Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет

імені В.Н. Каразіна

УДК: 57.043:612.111:352.462

ВПЛИВ модифікаторів мембрани і форми ЕРИТРОЦИТІВ НА ДЕЯКІ ФУНКЦІОНАЛЬНІ

ВЛАСТИВОСТІ клітин

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Важді Кхалаф Жаміль Маданат

Харків - 2006

Анотація

Важди Кхалаф Жамиль Маданат. Вплив модифікаторів мембрани і форми еритроцитів на деякі функціональні властивості клітин- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2006

Дисертація присвячена вивченню ролі форми еритроцитів як фактора, що може визначати чутливість клітин до ушкоджуючої дії літичних пептидів - мелітина і його аналога [Ala-14]мелітина (P14A) а також стійкість до кислотного гемолізу. Також вивчалися особливості взаємодії мелітина і P14A з мембраною еритроцитів, формотрансформуючий ефект модифікаторів різної хімічної природи і вплив такої модифікації на перебіг галій-індукованої агрегації еритроцитів.

За допомогою формометра-агрегометра ФА-01 досліджено вплив ряду хімічних сполук на кінетику формотрансформації еритроцитів людини, що дозволило розташувати досліджувані речовини в ряд за їх потенціалом формотрансформуючої дії, який має такий вигляд: спермідін <гуанідін <p-CMBS <NEM <CCCP <A23187 <DNDS <DIDS <SITS <лізолецитін <Cpr <SDS <CTAB.

Показано, що вплив модифікаторів форми на стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу визначається їх здатністю впливати на іонну проникність мембран клітин. Сполуки, що інгібують проникність, є інгібіторами кислотного гемолізу, а речовини, які збільшують проникність - активаторами гемолізу. Речовини, що не впливають на проникність, незалежно від їхньої здатності змінювати форму клітин, не впливали на кислотний гемоліз еритроцитів. Встановлено, що найпотужніший вплив на галій-індуковану агрегацію мають A23187 > SDS > DIDS, які призводять до достовірної зміни дисперсності агрегатів (тобто їх розподілу за розмірами і формою).

Ключові слова: мелітин, [Ala-14]мелітин, еритроцити, гемоліз, хлорпромазин, альбумін, галій, форма, індекс форми, трансформація, агрегація.

Аннотация

Важди Кхалаф Жамиль Маданат. Влияние модификаторов мембраны и формы эритроцитов на некоторые функциональные свойства клеток - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2006

Диссертация посвящена изучению роли формы эритроцитов как фактора, который может определять чувствительность клеток к повреждающему действию литических пептидов мелітина и его аналога [Ala-14]мелітина (P14A) и устойчивость к кислотному гемолизу. Изучались также особенности взаимодействия мелітина и P14A с мембраной эритроцитов, формотрансформирующее влияние модификаторов различной химической природы и влияние такой модификации на протекание галлий-индуцируемой агрегации эритроцитов.

Показано, что гемолиз эритроцитов, индуцируемый литическим пептидом мелиттином и его аналогом P14A, зависит от структуры пептида, порядка взаимодействия между клетками и пептидами и присутствия ингибиторов, таких как двухвалентные катионы, хлорпромазин, альбумин и другие. Максимальный протектирующий эффект ингибиторов наблюдался, когда пептиды и ингибиторы действовали одновременно после помещения клеток в среду, содержащую смесь пептидов и ингибиторов. Протекция уменьшалась после эквилибрации клеток в растворе в присутствии ингибиторов. Предполагается, что этот эффект обусловлен синергичным взаимодействием между блокаторами и слабо связанными с мембраной мембранными ингибирующими компонентами (МИК), играющими роль природных блокаторов. Полученные данные показывают, что альбумин может быть отнесен к таким ингибирующим компонентам, в отличие от других ингибиторов, таких как катионы и хлорпромазин, поскольку инкубация клеток в присутствии этих агентов, в отличие от альбумина, не предотвращала увеличения чувствительности клеток к литическому действию тех же количеств пептида. Р14А обладал большей литической активностью по сравнению с мелиттином, в 3 раза большей величиной константы связывания с мембранами нативных клеток и их теней, и минимальной чувствительностью к действию ингибиторов. Хлорпромазин и альбумин специфически ингибировали гемолиз, индуцированный мелиттином, но были слабо эффективны в отношении гемолиза, индуцированного Р14А. Кроме этого, нормализированная скорость гемолиза линейно зависела от относительного количества Р14А в смеси с мелиттином и пчелиным ядом, а кривые зависимости доза-ответ для Р14А демонстрировали насыщение только тогда, когда мембранно-связанный мелиттин был ингибирован хлорпромазином. Это показывает, что мелиттин и Р14А вызывают гемолиз, действуя независимо друг от друга. В отличие от мелитина, но аналогично пчелиному яду, Р14А также уменьшал объем лизированных клеток. Нелинейные эффекты при сжатии клеток, индуцированные смесями Р14А с мелиттином и пчелиным ядом предполагают, что в основе этого явления лежит синергизм во взаимодействии между пептидами. Полученные данные показывают, что мелиттин и Р14А вызывают гемолиз посредством связывания с различными классами участков связывания на мембране эритроцитов. Таким образом, структура пептида является определяющим фактором, который в совокупности с конкретной последовательностью взаимодействия пептида с мембраной обеспечивает его литические свойства.

С помощью формометра-агрегометра ФА-01 исследовано влияние ряда химических соединений на кинетику формотрансформации эритроцитов. Установлено, что способность веществ изменять форму клеток зависит от химической природы вещества и увеличивается при увеличении его концентрации, достигая насыщения. Формотрансформирующая способность (потенциал) веществ была оценена по их способности превращать клетки в сферы и минимальной концентрации, при которой происходило максимальное кренирование клеток. Такой подход позволил получить ряд формотрансформирующей способности в следующем виде: спермидин <гуанидин <p-CMBS <NEM <CCCP <A23187 <DNDS <DIDS <SITS <лизолецитин <Cpr <SDS <CTAB.

Показано, что трехвалентные ионы галлия подобно ионам лантана вызывают агрегацию эритроцитов человека. Исследование влияния ряда модификаторов мембраны, влияющих и не влияющих на форму эритроцитов, на процесс агрегации показал, что наиболее сильным действием обладают А23187, додецилсульфат натрия и DIDS. Эти вещества достоверно изменяют дисперсность агрегатов, уменьшая их равновесный размер. Во второй, более слабой группе, находятся SITS, DNDS и CCCP, которые имеют тенденцию изменять агрегатное состояние, в третьей группе CTAB и Lyso, которые меняют только кинетические параметры агрегации и, наконец, замыкает этот ряд группа нейтральных веществ Cpr, NEM, p-CMBS, спермидин и гуанидин, которые существенно на агрегацию не влияют.

Ключевые слова: мелиттин, [Ala-14]мелиттин, эритроциты, гемолиз, хлорпромазин, альбумин, галлий, форма, индекс формы, трансформация, агрегация.

Summary

Wajdi Khalaf Jamil Madanat. Effect of erythrocyte membrane and shape modificators on some functional properties of the cells - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences by specialty 03.00.13 - physiology the man and animals.- V.N. Karazin Kharkіv National University, Kharkіv, 2006

The aim of dissertation is to clarify the role of cell shape as a factor determining susceptibility of cells toward damage action of lytic peptides melittin and its analog [Ala-14]melittin (P14A) as well as resistance toward acid hemolysis. Peculiarities of interaction of melittin and P14A with erythrocyte membrane, shape transforming action of various chemical reagents, and the effect of such modification on gallium-induced aggregation was studied as well. Using shapemeter-aggregometer SA-01 the action of number of chemicals on kinetic of shape transformation of erythrocytes was investigated and the sequence of shape transformation potential of substances was obtained in the next form: spermidine <guanidine <p-CMBS <NEM <CCCP <A23187 <DNDS <DIDS <SITS <lysolecithin <Cpr <SDS <CTAB. It has been shown that an ability of modifiers to change acid resistance of cells is attributed by their ability to affect ion permeability of membrane. The substances that able to reduce membrane permeability demonstrate inhibitory effect on acid hemolysis whereas those increasing permeability show activating one. The substances having no effect on permeability irrespective to their influence on cell shape had no effect on acid resistance of cells. Studying the effect of modifiers showed that A23187, SDS and DIDS had a maximal effect on aggregation of erythrocytes induced by gallium. These substances changed substantially dispercity of aggregates i.e. their size distribution reducing the size of aggregates.

Key words: melittin, [Ala-14]melittin, erythrocyte, hemolysis, chlorpromazine, albumin, gallium, shape, shape index, transformation, aggregation.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н.Каразіна Міністерство освіти і науки України (м. Харків).

Науковий керівник:доктор біологічних наук, професор Бондаренко Валерій Антонович, Харківський національний університет імені В.Н.Каразіна (м. Харків), завідувач кафедри фізіології людини та тварин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Субота Ніна Павлівна, Харківський національний педагогічний університет імені Г.С.Сковороди (м. Харків), завідувач кафедри валеології.

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Компанієць Антоніна Михайлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків), завідувач відділу кріопротекторів.

Провідна установа: Інститут експериментальної онкології, патології і радіобіології імені. Р.Є. Кавецького НАН України (відділ модифікаторів протипухлинної терапії), м.Київ

Захист дисертації відбудеться “25”жовиня 2006 р. о 16-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд 3-15)

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4)

Автореферат розісланий 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук В.І. Падалко

Загальна ХАРАКТЕРИСТИКА роботи

Актуальність теми. Лікарські сполуки або комплексні препарати, що застосовуються для лікування різних хвороб, часто містять в своєму складі компоненти, здатні впливати на просторову структуру мембрани і цитоскелету, об'єм і форму еритроцитів і змінювати, таким чином, гемодинаміку в мікроциркуляторному руслі. Наприклад, екстракт анжеліки може відігравати реологічно активну роль, зменшуючи осмотичну крихкість і агрегацію еритроцитів, і протидіяти факторам, що зменшують деформуємость клітин (Wang X. et al., 2004). Протилежний ефект, коли зростає осмотична крихкість і агрегація еритроцитів, може бути чинником ризику, особливо у патологічних випадках, при яких гемодинаміка має особливе значення, наприклад у випадку розвитку інфарктів і інсультів. Тому існує необхідність у розробці простих методів моніторингу змін форми еритроцитів, пов'язаних з дією на клітини лікарських сполук в умовах наближених до умов in vivo.

В нормі еритроцити, що циркулюють у руслі крові, мають форму двоувігнутих дисків. Дискоїдна форма є оптимальною з точки зору виконання еритроцитами своєї головної функції - транспорту кисня і постачання його тканинам організму. Встановлено, що морфологічна трансформація дискоцитів приводить до зменшення деформуємості клітин (La Celle P.L., Smith B.D., 1981, Reinhart W.H., Chien S., 1986), що впливає на їх функціональний стан. Еритроцити легко змінюють свою форму при взаємодії з різними мембраноактивними речовинами, що в більшості випадків зумовлено вбудовуванням речовини в зовнішній чи внутрішній моношар мембрани і зміною її поверхневої площі (Alhanaty E, Sheetz M.P. 1983, 1984, Chen J.Y. еt al., 2003). Крім цього, еритроцит є зручною моделлю для вивчення дії лікарських препаратів на різні типи клітин, оскільки в будь-якому випадку саме плазматична мембрана є первинною мішенню дії препарату на клітини.

Зважаючи на те, що просторова структура мембрани і форма еритроцитів визначаються балансом взаємодії глікокаліксу, мембрани і цитоскелету (Fujii T., 1981, Reinhart W.H. et al., 1988, Lin S., Huestis W.H., 1995) порушення в узгодженій взаємодії цих систем клітини можуть відбитися на стійкості еритроцитів до дії різних ушкоджуючих факторів, таких, як літичні пептиди, кислотний гемоліз, гіпертонічний чи постгіпертонічний лізис тощо (Ніпот О.Є., 1995, Rudenko S.V., Patelaros S.V., 1995, Фираз Мустафа М Абуласал, 2003). Також важливо відзначити, що еритроцитам притаманна здатність трансформуватися в певні морфологічні типи, які досить детально класифіковані і для кожного з цих типів визначено відповідний механізм зміни просторової структури цитоскелет-мембранного комплексу. Зміна форми клітин супроводжується певними змінами їх агрегативних та адгезивних властивостей тощо.

В той же час, роль такого фактору, як форма клітини у визначенні стійкості і стабільності мембрани при дії модифікуючих факторів різної природи, досліджена недостатньо. Зокрема, серед літичних пептидів можна виділити мелітин, пептид природного походження, що виявляє виражену літичну активність стосовно різних типів клітин (Habermann E., 1972, Dempsey C.E., 1990). Механізм його дії є досить складним, і залишається незрозумілим, як модифікація мембранної структури може змінювати пептид-ліпідні чи пептид-білкові взаємодії (Dempsey C.E., 1990).

Крім мелітину, потужно впливають на еритроцити тривалентні іони лантану, що викликають агрегацію і злиття відмитих еритроцитів (Шереметьєв Ю.А. і ін. 2000, 2003). Тривалентні іони галію, подібно іонам лантану, також мають здатність викликати агрегацію еритроцитів. Хоч механізм такого впливу залишається не повністю зрозумілим, очевидно, що агрегація еритроцитів пов'язана з адгезивними властивостями клітинної поверхні, яка, в свою чергу, може змінюватися при зміні форми клітин. Таким чином, іони Ga³⁺ можуть бути використані як індикатор, здатний зафіксувати зміни поверхневих властивостей мембран після дії на них різних модифікаторів, включаючи фармакологічні препарати. З іншого боку, вплив модифікаторів на Ga³⁺-індуковану агрегацію є самостійною проблемою з точки зору з'ясування механізму агрегації, оскільки літературні дані з цього питання відсутні. Таким чином, вивчення процесів модифікації еритроцитів та їх впливу на фізіологічні реакції клітин в умовах, коли одним з факторів модифікації є зміна форми клітин, є актуальним і має теоретичний і практичний інтерес.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до наукового напрямку робіт кафедри фізіології людини та тварин Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна, по темі: “Закономірності фізіолого-біохімічної та структурно-функціональної адаптації біологічних систем до факторів середовища в онтогенезі”, номер державної реєстрації 0103U005743.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є визначення впливу модифікаторів мембрани і форми еритроцитів на мелітин-індукований і кислотний гемоліз, галій-індуковану агрегацію клітин, а також особливостей взаємодії мелітину і його аналогу [Ala-14]мелітину (P14A) з мембраною еритроцитів. мембрана еритроцит гемоліз мелітин

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

У порівняльному аспекті проаналізувати кінетику зміни форми еритроцитів, викликану речовинами різної природи, і оцінити ступінь трансформуючої дії і формотрансформуючу здатність різних модифікаторів мембрани і цитоскелета.

Дослідити вплив модифікаторів форми (DIDS, SITS, DNDS, SDS, CTAB, CCCP, A23187, p-CMBS, Cpr, Lyso, NEM, гуанідину, спермідину) на параметри мелітин-індукованого і кислотного гемолізу еритроцитів.

Провести порівняльні дослідження літичної активності мелітина і його аналогу [Ala-14]мелітина (P14A), в якому пролін замінено на аланін в положенні 14, а також активності бджолиної отрути, в якій мелітин діє разом з фосфоліпазою A₂.

Вивчити зміни форми і об'єму еритроцитів, та динаміку гемоліза, викликаного літичними пептидами при дії на еритроцити інгібіторів гемолітичної реакції (Zn²⁺ і хлорпромазин).

Дослідити вплив модифікаторів форми на параметри галій-індукованої агрегації еритроцитів.

Об'єкт дослідження - модифікація стану мембрани, лізис, агрегація, формотрансформація еритроцитів.

Предмет дослідження - чутливість еритроцитів до літичної дії пептидів і закисненню середовища, здатність еритроцитів до агрегації при дії іонів галія і модифікації форми клітин сполуками різної хімічної природи.

Наукова новизна отриманих результатів. Отримано нові дані про взаємозв'язок між вихідними умовами середовища і взаємодією між клітинами і пептидами в присутності мембраностабілізуючих агентів і інгібіторів гемолізу, таких як двовалентні катіони, хлорпромазин, альбумін та інші. Встановлено, що максимальний захисний ефект інгібіторів спостерігається в умовах, коли пептиди та інгібітори діють на клітини одночасно, а не послідовно один за одним. З'ясовано, що мелітин, Р14А і бджолина отрута по-різному впливають на еритроцити людини. Мелітин і Р14А викликають гемоліз, діючи незалежно один від одного, за допомогою асоціації з різними класами єднальних ділянок на мембрані еритроцитів. Показано, що хлорпромазин і альбумін специфічно інгібують гемоліз, індукований мелітином, але майже неефективні відносно гемолізу, індукованого Р14А. При цьому, дія аналогів мелітина більш нагадує дію пептидів різної природи, а не речовин однієї групи.

Встановлено індивідуальний характер впливу різних модифікаторів на динаміку зміни форми еритроцитів і проведено їх класифікацію з точки зору ефективності формотрансформуючої дії (формотрансформуючий потенціал), що має наступний вигляд: спермідин <гуанідин <p-CMBS < NEM < CCCP < A23187 < DNDS < DIDS <SITS < лізолецитин <Cpr < SDS < CTAB.

Показано, що вплив модифікаторів форми на стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу визначається їх здатністю впливати на іонну проникність мембран клітин. Речовини, що інгібують проникність, є інгібіторами кислотного гемолізу, а речовини, що збільшують проникність - активаторами гемолізу. Речовини, що не впливають на проникність, незалежно від їх здатності змінювати форму клітин, не впливали на кислотний гемоліз еритроцитів.

Уперше показано, що іони галію викликають агрегацію відмитих еритроцитів людини. Встановлено, що найбільш значним впливом на галій-індуковану агрегацію мають A23187 > SDS > DIDS, які приводять до достовірної зміни дисперсності агрегатів (тобто розподілу їх за розмірами і формою). Інші речовини виявляють тенденцію впливати на агрегатний стан, змінюючи тільки кінетичні параметри агрегації, або істотно на них не впливаючи.

Отримані дані не вказують на пряму кореляцію між морфологічними змінами і зміною чутливості еритроцитів до того чи іншого впливу. Це свідчить, що форма еритроцитів є не первинним, а вторинним чинником, що визначає фізіологічну реакцію клітин.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані в роботі, можуть бути використані при розробці нових засобів регуляції чутливості еритроцитів до дії літичних пептидів та інших поростворюючих сполук, а також для розробки методів тестування мембраноактивних сполук. Результати роботи можуть бути рекомендовані для наукового використання в навчальному процесі в різних областях біології.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Головна ідея роботи запропонована науковим керівником, а її практичне виконання належить дисертанту. Автором дисертаційної роботи самостійно проведені пошук і аналіз наукової літератури, статистична обробка результатів, аналіз і узагальнення отриманих даних, сформульовані основні положення і висновки, проведена апробація результатів досліджень і підготовка до друку робіт. Спільні публікації відбивають результати спільного планування, проведення експериментів і обговорення результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень, що включені в дисертацію були представлені на I з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи в спеціалізованих наукових журналах опубліковано 4 роботи і 2 тез доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 160 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 27 малюнками, 4 таблицями. Вона складається із вступу, огляду літератури, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел із 264 найменувань.

Основний зміст роботи

Матеріали ТА методи дослідження

Одержання еритроцитів. Еритроцити донорської крові 1 і 2 групи, заготовлено на консерванті Глюгіцир, відмито 10-кратним обсягом фізіологічного розчину (150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,4 ) (розчин TBS) чи (150 мМ NaCl, 5 мМ HEPES, рН 7,4) (розчин HBS) центрифугуванням на центрифузі ОПН-3 при 3000 об/хв протягом 3 хв.

Вимірювання концентрації білків у плазмі крові. Концентрацію білків у плазмі вимірювали фотометричним методом, (Скоупс П., 1985) використовуючи альбумін як стандарт.

Реєстрація динаміки гемолізу еритроцитів методом світлорозсіювання. Для реєстрації динаміки гемолізу еритроцитів у роботі була використана установка для виміру світлорозсіювання клітинних суспензій, створена на базі монохроматору спектрофотометра СФ-4А. Динаміку гемолізу еритроцитів вимірювали на довжині хвилі 720 нм. Швидкість гемолізу розраховувалася як тангенс (tg ), де - кут між лінійною частиною кривої оптичної щільності (ОЩ) і віссю часу. ОЩ лізированної суспензії клітин при даній довжині хвилі, практично дорівнює нулю (Руденко С.В. і ін., 1995, Rudenko S.V., Nipot E.E., 1996). Про форму клітин робили висновок на підставі амплітуди флуктуацій ОЩ, що дорівнює нулю для сферульованих еритроцитів і зростає в міру збільшення ступеня дискоїдності (Hoffman J.F., 1987, Руденко С.В. і ін., 1998). Всі експерименти проводили при температурі (20-22C).

Вимір об'єму і концентрації еритроцитів методом спектроскопії імпульсів опору (СІО). Розподіл за об'ємом і концентрацію еритроцитів вимірювали на електроцитоаналізаторі ЭЦА-01 (ІПКіК НАН України), що є аналогом лічильника типу Coulter-Counter, принцип дії якого заснований на реєстрації імпульсів струму, що виникають при зміні клітиною опору датчика (Richiery G.V. et al.? 1985, Akeson S.P., Mel H.C., 1986, Richiery G.V., Mel H.C., 1986). Амплітуда імпульсів опору представлялась у вигляді гістограми (256 каналів), модальне значення та інші характеристики якої розраховувалися комп'ютером. Використовували циліндричний отвір довжиною і діаметром 50 мкм і систему трансдюсера, що забезпечує практично повне гідродинамічне фокусування клітин. Середня лінійна швидкість потоку рідини через отвір не перевищувала 1 м/с. У кожному експериментальному циклі аналізувалося 2¹⁵ клітин, при цьому струм через отвір не перевищував 0,2 мА, і, таким чином, ні електричного пробою мембран (Richiery G.V., Mel H.C., 1986), ні їхньої значної деформації не відбувалося (Richiery G.V. et al., 1985). Калібрування приладу здійснювали за допомогою латексних часток відомого обсягу і еталону, роль якого виконували сферульовані і зафіксовані розчином 1%-го глутарового альдегіду еритроцити. Таким чином, метод забезпечував вимірювання об'єму еритроцитів та їх тіней у суспензії. Додатково параметри еритроцитів (середній об'єм, середній вміст гемоглобіну, гематокрит, ширина розподілу еритроцитів за об'ємом) після тієї чи іншої обробки вимірювалися на гематологічному аналізаторі Sysmex 2000 (Японія).

Одержання гіпотонічних і гіпертонічних тіней. Для приготування гіпотонічних тіней 0,05 мл упакованих клітин інкубували в 0,5 мл гіпотонічного розчину NaCl (50 мМ NaCl, 10 мM Tris-HCl, pН 7.4) протягом 1 хв при 0 C з наступним відновленням ізотонії шляхом додавання 10 мл холодного TBS і центрифугуванням (4000g, 10 хв).

Особливості впливу мелітину і його аналогу [Ala-14]мелітина на еритроцити. На рис. 1 представлені дані про вплив іонів Zn²⁺ на час затримки гемолізу (час лага між додаванням клітин і максимальною величиною ОЩ, що відбиває момент початку гемолізу), індукованого мелітином (А) і P14A, (Б), відповідно. Видно, що двовалентні катіони при збільшенні їх концентрації затримують момент початку гемолізу. Проте блокуюча здатність катіонів знижувалась приблизно вдвічі, тоді як та ж сама кількість пептиду вносилася в кювету через 50 с після внесення клітин (закриті символи). Величина цього ефекту була меншою для Р14А. Аналогічні закономірності характерні і для протектуючої дії іонів Ca²⁺ і лантана.

Кількості двовалентних катіонів, що вдвічі збільшували час затримки гемолізу, було недостатньо для того, щоб значно зменшити швидкість пептид-індукованого гемолізу на етапі коли пептид-індуковані пори були вже сформовані. Отже, значне інгібування гемолізу відбиває додаткові блокуючі властивості катіонів на ранній стадії пептид-мембранних взаємодій, переважно на стадії вбудовування пептиду в мембрану і/або стадії формування пори. Ці властивості відрізняються від властивостей катіонів закривати передіснуючу пору в мембранах. На рис. 2 показано типовий приклад мелітин-індукованого гемолізу за умов присутності і відсутності Ca²⁺ і хлорпромазину. Видно, що як Ca²⁺, так і хлорпромазин, а також багато інших інгібіторів (наприклад DIDS) значно зменшують швидкість гемолізу (₀) порівняно з швидкістю в контролі

(_c), за умов відсутності інгібітору.

Сінергизм при взаємодії літичних агентів часто виявляється в тім, що криві залежностей доза-відповідь мають сигмоідальний вигляд. Отже загальний ефект не дорівнює сумі індивідуальних ефектів, що відбиває як комплексну взаємодію між самими агентами так і їх кооперативну взаємодію з місцями зв'язування на мембрані. Для перевірки припущення, що мелітин і Р14А забезпечують літичний ефект діючи на незалежні класи місць зв'язування на мембрані еритроцитів, було проведено експеримент, результати якого представлені на рис. 3. У даному випадку ми використовували властивість хлорпромазина сильно інгібувати мелітин-індукований гемоліз і надто слабко інгібувати гемоліз, індукований Р14А (Rudenko S.V., Nipot E.E., 1996).

Припускаючи існування тільки одного класу мембранних сайтів, загальних для мелітина і Р14А, можна очікувати, що окупація частини сайтів мелітином приведе до зменшення швидкості гемолізу, який потім індукується Р14А, як це відбувається, наприклад, у випадку одночасної дії активної і неактивної форм деяких токсинів (Tang G.Q. et al., 1994). Однак, як показано на рис. 3, швидкість P14A-індукованого гемолізу не залежить від присутності в середовищі одного хлорпромазина, проте залежить у випадку додаткової присутності мелітину. У присутності хлорпромазина, що цілком блокує індуковану мелітином пору, швидкість гемолізу відповідає швидкості гемолізу, індукованого тільки Р14А і при цьому відбувається насичення процесу. Це означає, що сам мелітин не перешкоджає Р14А виявляти свій літичний ефект, але робить це в умовах блокування хлорпромазином, що можна пояснити взаємодією Р14А з літичними сайтами, хімічна природа яких відрізняється від сайтів, з якими зв'язується мелітин. Той факт, що існує, принаймні, два сильних інгібітора мелітин-індукованого гемолізу - хлорпромазин і альбумін, які є неефективними у відношенні гемолізу, індукованого Р14А, також підтверджує цей висновок.

Вплив модифікаторів на кінетику зміни форми еритроцитів. Оскільки еритроцити легко змінюють форму при взаємодії з багатьма мембраноактивними речовинами, становить інтерес проаналізувати у порівняльному аспекті кінетику змін форми еритроцитів, викликаних модифікаторами, і оцінити їх формотрансформуючу здатність. На рис. 4 на верхніх графіках показана зміна ОЩ, а на нижніх - індексу форми, що відбиває ступінь дискоїдності (сферичності) клітин. Видно, що кінетичні залежності не є однаковими, а залежать від типу і концентрації діючої речовини. Зокрема, збільшення концентрації CTAB призводить до збільшення амплітуди змін ОЩ і ІФ і швидкості цих змін. Аналогічним образом клітини реагують на іонофор А23187, однак постійна часу цього процесу в кілька разів більше, ніж у випадку CTAB. Оцінюючи постійну часу і ефективну концентрацію речовини, що приводить до сферуляції еритроцитів, ми одержали ряд формотрансформуючої ефективності наступного вигляду:

спермідин <гуанідин <p-CMBS < NEM < CCCP < A23187 < DNDS < DIDS <SITS < лізолецитин <Cpr < SDS < CTAB.

Вплив модифікаторів на мелітин-індукований і кислотний гемоліз еритроцитів. На рис. 5 показано вплив модифікаторів на швидкість мелітин-індукованого гемолізу еритроцитів. Досліджені речовини можуть бути розділені на три головних групи:

1) активатори - до яких відносяться DNDS, SITS, SDS, CCCP і Lyso

2) інгібітори - CTAB, Cpr, A23187, DIDS

3) нейтральні речовини - NEM, p - CMBS, гуанідин і спермідин.

Аналіз даних виявив закономірність, яка полягає в тім, що речовини, які не впливають на форму клітин, не роблять істотного впливу і на мелітин-індукований гемоліз. Ті агенти, що впливають на форму, можуть як активувати, так і інгібувати гемоліз. Наприклад, CTAB інгібує гемоліз у малих концентраціях, при яких він не викликає формотрансформації, а речовини, що викликають ехіноцитоз, можуть бути як активаторами, так і інгібіторами (Lyso, CTAB). Це означає, що зміни в структурі мембрани, викликані дією модифікатора, мають більш істотне значення для характеру протікання мелітин-індукованного гемолізу, ніж зміни форми, що вони викликають.

На рис. 6 показано вплив стильбенів DIDS, SITS і DNDS на хід кислотного гемолізу. Можна відзначити виражене збільшення лаг-періоду (в 2,5 рази) і зменшення швидкості гемолізу для всіх цих речовин. Характерною рисою їхнього впливу є транзиторні перетворення форми клітин у лаг-періоді. ІФ, що спочатку зменшується після додавання модифікаторів, після зміни рН середовища починає знову збільшуватися і, практично, досягає величини, що відповідає дискоцитам. Після цього знову спостерігається зниження ІФ у фазі набрякання, проте ІФ залишається досить високим у порівнянні з величиною, характерною, наприклад, для мелітин-індукованого гемолізу, що вказує на істотну різницю між двома типами гемолізу. Аналіз даних про вплив модифікаторів на параметри кислотного гемолізу дозволяє зробити висновок про певну закономірність, яка полягає в тім, що агенти-інгібітори, DIDS, SITS, DNDS, A23187, що зменшують швидкість гемолізу, одночасно збільшують і час лаг-періоду (параметр Т_v). Зворотня закономірність спостерігається у випадку СССР. Ті речовини, що істотно не впливають на швидкість гемолізу, тобто є нейтральними, не впливають і на Т_v. Це дозволяє припустити, що швидкість процесів, які протікають у лаг-періоді, зумовлює наступну прогресію гемолізу.

Вплив модифікаторів на галій-індуковану агрегацію еритроцитів. На рис. 7 показано три типових приклади агрегації еритроцитів, індукованої Ga³⁺, в умовах відсутності і присутності модифікаторів DNDS і SDS. З контрольної кривої 1 видно, що процес агрегації супроводжується плавним зменшенням ОЩ і хвилеподібною зміною ІФ, що спочатку зменшується, досягає мінімуму, а потім знову збільшується і виходить на плато. За допомогою мікроскопії ми встановили, що агрегація, індукована галієм, є 100%, (тобто всі клітини формують агрегати), і тому у даному випадку менше кінцеве значення ОЩ (А₆₀₀) характеризує великі агрегати, а більше значення А₆₀₀ відповідає більш дрібним агрегатам. З розмірами агрегатів, але протилежним чином, також пов'язаний і ІФ. Як видно на рис. 7 (крива 3), обробка клітин привела до збільшення А₆₀₀ і зменшення ІФ₆₀₀ у порівнянні з контролем, що вказує на формування більш дрібних агрегатів. Як видно з кінетичних кривих, характер процесу змінюється неістотно.

Порівняльна характеристика дії модифікаторів. При дослідженні впливу форми еритроцитів, що попередньо була змінена за допомогою хімічної модифікації, на гемоліз клітин, індукований мелітином чи кислотою, а також на галій-індуковану агрегацію, були отримані результати, які систематизовані в таблиці. Модифікатори за своїм впливом на процеси були розділені на три групи: активатори, інгібітори і нейтральні речовини.

Можна зробити висновок, що використані нами модифікатори, крім безпосереднього впливу на форму клітин, можуть впливати і на інші фізіологічні параметри, що мають самостійне значення. При цьому, як випливає з таблиці, речовини, що слабко впливають на форму (NEM, p-CMBS, спермідин і гуанідин) є нейтральними і у відношенні розглянутих фізіологічних процесів. Вплив інших модифікаторів не підтверджує ідею про те, що можна установити більш-менш пряму кореляцію між фізіологічним ефектом модифікатора і зміною чутливості клітин до того чи іншого впливу. Так, у випадку мелітина, спостерігаються прямо протилежні ефекти DIDS, який є інгібітором гемолізу і іншими стильбеновими похідними SITS і DNDS, що є активаторами. Катіонні речовини CTAB і Cpr, що викликають різноспрямовані зміни форми, є інгібіторами, що притаманно і іншим позитивно зарядженим речовинам, а речовини детергентної природи SDS, СССР і Lyso - активаторами. Механізм гемолізу, індукований мелітином, складний і вивчений далеко не цілком. Отримані нами дані не дозволяють запропонувати уніфіковане пояснення цього явища, напроти, вони показують, що в кожному конкретному випадку можуть виявлятися свої особливості, пов'язані з характером взаємодії пептиду, мембрани і модифікатора, причому ці взаємодії є більш значущими порівняно з впливом модифікатора на форму клітини.

Кислотний гемоліз являє собою процес, що, на наш погляд, дозволяє пояснити отримані дані в рамках сучасних уявлень про його механізм. Тут також не спостерігається кореляція між характером зміни форми клітин і їхньою стійкістю до кислотного гемолізу, оскільки сильні і різноспрямовані модифікатори, такі як SDS і Cpr, на нього не впливають. Вплив речовин, проте, може бути пояснено їх впливом не на форму, а на проникність мембран еритроцитів, що не обов'язково пов'язано одне з одним. Дійсно, усі речовини, які так чи інакше є інгібіторами транспорту іонів у мембрані еритроцитів, виявляють інгібуючий ефект і у відношенні кислотного гемолізу. Суть їх ефекту полягає в інгібуванні транспорту протонів усередину клітини за рахунок блокування аніонного транспорту (DIDS, SITS, DNDS) чи транспорту води (CTAB). Єдиним активатором процесу є протонофор СССР, механізм дії якого, як переносника протонів, цілком відповідає запропонованій схемі.

Таблиця

Порівняльна характеристика впливу модифікаторів на гемоліз, індукований мелітином, кислотний гемоліз і галій-індуковану агрегацію еритроцитів.

Позначення: А- активатор, І- інгібітор, Н- нейтральна речовина, А-Н- слабкий активатор, ближче до нейтрального.

Встановлено, що вихідна форма клітин слабко впливає на процес галій-індукованної агрегації. Поряд з тенденцією активації, найбільший ефект модифікаторів полягає в зміні агрегатного стану системи - зменшенні кінцевих розмірів агрегатів, що може віддзеркалювати кінетичний процес зміни (зменшення) адгезивних властивостей поверхні мембрани, в результаті якого досить великий агрегат вже не може об'єднатися з таким же аналогічним агрегатом. Це може свідчити про збільшення модифікаторами чутливості мембран до катіонів галію за рахунок порушення мембранної структури, чи експонування додаткових катіон-чуттєвих сайтів, які можуть виникнути, наприклад, як результат трансмембранного перерозподілу фосфоліпідів, індукованого модифікаторами (Pantaler E.R. et al., 2000).

Висновки

У роботі проведено дослідження впливу хімічних інгібіторів (двовалентні катіони, хлорпромазин, альбумін та інші) які можуть інгібувати транспортні процеси і змінювати форму клітин, на чутливість клітин до дєяких типів гемолізу, а також на їх здатність агрегувати під впливом катіонів галію, що дає підставу для визначення механізмів, які контролюють стабільність мембрани клітин.

Показано, що динаміка гемолізу еритроцитів, індукованого літичним пептидом мелітином і його аналогом [Аlа-14]мелітином, залежить від послідовності взаємодії між клітинами і молекулами пептидів, а також присутності інгібіторів, таких як двовалентні катіони, хлорпромазин, альбумін та інші. Максимальний протектуючий ефект інгібіторів спостерігається в умовах, коли пептиди і інгібітори діють одночасно, а не послідовно один за одним. Хлорпромазин і альбумін специфічно інгібують гемоліз, індукований мелітином, але мало ефективні у відношенні гемолізу, індукованого Р14А.

Встановлено, що мелітин, Р14А і бджолина отрута різним чином впливають на еритроцити людини. Нормалізована швидкість гемолізу лінійно залежить від відносної кількості Р14А в суміші з мелітином і бджолиною отрутою. Криві залежності доза-відповідь для Р14А виходять на насичення тільки тоді, коли мембранно-зв'язаний мелітин блоковано хлорпромазином. Це демонструє, що мелітин та Р14А викликають гемоліз, діючи незалежно один від одного, завдяки асоціації з різними класами ділянок зв'язування на мембрані еритроцитів.

Встановлено індивідуальний вплив різних модифікаторів на динаміку зміни форми еритроцитів. Запропоновано принцип, на підставі якого досліджені модифікатори можуть бути розташовані в ряд відповідно силі формотрансформуючої дії (потенціалу), що має наступний вигляд: спермідин <гуанідин <p-CMBS < NEM < CCCP < A23187 < DNDS < DIDS <SITS < лізолецитин <Cpr < SDS < CTAB.

Показано, що вплив модифікаторів форми на стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу визначається здатністю речовин впливати не на форму, а на іонну проникність мембран клітин. Речовини, що інгібують проникність (DIDS, SITS, DNDS, CTAB) є інгібіторами кислотного гемолізу, а речовини які посилюють проникність (протонофор СССР) - активаторами гемолізу. Інші речовини, що не впливають на проникність, незалежно від їх здатності змінювати форму клітин, не впливають на кислотний гемоліз еритроцитів.

Встановлено, що найбільш істотний вплив на галій-індуковану агрегацію еритроцитів мають A23187 > SDS > DIDS, які призводять до достовірної зміни дисперсності агрегатів (тобто їх розподілу за розмірами і формою). В другій, більш слабкій групі, знаходяться SITS, DNDS і CCCP, що мають тенденцію змінювати агрегатний стан, в третій групі - CTAB і Lyso, які змінюють тільки кінетичні параметри агрегації і, нарешті, замикає цей ряд група нейтральних речовин Cpr, NEM, p-CMBS, спермідин і гуанідин, що істотно на агрегацію еритроцитів не впливають.

В результаті аналізу впливу модифікаторів форми еритроцитів на гемоліз, індукований мелітином, кислотою а також на галій-індуковану агрегацію не виявлено прямої кореляції між морфологічними змінами і зміною чутливості еритроцитів до того чи іншого впливу, що свідчить про те, що форма клітини є не первинним, а вторинним чинником, що визначає фізіологічну реакцію еритроцитів.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

DIDS4,4' - Діізотіоцианатостильбен-2,2'-дісульфонова кислота

SITS4-Ацетамідо-4'-ізотіоцианатостильбен - 2,2'-дісульфонова кислота

DNDS - 4,4'-дінітростильбен - 2,2'-дісульфонова кислота

SDS - додецил сульфат натрия

CTAB - цетилтриметиламмоній бромид

CCCP - карбонілціанід m-хлорфенілгидразон

A23187 - кальціевий іонофор

p-CMBS - 4-хлормеркурійбензенсульфонат

Cpr - хлорпромазин-НCl

Lyso - лізолецитин

NEM - N-етілмалеймід

Р14А - [Ala-14]мелиттин

Список опублікованих праць за темою дісертації

Rudenko S.V, Wajdi Khalaf Jamil Madanat. Modulatory effect of peptide structure and equilibration conditions of cells on peptide-induced hemolysis // Visnyk of V.N. Karazin Kharkiv National University. Biophysical Bulletin. - 2005. Series: biology. - №709, Issue 1-2. - P. 139-146. (Дисертантом проведено дослідження літичної дії мелітину на еритроцити).

Rudenko S.V, Wajdi Khalaf Jamil Madanat. Peculiarities of lytic action of melittin and its analog [Ala-14]melittin // Visnyk of V.N. Karazin Kharkiv National University. - 2005. - №716. Issue 2(16). - P. 47-52. (Дисертантом проведено дослідження літичної дії [Ala-14]мелітину на еритроцити).

Руденко С.В., Важди Кхалаф Жамиль Маданат, Бондаренко В.А.. Влияние модификаторов на катион-индуцируемую агрегацию эритроцитов // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. - 2006. Серія: біологія. - №729, Вип. 3. - С. 265-270. (Дисертант провів пошук модифікаторів з необхідними властивостями).

Руденко С.В., Важди Кхалаф Жамиль Маданат. Влияние модификаторов на кинетику формотрансформации эритроцитов // Вісник проблем біології і медицини. -2006. - Вип. 2. - С. 292-295. (Дисертант провів дослідження кінетики формотрансформації еритроцитів).

Бондаренко В.А., Рамазанов В.В., Важді Кхалаф Джаміль Маданат, Мєліхова С.В. Вплив інгібіторів транспорту аніонів на чутливість еритроцитів до осмотичного і температурного стресу // Тези доповідей Першого установочного з'їзду українського товариства клітинної біології. - Львів, 2004. - С. 51. (Дисертант брав участь у аналізу одержаної інформації).

Рамазанов В.В., Мєлихова С.В. Важди Кхалаф Жамиль Маданат, Ихсан А.С. Аль-Салаймех, Бондаренко В.А.. Факторы контроля транспорта анионов в эритроцитах при изменении температурных и осмотических параметров среды // Тези доповідей Першої Української наукової конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”. - Харків, 2004. - С. 121. (Дисертантом проведено дослідження впливу температури на транспорт аніонів).

Размещено на Allbest.ru