Поліморфізм фрагментів ДНК та особливості геномної організації деяких ссавців і дводольних рослин

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

ПОЛІМОРФІЗМ ФРАГМЕНТІВ ДНК ТА ОСОБЛИВОСТІ ГЕНОМНОЇ ОРГАНІЗАЦІЇ ДЕЯКИХ ВИДІВ ССАВЦІВ І ДВОДОЛЬНИХ РОСЛИН

03.00.15 - генетика

ТРЯПІЦИНА Наталія Василівна

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті агроекології Української Академії аграрних наук

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, професор

Глазко Валерій Іванович

Завідувач відділу радіоекології Інституту агроекології УААН

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, професор

Димань Тетяна Миколаївна

Білоцерківський аграрний університет,

завідувач кафедри екотрофології

кандидат біологічних наук, Балацький Віктор Миколайович,

Інститут свинарства УААН, завідувач лабораторії генетики

Провідна установа: Київський національний аграрний університет

при Кабінеті Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться 11 травня 2006 р. об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.371.01 Інституту агроекології УААН за адресою: 03143, м.Київ, вул. Метрологічна,12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології УААН за адресою: м. Київ, вул..Метрологічна,12.

Автореферат розіслано 11 квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат хімічних наук Л.І.Моклячук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

поліморфізм успадкування мутаційний радіоактивний

Актуальність теми. При вирішенні теоретичних і прикладних завдань сільськогосподарської генетики необхідно мати високополіморфні молекулярно-генетичні маркери, які б дозволяли адекватно оцінювати рівень генетичної мінливості сільськогосподарських видів рослин і тварин а також споріднених з ними диких видів (Глазко, Созинов, 1993; Сиволап, 1998).

В останні роки стали інтенсивно використовуватися маркери, отримання яких базується на ампліфікації різних класів повторюваної ДНК, зокрема мікросателітної (ISSR-PCR-маркери) (Caetano-Annoles, 1995; Wolfe et al., 1998; Gupta et al., 1998) і транспозонної (IRAP-PCR-маркери) (Waugh et al., 1997; Kalendar et al., 1999; Leigh et al., 2003). Обидва класи маркерів є фрагментами геномної ДНК, що фланковані інвертованими повторами. Основною їх перевагою є високий рівень поліморфізму та відтворення, що робить можливими міжлабораторні порівняння. Недоліком цих маркерів є відсутність інформації про функції й хромосомну локалізацію. Це ускладнює інтерпретацію даних, які отримуються з їх використанням, оскільки не дозволяє оцінити рівень нейтральності цих маркерів до дії добору та їх універсальність для визначення генотипів рослин і тварин на всіх таксономічних рівнях. Не визначені також чіткі критерії для цілеспрямованого підбору цих маркерів для роботи з рослинними і тваринними геномами, що сприяло б ефективнішому їх використанню при паспортизації геномів, MAS-селекції, оцінці внутрішньопородньої, внутрішньосортової й внутрішньопопуляційної генетичної мінливості, вивченню генетичних наслідків впливу різних факторів добору, у тому числі стресових.

З огляду на це, розробка нових підходів до оцінки рівня інформативності молекулярно-генетичних маркерів, що базуються на використанні характеристик із фізичним і математичним змістом, і виявлення найбільш інформативних ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів для оцінки генетичної мінливості сільськогосподарських видів рослин і тварин є актуальними.

Зв'язок роботи з науковими прогамами, планами, темами. Дослідження проводилися відповідно до тематичного плану науково-дослідних робіт Інституту агроекології УААН за темою: „Теоретично обгрунтувати і розробити практичні заходи щодо екологічного використання природоресурсного потенціалу агроландшафтів з метою забезпечення сталого розвитку аграрного виробництва і покращання якості життя людини” (номер державної реєстрації 0101U003298), підпрограма „Теоретично обгрунтувати і застосувати на практиці методи сільськогосподарської біотехнології для цілеспрямованого формування сталих агросистем” (номер Державної реєстрації 0101U003296).

Мета і задачі досліджень. Метою дослідження була оцінка інформативності, універсальності та нейтральності до дії добору ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів залежно від особливостей досліджуваних геномів (сільськогосподарські види рослин і тварин та споріднені дикі види) і від характеристик локусів повторюваної ДНК, що їх фланкують (мікросателітні послідовності з ди- і тринуклеотидними субповторами та транспозонні послідовності).

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Провести порівняльний аналіз поліморфізму молекулярно-генетичних маркерів, отриманих із використанням ди- і тринуклеотидних мікросателітних праймерів у геномах ссавців (на прикладі диких і доместикованих представників підродини Bovinae) і рослин (на прикладі диких і доместикованих представників підродини Phaseoleae).

2. На підставі сімейного аналізу дослідити поліморфізм, успадкування і нейтральність до дії факторів добору ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів, а також оцінити можливі мутаційні події в поколіннях групи великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового радіоактивного випромінювання.

3. Оцінити універсальність ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркерів для використання в оцінці та паспортизації геномів рослин і тварин.

4. Дослідити залежність рівня поліморфізму ISSR-PCR-маркерів від композиційних і термодинамічних характеристик фланкуючих їх локусів ди- і тринуклеотидних мікросателітних послідовностей.

Об'єкт досліджень - поліморфізм молекулярно-генетичних ISSR-PCR-маркерів і IRAP-PCR-маркерів та фактори, що його визначають у доместикованих і диких представників рослин і тварин.

Предмет досліджень - геноми доместикованих та споріднених з ними диких видів рослин і тварин.

Методи досліджень. У роботі було використано загальноприйняті методики виділення й очищення рослинної і тваринної ДНК. Для отримання мультилокусних ампліфікаційних спектрів використано метод полімеразної ланцюгової реакції у двох модифікаціях (ISSR-PCR, IRAP-PCR). Для отримання електрофоретичних спектрів продуктів ампліфікації використано метод агарозного горизонтального гель-електрофорезу. Статистичну обробку результатів, кореляційний і регресійний аналіз проведено із використанням статистичних програм. Для розрахунків генетичних дистанцій (Nei, 1976) та побудови філогенетичних дендрограм використано пакет програм Phylip 3.65. Для розрахунків термодинамічних показників олігодуплексів використано програму Oligonucleotide Properties Calculator Version 3.07.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що молекулярно-генетичні маркери двох типів (ISSR-PCR- і IRAP-PCR-маркери), які раніше вважалися селекційно-нейтральними, у тварин піддаються тиску добору. Виявлено, що в ISSR-PCR- маркерів відповідь на дію добору залежить від термодинамічних характеристик мікросателітних локусів, що їх фланкують. Визначено найбільш інформативні ISSR-PCR-маркери для внутрішньопороднього та внутрішньопопуляційного типування великої рогатої худоби, а також для філогенетичного аналізу представників підродини Bovinae.

Розроблено методику оцінки внутрішньопопуляційної генетичної мінливості у ВРХ, яка ґрунтується на сімейному аналізі поліморфізму й успадкування ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів. У рослин (дикі і культурні представники підродини Phaseoleae) вперше виявлена залежність між рівнем поліморфізму ISSR-PCR-маркерів і термодинамічними характеристиками мікросателітних локусів, що їх фланкують. Показано, що ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними послідовностями з високими термодинамічними характеристиками є перспективними для визначення генотипів сої на міжвидовому рівні, а з низькими термодинамічними показниками - для оцінки генотипів сортів сої.

Розроблено новий підхід до оцінки і підбору мікросателітних праймерів при вирішенні конкретних генетичних задач, що ґрунтується на використанні композиційних і термо-динамічних характеристик олігодуплексів між праймером і матричною ДНК.

Науково-практична цінність отриманих результатів. Проведено оцінку впливу хронічного низькодозового радіактивного випромінювання на модельну групу тварин для прогнозування його наслідків на види сільськогосподарських тварин і людину. У відповідь на дію факторів екологічного стресу виявлено переважне відтворення гетерозигот у дочірньому поколінні F2 порівняно з батьківським поколінням F0 та порушення в передачі від батьків до потомків алельних варіантів певних ISSR-PCR- та IRAP-PC-локусів. Паспортизовано генотипи 13-ти сортів сої з використанням ISSR-PCR-маркерів. Виявлено найперспективніші ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркери для оцінки генетичної мінливості тварин і рослин на різних таксономічних рівнях. Розроблено метод цілеспрямованого підбору мікросателітних праймерів для вирішення ряду завдань сільськогосподарської генетики з використанням ISSR-PCR-маркерів.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на засіданнях вченої ради Інституту агроекологии і біотехнології в 2001-2005р.; на Міжнародній науково-практичній конференції „Перспективы развития животноводства в третьем тисячелетии” 2001р., м.Суми; на Міжнародній конференції ISAG (International Society for Animal Genetics) 2002 р., м. Геттінген, Німеччина; на VII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів, 2002 р. Крим; на науково-практичній конференції „Новітні методи досліджень біологічних об'єктів”, 2004 р., м. Біла Церква; на міжнародній науковій конференції „Сучасний стан і перспективи розвитку генетики сільськогосподарських тварин”, 2004 р., м. Київ.

Особистий внесок здобувача полягає в узагальненні літературних даних; розробці програми й виконанні запланованих досліджень; аналізі, інтерпретації, та підготовці результатів досліджень до публікацій і апробації; розробці методики розрахунків; форму-люванні висновків.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 наукових праць, у тому числі 4 у фахових виданнях ВАК України.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 176 сторінках комп'ютерного тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків, рекомендацій виробництву, заключення та списку використаної літератури, що містить 238 найменувань переважно зарубіжних авторів. Дисертаційна робота містить 43 таблиці, 14 рисунків, 19 фотографій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить загальні характеристики повторюваної ДНК двох класів - мікросателітної та транспозонної. Приділено увагу особливостям розповсюдження цих послідовностей у різних геномах, їх походженню, біологічному значенню та факторам, що визначають високий рівень їх поліморфізму. Розглянуто галузі застосування цих повторюваних послідовностей для отримання різних молекулярно-генетичних маркерів. Узагальнені дані щодо використання ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів для вирішення різних генетичних завдань.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом дослідження слугували рослини 4-х видів підродини Phaseoleae: Glycynia Max. (13 сортів), Glycynia soya (4 дикі усурійські популяції), Glycynia tomentella, Glycynia clandestine та тварини 4-x видів підродини Bovinae: Bison bonasus, Bison bison, Bos frontalis та Bos taurus. Останній вид був представлений зоопарковими тваринами анколє-ватусі та групою голштинізованої великої рогатої худоби, яка відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання (200 Ки/км²) в господарстві Новошепеличі. Ця група представлена 8-ма родинами, три з яких походять від корів, які перебували в цій місцевості ще до аварії 1986-го року, та 5 родин - від корів, що були завезені в господарство із поліських відносно чистих (<5Ки/км²) районів. Всі тварини, за виключенням корів покоління F0, походять від одного і того ж плідника - бугая Урана, який також переніс катастрофу в цій самій місцевості.

Таблиця 1

Вивчені види тварин і рослин

Протестовані види рослин і тварин	Кількість	Походження
Bos Taurus (голштинізована велика рогата худоба)	32	Господарство Новошепеличі
Bison bonasus (зубр)	9	Біосферний заповідник Асканія- Нова
Bison bison (бізон)	5
Bos frontalis (Bibos gauros frontalis) (гаял)	7
Bos taurus macrocerus (анколе-ватусси)	3
Glycynia Max. Cорти: Харківська, Новосибірська, Кировоградська, Колективна, Білосніжка, Іскра, Юго-западна, Скороспєлка, Барвиста, Чарівниця степу, Крепиш, Успіх, S0412, Барвиста, Крістал)	13 сортів	ВІР ім.Н.І.Вавілова, Росія
Glycynia.tomentella
Glycynia clandestine
Glycynia soya 19.95, 6/95, 83/95, 166/98, 1050/11	5 диких популяцій	ВНДІ сої, м. Благовєщенськ, Росія

Вихідним матеріалом для досліджень у тварин були зразки крові (лейкоцити), у рослин- етиольовані проростки насіння. Тваринна та рослинна ДНК виділялася за методикою із використанням СТАБ.

Отримання мультилокусних ампліфікаційних спектрів проводилося згідно Zietkiewicz et al.,1991. Умови ПЛР для динуклеотидних праймерів включали початкову денатурацію при 95єС - 2 хв. і наступних 37 циклів : 95єС - 30 сек., 55єС - 30 сек., 72єС - 2 хв. 30 сек. Кінцевий синтез 72єС - 7 хв. Для тринуклеотидних праймерів використовувалися ті ж самі умови ампліфікації, за винятком температури підпалу - 58єС. Для ПЛР із праймерами до LTR соєвого ретротранспозону SIRE-1 витримувалися наступні умови: 95С - 2 хв. Та наступні 30 циклів: 94С - 30 сек., 58С - 30 сек., 72С - 2 хв. Кінцевий синтез 72С - 7 хв.

У роботі були використані 14 мікросателітних праймерів з ди- і тринуклеотидними субповторами, що мають якірні нуклеотиди (табл.2), а також 1 сайт-специфічний праймер до довгих кінцевих повторів соєвого ретротранспозону SIRE-1 із послідовностю: 5'-GCA CTT ATG CAA GTG GGA TCA GC-3'.

Таблиця 2

Використані в роботі мікросателітні праймери

праймер	5'фланк	%GC	3'фланк
(AC)9G	5'-ACA CAC	52%	CAC ACG-3'
(GA)9C	5'-GAG AGA	52%	AGA GAC-3'
(GT)10C	5'-GTG TGT	52%	TGT GTC-3'
(CT)9G	5'-CTC TCT	52%	TCT CTG-3'
(АСС)6 G	5'-АСС ACC	68%	CCA ССG-3'
(AGC)6G	5'-AGC AGC	68%	GCA GCG-3'
(AGC)6C	5'-AGC AGC	68%	GCA GCC-3'
(AGC)6Т	5'-AGC AGC	63%	GCA GCТ-3'
(TCG)6G	5'-TCG-TCG	68%	CGT CGG-3'
(CAC)7А	5'- CAC CAC	63%	ACC АСА-3'
(CAC)7Т	5'- CAC CAC	63%	ACC АСТ-3'
GT(CAC)7	5'-GTC ACC	65%	ACC CAC-3'
(СТС)6А	5'-СТС CTC	63%	TCC ТСА-3'
(СТС)6С	5'-СТС CTC	63%	TCC ТСС-3'

Продукти ампліфікації розділяли методом электрофорезу в 2%-ному агарозном гелі з додаванням бромистого етидію і візуалізували під УФ променями. Для фотографування використовували плівку з високою роздільною здатністю Мікрат-300. Розміри фрагментів визначалися за допомогою маркеру молекулярних мас Step Ladder DNA S7025 (SIGMA).

Для обробки експериментальних даних були використані популяційно-біометричні методи, а також розроблена в дисертаційній роботі методика оцінки внутрішньопуляційної генетичної мінливості, основана на використанні сімейного аналізу поліморфізму і успад-кування ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів. При цьому припускали, що вони успадковуються згідно законів Менделя. Кожен продукт ампліфікації в спектрі розглядався як наявність домінантного алеля в окремому локусі.

Для розрахунків генетичних відстаней та побудови філогенетичних дендрограм було використано пакет програм Phylip 3.65. Термодинамічні показники олігодуплексів праймер-матрична ДНК (ДG - енергія Гибса, ДH - ентальпія, ДS - ентропія) було розраховано із використанням програми Oligonucleotide Properties Calculator Version 3.0.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Порівняльгий аналіз поліморфізму ISSR-PCR-маркерів в тваринних і рослинних геномах. За допомогою ISSR-PCR-маркерів було оцінено рівень генетичної мінливості у доместикованих і споріднених з ними диких представників тварин і рослин. Всього у 5-ти представників підродини Bovinae було виявлено 219 ISSR-PCR-локусів. Між дикими представниками підродини Bovinae і великою рогатою худобою не виявлено достовірної різниці за часткою поліморфних локусів (Р) і за часткою локусів з низькою частотою зустрічальності (ц_<0,3) в спектрах усіх праймерів. Не відзначено також достовірної різниці між дикими представниками підродини і великою рогатою худобою за рівнем середньої гетерозиготності (Hav). Це свідчить про те, що рівень генетичної мінливості, який виявляється з використанням ISSR-PCR-маркерів, у диких представників підродини Bovinae є порівняним із рівнем генетичної мінливості у великої рогатої худоби (табл.3).

Таблиця 3

Показники генетичної мінливості у підродини Bovinae, виявлені з використанням мікросателітних праймерів

Праймери	Дикі представники підродини Bovinae	ВРХ
	P	H av	ц<0,3	P	H av	ц<0,3
(AGC)6G	0,850	0,310	0,307	0,846	0,363	0,307
(AGC)6C	0,758	0,286	0,380	0,842	0,302	0,320
(AGC)6T	0,777	0,408	0,275	0,769	0,354	0,231
(ACC)6G	0,805	0,391	0,153	0,842	0,338	0,210
(TCG)6G	0,850	0,358	0,166	0,833	0,355	0,250
GT(CAC)7	0,870	0,402	0,388	0,833	0,346	0,083
(AC)9G	0,714	0,301	0,233	0,777	0,285	0,333
(GA)9C	0,777	0,341	0,250	0,777	0,288	0,277
(GT)10C	0,785	0,319	0,240	0,777	0,327	0,285
(CT)9G	0,833	0,304	0,166	0,555	0,317	0,111

Маркерні індекси (Мі) показали, що для представників підродини найбільш інформативними є спектри, отримані з використанням тринуклеотидних мікросателітних праймерів.

Серед дендрограм філогенетичних взаємовідносин, побудованих на основі розподілу алельних варіантів ISSR-PCR-локусів між проаналізованими видами підродини Bovinae, найбільшою мірою сучасним уявленням відповідала дендрограма, отримана із використанням маркерів, фланкованих тринуклеотидними мікросателітними послідовностями, що ймовірно є наслідком різної еволюційної історії відповідних мікросателітних послідовностей в геномі представників підродини. При порівнянні дендрограм, що були побудовані із урахуванням розподілу алельних варіантів ISSR-PCR-локусів, отриманих із застосуванням різних праймерів, найбільш нестабільним виявилося положення виду Bibos gauros frontalis (гаял).

За аналізу генетичної мінливості видів сої з використанням методу ISSR-PCR виявлено 109 локусів, 84 з яких виявилися поліморфними (77%). Всього у культурних сортів було виявлено 74 амплікони, а у диких представників сої - 97. Незважаючи на це, рівень генетичного поліморфізму, виявлений з використанням ISSR-PCR-маркерів, отриманих із використанням 7-ми мікросателітних праймерів, у культурних і диких представників сої достовірно не відрізнявся як ні за жодним із праймерів, так і в цілому за сумою усіх виявлених ISSR-PCR-маркерів (табл. 4).

Таблиця 4

Показники генетичної мінливості у культурних і диких представників сої

Праймер	Сорти культурної сої	Види дикої сої	ц<0,3
	P	Hav	P	Hav
(AGC)6C	0,764	0,72	0,714	0,42	0,235
(AGC)6G	0,500	0,43	0,705	0,46	0,250
(AGC)6T	0,555	0,41	0,444	0,28	0,285
(TCG)6G	0,375	0,42	0,769	0,54	0,307
(ACC)6G	0,200	0,19	0,714	0,32	0,285
(GA)9C	0,428	0,29	0,692	0,51	0,384
(AC)9G	0,785	0,57	0,500	0,37	0,268

Не було також виявлено достовірної різниці між показниками генетичної мінливості у культурних сортів і диких представників сої, отриманими окремо за допомогою ди- і тринуклеотидних праймерів, а також між маркерними індексами три- та динуклеотидних праймерів.

Аналіз ампліфікаційних фрагментів у спектрах ампліфікації за їх молекулярною масою дав змогу виявити істотну різницю між ампліфікаційними спектрами великої рогатої худоби та диких представників підродини Bovinae. В спектрах диких тварин частка ампліконів з високою (більше 2000 пн.) та низькою молекулярною масою (до 1000 пн) істотно перевищувала відповідний показник у спектрах великої рогатої худоби (р<0,05). Відповідно, в спектрах великої рогатої худоби вищою була частка ампліконів із середньою (від 1000 пн до 2000 пн) молекулярною масою (Р<0,01). У сої основна відмінність між спектрами диких рослин і спектрами сортів спостерігалась за часткою ампліконів із високою молекулярною масою, яка у диких видів була вищою (р<0,05). В двох інших інтервалах частка ампліконів у диких і культурних рослин була порівнянною.

Аналізуючи спектри, отриманні із вкористанням окремо ди- і тринуклеотидних мікросателітних праймерів, у тварин виявлено достовірну різницю між часткою ампліконів з високою (більше 2000 пн.) та низькою (до 1000 пн) молекулярною масою (р<0,05). Зокрема, ці показники були вищими в спектрах тринуклеотидних праймерів. У рослин достовірних відмінностей між спектрами ди- та тринуклеотидних праймерів не виявлено.

Виявлено також достовірну різницю між спектрами тварин і рослин за часткою висококонсервативних локусів, які відтворювалися в спектрах у всіх вивчених видів. У рослин частка таких локусів значно нижча порівняно з тваринами (р<0,01). Це може свідчити про істотніші структурні відмінності між геномами диких і культурних рослин, ніж між геномами диких і доместикованих тварин, що, ймовірно, може бути пов'язаним із насиченням геному культурної сої повторюваними послідовностями, яке може супроводжувати доместикацію рослин. У тварин і у рослин серед висококонсервативних локусів спостерігали як моно-, так і поліморфні. Як у рослин, так і у тварин між спектрами, отриманими окремо з використанням ди- та тринуклеотидних праймерів, за показником частки висококонсервативних локусів достовірних відмінностей не виявлено.

Оцінка рівня селективної нейтральності ISSR-PCR та IRAP-PCR маркерів. З метою оцінки селективної нейтральності ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів виконано дослідження з виявлення генотоксичних ефектів хронічної дії низькодозового випромінювання у 3-х поколіннях модельної групи великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах радіоактивного забруднення. Проведено порівняльний аналіз поліморфізму і успадкування алельних варіантів ISSR-PCR- та IRAP-PCR-локусів. У сумі використання 11-ти мікросателітних праймерів дало змогу виявити 162 ISSR-PCR-маркери, 134 з яких були поліморфними. З урахуванням всіх виявлених маркерів між проаналізованими поколіннями тварин не було виявлено достовірної різниці за часткою поліморфних локусів (Р), хоча за деякими праймерними системами було відмічено достовірні зміни як у дочірньому поколінні F1, так і в поколінні F2. За аналізу в поколіннях рівня гетерозиготності, розрахованого на основі сімейного аналізу (Hc), виявлено достовірні зміни цього показника за 8-ма праймерними системами із 11-ти використаних (табл.5).

Таблиця 5

Динаміка зміни розрахункової гетерозиготності (Нc) між поколіннями групи досліджених тварин ( P0,05, P0,01, P0,001)

Праймер	Розрахункова гетерозиготність (Нc)
	F0	F1	F2
(AC)9G	0,174	0,253	0,428
(GA)9C	0,333	0,222	0,310
(CT)9G	0,287	0,222	0,444
(AGC)6G	0,243	0,310	0,538
(AGC)6C	0,215	0,236	0,457
(ACC)6C	0,287	0,202	0,525
(CTC)6C	0,224	0,242	0,571
(CTC)6A	0,607	0,370	0,571
(CAC)7A	0,310	0,387	0,573
(CAC)7T	0,228	0,249	0,356
GT(CAC)7	0,291	0,249	0,499

При зворотньому схрещуванні корів покоління F1 та батька (Урана) можна було б очікувати зростання інбридингу в поколінні F2. Таке схрещування має зумовлювати зростання інбридингу і зменшення гетерозиготності в поколінні F2 у порівнянні з гетерозиготністю в батьківських поколіннях (F0, F1). Однак аналіз експериментальних даних показав, що сумарно в спектрах усіх 11-ти праймерів в групі досліджених тварин виявлено достовірне збільшення розрахункової гетерозиготності в дочірньому поколінні F2 порівняно з поколіннями F0 і F1 (P0,001) (табл.6).

Таблиця 6

Розрахункова (Нс) та очікувана гетерозиготність (Hex) у поколіннях досліджуваних тварин, розраховані з використанням ISSR-PCR-маркерів ( P 0,001)

Показник	F0	F1	F2
Коефіцієнт інбридингу	0	0	0,250
Очікувана гетерозигот-ність (Hex)	0,2900,069	0,2900,069	0,2130,060
Розрахункова гетерозиготність (Нсalc)	0,2900,069	0,2670,046	0,4410,079

У F0 як очікувану гетерозиготність (Hex) розглядали сумарну розрахункову за спектрами усіх праймерів і припускали, що вона має зберегтися в поколінні F1, оскільки в цьому поколінні коефіцієнт інбридингу дорівнює 0. У поколінні F2 коефіцієнт інбридингу дорівнює 0,250 і гетерозиготність, що спостерігається, мала б зменшитися від F1 приблизно на 25 %. Однак цього не відбувається, і в поколінні F2 розрахункова гетерозиготність статистично достовірно (Р<0,001) збільшується. Таке збільшення може свідчити про ймовірне пристосувальне значення гетерозигот у популяційно-генетичній відповіді на дію низькодозового іонізуючого випромінювання. Можна очікувати, що переважне відтворення гетерозигот у F2 реалізується як на рівні предзиготичної селекції гамет, так і внаслідок ранньої ембріональної смерті гомозигот.

Аналіз поліморфізму і успадкування 162 локусів не виявив нових продуктів ампліфікації, появу яких можна було б розцінювати як мутаційну подію (рис.2). Однак у потомстві відзначалося порушення рівновірогідного розподілу алельних варіантів локусів порівняно з батьківським поколінням. Аналіз очікуваної частоти зустрічальності домінантних алелів (fex) та частоти зустрічальності домінантних алелів, що спостерігається (fob) по поколіннях у досліджуваних родинах показав, що в більшості родин (у 6-ти з 8-ми) спостерігали достовірні відмінності між цими показниками (табл.7), причому в 4-х родинах такі зміни відбувалися вже в поколінні F1 .

Таблиця 7

Очікувана частота зустрічальності домінантних алелів (fex) і частота, що спостерігається (fob) усереднена за всіма ISSR-PCR- локусами у кожній родині досліджуваної групи тварин ( P 0,05, P 0,01, P 0,001).

Родини	Покоління F1	Покоління F2
	fex	fob	fex	fob
Альфа	0,490±0,40	0,546±0,041	0,421±0,038	0,368±0,037
Бета	0,541±0,038	0,464±0,037	0,469±0,037	0,417±0,038
Гама	0,490±0,040	0,546±0,041	0,560±0,038	0,393±0,037
6803	0,474±0,038	0,428±0,038	0,452±0,035	0,324±0,035
6824	0,519±0,041	0,366±0,040	0,408±0,040	0,382±0,040
6827	0,494±0,034	0,359±0,031
6843	0,477±0,039	0,353±0,038	0,400±0,038	0,351±0,037
4789	0,524±0,041	0,509±0,041

Імовірно, що у такий спосіб в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання в групі досліджуваних тварин підтримується рівень генетичного поліморфізму, необхідний для розширення їх адаптивних можливостей. Аналогічні зміни в генетичній структурі групи тварин було виявлено із використанням IRAP-PCR-маркерів. Серед 31 виявленого локусу 25 виявилися поліморфними. За аналізу показника частки поліморфних локусів (P) по поколіннях відзначалося його достовірне зменшення (P 0,001) у поколіннях F1 і F2 у порівнянні з поколінням F0 (табл.8).

Таблиця 8

Показники, які характеризують генетичну мінливість групи ВРХ, що відтворюється в зоні відчуження Чорнобильської АЕС, розраховані з використанням IRAP-PCR-маркерів ( P 0,05, P 0,01, P 0,001).

Показник	Покоління
	F0	F1	F2
Розрахункова гетерози-готність (Hс)	0,361±0,089	0,384±0,097	0,457±0,146
Очікувана гетерозигот- ність (Hех)	0,361±0,089	0,361±0,089	0,249±0,048
Коефіцієнт інбридингу	0	0	0,25
Частка поліморфних локусів (P)	0,935±0,031	0,548±0,063	0,483±0,063

Аналіз поліморфізму і успадкування IRAP-PCR-маркерів із урахуванням коефіцієнту інбридингу показав, що, як і в описаному вище випадку для ISSR-PCR-маркерів, у F2 розрахункова гетерозиготність (Нс) статистично вірогідно (Р<0,001) перевищує очікувану (Нех), замість того, щоб зменшитися від значення в поколінні F1 приблизно на 25 %.

Таким чином, обидва класи маркерів: і ISSR-PCR-маркери, що є фрагментами геномної ДНК, фланкованими локусами інвертованих мікросателітніх повторів, і IRAP-PCR-маркери, що являють собою ділянки ДНК між специфічними інвертованими послідовностями довгих кінцевих повторів (LTRs) соєвого ретротранспозону SIRE-1, дали змогу виявити в модельній групі тварин підвищення рівня гетерозиготності в поколінні F2 проти очікуваної, відповідно до коефіцієнту інбридингу. Отже, незважаючи на те, що у всіх дочірніх поколіннях модельної групи тварин відбувається схрещування з одним і тим самим бугаєм Ураном, в ній не спостерігається збільшення гомозигот, а, отже, зниження генетичної різноманітності.

Такі зміни, з одного боку, можуть свідчити про ймовірне пристосувальне значення гетерозигот у популяційно-генетичній відповіді на хронічну дію низькодозового іонізуючого випромінювання, з іншого боку - опосередковано відзеркалювати факт утрати спеціалізації. Порушення рівновірогідного розподілу алельних варіантів локусів порівняно з батьківським поколінням F0 вже у поколінні F1 підтверджує здатність генотипу КРС до швидкої адаптаційної перебудови у відповідь на дію нового фактору добору вже на міжгенераційному рівні.

Достовірні зміни рівня гетерозиготності та відхилення від розподілу батьківських алельних варіантів локусів у дочірніх поколіннях відповідно до законів Менделя, разом свідчать про те, що обидва типи маркерів не є селективно нейтральними.

Поліморфізм сортів сої. У роботі з паспортизації 13 сортів сої було використано 7 мікросателітних праймерів. У культурної сої загалом було виявлено 74 ISSR-PCR-локуси, 39 з яких були поліморфними (Р=52,7%) (табл.9).

Таблиця 9

Характеристика поліморфних ISSR-PCR-локусів у сортів сої

Праймер	Кількість полі-морфних локусів	Розміри ампліконів (пн)	Індекси локусів
(AGC)6C	14	400 550 600 650 700 800 850 900 950 1100 1150 1500 1550 1600	A B C D E F G H I K L M N О
(AGC)6G	7	575 700 750 775 1200 1250 1700	A B C D E F G
(AGC)6T	5	350 450 550 600 1600	A B C D E
(TCG)6G	2	1400 1600	A B
(ACC)6G	1	950	A
(GA)9C	3	1400 1500 1600	A B C
(AC)9G	7	650 1200 1300 1400 1500 1600 1700	A B C D E F G

Серед 74 виявлених лише 4 локуси були сортоспецифічними, що становить лише 5,4 % від загальної кількості. У свою чергу частка локусів з низькою частотою зустрічальності у вибірці (ц_<0,3) становила серед усіх виявлених 27,0 %, що для генотипування 13 сортів вважалося недостатнім. Тому для створення формул генотипів протестованих сортів сої в даній роботі були використані усі виявлені поліморфні ISSR-PCR-локуси.

Поліморфним локусам у спектрі кожного мікросателітного праймеру в порядку зростання їх молекулярної маси присвоєні індекси, позначені літерами латинського алфавіту. Кожному використаному мікросателітному праймеру відповідно були присвоєніі порядкові номери, позначені арабськими цифрами.

Формула генотипу кожного сорту сої, таким чином, включає перелік усіх виявлених у спектрах ампліфікації ДНК цього сорту поліморфних ISSR-PCR-локусів. Після порядкового номеру праймера в круглих дужках зазначена послідовність індексів, кожний з яких відповідає певному поліморфному ISSR-PCR-локусу (табл.10).

Табл.10

Формули генотипів протестованих сортів сої, розраховані з використанням ISSR-PCR-маркерів

Сорт	Формула паспорту
Харківська	1(CFNO) 2(AE) 3(ABC) 6(AC) 7(DG)
Новосибірська	1(ABCDEGIKO) 2(B) 3(ABCD) 6(C) 7(CDEF)
Кіровоградська	1(DFHLO) 2(C) 3(A) 4(A) 6(AC) 7(CEF)
Колективна	1(DEIMN) 2(E) 6(AC) 7(ACEF)
Білосніжка	1(CDFIKM) 2(AE) 3(AE) 6(ABC) 7(BCFG)
Іскра	1(CDEGIKLO) 2(BE) 3(AD)6(ABC) 7(ADE)
Юго-Западна	1(CEMO) 2(A) 3(ADE) 6(ABC) 7(BCG)
Скороспєлка	1(CEIO) 3(CD) 5(A) 6(A) 7(CEG)
Барвиста	1(ABEMO) 2(BE) 3(E) 6(AB) 7(ACF)
S0512	1(ABDEFO) 2(E) 3(AD) 6(AC) 7(CEG)
Успіх	1(CFMN) 2(G) 3(D) 6(BC) 7(ACE)
Крєпиш	1(CEMO) 2(D) 3(D) 4(AB) 7(ACG)
Чарівниця	1(ACEFMNO) 2(AB) 3(AD) 5(A) 7(ACF)

Кількість індексів в отриманих формулах генотипів коливається від 11 у сортів Скороспілка, Крєпиш і Успіх до 19 - у сорту Новосибірська. В середньому у кожній із 13 формул враховано по 42,19 % від усіх поліморфних локусів. Для створення переважної більшості формул генотипів сортів сої використано по 5 мікросателітних праймерів із 7-ми застосованних.У культурних і у диких рослин сої рівень поліморфізму IRAP-PCR-маркерів виявився досить низьким - всього 20 %, тому ці маркери не були використані для створення формул генотипів сортів сої. Дендрограми, побудовані із урахуванням розподілу алельних варіантів усіх виявлених ISSR-PCR- та IRAP-PCR-локусів дозволили згрупувати вивчені сорти сої у 4 основні кластери.

Залежність рівня поліморфізму ISSR-PCR-маркерів від характеристик фланкуючих їх мікросателітних локусів. Проведено кореляційний аналіз між показниками генетичної мінливості, розрахованими на основі експериментальних даних у рослин і тварин, з одного боку, та термодинамічними характеристиками олігодуплексів праймер-матрична ДНК, розрахованих із використанням програми Oligonucleotide Properties Calculator Version 3.07, з іншого боку. У культурних і у диких рослин сої рівень поліморфізму ISSR-PCR-маркерів виявився залежним від термодинамічних характеристик фланкуючих їх мікросателітних локусів, що відповідають олігодуплексам між праймерними послідовностями і матричною ДНК. Для культурних рослин сої цей зв'язок між ознаками носить характер зворотньої кореляції, а для диких рослин - прямої. Іншими словами, кореляційні зв'язки між однаковими проаналізованими ознаками у рослин сої на внутрішньовидовому і на міжвидовому рівнях відрізняються знаком кореляції.

На підставі розрахованих кореляційних коефіцієнтів між виявленими достовірно пов'язаними ознаками, зокрема показником частки поліморфних локусів Р у культурних і диких рослин сої і такими термодинамічними характеристиками мікросателітних локусів, як ентальпія та ентропія (ДH і ДS), був проведений регресійний аналіз, що дозволив дістати математичний вираз залежності однієї ознаки від іншої. Були проаналізовані випадки з найвищим рівнем достовірності. У такий спосіб були розраховані коефіцієнти регресії, що дозволяють завчасно, при плануванні експерименту оцінити перспективність мікросателітних праймерів для роботи з геномною ДНК культурних і диких рослин сої. Зокрема,

Р _{j (cult)}= 2,667- 0,013 x ДH_j (1)

Р _{j (wild)}=-0,361+ 0,006 x ДH_j (2), де

Р _{j (cult)} - частка поліморфних локусів в спектрах j-го праймера для сортів сої;

Р _j(wild) - частка поліморфних локусів в спектрах j-го праймера для диких представників сої; ДH_j - зміна ентальпії при утворенні олігодуплекса j-й праймер - матрична ДНК.

Для тварин підродини Bovinae найбільш поліморфними виявилися ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами з найвищими показниками ентальпії (ДН) та ентропії (ДS). До цієї категорії серед проаналізованих належать лише тринуклеотидні мікросателітні локуси. Відповідна залежність для випадку з найвищим рівнем імовірності задається наступним співвідношенням:

Р _{j Bovinae} = - 0,026+0,462 x ДS _j (3), де

Р _{j Bovinae} - частка поліморфних локусів в спектрах j-го праймера у представників підродини Bovinae,

ДS _j - зміна ентропії (ДS) при утворенні олігодуплексу j-й праймер - матрична ДНК.

Виявлено, що як додатковий критерій добору праймерів для отримання високоінформативних ISSR-PCR-маркерів при вивченні геномів представників підродини Bovinae можна рекомендувати праймери з високими термодинамічними показниками їх 5'-фланків.

Проведено також кореляційний аналіз між значеннями середніх відхилень від очікуваного розподілу в потомстві частоти батьківських домінантних алелів (D_abs), з урахуванням зміни знака аналізованого показника, і характеристиками дуплексів праймер-матрична ДНК. Виявлено, що відхилення частоти домінантних алелів від очікуваної в поколінні F1 було тим значнішим, чим вищою або нижчою була термостабільність фланкуючих їх послідовностей. Це показує, що, по-перше, мікросателітні послідовності, які фланкують виявлені ISSR-PCR-локуси перебувають під селективним тиском добору, а по-друге, цей тиск проявляється з більшою імовірністю у відносно термостабільних мікросателітних послідовностях, та мікросателітних послідовностях із низьким рівнем термостабільності. Вираз такої залежності, отриманий із використанням регресійного аналізу, дав змогу розрахувати термодинамічні показники мікросателітних локусів, які є найбільш селективно-нейтральними. Зокрема, на рівні достовірності 95%, значення ентальпії, при яких D_{abs j} = 0, дорівнює:

ДН_j=161,8±0,084 (4)

Серед використаних в роботі праймерів оптимально відповідає цій вимозі праймер (AC)9G, а також найближчі до нього за термодинамічними характеристиками праймери: (CTC)6C, (CTC)6A, (AGC)6C, та (AGC)6G, які можуть бути рекомендовані для аналізу філогенетичних взаємовідносин в підродині Bovinae як найнейтральніші до дії добору. Для оцінки внутрішньовидової та внутрішньопопуляційної генетичної мінливості, виходячи із формул (3) та (4), доцільно використовувати ISSR-PCR-маркери, фланковані високополіморфними мікросателітними локусами із високими термодинамічними характеристиками, до яких серед проаналізованих належать послідовності із субповторами (САС) та (АСС).Встановлено, що праймери (CT)9G, (GA)9C та (AGC)6T з низькими термодинамічними характеристиками, які також є чутливими до дії добору і краще відбивають найближчу генетичну історію виду, зважуючи на низький рівень поліморфізму ISSR-PCR-маркерів, які вони фланкують, доцільно використовувати для оцінки внутрішньовидової та внутрішньопопуляційної генетичної мінливості у комплексі із більш інформативними праймерами.

ВИСНОВКИ

1. Рівень генетичної мінливості за ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерами у диких та доместикованих представників підродини Bovinae у тварин та підродини Phaseoleae у рослин є порівняним.

За ISSR-PCR- маркерами генетична мінливість і у тварин, і у рослин залежить від композиційних та термодинамічних характеристик локусів, які фланкують ці маркери.

2. Із застосуванням розробленої в дисертаційній роботі методики оцінки внутрішньопопуляційної генетичної мінливості, що ґрунтується на сімейному аналізі, вперше доведено, що ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркери, які раніше вважалися селективно-нейтральними, у тварин (велика рогата худоба) піддаються тиску добору.

3. У великої рогатої худоби тиску добору більшою мірою піддаються ISSR-PCR-маркери, які фланковані відносно термостабільними мікросателітними послідовностями (показник ентальпії ДН_j>180 ккал/моль), а також мікросателітними послідовностями із низьким рівнем термостабільності (показник ентальпії ДНj<155 ккал/моль).

4. Найбільш нейтральними до дії добору і відповідно більш інформативними для виявлення філогенетичних взаємовідносин в підродині Bovinae є ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами із середніми термодинамічними характеристиками, зокрема з показником ентальпії близьким до ДН_j=161,8±0,084 ккал/моль.

5. У великої рогатої худоби за оцінки внутрішньопопуляційної мінливості доцільно використовувати високополіморфні ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами із високими термодинамічними характеристиками (показник ентальпії ДН_j>180 ккал/моль), оскільки вони більшою мірою дозволяють оцінити найближчу генетичну історію виду.

6. В групі великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання, достовірно збільшується рівень гетерозиготності у дочірньому поколінні F2 порівняно з батьківським поколінням F0, що може свідчити про пристосувальне значення гетерозигот у популяційно-генетичній відповіді на дію низькодозового іонізуючого випромінювання.

7. З використанням ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів у дочірніх поколіннях групи великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання, не виявлено подій, які можна було б розцінювати як мутаційні.

8. За паспортизації рослинних геномів критерії підбору мікросателітних праймерів для аналізу генетичної мінливості у культурних і диких рослин сої відрізняються: для визначення генотипів сортів сої доцільно застосовувати ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами з низькими термодинамічними характеристиками (показник ентальпії ДН_j<170 ккал/моль), а для оцінки диких видів сої - відповідно ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними локусами з високими термодинамічними характеристиками (показник ентальпії ДН_j>170 ккал/моль).

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Для підтримання характеристик породи в популяціях великої рогатої худоби, що відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового випромінювання, необхідно враховувати здатність їх генотипу до швидкої адаптаційної перебудови вже на міжгенераційному рівні, що проявляється в підвищенні рівня гетерозиготності і, отже, у зниженні рівня спеціалізації породи.

2. При проведенні внутрішньопородньої та внутрішньопопуляційної оцінки генотипів великої рогатої худоби доцільно застосовувати найбільш поліморфні ISSR-PCR-маркери, фланковані мікросателітними повторами з високими термодинамічними характеристиками, зокрема мікросателітними субповторами (САС) та (АСС), що є чутливішими до дії факторів добору і краще відображають найближчу генетичну історію виду.

3. Для визначення генотипів сортів сої рекомендується застосування ISSR-PCR-маркерів, фланкованих мікросателітними повторами з низькими термодинамічними характеристиками, зокрема із субповторами (AGC).

СПИСОК НАУКОВИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тряпіцина Н.В., Глазко В.І. Використання методу ISSR-PCR для оцінки мутаційних спектрів ссавців у зоні відчуження Чорнобильської АЕС // Науковий вісник Національного аграрного університету. - Київ. - 2001. - Випуск . - С.175-182.

2. Тряпіцина Н.В., Глазко В.І. Використання методу IRAP-PCR для аналізу генетичної структури великої рогатої худоби // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Збірник наукових праць. - Біла Церква, 2005. - Вип. 31. - С. 168-175.

3.Тряпицина Н.В., Глазко В.И. Полиморфизм фрагментов ДНК, фланкированных микросателлитными локусами (ISSR-PCR) у воспроизводящегося в условиях низкодозового ионизирующего облучения крупного рогатого скота // Цитология и генетика. - 2005. - №5. - С.41-50.

4. Тряпицина Н.В., Городная А.В., Глазко В.И. Мутационная изменчивость черно-пестрой породы крупного рогатого скота, воспроизводящейся в 10-км зоне отчуждения Чернобыльской АЭС // Вісник Сумського державного аграрного університету: В сб. перспективи розвитку скотарства у третьому тисячолітті . - Суми. - 2001. - С.121-123 (визначені завдання, проведені дослідження, проаналізований матеріал, написана стаття).

5. Глазко В.И., Тряпицына Н.В. Генетическая структура черно-пестрой породы, воспроизводящейся в зоне ЧАЭС // В сб. “Труды 40-го сьезда по радиационным исследованиям”. - Москва, 2001. - с.96.

6. Tryapitcyna N.V., Glazko V.I. Cattle polymorphism revealed using ISSR-PCR at animals from 10km alienation zone of Chernobyl NPS // XXVIII International Conference on Animal Genetics (ISAG).Gottingen-Germany. - 2002. - P.138.

АНОТАЦІЯ

Тряпіцина Н.В. Поліморфізм фрагментів ДНК та особливості геномної організації деяких ссавців і дводольних рослин. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут агроекології УААН, Київ, 2006.

Роботу присвячено використанню ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів для оцінки генетичної мінливості доместикованих та споріднених з ними диких видів рослин і тварин. Виявлено залежність між рівнем поліморфізму ISSR-PCR-маркерів і термодинамічними характеристиками мікросателітних локусів, які їх фланкують. Визначено найперспективніші ISSR-PCR-маркери для філогенетичного аналізу представників підродини Bovinae та для оцінки генетичної мінливості великої рогатої худоби на внутрішньопопуляційному рівні. Показано, що ISSR-PCR-маркери, фланковані послідовностями з високими термодинамічними характеристиками, є перспективними для визначення генотипів у дикої сої, а з низькими - у сортів сої. В модельній групі великої рогатої худоби, яка відтворюється в умовах хронічної дії низькодозового радіоактивного випромінювання за використання ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркерів виявлено достовірне збільшення гетерозиготності в дочірньому поколінні F2 по відношенню до батьківського покоління F0, що свідчить про переважне відтворення гетерозигот при популяційно-генетичній адаптації до нових факторів добору. Не виявлено нових ампліфікаційних фрагментів, появу яких можна було б розцінювати як мутаційну подію. Доведено, що ISSR-PCR- та IRAP-PCR-маркери, які раніше вважалися селективно-нейтральними, у великої рогатої худоби піддаються тиску добору.

Ключові слова: молекулярно-генетичні маркери, поліморфізм, мікросателітні послідовності, транспозони, композиційні та термодинамічні характеристики ДНК.

АННОТАЦИЯ

Тряпицына Н.В. Полиморфизм фрагментов ДНК и особенности геномной организации некоторых млекопитающих и двудольных растений. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.15 - генетика.- Институт агроэкологии УААН, Киев, 2006.

Диссертационная работа посвящена проблеме использования молекулярно-генетических маркеров, получение которых основывается на использовании различных классов повторяющейся ДНК, в частности микросателлитной (ISSR-PCR-маркеры) и транспозонной (IRAP-PCR-маркеры) для возможностей генотипирования сельскохозяйственных видов животных и растений, а также для оценки генофондов близких к ним диких и условно доместицированных видов. Впервые выявлена зависимость между уровнем полиморфизма ISSR-PCR-маркеров и термодинамическими характеристиками фланкирующих их микросателлитных локусов у растений (дикие и культурные представители подсемейства Phaseoleae) и животных (дикие и доместицированные представители подсемейства Bovinae). Выявлены маркеры, наиболее перспективные для генетического типирования исследованных животных и растений на различных таксономических уровнях. В модельной группе крупного рогатого скота, воспроизводящейся в условиях хронического действия низкодозового радиоактивного излучения с использованием семейного анализа выявлены достоверные отклонения от распределения в дочерних поколениях F1 и F2 родительских аллельных вариантов ISSR-PCR- и IRAP-PCR-локусов, а также увеличение уровня гетерозиготности в дочернем поколении F2 по отношению к родительскому поколению F0, что может свидетельствовать о преимущественном воспроизведении гетерозигот как результате популяционно-генетической адаптации к действию новых факторов отбора. Обсуждается способность генотипа крупного рогатого скота к быстрой адаптационной перестройке уже на межгенерационном уровне. Показано, что молекулярно-генетические маркеры 2-х типов (ISSR-PCR- и IRAP-PCR-маркеры), которые ранее считались селективно-нейтральными, подвержены действию отбора. Установлено, что у крупного рогатого скота действие отбора на ISSR-PCR- маркеры зависит от композиционных и термодинамических характеристик фланкирующих их микросателлитных локусов. В большей степени такому действию подвержены ISSR-PCR- маркеры, фланкированные относительно термостабильными микросателлитными последовательностями, а также микросателлитными последовательностями с низкой термостабильностью. Наиболее нейтральными к действию отбора являются ISSR-PCR-маркеры, фланкированные микросателлитными последовательностями со средними термодинамическими характеристиками, в частности с показателем энтальпии, близкой к ДН_j=161,8±0,084. Протипированы 13 сортов сои. Показано, что ISSR-PCR-маркеры, фланкированные микросателлитными последовательностями с высокими термодинамическими характеристиками являются перспективными для типирования диких видов сои, а с низкими термодинамическими показателями - для генотипирования сортов сои. Между анализируемыми сортами рассчитаны генетические взаимоотношения с использованием различных сочетаний ISSR-PCR- и IRAP-PCR-маркеров. Разработан новый подход к оценке и подбору микросателлитных праймеров при решении конкретных генетических задач, который основывается на расчете композиционных и термодинамических характеристик олигодуплексов между праймерной последовательностью и матричной ДНК. Выведены формулы, позволяющие проводить предварительные оценки информативности микросателлитных праймеров для их целенаправленного подбора.

Ключевые слова: молекулярно-генетические маркеры, полиморфизм, микросателлитные последовательности, транспозоны, композиционные и термодинамические характеристики ДНК

ABSTRACT

Nathaliya Tryapitcyna. DNA-fragments polymorphism and genome organization peculiarities of some mammals and dicotyledonous plants. - Manuscript.

The thesis for PhD degree in Agriculture by speciality 03.00.15 - genetics- Institute of Agroecology of UAAS, Kyiv, 2006.

The thesis covers the problems of ISSR-PCR- and IRAP-PCR markers utilization for genetic diversity quantification of plants and animals domesticated and closely related wild species.

Correlation between ISSR-PCR-markers polymorphism level and thermodynamic characteristics of its microsatellite flank loci was found. The most suitable ISSR-PCR-markers for cattle intrapopulational genotyping as well as for phylogenetic studies of subfamily Bovinae representatives were selected. Fact, that the ISSR-PCR-markers flanked by the microsatellite loci with high thermodynamic characteristics are more suitable for wild soybean genotyping and with low one - for soybean cultivars quantification were shown. In model group of cattle reproducing under of low irradiation dose influence conditions the heterozygozity increasing in F2 generation in comparison with parental F0 generation were found. It is probably that the heterozygous animals have advantages for reproduction under new selection-factor pressure. It was not revealed new amplicons, that may be evaluated as mutational event. The non-neutrality of the ISSR-PCR- and IRAP-PCR-markers, which were considered to be neutral for the selection, was demonstrated for the cattle.

Key words: molecular-genetic markers, polymorphism, microsatellite sequences, transposones, compositional and thermodynamic DNA characteristics

Размещено на Allbest.ru