Вплив in vitro пептидогліканів та ліпополісахаридів бактерій на функціональну, метаболічну активність та апоптоз моноцитів і Т-лімфоцитів

I. Дослідити in vitro вплив ПГН та ЛПС на:

Фагоцитарну та секреторну активність, стан процесів ПОЛ/АОЗ, систему аденілових та циклічних нуклеотидів, інтенсивність експресії молекул CD38 та CD95 на мембранах моноцитів, виділених з периферійної крові здорових донорів.

Секреторну активність, стан прооксидантно-антиоксидантних процесів, систему аденілових та циклічних нуклеотидів, інтенсивність експресії молекул CD38 та CD95 на мембранах Т-хелперів/індукторів периферійної крові здорових донорів.

Секреторну активність, стан процесів ПОЛ/АОЗ, систему аденілових та циклічних нуклеотидів, інтенсивність експресії молекул CD38 та CD95 на мембранах Т-супресорів/цитотоксиків периферійної крові здорових донорів.

II. Визначити in vitro ефективність обробки «Амізоном» в корекції порушень функціональної активності моноцитів та Т-лімфоцитів, підданих впливу ПГН та ЛПС бактерій.

Об'єкт дослідження: моноцити, Т-хелпери/індуктори, Т-супресори/цитотоксики периферійної крові здорових донорів.

Предмети дослідження: вплив in vitro ПГН та ЛПС в концентраціях 100 та 200 мг/л на функціональну, секреторну, метаболічну активність та апоптоз моноцитів, Т-хелперів/індукторів та Т-супресорів/цитотоксиків; роль обробки суспензії моноцитів та субпопуляцій Т-лімфоцитів препаратом «Амізон» в усуненні порушень, які виникли.

Методи дослідження: імунологічні (виділення клітин з крові, вивчення фагоцитарної активності моноцитів, секреторної та метаболічної активності моноцитів, субпопуляцій Т-лімфоцитів, експресії маркерів апоптозу на цитоплазматичних мембранах клітин), біохімічні (вивчення показників процесів ПОЛ/АОЗ, системи аденілових та циклічних нуклеотидів), статистичні (варіаційна статистика, кореляційний аналіз).

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчений in vitro вплив високих концентрацій (100 та 200 мг/л) ПГН та ЛПС на функціональний стан моноцитів та Т-лімфоцитів периферійної крові людини. Встановлено, що високі концентрації ПГН та ЛПС пригнічують фагоцитарну активність моноцитів та стимулюють секрецію ними інтерлейкінів - ІЛ-1в, ІЛ-6, ІЛ-8, фактора некрозу пухлини - ФНП-, простагландину - ПГЕ2, найбільший потенціал при цьому мають ЛПС. Показано, що високі концентрації ПГН та ЛПС in vitro стимулюють секрецію ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10, ФНП-в, інтерферону - г-ІФН та ПГЕ2 Т-хелперами/індукторами, а також стимулюють секрецію ІЛ-2, ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП- та ПГЕ2 Т-супресорами/цитотоксиками. Встановлено, що високі концентрації ПГН та ЛПС активують в моноцитах та Т-лімфоцитах in vitro процеси ПОЛ, пригнічують активність ферментів системи АОЗ, знижують енергетичний потенціал, збільшують вміст циклічного аденозину монофосфату (цАМФ) та знижують вміст циклічного гуанозину монофосфату (цГМФ) в клітинах, посилюють експресію рецепторів до маркерів CD38 та CD95 на мембранах клітин. Вперше доведено, що попередня обробка моноцитів та Т-лімфоцитів периферійної крові людини розчином «Амізону» (0,0072 г/л) позитивно впливає на функціональну активність та метаболізм даних клітин при подальшій обробці них ПГН та ЛПС: підвищує фагоцитарну активність, зменшує секрецію медіаторів, активність процесів ПОЛ, дисбаланс в системі цАМФ/цГМФ, експресію рецепторів CD38 та CD95; підвищує енергетичний потенціал клітин та активність ферментів системи АОЗ.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані дозволяють оцінити in vitro функціональний стан та метаболічний статус моноцитів та Т-лімфоцитів крові людини; екстраполювати ступінь функціональних та метаболічних порушень в імунних клітинах з рівнем вмісту у оточуючому них середовищі ПГН та ЛПС гноєтворних бактерій; є підставою для використання фармакологічних препаратів з антиоксидантною, протизапальною та імунокоригуючою дією. Використання «Амізону» в концентрації 0,0072 г/л позитивно впливає на функціональну активність та метаболічний статус моноцитів та Т-лімфоцитів периферійної крові людини, що дозволяє рекомендувати до використання «Амізон» в клінічній практиці при гнійно-запальних захворюваннях, викликаних золотавим стафілококом та паличкою синього гною.

Отримані дані використовуються в навчальному процесі кафедр патологічної фізіології і мікробіології ЛДМУ Мінздраву України, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, постановка мети, задач і обговорення одержаних результатів, планування роботи були здійснені разом із науковим керівником професором І.С. Гайдашем. Автором самостійно проведений: патентно-інформаційний пошук за допомогою бази даних «Medline», аналіз літератури за темою дисертації, виконана експериментальна частина роботи, вивчені та узагальнені результати проведених досліджень, обгрунтовані наукові висновки і рекомендації для практичного використання результатів, написані всі розділи дисертації та автореферат.

Апробація роботи. Основні положення дисертації докладені та обговорені на засіданнях: Всеукраїнської науково-практичної та навчально-методичної конференції «Фундаментальні науки - хірургії» (Треті Скліфософські читання) ВДНЗ «Українська державна медична академія» (Полтава, 2007); науково-практичної конференції з міжнародною участю «Діагностичні центри - медико-біологічні аспекти діагностичного процесу», приуроченої до 50-річчя від дня народження засновника - першого головного лікаря Рівненського обласного клінічного лікувально-діагностичного центру Поліщука В.М. (Рівне, 2007); а також на засіданнях Луганського обласного товариства патофізіологів в 2002-2007 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 наукових статті в часописах, які відповідають вимогам ВАК України та надруковані згідно вимог, викладених в пункті 3 Постанови ВАК України від 15 січня 2003 р. за № 7-05/1, та 1 тези.

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 150 сторінках комп'ютерного набору та складається з вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, практичних рекомендацій та списку літературних посилань. Робота ілюстрована 38 таблицями (загальний обсяг - 0 сторінок). Список літератури включає 135 джерел вітчизняних та іноземних авторів.

Основний зміст роботи

Матеріал і методи дослідження. Лімфоцити та моноцити були виділені з периферійної крові 45 здорових чоловіків віком від 20 до 35 років (середній вік - 27,301,37 років). ПГН золотавого стафілокока та ЛПС палички синього гною були виділені з клітинних стінок штамів, ізольованих від пацієнтів з хірургічною патологією, які находились на лікуванні в хірургічному відділенні Луганської міської багатопрофільної лікарні № 1 у червні-серпні 2006 р. Використовували робочі концентрації ПГН та ЛПС 100 та 200 мг/л. В якості показників референтної норми були прийняті показники інтактних клітин (які не контактували з ПГН та ЛПС). Роботу виконували у відповідності до біоетичних норм з дотриманням відповідних законів України.

Кількість Т-хелперів/індукторів, Т-супресорів/цитотоксиків визначали цитотоксичним методом з використанням моноклональних антитіл. ПГН отримували з клітинних стінок золотавого стафілокока за методом P.K. Peterson і співавт. Приналежність ізольованих штамів до роду Staphylococcus вивчали з використанням тест-препарату «Діастаф», розробленого в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ (м. Київ). ЛПС одержували з культур паличок синього гною водно-феноловою екстракцією при 65єС. Фагоцитарну активність моноцитів вивчали чашковим методом, визначаючи фагоцитарний індекс (ФІ), фагоцитарне число (ФЧ) та індекс перетравлення (ІП). В клітинах проводили визначення: концентрацій ДК ненасичених вищих масних кислот, МДА, гідроперекисів ліпідів (ГПЛ), активності каталази та СОД. Коефіцієнт К вираховували за формулою: К=(МДА+ДК)/(каталаза+СОД). Визначення ІЛ-1в, ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП-б проводили в супернатантах моноцитів, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10. ФНП-в, ІФН-г - в супернатантах Т-хелперів/індукторів, ІЛ-2, ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП- - в супернатантах Т-супресорів/цитотоксиків. Також визначали вміст ПГЕ2, цАМФ і цГМФ, аденозинофосфатів (АМФ, АДФ, АТФ). Енергетичний заряд (ЕЗ) підраховували за формулою: ЕЗ=АТФ/(АДФ+АМФ). Визначення кількості моноцитів та лімфоцитів з маркерами апоптозу проводили методом непрямої імунної флуоресценції з використанням моноклональних антитіл CD38 та CD95.

Частину моноцитів та лімфоцитів обробляли in vitro стерильним розчином на середовищі 199 «Амізону» (концентрація препарату - 0,0072 г/л). Час контакту клітин з препаратами складав 4 години.

Характер виявлених змін був проаналізований з використанням варіаційної статистики на ЕОМ.

Результати дослідження та їх аналіз. Вплив ПГН та ЛПС на фагоцитарну активність моноцитів. Інкубація клітин з 100 мг/л ПГН сприяла зниженню ФІ порівняно з нормою у 1,64 рази, ФЧ - у 1,43 рази, ІП - у 1,24 рази (р0,05 в усіх випадках). Вплив на моноцити 200 мг/л ПГН викликав зниження ФІ проти норми у 2,42 рази, ФЧ та ІП - у 2,13 та у 1,82 рази відповідно. ФІ після обробки клітин 100 мг/л ЛПС виявився у 2,13 рази нижчим норми, і у 1,3 рази нижчим показника при використанні 100 мг/л ПГН (р0,05 в обох випадках). ФЧ знизився проти норми у 2,23 рази, а ІП - у 1,57 рази, а також виявились, відповідно, у 1,56 та у 1,27 рази нижчими показників використанні 100 мг/л ПГН. В досліді з 200 мг/л ЛПС кратність зниження ФІ проти норми склала 3,14 рази, ФЧ - 3,96 рази, ІП - 2,09 рази. ФІ у досліді з 200 мг/л ЛПС виявився у 1,47 рази нижчим, ніж при використанні 100 мг/л ЛПС, а також у 1,3 рази нижчим, ніж при впливі 200 мг/л ПГН (р0,05 у всіх випадках). Аналогічні зміни зареєстровані і відносно ФЧ та ІП.

Вплив ПГН та ЛПС на секреторну активність моноцитів. При інкубації клітин з 100 мг/л ПГН кратність збільшення секреції ІЛ-1в склала 19,83 рази, ІЛ-6 - 13,72 рази, ІЛ-8 - 12,63 рази, ФНП- - 16,22 рази, ПГЕ2 - 11,26 рази проти норми. При збільшенні дози ПГН до 200 мг/л кратність секреції ІЛ-1в зросла проти норми у 51,3 рази, ІЛ-6 - у 30,94 рази, ІЛ-8 - у 21,08 рази, ФНП- - у 41,04 рази, ПГЕ2 - у 23,37 рази. Інкубація з 100 мг/л ЛПС сприяла посиленню секреції ІЛ-1в у 27,4 рази проти норми, ІЛ-6 - у18,23 рази, ІЛ-8 - у 15,41 рази, ФНП- - у 25,61 рази, ПГЕ2 - у 23,84 рази. При впливі 200 мг/л ЛПС кратність збільшення секреції ІЛ-1в склала проти норми 67,0 разів, ІЛ-6 - 37,47 рази, ІЛ-8 - 28,51 рази, ФНП- та ПГЕ2 - 58,43 та 45,3 рази відповідно. Рівні медіаторів у досліді з 200 мг/л ЛПС виявились вірогідно вищими таких у досліді з 200 мг/л ПГН.

Вплив ПГН та ЛПС на ПОЛ та систему АОЗ моноцитів. Обробка 100 мг/л ПГН супроводжувалась збільшенням вмісту ДК у 1,42 рази проти норми, МДА - у 1,57 рази, ГПЛ - у 1,35 рази; обробка 200 мг/л - збільшенням, відповідно, в 2,11, 2,06 та 1,86 рази (р0,05 у всіх випадках). Вплив 100 мг/л ПГН супроводжувався зниженням активності каталази проти норми у 1,3 рази, СОД - у 1,24 рази, а вплив 200 мг/л ПГН - у 1,64 та 1,59 рази (р0,05 у всіх випадках). Використання 100 мг/л ЛПС супроводжувалось збільшенням вмісту ДК у 1,68 рази, МДА - у 1,73 рази, ГПЛ - у 1,59 рази проти норми; дія 200 мг/л ЛПС - відповідно, у 2,56, 2,41 та у 2,23 рази (р0,05 у всіх випадках). Культивування з 100 мг/л ЛПС призводило до зниження активності каталази проти норми у 1,38 рази, а СОД - у 1,43 рази, а взаємодія з 200 мг/л ЛПС - у 1,88 та в 1,97 рази (р0,05 в обох випадках).

Вплив ПГН та ЛПС на систему аденілових та циклічних нуклеотидів моноцитів. При дії 100 мг/л ПГН ЕЗ зменшувався у 1,42 рази (р0,05), а коефіцієнт цАМФ/цГМФ збільшувався у 2,21 рази проти норми (р0,05). Вплив 200 мг/л ПГН викликав зниження ЕЗ у 1,83 рази (р0,05) та збільшення коефіцієнта цАМФ/цГМФ у 3,26 рази (р0,001) проти норми. Взаємодія з 100 мг/л ЛПС викликала зменшення ЕЗ у 1,58 рази проти норми, але він вірогідно не відрізнявся від показника при використанні 100 мг/л ПГН. Під впливом 100 мг/л ЛПС коефіцієнт цАМФ/цГМФ збільшився проти показника в досліді з 100 мг/л ПГН у 1,22 рази (р0,05). У досліді з 200 мг/л коефіцієнт цАМФ/цГМФ виріс проти норми у 4,64 рази (р0,001).

Вплив ПГН та ЛПС на експресію маркерів апоптозу моноцитами. Інкубація з 100 мг/л ПГН супроводжувалась збільшенням кількості CD38+-клітин у 2,16 рази, CD95+-клітин - у 2,57 рази проти норми; інкубація з 200 мг/л ПГН - відповідно, у 7,66 та 4,83 рази (р0,05 в усіх випадках). Під впливом 100 мг/л ЛПС кількість CD38+-моноцитів збільшилась проти норми у 3,12 рази, а також була у 1,14 рази вищою, ніж у досліді з 100 мг/л ПГН. Кратність збільшення кількості CD95+-моноцитів склала проти норми 3,02 рази (р0,05). При дії 200 мг/л ЛПС питома вага CD38+-моноцитів збільшилась відносно норми у 9,15 рази, а питома вага CD95+-клітин - у 7,23 рази. Експресія CD38+-рецепторів виявилась також у 1,2 рази, а експресія СD95+-рецепторів - у 1,49 рази більш вираженою, ніж це мало місце при взаємодії моноцитів з 200 мг/л ПГН.

Вплив ПГН та ЛПС на секреторну активність Т-хелперів/індукторів. Інкубація клітин з 100 мг/л ПГН викликала посилення секреції ІЛ-2 проти норми у 11,46 рази, ІЛ-4 - у 2,74 рази, ІЛ-10 - у 7,32 рази, ФНП-в - у 13,05 рази, ІФН-г та ПГЕ2 - у 5,84 та у 2,17 рази (р0,05 у всіх випадках). Рівень ІЛ-2 при дії 200 мг/л ПГН збільшився проти норми у 31,94 рази, та у 2,8 рази - проти показника в досліді з 100 мг/л ПГН. Аналогічні зміни мали місце і відносно інших медіаторів. Інкубація клітин з 100 мг/л ЛПС супроводжувалась збільшенням вмісту ІЛ-2 у 16,13 рази проти норми, та у 1,41 рази - проти показника в досліді з 100 мг/л ПГН (р0,05 в обох випадках). Рівень ІЛ-4 перевищив норму у 3,14 рази, а показник при дії 100 мг/л - в 1,15 рази; ІЛ-10 - в 9,06 та 1,24 рази, ФНП-в - 17,26 та 1,32 рази, ІФН-г - 10,3 та 1,77 рази, ПГЕ2 - 2,58 та 1,19 рази (р0,05 у всіх випадках). Найбільші рівні секреції медіаторів зареєстровані при використанні 200 мг/л ЛПС.

Вплив ПГН та ЛПС на ПОЛ та систему АОЗ Т-хелперів/індукторів. Інкубація клітин з 100 мг/л ПГН супроводжувалась збільшенням вмісту ДК у 1,34 рази, МДА - у 1,46 рази, ГПЛ - у 1,28 рази проти норми (р0,05). Дія 200 мг/л ПГН викликала збільшення ДК проти норми у 1,95 рази, МДА - у 1,88 рази, ГПЛ - у 1,59 рази (р0,05 в усіх випадках). Під впливом 100 мг/л ПГН активність каталази в клітинах знизилась проти норми у 1,23 рази, СОД - у 1,19 рази, під впливом 200 мг/л ПГН - в 1,55 та 1,47 рази (р0,05 в усіх випадках). Під дією 100 мг/л ЛПС вміст ДК збільшився у 1,52 рази проти норми, МДА - у 1,65 рази, ГПЛ - в 1,48 рази; під впливом 200 мг/л ЛПС - відповідно, у 2,49, 2,11 та 1,96 рази (р0,05 у всіх випадках). Використання 100 мг/л ЛПС викликало зниження активності каталази проти норми у 1,29 рази, СОД - у 1,36 рази; 200 мг/л ЛПС - в 1,91 та 1,78 рази.

Вплив ПГН та ЛПС на систему аденілових та циклічних нуклеотидів Т-хелперів/індукторів. Обробка 100 мг/л ПГН супроводжувалась зниженням ЕЗ у 1,5 рази (р0,05); обробка 200 мг/л ПГН - у 2,32 рази проти норми (р0,05), що було в 1,55 рази нижче, ніж показник у досліді з 100 мг/л ПГН. Обробка клітин 100 мг/л ПГН призводила до збільшення коефіцієнта цАМФ/цГМФ у 1,95 рази проти норми, обробка 200 мг/л - у 3,0 рази, та проти показника у дослідах з 100 мг/л ПГН - у 1,52 рази (р0,05 в усіх випадках).

Інкубація з 100 мг/л ЛПС супроводжувалась зниженням ЕЗ проти норми у 1,86 рази, та у 1,25 рази - проти показника у досліді з 100 мг/л ПГН (р0,05 в обох випадках). В досліді з 200 мг/л ЛПС ЕЗ був нижчим норми у 2,75 рази, та у 1,19 рази нижчим, ніж це мало місце в досліді з 200 мг/л ПГН (р0,05 в обох випадках). Інкубація з 100 мг/л ЛПС викликала збільшення коефіцієнту цАМФ/цГМФ у 2,72 рази проти норми, та в 1,39 рази - проти показника в досліді з 100 мг/л ПГН (р0,05 в обох випадках). Дія 200 мг/л ЛПС викликала збільшення коефіцієнту цАМФ/цГМФ у 4,48 рази проти норми, і в 1,51 рази - проти показника у досліді з 200 мг/л ПГН (р0,05 у всіх випадках).

Вплив ПГН та ЛПС на експресію маркерів апоптозу Т-хелперами/індукторами. Обробка 100 мг/л ПГН призводила до збільшення кількості CD38+-клітин у 2,91 рази проти норми, а CD95+-клітин - у 2,33 рази; обробка 200 мг/л ПГН - у 6,48 та у 4,13 рази (р0,05 в усіх випадках). Під впливом 100 мг/л ЛПС рівень CD38+-клітин виявився у 3,6 рази вищим норми, а рівень CD95+-клітин - у 2,96 рази. Інкубація клітин з 200 мг/л ЛПС сприяла збільшенню кількості CD38+-лімфоцитів у 7,8 рази проти норми, а CD95+-клітин - у 6,44 рази (р0,05 в обох випадках). Абсолютні рівні CD38+- та CD95+-клітин були вірогідно вищими таких в дослідах з 100 та 200 мг/л ПГН.

Вплив ПГН та ЛПС на секреторну активність Т-супресорів/цитотоксиків. На вплив 100 мг/л ПГН клітини відповідали посиленням секреції медіаторів, з яких найбільш інтенсивно продукували ФНП-, ІЛ-6 та ІЛ-8. Збільшення дози ПГН до 200 мг/л викликало збільшення рівня ФНП- у 24,37 рази проти норми, а проти показника у досліді з 100 мг/л ПГН - у 1,87 рази. Рівень ІЛ-6 виявився у 23,64 рази вищим норми, та у 2,14 рази вищим, ніж рівень у досліді з 100 мг/л ПГН. Секреція ІЛ-8 збільшилась проти норми у 19,15 рази, ІЛ-12 - в 16,13 рази, ПГЕ2 - в 5,18 рази (р0,05 у всіх випадках). Обробка клітин 100 мг/л ЛПС викликала активацію секреції ІЛ-2, ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП- та ПГЕ2 більш значно, ніж у досліді з 100 мг/л ПГН. Збільшення дози ЛПС до 200 мг/л сприяло збільшенню секреції ФНП- проти норми у 37,11 рази, ІЛ-6 - у 32,94 рази, ІЛ-8 - у 28,09 рази, ІЛ-2 та ПГЕ2 - в 25,61 та 7,84 рази відповідно.

Вплив ПГН та ЛПС на ПОЛ та систему АОЗ Т-супресорів/цитотоксиків. Інкубація з 100 мг/л ПГН викликала збільшення ДК у 1,31 рази, МДА - у 1,44 рази, ГПЛ - у 1,22 рази проти норми; інкубація з 200 мг/л ПГН - відповідно, у 1,88, 1,91 та 1,48 рази (р0,05 в усіх випадках). Активність каталази в досліді з 100 мг/л ПГН знизилась у 1,18 рази проти норми, СОД - в 1,38 рази; в досліді з 200 мг/л ПГН в 1,46 та 1,38 рази (р0,05 в усіх випадках).

Під впливом 100 мг/л ЛПС вміст ДК збільшився проти норми в 1,45 рази, МДА - у 1,58 рази, ГПЛ - в 1,41 рази. Використання 200 мг/л ЛПС супроводжувалось збільшенням вмісту ДК проти норми у 2,27 рази, МДА - у 2,04 рази, ГПЛ - в 1,85 рази (р0,05 у всіх випадках). Під впливом 100 мг/л ЛПС активність каталази знижувалась у 1,24 рази, СОД - в 1,29 рази проти норми; під впливом 200 мг/л ЛПС - в 1,82 та 1,57 рази.

Вплив на ПГН та ЛПС систему аденілових та циклічних нуклеотидів Т-супресорів/цитотоксиків. В досліді з 100 мг/л ПГН ЕЗ знизився проти норми в 1,38 рази, а коефіцієнт цАМФ/цГМФ збільшився в 1,51 рази; в досліді з 200 мг/л ПГН ЕЗ знизився в 2,0 рази, а коефіцієнт цАМФ/цГМФ збільшився у 2,17 рази (р0,05 у всіх випадках). Використання 100 мг/л ЛПС призводило до зниження ЕЗ проти норми в 1,74 рази; 200 мг/л ЛПС - в 2,4 рази (р0,05 в обох випадках). Контакт клітин з 100 мг/л ЛПС супроводжувався збільшенням коефіцієнту цАМФ/цГМФ в 1,86 рази проти норми; а з 200 мг/л ЛПС - в 2,9 рази, та в 1,35 рази - проти показника в досліді з 200 мг/л ПГН.

Вплив ПГН та ЛПС на експресію маркерів апоптозу Т-супресорами/цитотоксиками. Під впливом 100 мг/л ПГН питома вага CD38+клітин збільшувалась в 1,63 рази, а CD95+-клітин - в 1,48 рази; під впливом 200 мг/л ПГН - в 2,33 та 1,95 рази (р0,05 в усіх випадках).

ЛПС в дозі 100 мг/л викликали збільшення кількості CD38+-клітин в 1,97 рази проти норми, а CD95+-клітин - в 1,78 рази, що було вірогідно вище показників в досліді з 100 мг/л ПГН. Використання 200 мг/л ЛПС призводило до збільшення рівня CD38+-клітин в 3,17 рази проти норми, а CD95+-клітин - в 2,46 рази (кратність перевищення показників в досліді з 200 мг/л ПГН - 1,36 та 1,26 рази відповідно, р0,05 в обох випадках).

Вплив «Амізону» на фагоцитарну активність моноцитів, підданих дії ПГН та ЛПС. ФІ моноцитів, інкубованих з розчином «Амізону» та підданих впливу 100 мг/л ПГН, виявився у 1,45 рази вищим, ніж у досліді без «Амізону», але в присутності 100 мг/л ПГН (р0,05), та в 1,3 рази нижчим норми (р>0,05). При дії 200 мг/л ПГН ФІ збільшився в 1,39 рази (р0,05) порівняно з показником в досліді без використання «Амізону», та знизився порівняно нормою в 1,74 рази (проти 2,42 рази в досліді без використання «Амізону»). Аналогічні зміни зареєстровані також відносно ФЧ та ІП. Позитивний вплив «Амізону» на фагоцитарну активність був зареєстрований також в дослідах з 100 та 200 мг/л ЛПС. Однак показники фагоцитарної активності в досліді з «Амізоном» та ЛПС були нижчими таких в дослідах з «Амізоном» та ПГН в аналогічних дозуваннях.

Вплив «Амізону» на секреторну активність моноцитів, підданих дії ПГН та ЛПС. При обробці моноцитів «Амізоном» з стимуляцією 100 мг/л ПГН секреція ІЛ-1в знижувалась в 2,15 рази порівняно з показником клітин, які не контактували з «Амізоном» (р0,001), ІЛ-6 - у 2,22 рази, ІЛ-8 - у 2,09 рази, ФНП- та ПГЕ2 - у 2,05 та 2,04 рази (р0,05 у всіх випадках). Але показники секреції під впливом «Амізону» залишались вищими норми (р0,001 у всіх випадках). Вплив 200 мг/л ПГН на клітини, інкубовані з розчином «Амізону», супроводжувався зниженням секреції ІЛ-1в в 2,13 рази порівняно до рівня в досліді тільки з використанням ПГН, ІЛ-6 - в 2,1 рази, ІЛ-8 - в 1,92 рази, ФНП- та ПГЕ2 - у 1,78 та 1,83 рази (р0,05 у всіх випадках). Але рівні секреції, незважаючи на вплив «Амізону», суттєво перевищували норму. Пригнічення секреторної активності моноцитів під впливом «Амізону» спостерігали також і в дослідах з ЛПС (найбільше - в досліді з концентрацією 100 мг/л). Порівняння ефекту «Амізону» в дослідах з 100 та 200 мг/л ПГН та ЛПС показало, що пригнічення секреції медіаторів «Амізоном» було більш значним в дослідах з ПГН.

Вплив «Амізону» на ПОЛ та систему АОЗ моноцитів, підданих дії ПГН та ЛПС. Коефіцієнт К в досліді з «Амізоном» при дії 100 мг/л ПГН залишався нижчим показника для клітин, які з «Амізоном» не контактували, в 1,41 рази; при дії 200 мг/л ПГН - в 1,37 рази (р0,05 в обох випадках). Коефіцієнт К в досліді з «Амізоном» та 100 мг/л ЛПС виявився в 1,33 рази нижчим показника клітин, які контактували лише з 100 мг/л ЛПС (р0,05), але залишався в 1,77 рази вищим норми (р0,05). Під впливом «Амізону» та 200 мг/л ЛПС коефіцієнт К знизився в 1,37 рази проти показника для моноцитів, які контактували тільки з 200 мг/л ЛПС.

Вплив «Амізону» на систему аденілових та циклічних нуклеотидів моноцитів, підданих дії ПГН та ЛПС. Обробка розчином «Амізону» моноцитів з наступним впливом 100 мг/л ПГН сприяла збільшенню ЕЗ в 1,35 рази (р0,01) порівняно з ЕЗ клітин, які контактували лише з 100 мг/л ПГН, що, однак, не мало вірогідних розбіжностей з нормою. Коефіцієнт цАМФ/цГМФ клітин, підданих впливу «Амізону» та 100 мг/л ПГН, виявився в 1,41 рази нижчим такого клітин, підданих дії тільки ПГН, а також перевищував норму в 1,57 рази, проти 2,21 рази в групі співставлення (р0,05 в усіх випадках). Вплив 200 мг/л ПГН супроводжувався збільшенням ЕЗ клітин, які контактували з «Амізоном», в 1,34 рази (р0,01) проти ЕЗ моноцитів, які контактували лише з ПГН. Показник цАМФ/цГМФ зберігався на рівні, який був в 1,37 рази нижчим.

Після впливу «Амізону» обробка 100 мг/л ЛПС сприяла збільшенню ЕЗ в 1,36 рази порівняно з показником клітин, оброблених лише 100 мг/л ЛПС (р0,01). Коефіцієнт цАМФ/цГМФ в моноцитах, оброблених «Амізоном» та 100 мг/л ЛПС, перевищив в 1,37 рази показник групи порівняння (р0,01). ЕЗ моноцитів, які були оброблені «Амізоном» та 200 мг/л ЛПС, перевищив ЕЗ клітин, оброблених лише ЛПС, в 1,34 рази (р0,01). Коефіцієнт цАМФ/цГМФ знизився в 1,36 рази проти показника моноцитів, які контактували тільки з 200 мг/л ЛПС (р0,01).

Вплив «Амізону» на експресію маркерів апоптозу моноцитами, підданими дії ПГН та ЛПС. Експресія CD38-рецепторів на мембранах моноцитів, оброблених «Амізоном» та стимульованих 100 мг/л ПГН, знизилась проти показника клітин, які контактували тільки з 100 мг/л ПГН, в 1,23 рази, експресія CD95-рецепторів - в 1,3 рази (р0,05 в обох випадках). При дії 200 мг/л ПГН експресія CD38- та CD95-рецепторів на моноцитах, оброблених розчином «Амізону», зменшилась проти показників клітин, оброблених лише ПГН, в 1,26 та в 1,23 рази (р0,05 в обох випадках).

На моноцитах, підданих впливу «Амізону» та 100 мг/л ЛПС, експресія CD38- та CD95-рецепторів виявилась нижчою в 1,25 рази в обох випадках, а при використанні ЛПС в дозі 200 мг/л - в 1,22 та в 1,24 рази (р0,05 в усіх випадках).

Вплив «Амізону» на секреторну активність Т-хелперів/індукторів, підданих дії ПГН та ЛПС. При обробці клітин «Амізоном» з стимуляцією 100 мг/л ПГН секреція ІЛ-2 знижувалась в 2,02 рази порівняно з показником клітин, які не контактували з «Амізоном» (р0,001), ІЛ-4 - в 1,32 рази, ІЛ-10 - в 1,75 рази, ФНП-в та ПГЕ2 - в 1,82 та 1,26 рази (р0,05 у всіх випадках). Однак повного пригнічення секреції медіаторів під впливом «Амізону» не відбувалось. Дія 200 мг/л ПГН на клітини, інкубовані з «Амізоном», мала прояв у зниженні секреції ІЛ-2 в 1,86 рази проти рівня в досліді з використанням тільки 200 мг/л ПГН, ІЛ-4 - в 1,2 рази, ІЛ-10 - в 1,155 рази, ФНП-в та ПГЕ2 - в 2,31 та 1,27 рази (р0,05 у всіх випадках). Однак рівні секреції медіаторів, незважаючи на вплив «Амізону», суттєво перевищували показники норми.

Найбільше пригнічення секреторної активності під впливом «Амізону» спостерігали в дослідах з 100 мг/л ЛПС. Порівняння ефекту «Амізону» в дослідах з 100 та 200 мг/л ПГН та ЛПС показало, що пригнічення секреції медіаторів «Амізоном» було більш значним в дослідах з ПГН.

Вплив «Амізону» на ПОЛ та систему АОЗ Т-хелперів/індукторів, підданих дії ПГН та ЛПС. Коефіцієнт К в досліді з «Амізоном» та 100 мг/л ПГН виявився в 1,43 рази нижчим (р0,05), а в досліді з «Амізоном» та 200 мг/л ПГН - в 1,38 рази нижчим показника клітин, які з «Амізоном» не контактували (р0,05 в обох випадках). Однак значення коефіцієнту К залишались вищими норми (р0,05). Аналіз коефіцієнту К в досліді з «Амізоном» та 100 і 200 мг/л ЛПС показав, що під впливом «Амізону» дисбаланс в системі ПОЛ/АОЗ ставав менш значним порівняно з таким в клітинах, які не контактували з «Амізоном», але коефіцієнт К залишався вищим норми (р0,05).

Вплив «Амізону» на систему аденілових та циклічних нуклеотидів Т-хелперів/індукторів, підданих дії ПГН та ЛПС. Обробка «Амізоном» клітин з наступним впливом 100 та 200 мг/л ПГН сприяла збільшенню ЕЗ в 1,34 рази в обох випадках (р0,05) порівняно з ЕЗ клітин, які контактували тільки з ПГН. Обробка розчином «Амізону» з наступним впливом 100 мг/л ПГН сприяла зниженню коефіцієнту цАМФ/цГМФ в 1,33 рази проти показника клітин, підданих дії тільки ПГН (р0,05). В клітинах, на які діяли «Амізоном» та 200 мг/л ПГН, показник цАМФ/цГМФ зберігався на рівні, в 1,14 рази нижчому показника клітин, підданих дії тільки ПГН.

Після впливу «Амізону» обробка клітин 100 мг/л ЛПС сприяла зниженню ЕЗ в 1,39 рази проти норми (р0,05), обробка 200 мг/л ЛПС - збільшенню ЕЗ в 1,33 рази (р0,01) проти показника клітин, оброблених лише ЛПС. Коефіцієнт цАМФ/цГМФ в клітинах, оброблених «Амізоном» та 100 і 200 мг/л ЛПС, виявився в 1,38 та в 1,37 рази вищим показника в групі порівняння (р0,01).

Вплив «Амізону» на експресію маркерів апоптозу Т-хелперами/індукторами, підданими дії ПГН та ЛПС. Експресія CD38-рецепторів на мембранах клітин, оброблених «Амізоном» та стимульованих 100 мг/л ПГН, знизилась проти показника клітин, які контактували винятково з 100 мг/л ПГН, в 1,18 рази, CD95-рецепторів - в 1,25 рази (р0,05 в обох випадках). При дії 200 мг/л ПГН експресія CD38- та CD95-рецепторів на клітинах, оброблених розчином «Амізону», зменшилась проти показників клітин, оброблених лише ПГН, в 1,27 та 1,21 рази (р0,05 в обох випадках).

На клітинах, підданих впливу «Амізону» та 100 мг/л ЛПС, експресія CD38- та CD95-рецепторів виявилась нижчою в 1,23 та в 1,18 рази, а оброблених 200 мг/л ЛПС - в 1,23 та 1,34 рази (р0,05 в усіх випадках). Абсолютні значення показників експресії клітин, оброблених «Амізоном» та ЛПС, перевищували норму.

Вплив «Амізону» на секреторну активність Т-супресорів/цитотоксиків, підданих дії ПГН та ЛПС. При обробці клітин розчином «Амізону» з наступною стимуляцією 100 мг/л ПГН секреція ІЛ-2 знижувалась в 1,86 рази порівняно з показником клітин, які не контактували з «Амізоном»; ІЛ-6 - в 2,34 рази, ІЛ-8 - в 2,21 рази, ФНП- та ПГЕ2 - в 2,04 та 1,66 рази (р0,05 у всіх випадках). Вплив 200 мг/л ПГН на клітини, попередньо інкубовані з розчином «Амізону», супроводжувався зниженням секреції ІЛ-2 в 1,86 рази порівняно до рівня в досліді з використанням тільки 200 мг/л ПГН, ІЛ-6 - в 1,76 рази, ІЛ-8 - в 1,25 рази, ФНП- та ПГЕ2 - в 2,04 та 1,35 рази (р0,05 у всіх випадках). Але повного пригнічення секреції під впливом «Амізону» не відбувалось.

Пригнічення секреторної активності клітин під впливом «Амізону» спостерігали також і в дослідах з ЛПС. Як і у випадку з ПГН, найбільше пригнічення секреції реєстрували в досліді з 100 мг/л ЛПС.

Вплив «Амізону» на ПОЛ та систему АОЗ Т-супресорів/цитотоксиків, підданих дії ПГН та ЛПС. Коефіцієнт К в досліді з «Амізоном» та 100 мг/л ПГН виявився нижчим показника для клітин, які з «Амізоном» не контактували, в 1,43 рази, а в досліді з «Амізоном» та 200 мг/л ПГН - в 1,57 рази порівняно з показником клітин, які з «Амізоном» не контактували (р0,05 в обох випадках).

Значення коефіцієнту К в досліді з «Амізоном» та 100 мг/л ЛПС було нижчим в 1,37 рази показника клітин, які контактували лише з ЛПС (р0,05), але залишалось в 1,37 рази вищим норми (р0,05). Під впливом «Амізону» та 200 мг/л ЛПС коефіцієнт К знизився в 1,36 рази показника для клітин, які контактували тільки з 200 мг/л ЛПС.

Вплив «Амізону» на систему аденілових та циклічних нуклеотидів Т-супресорів/цитотоксиків, підданих дії ПГН та ЛПС. Обробка розчином «Амізону» з наступним впливом 100 мг/л ПГН сприяла збільшенню ЕЗ в 1,29 рази (р0,05) порівняно з ЕЗ клітин, які контактували з 100 мг/л ПГН, але не були оброблені «Амізоном». Вплив на клітини, оброблені «Амізоном», розчином 200 мг/л ПГН супроводжувався збільшенням ЕЗ в 1,3 рази (р0,05). Обробка клітин розчином «Амізону» при наступному впливі 100 мг/л ПГН сприяла зменшенню коефіцієнту цАМФ/цГМФ в 1,32 рази проти такого клітин, підданих дії тільки ПГН; при впливі 200 мг/л ПГН - в 1,25 рази (р0,05 в обох випадках).

Після впливу «Амізону» обробка клітин 100 мг/л ЛПС сприяла збільшенню ЕЗ в 1,19 рази порівняно з показником клітин, оброблених лише 100 мг/л ЛПС (р0,01), але його значення залишалось нижчим норми в 1,47 рази (р0,05). При обробці клітин 200 мг/л ЛПС додатково до попередньої інкубації з «Амізоном» спостерігали збільшення ЕЗ в 1,3 рази (р0,01). Коефіцієнт цАМФ/цГМФ в клітинах, оброблених «Амізоном» та 100 мг/л ЛПС, виявився в 1,13 рази нижчим показника в групі порівняння; при обробці 200 мг/л ЛПС - в 1,21 рази (р0,01 в обох випадках).

Вплив «Амізону» на експресію CD38- та СD95-рецепторів Т-супресорами/цитотоксиками, підданими дії ПГН та ЛПС. Експресія CD38-рецепторів на мембранах клітин, оброблених «Амізоном» та стимульованих 100 мг/л ПГН, знизилась в 1,25 рази (р0,05) проти показника клітин, які контактували винятково з 100 мг/л ПГН; CD95-рецепторів - в 1,19 рази (р0,05). Зі збільшенням концентрації ПГН до 200 мг/л експресія CD38- та CD95-рецепторів на клітинах, оброблених розчином «Амізону», зменшилась, відповідно, проти показників клітин, оброблених лише ПГН, в 1,18 та в 1,19 рази (р0,05 в обох випадках). На клітинах, підданих впливу «Амізону» та 100 мг/л ЛПС, експресія CD38- та CD95-рецепторів виявилась нижчою норми в 1,99 та в 1,51 рази, тоді як при використанні ЛПС в дозі 200 мг/л - в 2,71 та в 2,1 рази відповідно (р0,05 в усіх випадках).

Висновки

У дисертації викладені результати вивчення in vitro впливу ПГН та ЛПС бактерій на функціональну, секреторну, метаболічну активність та апоптоз моноцитів, Т-хелперів/індукторів та Т-супресорів/цитотоксиків периферійної крові людини, та запропонований метод усунення порушень, які виникають, шляхом використання препарату «Амізон».

ПГН та ЛПС in vitro в концентраціях 100 та 200 мг/л пригнічують фагоцитарну активність моноцитів та стимулюють секрецію ними ІЛ-1в, ІЛ-6, ІЛ-8, ФНП- та ПГЕ2. Найбільш виразно впливають на фагоцитоз та секреторну функцію моноцитів ЛПС в дозі 200 мг/л.