину Y - 1 мМ.

При інкубації сперматозоїдів у ЗКС при додаванні 0,05 % розчину сапоніну “загальна” АТРазна активність зростає в обох групах у 2-2,3 раза, відносно контролю. У випад-ку використання ВКС інкубації (оптимальна концентрація сапоніну 0,5 %) величина даної активності для груп 1 і 2 відповідно зростає до 18,0 ± 2,5 та 16,5 ± 2,2 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 (рис. 8). Тобто при титруванні сперматозоїдів сапоніном у ВКС в нормі еозин Y-чутлива АТРазна активність вірогідно зростає у 3,8-4 раза, а за умов олігозооспермії -- лише в 1,3-1,5 раза (М ± m, n = 5-8). Виявлена різниця між величинами “загальної” АТР-гідролазної актив-ності сперматозоїдів у нормі та при олігозооспермії, може бути використана для розробки стандартизованого біохімічного тесту на наявність даної патології.

Таким чином, у даній роботі показано, що олігозооспермія є поширеною патологією чоловічої репродуктивної системи. Підібрано оптимальні умови визначення АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків, ідентифіковано активності “екто”- та “ендо”-АТРаз. Встановлено, що Са²⁺-залежна АТРазна активність достовірно зростає при олігозооспермії, а Са²⁺-незалежна -- знижується. Розраховано ефективність впливу класичний інгібіторів та нових ефекторів (каліксаренів) на окремі АТР-гідролазні системи. Показано, що вміст нітритів у сперматозоїдах не змінюється при наявності олігозооспермії, відносно нормоспермії. Запропоновано новий біохімічний тест на наявність даного захворювання чоловічої репродуктивної системи.

Висновки

На моделях інтактних та пермеабілізованих сперматозоїдів чоловіків, ідентифіковано та досліджено властивості Мg²⁺, АТР-залежних іон-транспортувальних систем у нормі та при олігозооспермії, патології, що зустрічається у 30 % випадків чоловічого безпліддя. З одержаних результатів можна зробити наступні висновки:

1. Показано, що сапонін є ефективним детергентом спермальних мембран та зменшує середній гідродинамічний діаметр сперматозоїдів у 4-5 разів при додаванні 0,5 % його розчину.

2. “Екто”-АТРазна активність інтактних сперматозоїдів, яка становить 30,9 ± 4,5 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 інгібується на 40 % еозином Y та менш ефективно іонами La³⁺, о-ванадатом та п-ХМБ.

3. Сперматозоїди проявляють Са²⁺-залежну тапсигаргін-чутливу Са²⁺, Mg²⁺-АТРазну активність ендоплазматичного ретикулуму, величина якої становить для здорових чоловіків 4,3 ± 1,2 нмоль Р_і (хв. мг білка)^-1 і достовірно зростає в 2 рази при олігозооспермії.

4. Активність Са²⁺-незалежних АТРаз сперматозоїдів знижується при олігозооспермії: уабаїн-чутливої Nа⁺, K⁺-АТРази та “базальної” Mg²⁺-АТРази плазматичної мембрани -- в 4-4,5 та 2,5-3 рази відповідно та азид-чутливої мітохондріальної Н⁺-АТРази -- в 3-3,2 рази.

5. Каліксарени С-97 та С-107 значно ефективніше, ніж уабаїн, інгібують активність Na⁺, K⁺-АТРази сперматозоїдів чоловіків та володіють досить високою спорідненістю до даного ферменту -- K_i = (2-3)10^-8 М.

6. Вміст нітритів у сперматозоїдах здорових чоловіків становить 0,4 ± 0,02 нмоль/10 ⁶ клітин і достовірно не змінюється за умов олігозооспермії, але позитивно корелює з розвитком астенозооспермії.

7. Еозин Y є ефективним інгібітором “загальної” “екто”- та “ендо”-АТРазної активності сперматозоїдів в нормі та при олігозооспермії. Криві концентраційних залежностей в усіх випадках мають біфазну залежність: фаза високої спорідненності (K_i ? 0,110^-3 М) характеризується слабкою позитивною кооперативністю, а низькоафінна (K_i ? (0,3-0,4)10^-3 М) -- суттєвою негативною.

8. На основі визначення “загальної” еозин Y- чутливої АТРазної активності нативних та пермеабілізованих сапоніном (0,5 % розчин) сперматозоїдів запропоновано новий чутливий біохімічний діагностичний тест на наявність олігозооспермії.

Список робіт за темою дисертації

1. Кочешкова Н. С., Воробець З. Д. Системи транспортування Са²⁺ у сперматозоїдах. Біохімічні механізми капацитації та акросомної реакції // Український біохімічний журнал. -- 2006. -- Т. 78, № 4. -- С. 67-79. (Дисертант проводила пошук, систематизацію та аналіз літературних даних, створення на їх основі схем біохімічних механізмів процесу капацитації та акросомної реакції).

2. Кочешкова Н. С., Воробець З. Д. Еозин-чутлива АТРазна активність у сперматозоїдах чоловіків як біохімічний тест на олігозооспермію // Український біохімічний журнал. -- 2007. -- Т. 79, № 2. -- С. 45-55. (Дисертант проводила дослідження, аналіз літературних даних, статистичну, кінетичну та графічну обробку результатів, приймала участь в написанні статті).

3. Порівняльне дослідження впливу каліксаренів на Na⁺, K⁺-АТРазну активність в плазматичній мембрані скоротливих та рухливих клітин / Т. О. Векліч, Н.С. Кочешкова, Р.В. Родік, В.І. Бойко, З.Д. Воробець, С.О. Костерін // Український біохімічний журнал. -- 2007. -- Т. 79, № 3. -- С. 20-29. (Дисертантка проводила дослідження та кінетичні розрахунки впливу інгібіторів на АТРазні активності сперматозоїдів, приймала участь в аналізі літературних даних, написанні статті, статистичній, кінетичній та графічній обробці результатів).

4. Вплив детергентів на ферментативну активність та ультраструктуру сперматозоїдів / Н.С. Кочешкова, З.Д. Воробець, В.Ф. Горчев, О.Р. Кулачковський // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. -- 2007. -- Т. 37, № 2. -- С. 24-29. (Дисертанту належить аналіз спермограм, одержання суспензії сперматозоїдів, проведення досліджень активності АТРазних систем сперматозоїдів, аналіз літературних даних, участь у написанні статті, статистична, кінетична та графічна обробка отриманих результатів).

5. Кочешкова Н. С., Воробець З. Д., Оліферчук Л. П. Вплив інгібіторів на Са²⁺-залежні та Са²⁺-незалежні АТРазні системи сперматозоїдів // Світ медицини та біології. -- 2007. -- № 3. -- С. 65-70. (Дисертантка проводила дослідження, кінетичну, статистичну, аналіз даних літератури та приймала участь в аналізі результатів та написанні статті).

6. Кочешкова Н. С. Активність АТРазних систем сперматозоїдів за умов олігозооспермії // Матеріали ХІ Конгресу СФУЛТ. - Полтава, 2006. - С. 661. (Дисертантка проводила аналіз даних літератури, дослідження, аналіз їх результатів та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

7. Кочешкова Н. С. Визначення еозин-чутливої АТРазної активності сперматозоїдів чоловіків // Матеріали ІХ з'їзду Українського біохімічного товариства. -- Харків, 2006. -- С. 136-137. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів та їх статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

8. Кочешкова Н. С. Еозин Y-чутлива АТРазна активність сперматозоїдів чоловіків у нормі та за олігозооспермії / Матеріали конференції “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006” // Український біохімічний журнал. -- 2006. -- Т. 78, № 6. -- С. 142. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

9. Кочешкова Н. С. Вплив каліксаренів С-97, С-99 та С-107 на Na⁺,K⁺- та Mg²⁺-АТРазну активність сперматозоїдів // Збірник тез ІІІ міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів “Молодь та поступ в біології”. -- Львів, 2007. - С. 69-70. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

10. Кочешкова Н. С. Розробка діагностичного тесту на розвиток олігозооспермії - патології чоловічої репродуктивної системи // Материалы V международного симпозиума “Актуальные проблемы биофизической медицины”. -- Киев, 2007. -- С. 90-91. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

11. Kocheshkova N. S., Vorobets Z. D. Identification of ATP-hydrolases systems of spermatozoids and its role in development of oligozoospermia // Abstracts of the 6^th Parnas conference Molecular Mechanism of Cellular Signalling. -- Krakow, Poland, 2007. -- P. 30. (Дисертантка приймала участь у проведенні досліджень, аналізі літературних даних, статистичній обробці та аналізі результатів, написанні та оформленні тез, презентувала роботу на конференції).

12. Кочешкова Н. С. Активность систем Mg²⁺,АТР-зависимого транспорта ионов в сперматозоидах мужчин при развитии олигозооспермии // Материалы международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”. - Пущино, Россия, 2007. -- С. 317-319. (Дисертантка проводила дослідження, аналіз літературних даних, аналіз результатів, їх кінетичну та статистичну обробку, написала та оформила тези, презентувала роботу на конференції).

Анотація

Кочешкова Н. С. Ідентифікація та властивості іон-транспортувальних АТР-гідролаз сперматозоїдів чоловіків за умов олігозооспермії. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 -- біохімія. Інститут біології тварин УААН, Львів, 2007.

Дисертація присвячена ідентифікації активностей АТРазних систем, із зовнішньо- та внутрішньоклітинну локалізацію активних центрів у сперматозоїдах чоловіків, вивченню особливостей їх функціонування в нормі та при олігозооспермії, встановленню змін вмісту нітритів при розвитку даної патології.

Встановлено, що олігозооспермія зустрічається у 30 % випадків чоловічого безпліддя. Розроблено оптимальні умови (щодо детергенту, концентрації АТР, іонів Mg, сапоніну, білка, часу інкубації) реакції Mg²⁺-залежного ферментативного гідролізу АТР у сперматозоїдах.

Ідентифіковано “екто”- та “ендо”-АТРазні активності у мембранах чоловічих гамет. Показано, що Са²⁺-залежна АТРазна активність достовірно зростає при розвитку олігозооспермії, а Са²⁺-незалежна - знижується. Проведено кінетичний аналіз методом Хілла ефективності впливу інгібіторів на відповідні АТРазні системи сперматозоїдів чоловіків.

Встановлено, що каліксарени С-97 та С-107 є ефективними, селективними інгібіторами активності Nа⁺, K⁺-АТРази сперматозоїдів чоловіків. Вміст нітритів у сперматозоїдах не змінюється при олігозооспермії, відносно нормоспермії.

Запропоновано новий біохімічний тест на наявність олігозооспермії, який ґрунтується на визначенні величини “загальної” еозин Y-чутливої АТРазної активності сперматозоїдів при додаванні 0,5 % розчину сапоніну.

Ключові слова: активність Са²⁺, Mg²⁺-, Nа⁺, K⁺-, Н⁺- та “базальної” Mg²⁺-АТР-гідролаз, каліксарени, нітрит-іони, сперматозоїди, еякулят, олігозооспермія.

Аннотация

Кочешкова Н. С. Идентификация и свойства ион-транспортных АТР-гидролаз сперматозоидов мужчин в условиях олигозооспермии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. Институт биологии животных УААН, Львов, 2007.

Диссертация посвящена идентификации ион-транспортных АТР-гидролазных систем сперматозоидов мужчин, с внешне- и внутриклеточной локализацией активных центров ферментов, изучению особенностей их функционирования в норме и при олигозооспермии. А также определению изменений концентрации нитритов в условиях данной патологии.

Анализ данных спермограмм мужчин, состоявших в бесплодном браке, проводимый на протяжении 2004-2007 годов показал, что олигозооспермия (снижение концентрации сперматозоидов в сперме) характерна для 30 % случаев мужского бесплодия.

С помощью методов электронной микроскопии и лазерно-корреляционной спектроскопии был найден оптимальный детергент для пермеабилизации спермальных мембран - сапонин. Он эффективно нарушает барьерную функцию мембран сперматозоидов, раскрывая их “латентные” АТРазные активности, уменьшая при этом средний гидродинамический диаметр фрагментов практически в 5 раз.

Найдены оптимальные условия (относительно концентрации АТР, ионов Mg, сапонина, белка, времени инкубации) реакции Mg²⁺-зависимого ферментативного гидролиза АТР в суспензии нативных и пермеабилизированых сперматозоидов. Идентифицировано “экто”- и “эндо”-АТР-гидролазные системы, локализованные в мембранах мужских гамет. Показано, что активность Са²⁺-зависимой транспортной Са²⁺, Mg²⁺-АТРазы эндоплазматического ретикулума достоверно увеличивается при развитии олигозооспермии в 1,8-2 раза. В отличии от этого активность Са²⁺-независимых АТРазных систем достоверно снижается в условиях данной патологии: Nа⁺, K⁺- и “базальной” Mg²⁺-АТРаз плазматической мембраны в 4,5-5 и 2,5-3 раза соответственно, а Н⁺-АТРазы митохондрий -- в 3-3,2 раза. Методом линеаризации кривых концентрационных зависимостей охарактеризовано эффективность действия селективных (тапсигаргин, уабаин, азид натрия) и неселективного (эозин Y) ингибиторов.

Впервые показано, что макроциклические олигомеры фенолов - каликсарены С-97 и С-107 в концентрации 100 мкM на 97-99% ингибируют Na⁺, K⁺­ATPазную активность сперматозоидов мужчин. Данные каликсарены более эффективные, чем уабаин, высокоафинные и селективные ингибиторы активности Nа⁺, K⁺-АТРазы: в первом случае K_i составляет 20-30 нM, а во втором (для уабаина) -- 100-120 мкM.

Установлено, что концентрация нитритов в суспензии сперматозоидов не меняется в условиях олигозооспермии, относительно нормоспермии, но увеличивается в 2 раза при астенозооспермии (снижении подвижности сперматозоидов).

В ходе выполнения работы разработан новый чувствительный биохимический тест на наличие патологии олигозооспермии. В основе метода лежит определение активности “общей” эозин Y-чувствительной АТРазной активности сперматозоидов, которая при добавлении 0,5 % раствора сапонина, в норме увеличивается в 3,8-4 раза (изменения относительно контрольного значения без детергента достоверны), а в условиях развития олигозооспермии -- только в 1,3-1,5 раза (изменения не достоверны).

Ключевые слова: активность Са²⁺, Mg²⁺-, Nа⁺, K⁺-, Н⁺- и “базальной” Mg²⁺-АТР-гидролаз, каликсарены, нитрит-ионы, сперматозоиды, эякулят, олигозооспермия.

Summary

Kocheshkova N. S. Identification and properties of ion-transporting ATP-hydrolases of man's spermatozoa in the conditions of oligozoospermia. --Manuscript.

PhD thesis for obtaining the scientific degree of PhD (Biology) in the speciality 03.00.04 -- biochemistry. Institute of Animals Biology, Lviv, 2007.

Dissertation is devoted to the identification of ATP-hydrolasing systems, which have extra- and intracellular localizations of their active centres in man's spermatozoa. It was studied their properties, peculiarities of functioning in normal and oligozoospermia conditions, and also established the changes of concentration of nitrite-ions under development of this pathology.

It was shown that oligozoospermia is a widespread pathology of the male reproductive system (18 % all of the samples). There was defined the optimal regime of reaction of Mg²⁺-dependent enzymatic hydrolysis of АТР in suspension of spermatozoa.

It was identified several `extra'- and `intro'-АТР-hydrolysing systems in male gamete's membranes. The values of Са²⁺-ATPase activity of endoplasmic reticulum increased significantly in the case of oligozoospermia. Contrary to this, the activity of Са²⁺-independent ATPase systems (Nа⁺, K⁺-, `basal' Mg²⁺- and Н⁺-АТРases) decreases in case of oligozoospermia. We calculate main kinetic indexes (constant of inhibition K_i and Hill's coefficient n_H) for selective (tapsigargin, ouabain, sodium azid) and non-selective (eosin Y) inhibitors of proper ATPases systems of men's spermatozoa by linearization in the Hill's co-ordinates of curves of catalytic titration.