Морфолого-культуральні ознаки, екологія та практичне значення бактерій Bacillus anthracis

Размещено на http://allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

КАФЕДРА БІОТЕХНОЛОГІЇ І МІКРОБІОЛОГІЇ

КУРСОВА РОБОТА

з дисципліни «Біологія клітин»

на тему: Морфолого-культуральні ознаки, екологія та практичне значення бактерій Bacillus anthracis

Студентки I курсу 2 групи

напряму підготовки «Біотехнологія»

Гордієнко В. В.

Керівник доцент кафедри біотехнології та мікробіології,

кандидат технічних наук Волошина І. М.

м. Київ - 2014 рік



ЗМІСТ

ВСТУП

РОЗДІЛ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРІЙ Bacillus anthracis

1.1 Морфологічні та фізіологічні ознаки

1.2 Культуральні ознаки

1.3 Антигенна структура

1.4 Ферментативні властивості

1.5 Резистентність

1.6 Токсиноутворення

РОЗДІЛ 2. ЕКОЛОГІЯ Bacillus anthracis

2.1 Патогенність для тварин

2.2 Патогенез захворювання в людини

РОЗДІЛ 3. ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ Bacillus anthracis

3.1 Виготовлення протисибіркової вакцини

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ



ВСТУП

Bacillus - рід грампозитивних паличкоподібних спорогенних бактерій. Більшість видів є хвороботворними (Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus), деякі належать до нормальної мікрофлори людини.

Є штами, що використовуються як пробіотики, виконуючі роль активних речовин деяких ліків та БАДів (Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans).

Ряд штамів бацил використовується в тваринництві, птахівництві, для профілактики і лікування захворювань шлунково-кишкового тракту, бактеріальної етіології, дизбактеріоза, легеневих інфекцій, збільшення продуктивності, отримання здорового потомства, пригнічення росту патогенних і умовно патогенних мікроорганізмів.

У рослинництві на основі штамів бацил виробляються різні мікробіологічні препарати, що застосовуються для захисту городніх, садових, кімнатних і оранжерейних рослин від комплексу грибкових і бактеріальних хвороб.

Є бацили, які можуть ферменти (Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus), які мають важливе значення для фармацевтичної промисловості.

Bacillus anthracis - бацила, що є збудником сибірки у тварин та людини, яку Р. Кох виділив у чисту культуру в 1877 році.

Її спори дуже стійкі та зберігають життєздатність тривалий час.

Найчастіше вона зустрічається серед диких і домашніх ссавців (великої рогатої худоби, вівць, кіз, верблюдів, антилоп та інших травоїдних тварин), спричиняє захворювання людей, коли вони стикаються з інфікованими тваринами або м'ясом чи іншими тканинами інфікованих тварин, або коли спори сибірки використовуються в якості зброї біотероризму.

В промисловості використовують атенуйовані штами для виготовлення протисибіркової вакцини.

Перелік умовних позначень:

МПА - М'ясо-пептидний агар

МПБ - М'ясо-пептидний бульйон

цАМФ - Циклічний аденозинмонофосфат

БАД - Біологічно активні добавки



РОЗДІЛ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРІЇ Bacillus anthracis

1.1 Морфологічні та фізіологічні ознаки

Bacillus anthracis (antrax - вуглина) - велика грампозитивна нерухома паличка 3-10 мкм завдовжки і 1-1,5 мкм завширшки, забарвлюється всіма аніліновими барвниками, є облігатним паразитом, хемоорганотрофом та має факультативно аэробный метаболізм.

В організмі тварин і людини утворює капсулу, що містить специфічні протеїни і оточує одиноку клітину або весь ланцюжок. Капсули можуть утворюватися і при культивуванні на живильних середовищах, що містять кров, сироватку, яєчний білок або тканину мозку.

У мазках із культур на рідкому середовищі сибіркові бацили виглядають довгими ланцюжками, кінці клітин обрубані або злегка втягнуті, що надає ланцюгу форму бамбукової тростини з характерними колінчастими зчленуваннями (рис. 1.2, а).

а б

Рис. 1.2. Bacillus anthracis: а - забарвлення за Грамом; б - електронна мікроскопія спор;

Бацили сибірки у зовнішньому середовищі за несприятливих умов утворюють овальні спори (рис. 1.2, б), які розташовані в клітині центрально й не перебільшують її поперечного діаметру, дуже рефрактильні і містять дипіколінову кислоту.

В грунтах багатих гумусом, за сприятливих умов при 25-40^оС спори можуть проростати у вегетативні форми, а з настанням несприятливих умов знову перетворюватись на спори.

Спороутворення найбільш активне в присутності кисню і при температурі 30-40^оС, а при температурах вище 43^оС і нижче 15^оС припиняється. За типом дихання збудник сибірки є аеробом і факультативним анаеробом, для якого оптимальна температура росту 37-38^оС, крайні границі 12 і 45^оС, рН 7,2-7,6.

1.2 Культуральні ознаки

До живильних середовищ невибагливий. При посіві на МПА вірулентних штамів виростають R-форми колоній із нерівними хвилястими краями, які нагадують голову медузи або лев'ячу гриву.

При посіві на МПБ на дні пробірки або флакона з'являється осад, який нагадує жмутик вати, а бульйон залишається прозорим. Невірулентні або слабковірулентні штами, що не утворюють капсулу в організмі, утворюють круглі гладенькі S-форми колоній із чітко окресленим краєм.

При переході з R-форми в S-форму бацили сибірки втрачають здатність розташовуватись у мазках ланцюжками; утворюються кокоподібні, диплобацилярні форми або скупчення бацил. При посіві на МПА з пеніциліном сибіркові бацили втрачають клітинну стінку, фрагментуються на кульки і нагадують намисто («перлинне намисто»). Культивування про температурі 42,5^оС зумовлює утворення ниткоподібних, слабко вірулентних форм, які не утворюють спор [1].



1.3 Антигенна структура

Сибіркові бацили мають білковий (капсульний) антиген, який міститься в капсулі, що зумовлює анти фагоцитарну активність, і полісахаридний (соматичний) антиген, розташований в клітинній стінці. Соматичний антиген, що складаеться з б-глюкозаміну, галактози і залишків оцтової кислоти, термостійкий. Його можна виявити за допомогою реакції термопреципітації за Асколі.

З досліджуваного матеріалу кап'ятінням добувають екстракт, що містить полісахаридну (термостійку) фракцію, який при додаванні до преципітуючої протисибіркової сироватки утворює кільце преципітації. Капсула містить протеїноподібну речовину поліпептид, до складу якого входить полі глутамінова кислота.

При розмноженні в організмі, а також на середовищі з плазмою й екстрактами з тканин збудники утворюють протективний антиген, що являє собою атоксичний термолабільний протеїн, має імуногенні властивості та індукує продукцію неповних антитіл. Гаптен - антиген, який спричиняє вироблення неповних антитіл.

1.4 Ферментативні властивості

Bасillus anthracis містить ферменти - дегідразу, ліпазу, амілазу, пероксидазу, каталазу. При посіві уколом у стовпчик желатини ріст нагадує ялинку, перекинуту вниз верхівкою, при чому желатина розріджується на окремі шари. Збудник сибірки повільно розріджує зсілу сироватку, утворює аміак, сірководень, поступово відновлює нітрати в нітрити, зсідає і пептонізує молоко, ферментує з утворенням кислоти глюкозу, сахарозу, мальтозу й інші вуглеводи.



1.5 Резистентність

Бацили сибірки в запаяних ампулах зберігаються до 40, а спори - до 65 років. Потрапивши в грунт, утворюють дуже стійкі спори, які зберігають життєздатність протягом кількох десятиріч. Вони стійкі проти дії дезінфікуючих речовин.

Широко вживані дезінфектанти викликають їх загибель лише через декілька годин.

Вегетативні форми при температурі 55 ^оС гинуть за 40 хвилин, при кип'ятінні - за 1-2 хвилини.

Спори термостійкі, витримують кип'ятіння протягом 15-20 хвилин, від стерилізації парою при 110^оС гинуть протягом 5-10 хвилин, при дії на них 1% розчином формаліну і 10% розчином їдкого натру руйнуються через 2 години. При дослідженні гниючих трупів можна досить часто виявити порожні капсули (тіні) мікроорганізмів, позбавлені цитоплазми [4].

1.6 Токсиноутворення

В. anthracis при культивуванні на напівсинтетичному рідкому середовищі виділяє в культуральну рідину протеїновий комплекс екзотоксину, який складається з трьох компонентів та має структуру типу

A1-B-A2,

де В - це субодиниця, що бере участь у зв'язуванні токсину з рецептором, звана протективним антигеном, яку використовують для імунізації проти B. anthracis,

А1 і А2 - ферментативні субодиниці, що проявляють різну ензиматичну (токсичну) активність в клітині господаря, одна з яких - набряковий токсин (кальмодулінзалежна аденілатциклаза), що індукує утворення вторинних месенджерів (цАМФ) та викликає некроз і набряк шкіри у гвінейських свинок; інша - летальний токсин («мишачий токсин»), що є цинк-зв'язуючим білком металопротеазою і спричиняє смерть білих мишей.

Введення чутливим тваринам будь-якої з цих субодиниць окремо, не приводило ні до яких патологічних наслідків.

Внутрішньошкірне введення комбінації В-субодиниці і набрякового фактора, призводило до розвитку шкірних набряків у морських свинок і кроликів.

Суміш В-субодиниці і летального фактора при внутрішньовенному введенні викликала загибель мишей і щурів, але не давала утворення набряків. Розвиток сибірковиразкової інтоксикації передбачає обов'язкову участь всіх трьох компонентів сибірковиразкового токсину [5].

мікробіологічний спорогенний бактерія сибірка



РОЗДІЛ 2. ЕКОЛОГІЯ Bacillus anthracis

Природнім середовищем існування для сибіркових бацил є вологий ґрунт в річкових долинах та болотній місцевості, в якому вони розмножуються та довгий час зберігаються у формі спор. Грунт інфікується через потрапляння в нього екскрементів хворих тварин та в результаті захоронення трупів інфікованих. Поширення в природі відбувається шляхом перенесення вітром, комахами, тваринами спор B. anthracis. Найбільша активність бацил спостерігається при підвищеній вологості в період із серпня до вересня. Потрапляючи до організму тварини чи людини спори проростають та зосереджуються в селезінці, кровоносних судинах [7].

2.1 Патогенність для тварин

До сибіркової виразки сприйнятливі вівці, кози, велика рогата худоба, буйволи, коні, осли, олені, верблюди, менш сприйнятливі свині; хворіють також дикі копитні тварини. У них сибірка характеризується септицемією, серозно-геморагічною інфільтрацією підшкірної і субсерозної сполучної тканини. Як фактор передачі збудника сибіркової бацили особливо небезпечний труп тварини, що є джерелом зараження навколишнього середовища, головним чином ґрунту.

Висока стійкість спор збудника у зовнішньому середовищі призводить до того , що заражені ділянки ґрунту десятки років небезпечні для травоїдних. Основний шлях зараження тварин - з кормом і водою, частіше на пасовищі. Можливе проникнення збудника через пошкоджену шкіру, слизову оболонку рота, кон'юнктиву. Перехворілі тварини набувають тривалий і стійкий імунітет [4].



2.2 Патогенез захворювання в людини

Патогенні властивості збудника сибірки зумовлюють токсини і капсульна речовина, яка пригнічує фагоцитарну реакцію організму. Вхідними воротами інфекції є шкіра (95-98 %) слизові оболонки верхніх дихальних шляхів і кишечника. Інкубаційний період триває від 2 до 14 днів [1]. Шляхом зараження є вдихання спор, вживання в їжу м'яса померлих тварин, яке не піддавалося достатній термічній обробці, контакт із хворими тваринами через предмети та вироби із зараженої сировини (кожухи, рукавиці, шапки, пензлі для гоління тощо).

Однак, хворий не може інфікувати інших людей навколо себе. Щоб захворіти на сибірку, людині потрібен прямий контакт з її збудником в інкапсульованій формі (тобто зі спорами). Тому, на відміну від багатьох інших особливо небезпечних захворювань, сибірка не може викликати епідемії, які викликають неконтрольовані спалахи інфекції. При шкірній формі уражаються відкриті ділянки: щоки, лоб, шия, кисті, передпліччя. На місці проникнення збудника виникає карбункул із щільним чорним струпом (нагадує вуглинку), навколо якого виникають вторинні пухирчики з великою кількістю сибіркових бацил.

Легенева форма має перебіг тяжкої бронхопневмонії. Кишкова форма супроводжується блюванням, кровавим проносом і тяжкою інтоксикацією організму. Обидві генералізовані форми, як правило, закінчуються смертю [6]. У перехворілих на сибірку виникає стійкий, напружений імунітет. Він зумовлений антитілами проти протективного антигена й опсонінами, які сприяють знешкодженню сибіркових бацил фагоцитами. Поряд із цим в організмі виникає стан підвищеної чутливості, який виявляється при постановці алергічної проби з антраксином [1].



РОЗДІЛ 3. ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ Bacillus anthracis

3.1 Виготовлення протисибіркової вакцини

Вакцина проти сибірки відноситься до групи живих вакцин - біологічних препаратів, виготовлених з живих бактерій або вірусів із пониженою вірулентністю, але вираженими імуногенними властивостями. Вони нездатні в звичайних умовах викликати захворювання, але слабкий інфекційний процес при цьому має місце. Тому живі вакцини, як найбільш ефективні препарати для щеплення, індукують довготривалий і напружений поствакцинальний імунітет.

Для виготовлення живих вакцин використовують методи зниження вірулентності (атенуацію) бактерій, створюючи несприятливі умови культивування. Виготовлення протисибіркової вакцини проводиться на основі селекціонованого Н. Н. Гінсбурга атенуйованого штаму СТІ-1, який втратив протеолітичну активність і здатність утворювати капсулу як на поживних середовищах, так і в організмі тих, кому зробили щеплення. Виробничі культури штаму СТІ-1 зберігаються в ліофілізованому стані. Перед використанням культуру готують шляхом посіву на агар Хоттінгера, який інкубують протягом 4 діб.

Потім мікробів змивають з агару розчином гліцерину, отриману суспензію зі спорами після перевірки на чистоту, відсутність здатності до капсулоутворення, нешкідливість для кроликів, а також імуногенність для морських свинок використовують як посівний матеріал, який можна зберігати при 4-6°С протягом 6 місяців. У процесі виробництва вакцини спочатку цю суспензію засівають на бульйон Хоттінгера в бутлях, які інкубують протягом 1 доби при 33-34°С, вивчають ряд властивостей , що підлягають обов'язковій перевірці, і лише після цього пересівають на поживний агар, який інкубують посівом вгору протягом 4 діб при 33-34°С. Потім, упевнившись в чистоті культури шляхом бактеріоскопії мазків і наявності 80% спор, видаляють внесений при посіві бульйон і конденсат, мікробів змивають з поверхні агару 15-20 мл стерильної дистильованої води за допомогою 10-15 скляних бус для гомогенізації суспензії. Рідина, якою змивали, зливають в бутлі і після підрахунку числа спор в одиниці об'єму суспензію розводять до 10 млрд. спор в 1 мл, розливають по ампулам і ліофілізують [3]. Протисибіркову вакцину отримують ще зі штаму 55-ВНИИВВиМ, який культивують в рідкому живильному середовищі, що містить органічне джерело азоту, до максимального утворення спор і концентрування спорової культури з використанням допоміжної речовини з подальшим відстоюванням суміші і відділенням осаду, який відрізняється тим, що, з метою збільшення виходу кількості спор з одиниці живильного середовища, скорочення трудомісткості способу, матеріальних витрат і часу на отримання і концентрування спорового матеріалу, штам 55-ВНИИВВиМ культивують на живильному середовищі, що містить дріжджовий екстракт сухий, пептон, калій фосфорнокислий двозаміщений, хлористий кальцій, сірчанокислий магній, сірчанокислий цинк, сірчанокислу мідь, сірчанокисле залізо, сірчанокислий амоній при наступному співвідношенні компонентів, мас:

1) дріжджовий екстракт сухий - 0,2-0,3;

2) пептон ферментативний сухий - 0,2-0,3;

3) калій фосфорнокислий двозаміщений - 0,04-0,06;

4) хлористий кальцій - 0,004-0,006;

5) сірчанокислий магній - 0,03-0,05;

6) сірчанокислий цинк - 0,0005-0,0015;

7) сірчанокисла мідь - 0,0005-0,0015;

8) сірчанокисле залізо - 0,00005-0,00015;

9) сірчанокислий амоній - 0,15-0,25; 10) Вода демінералізована (pН 7,2) - решта [2].



ВИСНОВКИ

1. В ході огляду літературних даних встановлено, що бактерії Bacillus anthracis - грампозитивна, нерухома, факультативно анаеробна паличкоподібна бактерія роду Bacillus, родини Bacillaceae, порядку Bacillales, класу Bacilli, типу Firmicutes, царства Бактерии, домену Прокаріоти.

2. Bacillus anthracis живе у ґрунті та формує дуже стійкі ендоспори, які можуть зберігати життєздатність десятки років.

3. Бактерії Bacillus anthracis спричиняють захворювання на сибірку в тварин і людини - гостру бактерійну хворобу, яка найчастіше перебігає з локальним ураженням шкіри і лімфатичної системи.

4. У промисловості певні штами Bacillus anthracis використовують для виготовлення протисибіркової вакцини.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Мікробіологія, вірусологія, імунологія / І. О. Ситник, С. І. Климнюк, М. С. Творко. - Т.: Укр-медкнига, 1998. - 319 - 322 с.

2. Пат. № 2095409 РФ, С12R1/07, C12N1/20. Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных / В. А. Гаврилов, Ю. В. Числов, Л. Ф. Николайчук. - Опубл. 27.08.2001.

3. Пат. № 2115433 РФ, МПК⁶ A61K39/07, A61K39/40. Вакцина сибиреязвенная комбинированная / М.В. Супотницкий, Г.Д. Елагин, Н.В. Литусов та ін. - Опубл. 20.07.1998.

4. Пяткін К. Д., Кривошеїн Ю. С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. - 4-е изд. / Пер. З рос. В. В. Клінченка. - К.: Вища шк.., 1992. - 256 - 262 с.

5. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. -- М.: 2005. - 346 - 348 с.

6. Chandler A. Oregon Health Autority // The article of anthrax. - 2012. - V. 26. - P. 34 - 35.

7. Koch, R., Untersuchungen ьber Bakterien: V. Die Дtiologie der Milzbrand-Krankheit, begrьndet auf die Entwicklungsgeschichte des Bacillus anthracis. - Breslau: Cohns Beitrage zur Biologie der Pflanzen, 1876. - V. 2. - P. 277 - 310.

Размещено на Allbest.ru