Система тирозинового фосфорилювання-дефосфорилювання в клітинах слизової оболонки шлунка за умов експериментальної виразки

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

СИСТЕМА ТИРОЗИНОВОГО ФОСФОРИЛЮВАННЯ - ДЕФОСФОРИЛЮВАННЯ В КЛІТИНАХ СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ВИРАЗКИ

03.00.04 - біохімія

КУЗЬМЕНКО ЛАРИСА ІВАНІВНА

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біохімії НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри біохімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Цудзевич Борис Олександрович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник

лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету;

доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів.

Провідна установа: Чернівецький національний університет

імені Юрія Федьковича МОН України, м. Чернівці.

Захист відбудеться ”24” вересня 2007 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

тирозиновий протеїнкіназа виразка фосфорилювання

Актуальність теми. Система тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання білків сьогодні вважається однією з найважливіших ланок регуляції ряду внутрішньоклітинних процесів [Graves J.D., 1999, Hunter T., 2000]. Завдяки спряженій взаємодії тирозинових протеїнкіназ (ТПК-аз) (КФ 2.7.1.112) та тирозинових протеїнфосфатаз (ТПФ-аз) (КФ 3.1.3.48) здійснюється зворотна регуляція функціональної активності різноманітних ферментативних процесів в межах роботи внутрішньоклітинних месенджерних каскадів. Такий розвиток подій призводить або до підсилення сигналу, або, навпаки, до припинення його проходження від цитоплазматичної мембрани до ядра, регулюючи процеси росту, проліферації, диференціації, міграції та метаболізму клітин [Schenk P.W., 1999].

Сьогодні доведено значну роль системи білкового фосфорилювання - дефосфорилювання у розвитку різних патологій, зокрема виразкової хвороби шлунка [Paul M.K., 2004, Kellie S., 2003]. Клінічна картина цього захворювання та патофізіологічні процеси, які лежать у витоках порушень цілісності слизової оболонки шлунка, є достатньо вивченими. Проте, практично не дослідженo біохімічні і молекулярні механізми утворення та загоєння виразкових уражень, вивчення яких може сприяти розробці нових терапевтичних засобів лікування виразкового захворювання.

Функціонування системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання у клітинах слизової оболонки шлунка взаємопов'язанo з іншими ферментативними системами у процесі відновлення після пошкоджень [Tarnawski A.S., 2005]. Формування виразкових уражень супроводжується ішемічним процесом, порушенням кровообігу в слизовій, виникненням оксидативного і нітрозативного стресів та запальною реакцією. Вміст активних форм кисню, який значно зростає за таких умов, контролюється ферментами антиоксидантного захисту, в регуляцію активності яких залучені складні шляхи сигнальної трансдукції за участі ферментів тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання [Kevil C.G., 2001]. Встановлення особливостей функціонування взаємозалежних ланок регуляції внутрішньоклітинних сигналів в цілісній системі метаболічних процесів є важливим напрямком, вивчення якого є необхідним для з'ясування молекулярних механізмів утворення та загоєння виразкових уражень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт відділу біохімії НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках теми № 01 БФ 033-03 “Дослідження ролі нехолінергічних факторів у регуляції стану кишково-шлункового тракту”, № д. р. 0101U002485, підрозділ “Дослідження механізмів трансдукції сигналу в клітинах за умов розвитку патологічного стану”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити участь системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання у механізмах розвитку та корекції метаболічних порушень у клітинах слизової оболонки шлунка щурів за стрес-індукованих виразкових уражень. Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1. Дослідити активність тирозинових протеїнкіназ та тирозинових протеїнфосфатаз у плазматичних мембранах та цитозолі клітин слизової оболонки шлунка при експериментальній стресовій моделі виразки.

2. Визначити рівень фосфорилювання тирозину в білках плазматичних мембран та цитозолю клітин слизової оболонки шлунка за умов стрес-індукованого ульцерогенезу.

3. Дослідити активність ферментів антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази), рівень гідроксильного радикалу та оксиду азоту, активність синтази оксиду азоту та рівень 2',5'-олігоаденілат-синтетазної активності в клітинах слизової оболонки шлунка при експериментальній виразці.

4. Дослідити регулюючий вплив тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання на системи антиоксидантного захисту, 2',5'-олігоаденілату та оксиду азоту в клітинах слизової оболонки шлунка при експериментальній стресовій виразці за умов введення противиразкового препарату омепразолу.

Об'єкт дослідження - біохімічні механізми функціонування тирозинових протеїнкіназ та тирозинових протеїнфосфатаз у клітинах слизової оболонки шлунка щурів за умов експериментальної виразки.

Предмет дослідження - активність тирозинових протеїнкіназ та тирозинових протеїнфосфатаз, вміст фосфотирозину, активність ферментів антиоксидантного захисту, рівень гідроксильного радикалу, активність синтази оксиду азоту та вміст оксиду азоту, активність 2',5'-олігоаденілат-синтетази.

Методи дослідження - біохімічні, спектрофотометричні, гістологічні, методи імунно-ферментного аналізу та математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження особливостей функціонування системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання в клітинах слизової оболонки шлунка за умов розвитку та на ранніх етапах загоєння (5 діб) стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка. Встановлено пригнічення функціонування регуляторної системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання в клітинах слизової оболонки за таких умов. Досліджено взаєморегулюючий вплив системи фосфотирозинового гомеостазу та системи антиоксидантного захисту, оксиду азоту та 2',5'-олігоаденілату. Результати досліджень свідчать про суттєві зміни активності ферментів антиоксидантного захисту в клітинах слизової оболонки шлунка за умов обраної експериментальної моделі, які не нормалізувалися у процесі реепітелізації слизової. Показано, що в клітинах слизової оболонки шлунка протягом усього терміну досліджень спостерігалася стійка активація синтази оксиду азоту та ключового ферменту інтерферон-залежного месенджерного каскаду - 2',5'-олігоаденілат-синтетази, що свідчило про розвиток запальної реакції внаслідок холодового стресу. Встановлено, що зміни функціонування систем тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання, антиоксидантного захисту, оксиду азоту та 2',5'-олігоаденілату в клітинах слизової оболонки шлунка залучені до метаболічних ефектів інгібітора протонної помпи омепразолу.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень мають фундаментальне значення для розуміння біохімічних основ участі системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання у процесах розвитку та загоєння виразкових дефектів та її регулюючого впливу на системи антиоксидантного захисту, оксиду азоту та 2',5'-олігоаденілату. Аналіз данних по функціональній активності тирозинових протеїнкіназ і тирозинових протеїнфосфатаз, їх взаємозв'язок з іншими ферментативними системами, дає науково обґрунтовану можливість для розробки нових фармакологічних підходів до корекції виявлених метаболічних порушень. Результати експериментальної роботи, в яких встановлено суттєві зміни активності тирозинових протеїнкіназ, тирозинових протеїнфосфатаз та інших досліджених біохімічних показників за умов введення омепразолу у процесі регенерації слизової, є важливими для удосконалення схем його застосування та пошуку нових препаратів з противиразковими властивостями.

Особистий внесок здобувача. Пошук та аналіз літературних джерел, проведення експерименту, обробка та теоретичне обґрунтування результатів досліджень виконані дисертантом особисто. Планування експерименту, розробка методичних підходів виконання досліджень, узагальнення результатів та редагування матеріалів, підготовлених до друку, а також розділів дисертації здійснено спільно з науковим керівником. Гістологічні дослідження проводились сумісно зі ст.н.сп. Інституту хірургії і трансплантології АМН України к.м.н. І.М. Савицькою та асистентом кафедри цитології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка к.б.н. О.К. Вороніною.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на ІV Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2004); Х Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Чернівці, 2004); Российской научной конференции “Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты” (Санкт-Петербург, Россия, 2004); International Meeting of The Physiolоgical Society and FEPS (Bristol, Great Britain, 2005); 2-nd Іnternational Сonference “Neural-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes (Kyiv, Ukraine, 2005); ХІ Всероссийской Гастроэнтерологической Неделе (Москва, Россия, 2005); XVII з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Чернівці, 2006); Main Meeting of The Physiological Society (London, Great Britain, 2006); ХІ Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Полтава, 2006); VI Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів (Київ, 2006); IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); IV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 статей у фахових виданнях та 13 тез у матеріалах і тезах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що включає 337 джерел. Дисертація викладена на 163 стор., містить у своєму складі 25 рисунків та 7 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У дослідах використовували самців білих нелінійних щурів масою 200-250 г. Експериментальну виразку шлунка у піддослідних тварин викликали згідно з методом [Biswas К., 2003] за допомогою холодового стресу. Розчин препарату омепразолу у фізіологічному розчині вводили внутрішньочеревно у дозі 0,8 мг/кг один раз на добу відразу після припинення стресового впливу та протягом 1-5 діб. Тварин декапітували через 40 хв після введення препарату та виділяли слизову оболонку шлунка. Гістологічні дослідження проводили згідно з методом [Лили Р., 1969]. Отримання плазматичних мембран та цитозолю здійснювали за рекомендаціями [Рыбальченко В.К., 1988].

Тирозинпротеїнкіназну та тирозинпротеїнфосфатазну активність визначали методом імунно-ферментного аналізу з використанням наборів “Sigma” (США) згідно з інструкціями і виражали у пмоль Фн на 1 мг білка за 1 хв. Для визначення вмісту фосфотирозину в білках застосовували метод імунно-афінної преципітації на нітроцелюлозних фільтрах з використанням первинних антифосфотирозинових моноклональних антитіл, кон'югованих з пероксидазою хрону. Вміст білка визначали за методом [Bradford М.М., 1976].

Вимірювання супероксиддисмутазної активності здійснювали згідно з методом [Сирота Т.В., 1999], каталазної - за методом [Королюк М.А., 1988], глутатіонпероксидазної - за накопиченням окисненого глутатіону [Власова С.Н., 1990]. Рівень гідроксильного радикалу досліджували згідно з рекомендаціями [Babbs С.F., 1987] та виражали в нмоль *ОН на 1 мг білка. Активність синтази оксиду азоту визначали за специфічним розщепленням НAДФH+ [Сумбаєв В.В., 2000] і виражали в нмоль НAДФH+, що окиснюється протягом 1 хв на 1 мг білка. Вміст оксиду азоту визначали згідно [Киселик І.О., 2001]. Активність 2',5'-олігоаденілат-синтетази визначали за методом [Justensen J., 1992] і виражали в нмоль ФФн•хв-1•мг-1 білка. Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики із застосуванням стандартного пакету прикладних програм на ЕОМ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У ході досліджень було встановлено, що процес регенерації слизової оболонки шлунка супроводжувався суттєвими порушеннями функціонування ТПК-аз та ТПФ-аз у клітинах слизової оболонки. Стрес-індукований ульцерогенез призводив до зниження активності як мембранозв'язаних, так і цитозольних форм ферментів. Проте, на початкових етапах регенераційного процесу активність ферментів зростала. Вже на 1-2 добу після стресового впливу значення активності як мембранозв'язаних, так і цитозольних ТПК-аз досягали контрольного рівня (табл.1). На 3 та 4 добу активність ТПК-аз у плазматичних мембранах підвищувалась у 1,5 та 2 рази відповідно, а на 5 добу - набувала контрольних значень. У цитозолі на 3 та 5 добу ТПК-азна активність зменшувалась у 3 рази, а на 4 добу - 1,7 раза, незважаючи на зникнення макроскопічних ознак виразкових дефектів слизової, що свідчило про незавершеність процесів регенерації та відновлення нормального функціонування клітин.

Таблиця 1 Тирозинпротеїнкіназна та тирозинпротеїнфосфатазна активність (пмоль Фн / (мг * хв)) в клітинах слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній виразці за умов введення омепразолу (Mm, n=6)

*- р 0,05 по відношенню до контролю

Регуляцію фосфорилювання активованих ТПК-азами білків та їх функціонування у відповідному режимі здійснюють ТПФ-ази [Kellie S., 2003, Persson С., 2003]. Дослідження активності цих ферментів у клітинах слизової оболонки шлунка дозволило встановити, що розвиток та загоєння виразкових дефектів пов'язані зі значною інактивацією ТПФ-аз в усіх досліджуваних фракціях (табл.1), що може бути наслідком окиснення цих ферментів активними формами кисню [Tonks N.K., 2005, Yilmaz M., 2003] та нітрозилювання пероксинітритом [Lopez C.J., 2005], які утворюються у надвеликих концентраціях під час стрес-індукованої запальної реакції у процесі виразкоутворення [Kwiecien S., 2002].

Зміна активності ТПК-аз та ТПФ-аз в умовах виникнення патологічних станів призводить до порушення фосфорилювання залишків тирозину в білках. У ході досліджень було встановлено суттєві зміни вмісту фосфотирозину в білках клітин слизової оболонки шлунка та значний внесок ТПК-аз у регуляцію його рівня за умов виразкової патології.

Оскільки функціонування системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання в клітинах слизової оболонки шлунка взаємопов'язано з іншими важливими ланками регуляції клітинного метаболізму, а формування гострих виразкових уражень супроводжується значними ішемічними пошкодженнями, запальною реакцією та розвитком оксидативного стресу, нами було визначено активність ферментів антиоксидантної системи та рівень гідроксильного радикалу.

У ході досліджень було встановлено підвищення активності супероксиддисмутази (СОД) в 1,6 раза на 4-5 добу після стресового впливу (табл.2). Підвищення активності СОД відображає мобілізацію резервів фізіологічної антиоксидантної системи, яка направлена на знешкодження токсичної кількості супероксидного аніон-радикалу. Крім того, за умов розвитку запалення нейтрофілами у слизовій оболонці шлунка продукуються цитокіни TNF-б, IL-1в та INF-, що призводить до накопичення активних форм кисню, та експресії ферментів, що їх метаболізують [Konturek S.J., 2000]. Найбільший рівень місцевої нейтрофільної інфільтрації за обраної нами моделі спостерігався на 3-4 добу після стресогенної дії, що співпадало з підвищенням активності СОД за таких умов. Активація СОД у більш віддалені терміни дослідження може призводити до накопичення пероксиду водню, що співвідносилось з інактивацією ТПФ-аз та цитозольних ТПК-аз у цей період.

Експериментальний стрес-індукований ульцерогенез спричинював підвищення каталазної активності через 40 хв після стресового впливу та на 2 добу в 1,3 раза, однак, у більш віддалені терміни її значення перебували в межах контрольних величин (табл.2). Зростання каталазної активності може бути результатом фосфорилювання цього ферменту нерецепторними ТПК-азами с-Abl та Arg, яке ініціюється в умовах ішемії [Cao С., 2003]. Це співпадало зі встановленим відносним зростанням до контрольного рівня активності цитозольних ТПК-аз на 1-2 добу після стресу.

Таблиця 2 Активність ферментів антиоксидантного захисту та рівень гідроксильного радикалу в клітинах слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній виразці за умов введення омепразолу (Mm, n=6)

*- р 0,05 по відношенню до контролю

Через 40 хв після впливу стресового фактора відбувалося зниження активності ГП в клітинах слизової оболонки шлунка в 2,3 раза порівняно з контрольними значеннями (табл.2). Таке інгібування ГП відбувається за умов багатьох патологій та свідчить про виснаження цієї ланки антирадикального захисту, накопичення продуктів розпаду та токсинів. Через добу після стресового впливу значення активності ГП досягали контрольного рівня і залишались такими на 2-4 добу. На 5 добу спостерігалось зниження ферментативної активності в 3,3 раза. Інгібування активності ГП у більш віддалені терміни може бути пов'язано з надмірним використанням відновленого глутатіону без його достатнього відновлення із окисненого стану глутатіонредуктазою [Пасечников В.Д., 1998].

Нормалізація активності ГП на 1-4 добу після стресового впливу, можливо, спричинена фосфорилюванням ТПК-азами [Cao С., 2003], відносна активація яких спостерігалась на 2-5 добу в плазматичних мембранах, та 1-2 в цитозолі; тоді як на 5 добу відбувалось значне зниження ТПК-азної активності у цитозолі порівняно з 4 добою, що спостерігалось і у випадку ГП.

Також встановлено значне зростання рівня гідроксильного радикалу в 3,3 раза по відношенню до контролю через 40 хв після стресового впливу та зниження його у процесі регенерації слизової (табл.2). Підвищення рівня гідроксильного радикалу призводить до накопичення в клітині вторинних месенджерів Са2+ та цГМФ, стимуляції фосфорилювання білків у результаті активації протеїнкіназ, особливо ТПК-аз, які запускають шляхи сигнальної трансдукції та активують Ras/Raf/МАР-кіназний каскад [Frank G.D., 2000]. Показано, що значне підвищення рівня гідроксильного радикалу через 40 хв після стресового впливу супроводжувалось зростанням активності ТПК-аз до контрольного рівня на 1-2 добу. За таких умов спостерігалось суттєве зниження ТПФ-азної активності, як у плазматичних мембранах, так і в цитозолі, особливо через 40 хв після холодового стресу, що може бути пов'язано з окисним інгібуванням ферментів активними формами кисню, які накопичуються у надвеликих концентраціях під час стрес-індукованої запальної реакції у процесі виразкоутворення [Hao Q., 2006].

За умов розвитку виразкової хвороби поряд з накопиченням активних форм кисню значні запальні процеси призводять до активації індуцибельної форми синтази оксиду азоту [Zamora R., 2000], що виробляє NO у надвисоких концентраціях, та розвитку нітрозативного стресу. В результаті досліджень за умов розвитку та загоєння стрес-індукованих виразкових уражень встановлено активацію синтази оксиду азоту (NOS) в клітинах слизової оболонки шлунка, особливо на першу добу (в 3 рази) після дії стресогенного чинника (табл.3). Однак, значне підвищення активності NOS не супроводжувалось вираженими змінами вмісту оксиду азоту, хоча вони були однаково спрямованими.

Система оксиду азоту тісно взаємопов'язана з функціонуванням ферментів тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання. Взаємозалежна регуляція цих двох систем є важливою для прискорення регенераційних процесів у слизовій оболонці шлунка та швидкого загоєння виразкових дефектів [Zheng X.L., 1999]. Аналіз отриманих результатів дозволив підтвердити цей взаємозв'язок, особливо з мембраннозв'язаними ТПК-азами, які є важливою ланкою в шляхах сигнальної трансдукції від рецепторів факторів росту.

У відповідь на виникнення та розвиток стрес-індукованої виразки в клітинах слизової оболонки шлунка тварин збільшувалась активність ключового ферменту інтерферон-залежного месенджерного каскаду, 2',5'- олігоаденілат-синтетази (2',5'-А-синтетази) (табл.3), що свідчить про інтенсифікацію захисних механізмів цих клітин, і може вважатись показником відповіді сигнальної системи інтерферону на розвиток даного патологічного процесу. Слід відмітити значне зростання ферментативної активності (більш ніж удвічі) на 3 та 4 добу після стресового впливу, оскільки згідно з гістологічними даними, саме у ці строки у слизовій оболонці шлунка були виявлені найбільш виражені атрофічні зміни. Проте, її рівень нормалізувався на 5 добу після стресу.

Таблиця 3 Активність синтази оксиду азоту (нмоль НAДФH+ / (мг * хв)) та 2',5'-олігоаденілат-синтетази (нмоль ФФн / (мг * хв)) в клітинах слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній виразці за умов введення омепразолу (М±m, n=6)

*- р 0,05 по відношенню до контролю

Інтерферон-індукований каскад 2',5'-олігоаденілату розглядається як компонент єдиної регуляторної системи передачі внутрішньоклітинних сигналів, яка координує клітинний метаболізм поряд з функціонуванням ферментів тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання [Heim M.H., 1995, Прокопова К.В., 2004]. Це підтверджено експериментальними даними, в яких активація 2',5'-А-синтетази співпадала зі зростанням активності рецепторних ТПК-аз, особливо на 3-4 добу, коли спостерігався у слизовій оболонці шлунка найбільш виражений запальний процес. Відносне зниження функціональної активності ТПК-аз, яке відбувалось на 5 добу після стресового впливу також співпадало з відносним зменшенням 2',5'-А-синтетазної активності у цей період.

Серед найбільш розповсюджених лікарських засобів, що знижують кислотносекреторну діяльність шлунка та сприяють швидкому загоєнню виразкових дефектів, виділяють омепразол та його похідні [Ткач С.М., 2003, Хавкин А.И., 2003]. Для з'ясування ефекту введення цього препарату на біохімічні процеси, що знаходяться в основі відновлення цілісності слизової оболонки шлунка, було досліджено систему тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання та її взаєморегулюючий вплив на системи антиоксидантного захисту і оксиду азоту, а також систему 2',5'-олігоаденілату за умов введення омепразолу.

Показано, що на тлі введення препарату активність мембранозв'язаних та цитозольних ТПК-аз залишалася на контрольному рівні через 40 хв після стресового впливу (табл.1). На 1-3 добу регенераційного процесу у слизовій активність ТПК-аз у плазматичних мембранах не змінювалась по відношенню до контрольних значень. Підвищення активності цих ферментів спостерігалося на 4 та 5 добу після стресу. Активність цитозольних ТПК-аз за умов введення препарату зменшувалась на 1 та 3 добу після стресу, тоді як на 5 добу тирозинпротеїнкіназна активність у цитозолі зростала в 1,6 раза. Таке інгібування цитозольних форм ферментів на ранніх етапах регенерації слизової може свідчити про порушення передачі сигналів через каскади ТПК-аз.

За умов введення тваринам омепразолу встановлено також зниження активності ТПФ-аз, яке було особливо вираженим на 3 добу для мембранозв'язаних ТПФ-аз та на 4 добу для їх цитозольних форм (табл.1). За таких умов вміст фосфотирозину в білках плазматичних мембран протягом усього терміну досліджень та цитозолі на 1-5 добу залишався на контрольному рівні.

Введення препарату ініціювало швидке зростання активності СОД, яке було більш вираженим на початкових етапах регенерації слизової оболонки шлунка (табл.2). У динаміці загоєння стрес-індукованих уражень шлунка введення препарату тваринам призводило до інгібування активності каталази, значного пригнічення ГП активності, підвищення рівня гідроксильного радикалу, активації NOS та мало інгібуючий вплив на 2',5'-А-синтетазу. На більш пізніх строках загоєння експериментальні дані підтверджують концепцію пригнічення процесів сигнальної трансдукції за умов введення омепразолу (табл.2,3).

Такі висновки щодо ефекту введення омепразолу підтверджувалися дослідами, в яких препарат вводили інтактним тваринам (табл.1). Виявлене за цих умов інгібування активності ТПК-аз може бути пов'язано з пригнічуючим впливом омепразолу на функціонування клітин слизової оболонки шлунка за відсутності морфологічних уражень. Це також підтверджувалося зниженням ТПФ-азної активності та вмісту фосфотирозину в білках клітин слизової оболонки, найбільш вираженим в останні строки дослідження, та співпадало з результатами цитологічних досліджень.

За відсутності впливу стресового фактора при введенні омепразолу активність СОД не змінювалась, спостерігався негативний вплив введення препарату на каталазну та ГП активність (табл.2). За таких умов введення противиразкового препарату не впливало на рівень гідроксильного радикалу протягом перших діб, однак на 3-5 добу введення відбувалось поступове накопичення цієї активної форми кисню, кількість якої на 5 добу перевищувала контрольні показники в 4,3 раза.

Отримані дані можуть свідчити про порушення взаємозв'язків між системами синтази оксиду азоту, 2',5'-А-синтетази і тирозинових протеїнкіназ у клітинах слизової оболонки шлунка за умов введення омепразолу тваринам при експериментальній моделі виразкової патології.

Таким чином, нами було встановлено тісний взаємозв'язок системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання з іншими важливими ланками клітинного метаболізму та підтверджено їх взаєморегулюючий вплив за умов розвитку та на ранніх етапах загоєння стрес-індукованих виразкових дефектів слизової оболонки шлунка. Отримані дані свідчать про те, що пролонговане введення омепразолу може порушувати процеси сигнальної трансдукції за участю ферментів тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання та створювати перешкоди для нормального післявиразкового відновлення тканин слизової оболонки.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено особливості функціонування системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання в клітинах слизової оболонки шлунка щурів за умов експериментальної виразки та її регулюючий вплив на інші ланки клітинного метаболізму (активність ферментів системи антиоксидантного захисту, синтази оксиду азоту, 2',5'-олігоаденілат-синтетази, рівень гідроксильного радикалу та оксиду азоту).

2. Показано, що тирозинпротеїнкіназна активність у плазматичних мембранах клітин слизової оболонки шлунка підвищувалась у 1,5-2 рази на 3 та 4 добу після холодового стресу, у цитозолі залишалась зниженою, незважаючи на зникнення видимих ознак виразкових уражень слизової.

3. Встановлено інактивацію тирозинових протеїнфосфатаз в клітинах слизової оболонки шлунка при експериментальній виразці протягом усього терміну досліджень.

4. Показано зниження інтенсивності фосфорилювання залишків тирозину в білках плазматичних мембран клітин слизової оболонки шлунка, особливо виражене на початкових термінах дослідження, і в білках цитозолю - у більш віддалений період за умов впливу стресового фактора.

5. Розвиток та загоєння стрес-індукованих уражень шлунка супроводжувались різноспрямованими змінами активності ферментів антиоксидантного захисту: активність глутатіонпероксидази знижувалась через 40 хв після стресового впливу та на 5 добу, відбувалось підвищення каталазної активності через 40 хв після впливу стресового фактора та на 2 добу; супероксиддисмутазна активність зростала на 4-5 добу, спостерігалось значне накопичення гідроксильного радикалу через 40 хв після стресу та зниження його до рівня контрольних показників у процесі регенерації слизової.

6. Встановлено найсуттєвішу активацію синтази оксиду азоту на ранніх термінах регенерації слизової оболонки шлунка.

7. При експериментальній стресовій виразці в клітинах слизової оболонки шлунка тварин підвищувалась активність ключового ферменту інтерферон-залежного месенджерного каскаду - 2',5'-олігоаденілат-синтетази.

8. Встановлено, що до механізмів реалізації біохімічного впливу противиразкового препарату омепразолу залучені тирозинові протеїнкінази, тирозинові протеїнфосфатази та ферменти антиоксидантного захисту. Показано, що введення омепразолу мало наслідком активацію синтази оксиду азоту та зниження активності 2',5'-олігоаденілат-синтетази.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Богданова О.В., Солодков В.В., Кузьменко Л.І., Остапченко Л.І. Дослідження впливу сквалену на протеїнтирозинфосфатазну активність в лімфоїдних клітинах за різних патологічних станів // Доповіді НАН України. - 2004. - № 10. - С. 178-182. (Особистий внесок здобувача - виділення лімфоїдних клітин, отримання цитоплазматичних мембран та цитозолю, визначення активності тирозинових протеїнфосфатаз).

2. Богданова О.В., Кузьменко Л.І., Прокопова К.В., Дробінська О.В., Остапченко Л.І. Вивчення систем передачі сигналу в лімфоїдних клітинах щурів при введенні імуномодуляторів за опромінення у малих дозах // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - 2005. - Т. 68, вип. 5. - С. 77-98. (Особистий внесок здобувача - виділення лімфоїдних клітин, визначення активності тирозинових протеїнфосфатаз).

3. Ковальова В.А., Кузьменко Л.І., Степанов Ю.В., Остапченко Л.І. Дослідження активності тирозинової протеїнкінази в мембранах клітин слизової оболонки шлунка щурів за умов розвитку виразки // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Серія Біологія. - 2005. - Вип. 45. - С. 11-12. (Особистий внесок здобувача - отримання цитоплазматичних мембран клітин слизової оболонки шлунка, визначення активності тирозинових протеїнкіназ).

4. Кузьменко Л.І., Богданова О.В., Остапченко Л.І. Регуляція секреторних процесів у парієтальних клітинах за умов розвитку різних патологій шлунка // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 4. - С. 80-88. (Особистий внесок здобувача - підбір та обробка літературних даних, підготовка матеріалів до друку).

5. Кузьменко Л.І., Богданова О.В., Кравченко О.О., Кухарський В.М., Остапченко Л.І. Система тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання у клітинах слизової оболонки за умов розвитку стрес-індукованих уражень шлунка // Фізика живого. - 2006. - Т. 14, № 3. - С. 47-54. (Особистий внесок здобувача - визначення тирозинпротеїнкіназної та тирозинпротеїнфосфатазної активності, статистична обробка результатів, підготовка матеріалів до друку).

6. Bogdanova O., Kuzmenko L., Prokopova K., Ostapchenko L. Protein tyrosine kinase and phosphatase activities in rat stomach mucosa cells under conditions of stress induced stomach ulcer // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska. Sect. Pharmacia. - 2006. - Vol. 19, № 1. - Р. 119-122. (Особистий внесок здобувача - визначення тирозинпротеїнкіназної та тирозинпротеїнфосфатазної активності, аналіз та узагальнення).

7. Богданова О.В., Кузьменко Л.І., Моргаєнко О.О., Остапченко Л.І. Особливості реакції дефосфорилювання за участю ферментативного препарату тирозинової протеїнфосфатази СD45 із клітин тимуса інтактних щурів та після іонізуючого опромінення // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 5. - С. 127-131. (Особистий внесок здобувача - виділення лімфоїдних клітин із тимусу щурів, опрацювання літератури за темою досліджень).

8. Богданова О.В., Кузьменко Л.І. Вплив перорального введення сквалену на протеїнтирозинфосфатазну активність в лімфоїдних клітинах за різних патологічних станів // Біологічні дослідження молодих учених на Україні: Матеріали ІV Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів (24-25 квітня 2004 р.). - Київ: Київський національний ун-т імені Тараса Шевченка, 2004. - С. 10-12.

9. Богданова О.В., КузьменкоЛ.І., Остапченко Л.І. Вплив скваленової терапії виразкової хвороби шлунку на функціональну активність лімфоїдної тканини // Тези доповідей Х Конгресу світової федерації українських лікарських товариств (26-28 червня 2004 р.). - Чернівці, 2004. - С. 74.

10. Богданова О.В., КузьменкоЛ.І., Кравченко Е.Н. Влияние введения препарата сквалена на динамику изменений протеинтирозинфосфатазной активности лимфоидных клеток при различных дозах сублетального облучения // Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты: Материалы Российской научной конференции (май-июнь 2004 г.). - Санкт-Петербург: Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Россия, 2004. - С. 297-298.

11. Богданова О.В., Кузьменко Л.І., Прокопова К.В., Дробінська Л.В., Остапченко Л.І. Активність тирозинових протеїнфосфатаз у лімфоїдних клітинах щурів за умов розвитку виразкової хвороби шлунка // Фізіологічний журнал. - 2006. - Т. 52, № 2: Матеріали XVII з'їзду Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (18-20 травня 2006 р.). - Чернівці: ін-т фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, 2006. - С. 159-160.

12. Богданова Е.В., Кузьменко Л.И., Остапченко Л.И. Изучение протеинтирозинфосфатазной активности в лимфоидных клетках крыс в условиях развития различных моделей язвы желудка // Российский журнал Гастроэнтерологии, Гепатологии, Колопроктологии. - 2005. - Т. 15, № 5: Материалы ХІ Российской Гастроэнтерологической Недели (10-12 октября, 2005 г.). - Москва, Россия, 2005. - С. 113.

13. Кузьменко Л.І., Богданова О.В., Остапченко Л.І. Дослідження морфологічних уражень слизової оболонки шлунка після холодового стресу за умов введення омепразолу // Тези доповідей ХІ Конгресу світової федерації українських лікарських товариств (28-30 серпня 2006 р.). - Полтава, 2006. - С. 347.

14. Степанець І.О., Кузьменко Л.І., Богданова О.В. Активність ферментів антиоксидатної системи, NO - синтази та вміст оксиду азоту в гомогенаті клітин слизової оболонки шлунку щурів за умов виразкової хвороби // Біологічні дослідження молодих вчених в Україні: Матеріали VI Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів (21-22 вересня 2006 р.). - Київ: Київський національний ун-т імені Тараса Шевченка, 2006.

15. Прокопов В.В., Кузьменко Л.І., Прокопова К.В. Вплив препарату фенугрека на активність 2',5'олігоаденілат-синтетази при експериментальній виразці шлунка // Біологічні дослідження молодих вчених в Україні: Матеріали VI Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів (21-22 вересня 2006 р.). - Київ: Київський національний ун-т імені Тараса Шевченка, 2006. - С. 61-62.

16. Кузьменко Л.І., Богданова О.В., Прокопова К.В., Остапченко Л.І. Роль тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання у процесі загоєння виразкової хвороби шлунка // Матеріали IX Українського біохімічного з'їзду (24-27 жовтня 2006 р.). - Харків: Харківський національний ун-т ім. В.Н. Каразіна, 2006. - С. 74.

17. Богданова О.В., Кузьменко Л.І., Прокопова К.В., Остапченко Л.І. Активність тирозинових протеїнкіназ в клітинах слизової оболонки шлунка на різних етапах виразкової хвороби за умов введення омепразолу // Тези доповідей IV з'їзду Українського біофізичного товариства (19-21 грудня 2006 р.). - Донецьк: Донецький національний ун-т, 2006. - С. 36-38.

18. Bogdanova O.V., Kuzmenko L.I., Prokopova K.V., Gavrish L.I., Drobinska O.V., Ostapchenko L.I. Protein tyrosine phosphatase activity in lymphoid cells under conditions of different models of ulcer development and ionizing irradiation treatment, combined with cycloferone application // Joint International Meeting of The Physiological Society and FEPS: Book of Abstracts (20-23 July, 2005). - Bristol: University of Bristol, Great Britain, 2005. - P. 151.

19. Bogdanova O., Kuzmenko L., Strotska E., Skopenko O., Ostapchenko L. Protein tyrosine phosphatase activity in lymphoid cells under conditions of ethanol- aspirin- and stress-induced stomach ulcer development combined with cycloferone treatment // Neural-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes: 2-nd Іnternational Сonference (5-7 October, 2005). - Kyiv: Taras Shevchenko National University of Kyiv, Ukraine, 2005. - P. 22.

20. Bogdanova O.V., Kuzmenko L.I., Prokopova K.V., Bogdanov V.B., Ostapchenko L.I. Activity of protein tyrosine phosphorilation enzymes in stomach mucosa cells of rats with stress-induced gastric lesions // Main Meeting of The Phisiological Society: Book of Abstracts (4-7 July, 2006). - London: University College, Great Britain, 2006. - P. 193.

АНОТАЦІЯ

Кузьменко Л.І. Система тирозинового фосфорилювання-дефосфорилювання в клітинах слизової оболонки шлунка за умов експериментальної виразки. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007.

Досліджено особливості функціонування системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання в клітинах слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній моделі виразки. Співвіднесено отримані дані з показниками інших ланок регуляції клітинного метаболізму: системи антиоксидантного захисту, 2',5'-олігоаденілату та оксиду азоту. Встановлено, що незважаючи на зникнення макроскопічних проявів виразкових уражень слизової, процеси передачі сигналу за участі системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання є порушеними. Так, активність тирозинових протеїнкіназ зростала лише в плазматичних мембранах клітин слизової оболонки шлунка на 3 та 4 добу після стресового впливу, розвиток виразкової патології призводив до значної інактивації тирозинових протеїнфосфатаз та суттєвих змін вмісту фосфотирозину в білках. Виявлено взаємозв'язок системи тирозинового фосфорилювання - дефосфорилювання зі змінами активності ферментів антиоксидантного захисту, системою оксиду азоту та активністю 2',5'-олігоаденілат-синтетази в клітинах слизової оболонки шлунка за умов експериментальної виразки та при введенні противиразкового препарату омепразолу.

Ключові слова: тирозинові протеїнкінази, тирозинові протеїнфосфатази, ферментативна активність, слизова оболонка шлунка, виразкові ураження шлунка.

АННОТАЦИЯ

Кузьменко Л.И. Система тирозинового фосфорилирования - дефосфорилирования в клетках слизистой оболочки желудка в условиях экспериментальной язвы. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2007.

Исследовано особенности функционирования системы тирозинового фосфорилирования - дефосфорилирования в плазматических мембранах и цитозоле клеток слизистой оболочки желудка крыс при экспериментальной стрессовой модели язвы. Полученные данные сопоставлено с показателями других компонентов регуляции клеточного метаболизма: системы антиоксидантной защиты, 2',5'-олигоаденилата и оксида азота.

На основании проведенных исследований установлено, что образование и заживление язвенных дефектов желудка сопровождалось существенными нарушениями функционирования тирозиновых протеинкиназ (ТПК-аз) и тирозиновых протеинфосфатаз (ТПФ-аз) в клетках слизистой оболочки. Стресс-индуцированный ульцерогенез приводил к снижению активности как мембранносвязаных, так и цитозольных форм ферментов. Активность ТПК-аз повышалась только в плазматических мембранах на 3-4 сутки после стресса, при этом происходила существенная инактивация ТПФ-аз, уровень фосфотирозина в белках был сниженным, особенно на ранних сроках заживления язвенных дефектов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на исчезновение видимых дефектов слизистой, процессы регенерации и передачи сигнала в системе тирозинового фосфорилирования - дефосфорилирования остаются нарушенными.

Исследование показателей функционирования антиоксидантной системы позволило установить, что образование и заживление язвенных поражений желудка сопровождалось снижением активности глутатионпероксидазы (ГП) через 40 мин после стрессового влияния и на 5 сутки; повышением активности каталазы через 40 мин после стресса и на 2 сутки; повышением активности супероксиддисмутазы (СОД) на 4-5 сутки; активацией синтазы оксида азота, наиболее выраженной на 1 сутки; повышением активности ключевого фермента интерферон-зависимого мессенджерного каскада - 2',5'-олигоаденилат-синтетазы.

Изменения активности ферментов антиоксидантной системы, синтазы оксида азота и 2',5'-олигоаденилат-синтетазы в некоторых случаях были однонаправлены с показателями системы тирозинового фосфорилирования - дефосфорилирования. Так, повышение активности СОД соотносилось с повышением активности мембранносвязаных ТПК-аз; активация каталазы на ранних сроках заживления и нормализация активности ГП могла быть результатом фосфорилирования нерецепторными ТПК-азами, активность которых относительно возрастала в этот период. Значительное увеличение уровня гидроксильного радикала через 40 мин после стрессового влияния сопровождалось повышением активности ТПК-аз до контрольного уровня на 1-2 сутки и инактивацией ТПФ-аз. Установлено большую степень соотношения активности синтезы оксида азота и 2',5'-олигоаденилат-синтетазы с функционированием рецепторных ТПК-аз.

При введении омепразола - одного из наиболее широко используемых препаратов при лечении язвенной болезни - активность ТПК-аз повышалась на 4-5 сутки после стресса; нормализирующий эффект введения препарата на ТПФ-азную активность наблюдался только через 40 мин после стрессового влияния; уровень фосфотирозина в белках клеток слизистой оболочки желудка оставался существенно сниженным, особенно в цитозоле. Введение омепразола после стрессового влияния также приводило к возрастанию активности СОД, ингибированию активности каталазы и ГП, активации синтазы оксида азота, а также накоплению гидроксильного радикала.

Таким образом, был установлен определенный уровень взаимосвязи системы тирозинового фосфорилирования - дефосфорилирования с другими компонентами регуляции клеточного метаболизма в условиях развития и на ранних этапах заживления стресс-индуцированых язвенных дефектов слизистой желудка, который изменялся при введении омепразола.

Ключевые слова: тирозиновые протеинкиназы, тирозиновые протеинфосфатазы, ферментативная активность, слизистая оболочка желудка, язвенные поражения желудка.

SUMMARY

Kuzmenko L.I. System of tyrosine phosphorylation - dephosphorylation in stomach mucosa cells under conditions of experimental ulcer development. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2007.

System of tyrosine phosphorylation - dephosphorylation has been studied in rat stomach mucosa cells under ulcer experimental model development. Findings have been compared with data from study of others cellular metabolism regulation components: antioxidative, 2',5'-oligoadenylate and nitric oxide systems.

It was established that, in spite of disappearance of visible defects in mucosa, signal transduction processes via system of tyrosine phosphorylation - dephosphorylation were not restored. Thus, protein tyrosine kinase activity was increased only in plasma membranes of stomach mucosa cells on 3 and 4 day after stress influence. Development and healing of gastric lesions were accompanied by decrease in protein tyrosine phosphatase activity and changes of phosphotyrosine content in proteins.

It was shown interplay between functioning of system of tyrosine phosphorylation - dephosphorylation and antioxidant enzymes, nitric oxide system and 2',5'-oligoadenylate-synthetase in stomach mucosa cells under conditions of ulcer experimental model development after omeprazole treatment.

Key words: protein tyrosine kinase, protein tyrosine phosphatase, enzymatic activity, stomach mucosa, gastric lesions.

Размещено на Allbest.ru