Брожение -- это внутренний окислительно-восстановительный процесс, при котором акцептором электронов служит органическая молекула и суммарная степень окисления образующихся продуктов, отличается от степени окисления сбраживаемого вещества. С.П. Костычев выдвинул положение о генетической связи процессов брожения и дыхания. При этом он опирался на следующие факты:

1. У высших растений был найден весь набор ферментов, который катализирует отдельные этапы процесса брожения.

2. При временном попадании в условия анаэробиоза высшие растения определенное время существуют за счет энергии, выделяющейся в процессе брожения. Правда, поскольку процесс брожения энергетически значительно менее эффективен, в анаэробных условиях рост растений приостанавливается. Кроме того, продукты брожения, в частности спирт, ядовиты, и их накопление приводит к гибели растения.

3. При добавлении к клеткам факультативных анаэробов (дрожжи) полусброженных Сахаров интенсивность дыхания у них резко возрастает, следовательно, полусброженные продукты являются лучшим субстратом дыхания по сравнению с неизмененными сахарами.

В настоящее время общепризнано, что первые этапы (гликолиз) протекают одинаково при процессах, как дыхания, так и брожения. Поворотным моментом является образование пировиноградной кислоты. В аэробных условиях пировиноградная кислота распадается до С0₂ и воды в результате декарбоксилирования и цикла Кребса (дыхание), тогда как в анаэробных она преобразуется в различные органические соединения (брожение). Организм обладает способностью при изменении условий переключать процессы, прекращая брожение и усиливая дыхание и наоборот. Впервые в опытах Пастера было показано, что в присутствии кислорода процесс брожения у дрожжей тормозится и заменяется процессом дыхания. Одновременно резко сокращается распад глюкозы. Сокращение расхода глюкозы в присутствии кислорода целесообразно, поскольку при дыхательном распаде выход энергии значительно выше, а следовательно, глюкоза используется более экономно. Однако осуществление разбираемого эффекта требует специальных механизмов, которые будут рассмотрены далее. В зависимости от получаемого продукта различают разные типы брожения. При спиртовом брожении пировиноградная кислота, образовавшаяся в процессе гликолиза, декарбоксилируется с образованием уксусного альдегида при участии фермента пируватдекарбоксилазы, а затем восстанавливается до этилового спирта ферментом алкогольдегидрогеназой:

Обе эти реакции не сопровождаются образованием АТФ. В связи с этим выход АТФ при спиртовом брожении такой же, как при гликолизе (первой фазы брожения и дыхания), и составляет две молекулы при распаде 1 моль глюкозы. Восстановленные никотинамидные коферменты НАДН + Н⁺, образовавшиеся в процессе гликолиза, не поступают в дыхательную цепь (у анаэробных организмов ее и нет), а используются для восстановления уксусного альдегида до спирта. Следовательно, энергетический выход процессов брожения крайне низок. Разные микроорганизмы осуществляют и разные типы брожения. Так, молочнокислые бактерии накапливают молочную кислоту. При этом пировиноградная кислота восстанавливается до молочной кислоты:

Для некоторых облигатных анаэробных микроорганизмов, например азотфиксирующей бактерии Clostridium pasteurianum, характерно образование в процессе брожения масляной кислоты, С0₂ и N₂. Процесс брожения служит источником энергии для облигатных (обязательных) или факультативных анаэробных организмов. Обе эти реакции не сопровождаются образованием АТФ. В связи с этим выход АТФ при спиртовом брожении такой же, как при гликолизе (первой фазы брожения и дыхания), и составляет две молекулы при распаде 1 моль глюкозы. Восстановленные никотинамидные коферменты НАДН + Н⁺, образовавшиеся в процессе гликолиза, не поступают в дыхательную цепь (у анаэробных организмов ее и нет), а используются для восстановления уксусного альдегида до спирта. Следовательно, энергетический выход процессов брожения крайне низок. Разные микроорганизмы осуществляют и разные типы брожения. Так, молочнокислые бактерии накапливают молочную кислоту. При этом пировиноградная кислота восстанавливается до молочной кислоты: Для некоторых облигатных анаэробных микроорганизмов, например азотфиксирующей бактерии Clostridium pasteurianum, характерно образование в процессе брожения масляной кислоты, С0₂ и N₂. Процесс брожения служит источником энергии для облигатных (обязательных) или факультативных анаэробных организмов.

Включение пировиноградной кислоты в цикл Кребса (цикл ди- и трикарбоновых кислот).

Цикл тракарбоновых кислот, цикл Кребса, путь последовательных окислительных превращений ди- и трикарбоновых кислот -- продуктов распада углеводов, белков, жиров.

Открыт X. Кребсом и У.Джонсоном (1937). Осуществляется в митохондриях клеток. Начинается с окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и заканчивается образованием щавелевоуксусной кислоты, С02 и восстановлением коферментов никотина-мидных и флавиновых дегидрогеназ. Пировиноградная кислота, образующаяся при гликолизе в реакциях переаминирования, занимает одно из центральных мест в обмене веществ, является исходным соединением для образования ацетил-коэнзима А. Лимонная кислота синтезируется с использованием энергии ацетил-коэнзима А. В дальнейшем при окислении пирувата (1 мол.) и в последующих реакциях образуются 4 моля НАДН, 1 моль ФАДН2 и 3 моля С02. Непосредственная энергетич. эффективность процессов невелика и определяется образованием богатого энергией гуанозинтрифосфата (ГТФ) на отрезке ОС-кетоглутаровая -- фумаровая кислоты. Восстановленные эквиваленты вовлекаются в процесс окислительного фосфорилирования (участвуют ферменты дыхательной цепи) с образованием 15 макро-эргич. связей, заключенных в аденозинтрифосфате (АТФ).

Большинство органических кислот виноградного растения являются продуктами превращений циклов, т. к. Однако их суммарное количество (27) свидетельствует о наличии в винограде других метаболических путей -- глиоксалатного, гликолитического, шикиматного; цис-аконитовая и щавелевоянтарная кислоты в винограде не обнаружены. Винная кислота связана с циклом через щавелевоуксусную кислоту; яблочная кислота синтезируется непосредственно в цикле. С помощью Ц. т. к. осуществляется окисление не только продуктов обмена углеводов, но и жиров (производные ацетил-Ко А), белков. Реакция дальнейшего аминирования и переаминирования кетокислот с образованием аминокислот -- основной путь синтеза органических материала в клетке.

Цикл Кребса играет исключительно важную роль и в жизнедеятельности винных дрожжей. В анаэробных условиях дрожжи осуществляют спиртовое брожение, практически не размножаясь. В присутствии кислорода они переключаются с брожения на дыхание при этом пировиноградная кислота включается в цикл, в результате чего дрожжевые клетки получают необходимую для размножения энергию, а а-кетоглутаровая и щавелевоуксусная кислоты используются непосредственно для синтеза др. компонентов. В аэробных условиях циклах т. к. является основным источником энергии для дрожжей, по нему идет окончательное окисление продуктов обмена. Последующее окислительное фосфорилирование протекает в винных дрожжах по механизму, сходному с высшими организмами; дыхательная цепь содержит дегидрогеназы, флавопротеиды, убихинон, цитрохромы. Отличительной особенностью винных дрожжей является наличие митохондриальной НАД -- зависимой алкогольде-гидрогеназы, катализирующей окисление этанола помимо алкогольде-гидрогеназ I и И, локализованных в цитоплазме.

№87 Биохимические и биологические процессы, происходящие при главном брожении сусла

При главном брожении сусла протекают биологические, биохимические и физико-химические процессы, которые обусловливают формирование состава молодого пива.

Биологические процессы. К ним относится процесс размножения дрожжей. Способность дрожжей к размножению, т. е. к увеличению числа их клеток, зависит от состава питательных веществ в сусле, температуры, рН среды, доступа кислорода и др.

Размножение дрожжей при сбраживании пивного сусла проходит четыре основные фазы:

-Латентную, когда клетки приспосабливаются к среде и видимые признаки размножения дрожжей отсутствуют;

-Логарифмическую, характеризующуюся интенсивным размножением при некотором отставании прироста биомассы дрожжей;

-Стационарную, в которой размножение дрожжей замедляется и количество клеток остается без изменений;

-Затухания, характеризующуюся снижением активности размножения клеток, что обусловлено уменьшением массы питательных веществ и увеличением количества продуктов обмена.

Размножение дрожжей прекращается, мертвые клетки оседают на дно бродильного аппарата. Количество дрожжевых клеток в конце брожения увеличивается в 2.. .5 раз.

Биохимические процессы. К ним относится спиртовое брожение, представляющее собой цепь ферментативных процессов, конечным результатом которых является распад глюкозы с образованием этилового спирта и диоксида углерода, высвобождение энергии и теплоты. Вместе с тем эта энергия необходима дрожжевой клетке для образования новых тканевых веществ, используемых для жизнедеятельности, в том числе для роста и размножения.

Спиртовое брожение -- каталитический процесс, происходящий под действием биологических катализаторов -- ферментов. Этот сложный непрерывный процесс распада сахара катализируется разными ферментами с образованием 12 промежуточных продуктов. Углеводы сбраживаются в определенной последовательности, обусловленной скоростью их проникновения в дрожжевую клетку. Вначале сбраживаются глюкоза и фруктоза. Сахароза предварительно гидролизуется ферментом в-фруктофуранозидазой дрожжей до глюкозы и фруктозы, которые расходуются дрожжами еще в начале брожения. Когда в сусле почти не остается фруктозы и глюкозы, дрожжи начинают потреблять мальтозу. В среднем в 100 мл 12%-ного сусла содержится около 7,8 г сбраживаемых сахаров. Из них приходится, например, 14% на глюкозу и фруктозу, 4% на сахарозу, 64% на мальтозу и 18% на мальтотриозу (триозы). Из этих видов сахаров сначала сбраживаются моносахариды и ди-сахариды. Триозы сбраживаются большей частью во время дображивания, и от интенсивности протекания этого процесса зависит степень сбраживания готового пива.

При ферментативном распаде углеводов в качестве побочных продуктов брожения в небольших количествах образуются высшие спирты, сложные эфиры, альдегиды и их производные, органические кислоты, а также соединения, содержащие серу. Эти вещества имеют значение для аромата и вкуса пива.

Высокая температура брожения, интенсивная аэрация и перемешивание сусла обусловливают высокую концентрацию спиртов, а брожение под давлением снижает их образование. При низком содержании а-аминокислот в сусле увеличивается концентрация высших спиртов. Те же закономерности действуют при образовании сложных эфиров.

Содержание альдегидов при ускорении брожения несколько понижается. Увеличение содержания четырехуглеродных соединений -- ацетоина, диацетила, 2,3-бутиленгликоля -- находится в прямой зависимости от повышения температуры брожения, нормы введения дрожжей и количества кислорода.

В процессе главного брожения образуются органические кислоты -- уксусная, молочная, янтарная, муравьиная, пировиноградная, лимонная, яблочная и др.

К летучим относят уксусную и муравьиную кислоты, образующиеся в результате расщепления глюкозы. Образование уксусной кислоты усиливается при увеличении нормы введения дрожжей, повышении температуры и интенсивной аэрации. В пиве может содержаться 20… 150 мг/л уксусной кислоты, 20…40 мг/л муравьиной.

Нелетучие кислоты -- пировиноградная, янтарная, лимонная, молочная -- образуются как продукт обмена дрожжей при брожении, а также при дезаминироваиии аминокислот. В пиве может находиться пировиноградной кислоты 40…75 мг/л, янтарной в среднем 60…100, молочной 20…120 и лимонной 110…120 мг/л.

В течение трех-четырех дней главного брожения образуются как продукты обмена дрожжей карбоновые (жирные) кислоты: капроновая, каприловая, каприновая и лауриновая.

При ускоренном брожении содержание этих кислот понижается, а в случае автолиза дрожжей возрастает. Эти кислоты могут отрицательно влиять на вкус и пеностойкость готового пива. В процессе брожения образуется 1300.. .2000 мг/л глицерина. При высокой температуре брожения и массовой доле сухих веществ в сусле, а также повышенной норме введения дрожжей накапливается наибольшее количество глицерина.

Содержание азотистых веществ при брожении уменьшается примерно на 30%. В молодом пиве, приготовленном только из солода, содержится около 650 мг/л азотистых веществ. Из них почти 25…45% -- аминокислоты и пептиды, которые ассимилируются дрожжами. Количество ассимилируемого дрожжами низкомолекулярного азота зависит от штамма дрожжей, способа брожения, аэрации сусла и т. п. Ассимиляция азота, уменьшение его общего содержания являются условием для размножения дрожжей при брожении и образования веществ, создающих аромат пива. В процессе брожения происходит выделение дрожжами до 33% ассимилированного азота, который придает пиву бархатистую консистенцию и полноту вкуса. Кроме того, вследствие понижения рН сусла при брожении выделяется высокомолекулярный азот и изменяется степень дисперсности отдельных его фракций.

Минеральные вещества, особенно фосфаты, имеют значение для процессов обмена веществ. Зола охмеленного сусла обычно составляет около 2100 мг/л, во время главного брожения количество ее уменьшается приблизительно на 200 мг/л, причем уменьшение почти 50% происходит за счет фосфатов. Вследствие этого изменяются также соотношения буферности и кислотности в пиве.

При брожении происходит сдвиг рН в кислую сторону на значение, которое составляет около 1, т. е. от 5,2…5,7 до 4,35…4,65. Изменяется рН в результате действия кислот, возникающих как вторичные продукты обмена веществ в дрожжах, а также удаления фосфатов и ассимиляции аммиака из аминокислот. Количество и скорость образования кислот зависят от состава сусла, штамма дрожжей и режима брожения.

Пылевидные дрожжи оказывают более быстрое воздействие, чем хлопьевидные, на понижение рН. При повышенной норме введения дрожжей (25…30 млн клеток в 1 мл) ускоряются снижение рН и осаждение гумми-веществ. Верховое брожение также вызывает быстрое понижение рН.

В результате понижения рН изменяется растворимость некоторых веществ во время брожения, поэтому выделяются меланоидины, полифенолы и горькие вещества.

В процессе брожения на поверхности сусла появляются пузырьки диоксида углерода, которые доставляют горькие вещества в завитки пены или адсорбируются на поверхности дрожжевых клеток. При этом возможно уменьшение количества горьких веществ до 35%: а-кислоты, а вместе с ними часть изо-а-кислот и гулупоны выпадают в осадок.

При интенсификации процесса брожения наблюдается увеличение потерь горьких кислот. Однако их потери уменьшаются на 10…20% при брожении под давлением и в цилиндроконических аппаратах.

Уменьшение содержания полифенолов, а из них в большей степени антоцианогенов (20…30%), способствует повышению коллоидной стойкости пива.

Цветность молодого пива меньше, чем начального сусла, что связано с удалением меланоидинов, полифенолов и других красящих веществ вместе с декой, дрожжами и осадком.