Внутрішньомолекулярна конформаційна рухливість та РНК-зв’язувальні властивості С-модуля еукаріотної тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ

Характеристика власної флуоресценції триптофану в структурі С-модуля TyrRS і ЕМАР ІІ та аналіз структурного оточення Trp144 та Trp125. С-модуль TyrRS та ЕМАР ІІ містять у своїх структурах природні флуоресцентні зонди Trp144 та Trp125 (рис. 1), відповідно, що дає можливість досліджувати структурні та молекулярно-динамічні властивості цих білків.

Для отримання інформації про локалізацію цих хромофорів у білковій глобулі проаналізовано параметри їхньої флуоресценції при 20^оС. Для С-модуля TyrRS положення максимуму спектра флуоресценції (л_макс^зб296) Trp144 при довжині хвилі збудження 296 нм (умова збудження триптофанової флуоресценції) складає 327 нм; ширина спектра випромінювання при Ѕ максимальної інтенсивності (Дл^{спектра}) - 49 нм. Отримані дані свідчать про екранований стан залишку Trp144 в білковій глобулі згідно моделі Бурштейна (Reshetnyak et al., 2001) та узгоджуються з отриманими нами даними комп'ютерного аналізу моделі сm5 С-модуля, згідно яких величина доступності Trp144 молекулам розчинника становить 1-2%. Для ЕМАР ІІ параметри флуоресценції Trp125 становлять: л_макс^зб296 = 335 нм; Дл^{спектра} = 57 нм, що свідчить про частково експонований характер Trp125 молекулам розчинника згідно (Reshetnyak et al., 2001) та корелює з розрахованою величиною доступності поверхні Trp125 молекулам розчинника (10 ± 1%) в кристалічній структурі ЕМАР ІІ.

Інформацію про експонованість Trp144 в С-домені та Trp125 в ЕМАР ІІ молекулам розчинника та про конформаційну динаміку досліджуваних білків в наносекундному діапазоні отримано за допомогою методу гасіння триптофанової флуоресценції зовнішніми гасниками (акриламідом та іонами Cs⁺) (рис.2).

Для С-модуля TyrRS величина гасіння флуоресценції Trp144 акриламідом та іонами цезію становить ~38% і ~1%, відповідно (рис. 2 а). Оскільки іони Cs⁺ гасять флуоресценцію переважно експонованих залишків триптофану, то відсутність гасіння флуоресценції Trp144 цим гасником свідчить про внутрішню локалізацію Trp144 в білковій глобулі. Проте, цей залишок триптофану є доступним для акриламіду. Оскільки акриламід проникає всередину білкової глобули внаслідок динамічних флуктуацій конформації білка (Lakowicz, 1999), то дані гасіння флуоресценції Trp144 акриламідом свідчать про наявність швидкої внутрішньомолекулярної динаміки досліджуваного білка в наносекундному часовому діапазоні.

Для ЕМАР ІІ: величина гасіння флуоресценції Trp125 іонами Cs⁺ становить ~11% (рис. 2 б), що свідчить про часткове експонування Trp125 молекулам розчинника та корелює з даними молекулярного моделювання. Експериментально отримана величина гасіння флуоресценції Trp125 акриламідом (~54%) (рис. 2 б) свідчить про дифузію акриламіду всередину білкової матриці ЕМАР ІІ внаслідок флуктуацій в наносекундному часовому інтервалі.

Температурно-індуковані конформаційні зміни мікрооточення Trp144 С-модуля TyrRS та Trp125 ЕМАР ІІ. З метою дослідження внутрішньомолекулярної стабільності С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ ми проаналізували параметри флуоресценції Trp144 та Trp125, відповідно, в діапазоні температур 20-60^оС (рис. 3). Для Trp144 C-модуля положення максимуму спектра флуоресценції (л_макс) залежить від температури (рис. 3 а), що супроводжується зменшенням квантового виходу флуоресценції при підвищенні температури. В діапазоні температур 20-37^оС л_макс зміщується на 3±0,3 нм в довгохвильову область (рис. 3 а), що вказує на мінорні конформаційні зміни мікрооточення Trp144, обумовлені збільшенням його рухливості при 37^оС порівняно з 20^оС. Основний конформаційний перехід Trp144 із зануреного в білкову глобулу нативного стану в полярне оточення розчинника зафіксовано в діапазоні температур 37-52^oC, що обумовлює зміщення л_макс до 348,5±0,5 нм при 52^оС. Для Trp125 ЕМАР ІІ аналіз температурної залежності положення максимуму спектра його флуоресценції (рис. 3 б) виявляє, що в діапазоні температур 20-30^оС конформація локального оточення Trp125 є стабільною. При підвищенні температури до 37^оС л_макс Trp125 становить 3421 нм, що свідчить про збільшення експонованості цього флуорофору молекулам розчинника, порівняно з температурою 20^оС. Подальше підвищення температури до 45^оС призводить до зсуву л_макс до 3491 нм, що обумовлено втратою стабільного мікрооточення Trp125 та його виходом в водне оточення.

Важливо зазначити, що виявлені конформаційні переходи залишків триптофану не супроводжуються зміною вторинної структури білків. Про це свідчить розрахований за даними КД кількісний вміст елементів вторинної структури С-модуля та ЕМАР ІІ, який практично не змінюється при 20-54^оС.

Динамічні властивості мікрооточення залишку в Trp144 С-модулі та Trp125 в ЕМАР ІІ. Для характеристики динамічних властивостей мікрооточення залишку Trp144 в С-модулі та Trp125 в ЕМАР ІІ та конформаційних змін даних білків використовували в обох випадках метод крайового зсуву флуоресценції. Виявлено, що зі збільшенням довжини хвилі збудження максимум спектра флуоресценції Trp144 С-модуля та Trp125 ЕМАР ІІ при 20^оС зміщується в довгохвильову область спектра (рис. 3). Це свідчить про відсутність швидкої структурної релаксації мікрооточення залишку Trp144 та Trp125 при 20^оC, жорсткість мікрооточення цих флуорофорів при даній температурі та екранування залишків триптофанів від швидкорелаксуючого водного оточення. Отже, час дипольної релаксації оточення Trp144 та Trp125 є меншим, ніж час життя збудженого стану флуорофора. При підвищенні температури величина ефекту крайового зсуву флуоресценції зменшується і практично зникає при 52^оС для Trp144 С-модуля (рис. 3 а, 2) та при 45^оС для Trp125 ЕМАРІІ (рис. 3 б, 2), що свідчить про руйнацію специфічного мікрооточення відповідних залишків триптофану при цих температурах. Таким чином, флуоресценція Trp дозволила зареєструвати конформаційні зміни в С-модулі та ЕМАР ІІ, індуковані температурою, та зафіксувати, що вони є різними в цих двох високогомологічних білках.

Дослідження вторинної структури С-модуля TyrRS та ЕМАР II методом КД. Оскільки на сьогоднішній день є експериментальні дані про структуру С-модуля тільки для TyrRS людини, нами було отримано інформацію про вторинну структуру С-модуля Bos taurus за допомогою методу КД. Методом КД також проаналізовано вторинну структуру ЕМАР ІІ.

На основі отриманих КД-спектрів досліджених білків розраховано кількісний вміст елементів їхньої вторинної структури (табл.1) та показано його чітку кореляцію як із даними моделювання для С-модуля TyrRS Bos taurus (cm5) , так і з експериментальними даними рентгеноструктурного аналізу для ЕМАР ІІ з урахуванням похибки розрахунку елементів вторинної структури (± 5%).

Молекулярна динаміка С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ. Для моделювання механізму взаємодії С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК необхідно мати чітке уявлення про конформаційну рухливість нативної форми білка. З цією метою нами проведено розрахунок МД С-модуля (модель сm5) та ЕМАР ІІ (1EUJ_A) при температурі 25^оС та при фізіологічній температурі 37^оС. В цілому динаміка С-модуля та ЕМАР ІІ при цих температурах є стабільною, за винятком високої рухливості петлевих ділянок та б-спіралей, до складу яких входить Phe127 та Trp125, відповідно, що супроводжується перепакуванням структури цих -спіралей та їхнім подовженням (рис. 4). Слід зазначити, що при 37^оС нами виявлено високу рухливість залишків Trp125 ЕМАР ІІ та Phe127 С-модуля, що не спостерігалося при 25^оС. Отже, дані МД добре корелюють з отриманими даними флуоресцентної спектроскопії для Trp125 ЕМАР ІІ щодо локального конформаційного переходу залишку Trp125.

Вивчення тРНК-зв'язувальних властивостей С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ. Відомо, що залишок Trp125 належить до РНК-зв'язувального центру ЕМАР ІІ. Як показано вище, при 37^оС відбувається конформаційний перехід в оточенні Trp125, який супроводжується частковою експонованістю цього триптофану молекулам розчинника. Оскільки відомо, що білки, які містять ОВ-фолд та зв'язують нуклеїнові кислоти, як правило, мають у структурі РНК-зв'язувальних центрів консервативні ароматичні залишки, які є функціонально необхідними для формування комплексів білків з РНК (Theobald et al., 2003), ми припустили, що виявлений конформаційний перехід Trp125 може бути функціонально необхідним для подальшої взаємодії з РНК. Така взаємодія може здійснюватися за різними молекулярними механізмами, наприклад, шляхом інтеркаляції ароматичного залишку триптофану між азотистими основами в структурі тРНК чи формуванням стекінгових комплексів без інтеркаляції. Ймовірно, що С-модуль та ЕМАР ІІ взаємодіють з тРНК за подібними механізмами, а консервативний ароматичний залишок Phe127 С-модуля, еквівалентний Trp125 в ЕМАР ІІ, може брати участь у комплексоутворенні з тРНК. Для визначення параметрів зв'язування С-модуля з тРНК^Phe, нами було проведено флуориметричне титрування розчину білка тРНК^Phe. Виявлено, що залишок Trp144 у структурі С-модуля не є чутливим до утворення комплексу С-модуля з тРНК^Phe (рис. 5), що, ймовірно, обумовлено його локалізацією поза РНК-зв'язувальним сайтом у структурі білка.

Сайт-спрямований мутагенез Phe127>Trp в РНК-зв'язувальному центрі С-модуля TyrRS. Методами сайт-спрямованого мутагенезу консервативний аромати-чний залишок Phe127 в РНК-зв'язувальному центрі С-модуля заміщено нами на флуорофор Trp127 (рис. 6). Ефективність проведення сайт-спрямованого мутагенезу було перевірено за допомогою секвенування плазмідної ДНК.

Характеристика власної флуоресценції мутантного С-модуля TyrRS із зміною Phe127>Тrp127. На рис. 7 (крива 2) наведено спектр триптофанової флуоресценції С-модуля із заміною Phe127>Тrp127. Положення максимуму спектра флуоресценції мутантного С-модуля становить 332 нм і є суттєво зміщеним в довгохвильову спектральну область порівняно з нативним С-модулем (327 нм) (крива 1), що обумовлено внеском залишку Тrp127. Введення флуорофора Тrp127 призводить також до зростання квантового виходу флуоресценції білка (від 0,09 для нативного С-модуля до 0,298 для С-модуля із заміною Phe127>Trp), що обумовлено додатковим внеском залишку Тrp127 в загальну емісію білка.

Визначення параметрів зв'язування С-модуля (Phe127>Trp) з тРНК^Phe та ЕМАР ІІ з тРНК^Phe. На основі отриманих експериментальних даних зміни власної триптофанової флуоресценції С-модуля (Phe127>Trp) ТyrRS та ЕМАР ІІ при титруванні тРНК^Phe (рис. 5) були розраховані параметри зв'язування цих білків з тРНК. Константа дисоціації комплексу (К_д) С-модуля з тРНК^Phe складає 2,9·10^-8 М, стехіометрія комплексу n=1,2; для комплексу ЕМАР ІІ з тРНК^Phe - К_д= 3,4·10^-7 М, n=1,3. Незмінне положення максимуму спектра флуоресценції як С- модуля ТyrRS, так і ЕМАР ІІ, при титруванні тРНК^Phe з високою вірогідністю свідчить про відсутність інтеркаляції ароматичних залишків триптофану в структуру тРНК при формуванні комплексів. Отже, зміна інтенсивності флуоресценції при взаємодії С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК може бути обумовлена іншим механізмом, який, ймовірно, включає специфічні конформаційні зміни в мікрооточенні Trp, що індукуються нуклеїновою кислотою при утворенні комплексу.

Аналіз флуоресцентного перенесення енергії із залишку Trp144 С-модуля TyrRS на Y-нуклеозид тРНК^Phe. Нами досліджена можливість флуоресцентного перенесення енергії від Trp144 С-модуля до Y-нуклеозиду тРНК^Phe, який локалізований в антикодоновій петлі: це дозволило оцінити відстань між цими флуорофорами. Виявлено, що параметри спектрів флуоресценції та збудження тРНК^Phe не змінюються в присутності С-модуля: це свідчить про відсутність перенесення енергії з Trp144 білка на Y-нуклеозид тРНК^Phe. Оскільки характеристичний радіус Ферстера для даної донорно-акцепторної пари становить 1,4 нм, то відсутність перенесення енергії свідчить про те, що залишок Trp144 та Y-нуклеозид знаходяться на відстані r>1,4 нм, що добре узгоджується з моделлю комплексу, згідно з якою С-модуль TyrRS взаємодіє в області акцепторного стебла та D-петлі тРНК (рис. 8).

Дослідження конформаційної рухливості С-модуля, ЕМАР ІІ та їхніх комплексів із тРНК методами часороздільної флуоресцентної спектроскопії. З метою виявлення конформаційних змін С-модуля та ЕМАР ІІ при взаємодії з тРНК та встановлення функціональної ролі їхніх консервативних ароматичних залишків Trp127 та Trp125, відповідно, при утворенні комплексу з тРНК, нами було охарактеризовано затухання інтенсивності флуоресценції цих хромофорів у вільному стані та в присутності тРНК^Phe. Отримані параметри затухання флуоресценції Trp144 С-модуля при 20 ^оС (табл.2) залишаються незмінними при утворенні комплексу цього білка з тРНК, що корелює з даними моделювання про локалізацію даного залишку поза сайтом зв'язування тРНК. Для С-модуля із заміною Phe127>Trp та його комплексу з тРНК^Рhе параметри затухання флуоресценції відрізняються (табл.2) та характеризуються появою додаткової короткоживучої компоненти в присутності нуклеїнової кислоти (рис. 9). Ця компонента зумовлена гасінням флуоресценції саме залишку Trp127, оскільки параметри затухання Trp144 залишаються незмінними в присутності нуклеїнової кислоти. Для Trp125 в ЕМАР ІІ виявлено аналогічну додаткову короткоживучу компоненту в присутності тРНК (рис. 10, табл. 2).

Наявність короткоживучої компоненти лише для ~20% залишків триптофанів С-модуля та ~30% Trp125 ЕМАР ІІ свідчить про гетерогенність “популяцій” триптофанів в структурі досліджуваних комплексів цих білків з тРНК, що може бути пояснено динамічним механізмом взаємодії білка з нуклеїновою кислотою, для якого не існує єдиної унікальної конформації білка та єдиного механізму його взаємодії з тРНК. Слід зазначити, що поява короткоживучої компоненти зумовлена гасінням флуоресценції Trp127 та Trp125 безвипромінювальним шляхом, при формуванні комплексів білків з тРНК. Це можна пояснити як стекінгом залишку Trp з нуклеотидами тРНК^Phe, так і конформаційними змінами у структурі цих білків, зумовленими їхньою взаємодією з тРНК. Такі зміни можуть призвести до появи нових ротамерних форм триптофанів, що супроводжуватиметься зменшенням відстані між флуорофором і гасником, та до гасіння триптофанової флуоресценції безвипромінювальним шляхом та виникнення короткоживучої компоненти із субнаносекундним часом життя флуоресценції. Для перевірки такої можливості нами проаналізовано мікрооточення Trp127 С-модуля та Trp125 ЕМАР ІІ згідно їхніх тривимірних структур і виявлено можливість виникнення ротамерів цих ароматичних залишків та ймовірні гасники флуоресценції Trp127 С-модуля - Gln131, Cys63 та Cys81; та флуоресценції Trp125 ЕМАР ІІ - Cys65, Cys83.

Аналіз структури комплексу С-модуля TyrRS з тРНК^Phe. Аналіз моделі структури комплексу С-модуля TyrRS з тРНК^Phe дозволив виявити ймовірну РНК-зв'язувальну поверхню С-модуля та ділянки тРНК, що взаємодіють з С-модулем: акцепторне стебло (G1, C70, G71, C72, G71, A5, U7), T-стебло (C63, A64, A62), Т-петля (C61), D-петля (A14, G15, dHU16) та D-стебло (C13). Побудована модель комплексу узгоджується з отриманими нами даними флуоресцентної спектроскопії, згідно яких залишок Trp144 знаходиться поза РНК-зв'язувальним центром С-модуля, а залишок Trp127 приймає участь у взаємодії з тРНК.

Отримані нами результати часороздільної флуоресцентної спектроскопії при дослідженні комплексу С-модуля з тРНК^Phe, а саме - появу короткоживучої компоненти з часом життя флуоресценції Trp127 0,09 нс, яка виникає внаслідок безвипромінювального гасіння триптофанової флуоресценції, можна пояснити на основі запропонованої моделі структури цього комплексу. Виявлено, що таке гасіння флуоресценції може здійснюватися шляхом передачі електрону збудженого стану від Trp127 С-модуля в комплексі з тРНК^Phe на С=О групу Glu128 за рахунок стабілізації положення цієї карбоксильної групи (рис. 11) чотирма водневими зв'язками, в тому числі з атомами О2' рибози та N3 аденозину А5 в акцепторному стеблі тРНК.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі вивчено внутрішньомолекулярну конформаційну рухливість та РНК-зв'язувальні властивості С-модуля тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ. Проаналізовано можливі механізми взаємодії цих білків з тРНК та їхні конформаційні зміни при комплексоутворенні.

1. Встановлено внутрішньомолекулярну локалізацію залишку Trp144 в просторовій структурі С-модуля та виявлено швидку конформаційну рухливість мікрооточення Trp144 в наносекундному часовому інтервалі.

2. Mоніторинг залежних від температури конформаційних змін С-модуля з використанням флуоресценції Trp144 виявив конформаційний перехід мікрооточення Trp144 в діапазоні температур 37-52^оС, який характеризується виходом Trp144 із зануреного всередину глобули стану до стану, експонованого до швидкорелаксуючого полярного розчинника.

3. Методами флуоресцентної спектроскопії показано, що Trp125 EMAP II є частково експонованим до розчинника при 37^оС, а його повний вихід у швидкорелаксуюче водне оточення здійснюється при 45^оС.

4. Методами білкової інженерії отримано С-модуль TyrRS із заміною Phe127 на флуорофор Trp127. Досліджено формування комплексів С-модуля і ЕМАР ІІ з тРНК та визначено параметри зв'язування тРНК з білками в цих комплексах. Показано, що на відміну від Trp144 С-модуля, Trp125 EMAP II та Trp127 мутантного С-модуля залучені до взаємодії з тРНК.

5. Аналіз даних флуоресцентного перенесення енергії між флуорофором Trp144 С-модуля та Y-нуклеозидом тРНК^Phe вказує на віддаленість Trp144 від Y-нуклеозида на r>1,4 нм, що узгоджується з моделлю тривимірної структури комплексу, в якій С-модуль TyrRS взаємодіє в області акцепторного стебла та D-петлі тРНК.

6. Порівняльний аналіз параметрів затухання флуоресценції вільного С-модуля та його комплексу з тРНК дозволив виявити додаткову короткоживучу компоненту триптофанової флуоресценції в присутності тРНК, яка, ймовірно, обумовлена конформаційними змінами білка. Аналіз запропонованої моделі комплексу свідчить, що механізм гасіння флуоресценції Trp127 може бути обумовлений стабілізацією карбоксильної групи Glu128 за рахунок формування цим залишком нових водневих зв'язків при взаємодії з тРНК.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кордыш М.А., Одынец К.А., Корнелюк А.И. Trp144 как флуоресцентный зонд для изучения конформационной подвижности С-модуля эукариотической тирозил-тРНК синтетазы // Біополімери і клітина.-2003.-Т. 19, № 5.-С. 436-439. Особистий внесок здобувача: автором охарактеризовано та проаналізовано мікрооточення залишку Trp144, виявлена його швидка конформаційна рухливість за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії та комп'ютерного моделювання.

2. Кордыш М.А., Корнелюк А.И. Флуоресценция и динамика структурного окружения флуорофора Trp125 в цитокине EMAP II // Вестник Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина.: Биофизический вестник.-2003.-Т.2, №13.-С.86-90. Особистий внесок здобувача: охарактеризовано мікрооточення залишку Trp125 та степінь доступності поверхні даного залишку молекулам розчинника на основі власноруч отриманих даних флуоресцентної спектроскопії та комп'ютерного моделювання.

3. Кордыш М.А., Корнелюк А. И. Мониторинг конформационного изменения окружения флуорофора Trp144 в С-модуле тирозил-тРНК синтетазы при тепловой денатурации // Доповіді НАН України.-2004.-№1.- С. 156-161. Особистий внесок здобувача: проведено та проаналізовано температурно індуковане гасіння флуоресценції Trp144.

4. Кордиш М.О., Дубровський О.Л., Корнелюк О.І. Локальний конформаційний перехід флуорофора Trp125 в цитокіні EMAP II, індукований фізіологічною температурою // Фізика живого. - 2005. - Т. 13, №1. - С. 79-85. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано ефект крайового зсуву флуоресценції Trp 125 EMAP II при тепловій денатурації.

5. Kordysh M., Kornelyuk A, Conformational flexibility of cytokine-like C-module of tyrosyl-tRNA synthetase monitored by Trp144 intrinsic fluorescence // J. Fluoresc. - 2006. - Vol. 16 - P. 705-711. Особистий внесок здобувача: проведено експресію С-модуля TyrRS; отримано та проаналізовано: параметри флуоресценції Trp144, дані гасіння флуоресценції білка зовнішніми гасниками, дані температурно-індукованих конформаційних змін мікрооточення Trp144 методом крайового зсуву флуоресценції.

6. Кордиш М.О., Корнелюк О.І. Вивчення взаємодії С-модуля тирозил-тРНК синтетази з тРНК методами флуоресцентної спектроскопії // Біополімери і клітина.-2006.-Т. 19, № 5.-С. 436-439. Особистий внесок здобувача: за безпосередньої участі автора проведено сайт-спрямований мутагенез Phe127 на Trp127 С-модуля, експресію та очистку даного білка, визначено параметри зв'язування комплексу С-модуля з тРНК^Phe.

7. Кордиш М.О., Кирюшко Г.В., Мелі І., Корнелюк О.І. Дослідження конформаційної рухливості С-модуля тирозил-тРНК синтетази та його комплексу з тРНК методами часороздільної флуоресцентної спектроскопії // Біополімери і клітина. -2007. -Т. 23, № 2.- С. 130-136. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано параметри затухання флуоресценції С-модуля TyrRS та ЕМАР ІІ без та в присутності тРНК^Phe.

8. Кухар М.О., Одинець К.О., Корнелюк О.І. Флуоресценція Trp144 як зонд для вивчення конформаційної динаміки С-кінцевого цитокіноподібного модуля еукаріотичної тирозил-тРНК синтетази // Тези доповідей: ІІІ З'їзд Українського біофізичного товариства. - Львів. - 2002. - С. 59. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано температурну залежність триптофанової флуоресценції С-модуля.

9. Kordysh M., Kornelyuk A. Fluorescence spectroscopic study of the conformational changes in EMAP II cytokine // Abstract book: Conference for Students, PhD-students and young scientists on Molecular Biology and Genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine. - Kyiv.- 2003.-P. 84. Особистий внесок здобувача: отримано та проаналізовано спектри флуоресценції Trp125 ЕМАР ІІ при тепловій денатурації.

10. Kordysh M., Kornelyuk A. Monitoring of temperature-induced conformational changes of a Trp 144 microenvironment in cytokine-like C-module of mammalian tyrosyl-tRNA Synthetase // Abstract book: 5th International Conference on Biological Physics. - Gothenburg, Sweden. -2004. - P.99. Особистий внесок здобувача: автором проведено моніторинг температурно-індукованих конформаційних змін С-модуля, використовуючи власну флуоресценцію Trp144.

11. Кордиш М.О., Корнелюк О.І. Локальний конформаційний перехід та експонування Trp125 в цитокіні ЕМАР ІІ при фізіологічній температурі // Тези доповідей: Перша Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної фізики”. - Харків.- 2004.- С.31. Особистий внесок здобувача: методами флуоресцентної спектроскопії виявлено локальний конформаційний перехід залишку Trp125 при 37^оС.

12. Кордыш М.А., Ковальский Д.Б., Дубина В.М., Корнелюк А.И. Изучение стабильности закрытой конформации Trp125 цитокина ЕМАР ІІ методом молекулярной динамики // Тези доповідей: Перша Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної фізики”. - Харків.- 2004.- С.78. Особистий внесок здобувача: аналіз конформаційних змін цитокіну ЕМАР ІІ на основі проведенних розрахунків МД.

13. Kordysh M., Kornelyuk A. Red-edge excitation fluorescence studies of the fast intramolecular dynamics of EMAP II cytokine // European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 15^th IUPAB & 5^th EBSA International Biophysics Congress.- Montpellier, France.- 2005.- P. 615. Особистий внесок здобувача: методом крайового зсуву флуоресценції досліджено внутрішньомолекулярну динаміку мікрооточення Trp125 ЕМАР ІІ цитокіну.

14. Кордиш М.О., Сурова О.В., Корнелюк О.І. Сайт-спрямований мутагенез Phe127Trp в РНК- зв'язуючому центрі ізольованого С-модуля тирозил-трНК синтетази та дослідження взаємодії з тРНК методом флуоресцентної спектроскопії // Тези доповідей: IV З'їзд Українського Біофізичного товариства. - Донецьк. - 2006. - С.302. Особистий внесок здобувача: за безпосередньої участі автора проведено сайт-спрямований мутагенез Phe127 на Trp127 С-модуля; автором за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії визначено параметри зв'язування комплексу С-модуля з тРНК^Phe.

АНОТАЦІЯ

Кордиш М.О. Внутрішньомолекулярна конформаційна рухливість та РНК-зв'язувальні властивості С-модуля еукаріотної тирозил-тРНК синтетази і цитокіну ЕМАР ІІ. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України. - Київ. - 2007.

Досліджено внутрішньомолекулярну конформаційну рухливість ізольованого С-модуля TyrRS та цитокіну ЕМАР ІІ в розчині методами флуоресцентної спектроскопії, кругового дихроїзму та молекулярної динаміки, а також охарактеризовані конформаційні зміни цих білків під впливом температури. Проаналізовано формування комплексів С-модуля TyrRS та цитокіну ЕМАР ІІ із тРНК методами стаціонарної та з роздільністю у часі флуоресцентної спектроскопії, а також методами молекулярного моделювання. Визначено параметри зв'язування тРНК з досліджуваними білками. Експериментально досліджено ймовірні механізми взаємодії С-модуля та ЕМАР ІІ з тРНК, виявлено конформаційні зміни білків при утворенні комплексів з тРНК та охарактеризовано можливі механізми таких змін.

Ключові слова: С-модуль тирозил-тРНК синтетази, цитокін ЕМАР ІІ флуоресцентна спектроскопія, конформаційна рухливість.

АННОТАЦИЯ

Кордыш М.A. Внутримолекулярная конформационная подвижность и РНК-связывающие свойства С-модуля эукариотической тирозил-тРНК синтетазы и цитокина ЕМАР II. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины. - Киев. - 2007.

В работе методами стационарной флуоресцентной спектроскопии, флуоресцентной спектроскопии с разрешением во времени, КД-спектроскопии и компьютерного моделирования проведено исследование внутримолекулярной конформационной подвижности С-модуля ТyrRS и ЕМАР II.

Параметры собственной флуоресценции Trp144 С-модуля ТyrRS и отсутствие тушения флуоресценции ионами Cs⁺ свидетельствуют о внутренней локализации флуорофора в составе белка. Данные по тушению флуоресценции Trp144 акриламидом свидетельствуют о наличии конформационной динамики белка в наносекундном временном интервале.

Анализ зависимых от температуры конформационных изменений С-модуля обнаружил переход Trp144 из внутреннего нативного состояния в быстрорелаксирующий полярный растворитель в диапазоне температур 37-52^оС.

Параметры флуоресценции Trp125 ЕМАР II и их изменение в ходе тушения эмиссии белка акриламидом свидетельствуют о наличии быстрой конформационной подвижности ЕМАР II в наносекундном временном интервале.

Методами флуоресцентной спектроскопии исследована конформационная подвижности ЕМАР II в растворе в диапазоне температур 20-55^оС. Обнаружен локальный конформационный переход микроокружения Trp125, который характеризуется частичной экспонированностью Trp125 молекулам растворителя при физиологической температуре 37^оС, и его полным выходом из гидрофобного в быстрорелаксирующее водное окружение при температуре 45 ^оС.

На основании полученных спектров КД С-модуля ТyrRS и ЕМАР II рассчитано количественное содержание элементов вторичной структуры этих белков. Исследования вторичной структуры С-модуля и ЕМАР II в диапазоне температур 20-54^оС указывают на стабильность вторичной структуры этих белков в данном температурном интервале. Следовательно, описанные выше конформационные переходы остатков Trp144 С-модуля ТyrRS и Trp125 ЕМАР II имеют локальный характер и не сопровождаются изменением вторичной структуры исследуемых белков.

Конформационная подвижность С-модуля ТyrRS и ЕМАР II исследована методами компьютерного моделирования молекулярной динамики. Выявлены локальные конформационные переходы в подвижной области интерфейса А- и В-субдоменов этих белков, которые сопровождаются переупаковкой структуры белков и удлинением их -спиралей. Для ЕМАР II - удлинение б-спирали (Ile124-Gln129) на три аминокислотных остатка Lys121, Lys122, Lys123; для С-модуля TyrRS - удлинение б-спирали (Val126 - Gln131) на аминокислотные остатки Lys125, Ala132, Asp133.

С целью исследования взаимодействия изолированного С-модуля ТyrRS с тРНК проведен анализ формирования этого комплекса с использованием собственной флуоресценции Trp144. Выявлено, что флуорофор Trp144 нечувствителен к связыванию белка с тРНК, что обусловлено его пространственной удаленностью от РНК-связывающего сайта С-модуля.

В связи с этим, методами сайт-направленного мутагенеза консервативный остаток Phe127 в РНК-связывающем центре С-модуля заменен на флуорофор Trp127, что дало возможность охарактеризовать формирование комплекса С-модуля с тРНК методами флуоресцентной спектроскопии.

На основании данных спектрофлуориметрического титрования С-модуля с заменой Phe127>Trp и ЕМАР ІІ с тРНК рассчитаны величины констант диссоциации (Кд) и стехиометрии связывания (n) комплексов: С-модуля с тРНК^Phe (Кд=2,9·10^-8 М, n=1,2) и ЕМАР ІІ с тРНК (Кд=3,4·10^-7 М, n=1,3).

Проведено исследование взаимодействия С-модуля с заменой Phe127>Trp и ЕМАР ІІ с тРНК методами флуоресцентной спектроскопии с разрешением во времени. Сравнительный анализ параметров затухания флуоресценции этих белков без и в присутствии тРНК позволил обнаружить дополнительную короткоживущую компоненту триптофановой флуоресценции в присутствии нуклеиновой кислоты без существенных изменений других параметров. Возникновение этой дополнительной компоненты свидетельствует о конформационном изменении микроокружения Trp127 С-модуля и Trp125 ЕМАР ІІ

при взаимодействии с тРНК. Следует отметить, что наличие такой субнаносекундной компоненты времени жизни флуоресценции имело место всего для ~20% остатков триптофанов С-модуля и для ~30% Trp125 ЕМАР ІІ. Это обусловлено динамическим механизмом взаимодействия белка с нуклеиновой кислотой, в ходе которого происходит их конформационная адаптация: вероятно, не существует единственной уникальной конформации белка в комплексе с тРНК.

С использованием методов компьютерного моделирования построена модель трехмерной структуры С-модуля ТyrRS с тРНК. Достоверность построенной модели проверена нами экспериментально с использованием метода флуоресцентного переноса энергии между Trp144 С-модуля та Y-нуклеозидом в антикодоновой петле тРНК^Phe. Проведенный анализ структуры комплекса позволил определить область взаимодействия белка и нуклеиновой кислоты, а также объяснить полученные данные флуоресцентной спектроскопии с разрешением во времени, характеризующие этот комплекс, и предложить вероятный механизм взаимодействия С-модуля ТyrRS с тРНК.

Все полученные в диссертационной работе результаты имеют фундаментальное значение и могут быть использованы для объяснения механизмов взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами.