Дія анестетиків на сполучений з обміном аніонів транспорт іонів Н+ і осмотичну чутливість еритроцитів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені В.Н. КАРАЗІНА

03.00.13. - Фізіологія людини і тварин

УДК 591.111.1:547.26

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

АВТОРЕФЕРАТ

ДІЯ АНЕСТЕТИКІВ НА СПОЛУЧЕНИЙ З ОБМІНОМ АНІОНІВ ТРАНСПОРТ ІОНІВ Н+ І ОСМОТИЧНУ ЧУТЛИВІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ.

ІХСАН АЛІ САЛАМЕХ

АЛЬ-САЛАЙМЕХ

Харків-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (м. Харків)

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бондаренко Валерій Антонович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна (м. Харків), завідувач кафедри фізіології людини та тварин.

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук, професор Жегунов Генадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія МАП України (м. Харків), завідувач кафедри хімії і біохімії;

- доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євгеній Олександрович Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків), завідувач відділу низькотемпературного консервування

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка (кафедра фізіології людини і тварин), м. Київ

Захист відбудеться "25" жовтня 2006 р. о "14-00" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15 )

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий ""2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Падалко В.І.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Еритроцити відіграють важливу фізіологічну роль, представляючи собою структурні елементи крові, що виконують функцію транспорту і постачання тканин і організму киснем. Незважаючи на універсальний характер та функції, що виконуються еритроцитами, у різних видів організмів ці клітини відрізняються по розмірах, об'єму, морфологічним характеристикам і ряду фізіологічних параметрів (Mateі H., 2000, Plasenzottі R., 2004). Такого роду розходження часто відображають положення організму в еволюційному ряді та пристосованість організму до тих умов середовища, що є для нього оптимальними. Одним таким розходженням є те, що у вищих організмів, включаючи людину, еритроцити позбавлені ядра, у той час як еритроцити птахів і ряду інших організмів включають ядро. По ряду характеристик, наприклад, по вмісту гемоглобіну, ядерні і без'ядерні еритроцити істотно не розрізняються, але по інших фізіологічних характеристиках спостерігаються істотні розходження (Viscor G, 1982, Oyewale JO., 1994).

В даний час доведено, що кисень-транспортна функція еритроцитів залежить від структурно-функціонального стану плазматичної мембрани. Це обумовлено, по-перше тим, що плазматична мембрана забезпечує структурну цілісність кліток при дії на них гідродинамічного і сдвигового стресів у кровотоці. По- друге, у мембрану вбудовані білки, що формують системи транспорту іонів, що забезпечують здатність клітин регулювати свій об'єм і форму (Lang F., 1998). У ряді цих систем ключову роль грає білок смуги 3, що виконує функцію обміну аніонів хлориду на аніони бікарбонату й одночасно є ключовим елементом структурного макрокомплексу, що стабілізує мембрану (Vince J.W., 2000 Scozzafava A, 2002, Salhany J.M., 2003, Mohandas N, 2003). Ця роль білка смуги 3 є універсальною як у випадку ядерних еритроцитів птахів, так і у випадку без'ядерних еритроцитів ссавців. У зв'язку з цим становлять інтерес порівняльні дослідження чутливості ядерних і без'ядерних еритроцитів як до дії факторів, здатних дестабілізувати плазматичну мембрану, так і до дії факторів, що забезпечують захист мембрани від структурних порушень, здатних привести до формування в ній гемолітичної пори. Паралельно становить інтерес порівняти деякі параметри функціонування аніон-транспортної системи, наприклад сполучений з обміном аніонів транспорт протонів через плазматичну мембрану.

У дослідженнях на еритроцитах загальноприйнятим підходом для оцінки структурних особливостей плазматичної мембрани є аналіз чутливості клітин до гемолітичної реакції, зв'язаної зі збільшенням чи зменшенням їхніх обсягів. Класичними мембранними стабілізаторами в таких умовах є анестетики та інші амфіфільні сполуки, здатні вбудовуватися в мембрану і захищати клітини при стресових впливах. (Lieber М.R., 1984). Висока захисна ефективність, зокрема , характерна для аліфатичних спиртів, для яких характерна залежність стабілізуючого дії від коефіцієнта розподілу молекул речовин у мембрану (Malheiros SV., 2004). Крім цього, зазначені з'єднання здатні модифікувати функціональний стан аніонного переносника, тобто в цьому випадку має місце комплексна дія мембранних стабілізаторів (Hemmings H.C., 2005).

У цьому плані становить інтерес порівняльне вивчення дії анестетиків на еритроцити двох віддалених видів - птахів і жуйних ссавців, мембрани яких розрізняються як по складу білків і ліпідів, так і по параметрах функціонування систем транспорту іонів (Oyewale JO, 1991, Nourі-Sorkhabі M. H., 1996, Mateі H., 2000, Plasenzottі R., 2004).

Питання про вплив нейтральних та тих, що мають заряд амфіфільних з'єднань на аніонний обмін в еритроцитах, а також стійкість еритроцитів різних видів до змін осмотичних умов середовища дотепер вивчений недостатньо. Насамперед відсутні роботи, присвячені порівняльному вивченню впливу амфіфілів на осмотичне поводження ядерних і без'ядерних еритроцитів. Потреба проведення досліджень у цьому напрямку обумовлена, також, недостатністю порівняльних даних для ядерних і без'ядерних еритроцитів щодо функціонування аніонного транспортера (білок смуги 3) у мембранах еритроцитів.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Базовими для підготовки і подачі дисертаційної роботи, у яких здобувач брав участь у проведенні досліджень і аналізі результатів, були науково-дослідні роботи, виконані в рамках наукової тематики кафедри фізіології людини та тварин Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна, по темі: "Закономірності фізіолого-біохімічної та структурно-функціональної адаптації біологічних систем до факторів середовища в онтогенезі" № державної реєстрації 0103U005743.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є визначення ступеню впливу n-алканолів (гексанол, бутанол) і катіонних амфіфілів (хлорпромазин) на швидкість транспорту іонів Н+, пов'язанного з транспортом аніонів (хлориду і сульфату) у мембрані еритроцитів, і швидкість вивільнення іонів Н+ у циклі Якобса-Стюарта, а також на рівень і швидкість гіпотонічного гемолізу еритроцитів курки (ядерні) і барана (без'ядерні) в середовищах, що містять електроліт (NaCl, Na2SO4) і неелектроліт (сахарозу).

Для виконання цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити вплив n-гексанолу і n-бутанолу на швидкість транспорту іонів Н+ в еритроцитах барана і курки, пов'язанного з транспортом хлориду і сульфату.

2. Вивчити вплив n-гексанолу і n-бутанолу на вивільнення іонів Н+ у ході циклу Якобса-Стюарта в еритроцитах барана і курки.

3. Досліджувати вплив нейтральних амфіфілів (n-алканолів - n-гексанолу і n_бутанолу) на рівень і швидкість гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки в електролітному (NaCl) і неелектролітному (сахароза) середовищі.

4. Вивчити вплив n-гексанолу і n-бутанолу на розвиток гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки при заміні аніонів ClЇ на аніон SO42- у гіпотонічному середовищі.

5. Досліджувати вплив катіонного амфіфілу хлорпромазину на рівень і швидкість гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки.

6. Досліджувати залежність інгібуючого впливу n-гексанолу і n-бутанолу, а також хлорпромазину на розвиток гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки в залежності від етапу їхнього додавання в клітинну суспензію.

Об'єкт дослідження. Мембранний транспорт іонів, звільнення іонів Н+ у циклі Якобса-Стюарта. Осмотична чутливість еритроцитів барана і курки.

Предмет дослідження. Вплив n-алканолів (n-гексанол, n-бутанол) на швидкість транспорту іонів Н+ у мембрані, сполучений із транспортом хлориду і сульфату в циклі Якобса-Стюарта, а також вплив n-алканолів (n-гексанол, n-бутанол) і хлорпромазину на швидкість і рівень гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки.

Методи дослідження. Спектрофотометричний метод реєстрації динаміки рівня гемолізу, осмотичного поводження еритроцитів при розсіюванні цілими клітинами в умовах варіювання осмотичних параметрів середовища, рН-метричний метод оцінки транспорту сульфату в еритроцити.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано, що n-гексанол і n-бутанол знижують швидкість транспорту іонів Н+ в еритроцити барана і курки, пов'язаного з транспортом хлориду і сульфату, тобто під впливом n-алканолів відбувається інгібування аніонного транспорту в еритроцитах.

Установлено, що n-бутанол ефективно інгібує вивільнення іонів Н+ у циклі Якобса-Стюарта в еритроцитах барана, у той час як n-гексанол виявляє високу інгібуючу активність стосовно обох типів клітин - еритроцитів барана і курки.

Встановлено, що n-алканоли (n-гексанол, n-бутанол) і катіонні амфіфіли (хлорпромазин) по-різному виявляють інгібуючу дію на розвиток гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки в електролітних і неелектролітних середовищах. В електролітних (NaCl, Na2SO4) середовищах вплив n-алканолів, що виявляється в зниженні рівня і швидкості гемолізу більш виражений в порівнянні з неелектролітним (сахароза) середовищем. Катіонний амфіфіл хлорпромазин знижує рівень і швидкість гіпотонічного гемолізу еритроцитів курки, не роблячи впливу на параметри гемолізу еритроцитів барана. При цьому більш виражена інгібуюча дія хлорпромазину на гіпотонічний гемоліз ядерних еритроцитів курки має місце при його додаванні в середовище після початку гемолітичного процесу, чого не спостерігається у випадку n-гексанола і n-бутанола.

Теоретична та практична значимість роботи. Отримані результати дозволяють виявити ефективні концентрації нейтральних (n-алканоли) і катіонних (хлорпромазин) амфіфілів, при яких вони мають максимальну захисну дію на еритроцити при осмотичному впливі на них. Інгібуюча дія досліджуваних з'єднань на розвиток гемолізу може стати основою для застосування анестетиків і амфіпатів як компоненти в середовищах, що використовуються для збереження клітин крові.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана здобувачем самостійно. Головна ідея роботи запропонована науковим керівником, а її практичне виконання належить дисертанту. Експериментальні дослідження проведені здобувачем разом зі співавторами публікацій, що були виконавцями спільних тем. Автором дисертаційної роботи самостійно проведені пошук і аналіз наукової літератури, статистична обробка результатів, аналіз і узагальнення отриманих даних, сформульовані основні положення і висновки, проведена апробація результатів досліджень і підготовка до опублікування друкованих праць.

Апробація результатів. Результати проведених досліджень, що включені в дисертацію були представлені на І з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Українській науковій конференції "Проблеми біологічної і медичної фізики" (Харків, 2004).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи представлені в 4 статтях і 2 тезах.

Структура й обсяг роботи. Дисертація викладена на 116 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 29 малюнками, 3 таблицями. Робота складається з вступу, аналітичного огляду літератури, розділу, присвяченого опису матеріалів і методів, розділів, у яких викладені результати власних досліджень, розділу, присвяченого аналізу й узагальненню отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел з 134 найменувань.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

Розділ складається з чотирьох підрозділів, у яких розглянуті транспортні процеси в мембранах еритроцитів, представлені різні погляди на механізм гіпотонічного гемолізу еритроцитів, викладений сучасний погляд на взаємодію алканолів із клітинами.

Матеріали і методи дослідження

Одержання еритроцитів. Еритроцити одержували зі свіжоконсервованої крові, заготовленої на глюгіцировому консерванті за стандартною методикою шляхом центрифугування.

Вивчення впливу алканолів і хлорпромазину на гіпотонічний гемоліз еритроцитів. Для того, щоб оцінити осмотичну стійкість еритроцитів, аліквоту клітин з ізотонічного розчину електроліту чи неелектроліту переносили в гіпотонічне середовище при кімнатній температурі (23оС). Тоничність середовища підбиралася таким чином, щоб гемоліз складав приблизно 50-60 %. Для вивчення впливу n-алканолів на розвиток гіпотонічного гемолізу еритроцитів, у літичне середовище додавали спирти в кінцевих концентраціях 54-324 мМ бутанола і 1-15 мМ гексанола. Для вивчення впливу хлорпромазину на розвиток гіпотонічного гемолізу еритроцитів його додавали в літичне середовище в кінцевих концентраціях 7,5-150 мкМ.

Для реєстрації динаміки гемолізу еритроцитів у роботі була використана установка для виміру світлорозсіювання клітинних суспензій, створена на базі монохроматора СФ-4А. Динаміка гемолізу еритроцитів була досліджена за допомогою спектрофотометричного методу на довжині хвилі 720 нм (Latimer P.,1982).

Дослідження швидкості транспорту Н+ методом рН-метрії. Еритроцити барана і курки відмивали тричі безбуферним розчином 0,15 М NaCl за стандартною методикою.

При аналізі еритроцитів методом рН-метрії в термостатуєму кювету (37°C) додавали по 2 мл розчину 0,12 мМ сульфату натрію, доводили рН розчином гідроокису натрію до рівня внутрішньоклітинного рН (6,9-7,6), після чого вносили 50 мкл еритромаси з кінцевим 2% гематокритом і робили вимір зміни рН. Для вивчення впливу спиртів в осередок перед еритроцитами вносили алканоли в різних концентраціях (n-бутанол: 0-342 мМ чи n-гексанол: 0-15 мМ) і проводили вимір зміни рН у їхній присутності. Запис змін рН суспензії еритроцитів робили за допомогою рН-электроду на самописі Endim (GDR).

Статистичну обробку вибірок з нормальним розподілом проводили з використанням t-критерию Ст'юдента (Лакин Г.Ф., 1990).

Результати і їхнє обговорення

Вплив бутанолу і гексанолу на аніонний транспорт в еритроцитах барана і курки. N_алканоли, зокрема, n-бутанол і n-гексанол відносяться до класу загальних анестетиків, механізм дії яких на клітини активно вивчається. Класичні представлення про дію анестетиків на мембрану, пов'язані з вбудовуванням молекул у ліпідну фазу мембрани, останнім часом доповнюються новими даними про вплив n-алканолів на трансмембранний траспорт (Schwіchtenhovel C., 1992, Malheіros SV., 2004), зв'язування з рецепторами (Bootsveld A, 2004, Franks NP. 2006), інгібування чи активування мембрано'звязанних ферментів (Hemmіngs HC Jr, 2005). З цієї точки зору становило інтерес вивчити вплив спиртів на стан білка смуги 3 еритроцитів, що відіграє важливу роль не тільки в процесах аніонного обміну, але і як фактор, що контролює стабільність мембрани. Стан білка смуги 3 оцінювали по ефективності роботи транспортної системи Cl-/SO42- - H+ , зв'язаної з циклом Якобса-Стюарта в еритроциті, що має ведучу роль у дихальній функції клітини. Для того, щоб кількісно оцінити зміни швидкості звільнення іонів Н+ у результаті функціонування циклу Якобса-Стюарта і швидкості транспорту іонів Н+ в еритроцити, були обчислені константи швидкості цих процесів: К1 - константа швидкості звільнення іонів Н+ у результаті функціонування циклу Якобса-Стюарта, і К2 - константа швидкості транспорту іонів Н+ в еритроцити. Ці величини були обчислені як під час відсутності, так і в присутності алканолів.

Для відносного порівняння процесів інгібування швидкості звільнення іонів Н+ у результаті функціонування циклу Якобса-Стюарта і швидкості транспорту іонів Н+ в еритроцити барана і курки, були обчислені коефіцієнти інгібування цих процесів.

На рис. 1 відображено інгібування обміну іонів Н+ в еритроцитах барана. По мірі збільшення концетрації бутанола спостерігається поступове зростання коефіцієнта інгібування швидкості звільнення іонів Н+ у результаті функціонування циклу Якобса-Стюарта (крива 1) і інгібування швидкості транспорту іонів Н+ в еритроцити барана (крива 2). Видно, що в присутності бутанолу відбувається блокування котранспорту SO42- - Н+ приблизно на 40%, а транспорту НСО3-/Cl- - майже на 70 %.

Хід кривих інгібування дзеркально відбиває динаміку змін кривих швидкості і при великих концентраціях бутанолу спостерігається зменшення інгібування обміну іонів Н+, особливо для другої фази обміну, тобто котранспорту SO42- - Н+.

У випадку гексанолу картина, що спостерігається, відрізняється від бутанолу (рис. 2). Це відображується, по-перше, у більш плавному ході кривих інгібування, що не виходять на плато після визначеного збільшення концентрації інгібітору, а поступово змінюються зі збільшенням концентрації гексанолу. По-друге, ступінь інгібування другої фази процесу обміну протонів, а саме - котранспорту SO42- - Н+, складає приблизно 60% у порівнянні з 40% для бутанолу.

Це може вказувати на більш сильний вплив гексанолу у порівнянні із бутанолом на ту ділянку білку смуги 3, що відповідає за котранспорт сульфату і протонів. Можливо гексанол має більшу спорідненість до цієї ділянки та/чи викликає більш виражені конформаційні зміни білку при дії на мембрану. Відмінність динаміки інгібування може також вказувати на різну швидкість зв'язування спиртів з цією ділянкою. Оскільки ступінь інгібування першої фази, а саме НСО3-/Cl- транспорту для обох спиртів збігається, а відрізняється тільки динаміка, можна сказати , що вплив обох спиртів на цю ділянку білка смуги 3 приблизно однаковий і може відрізнятися тільки швидкістю зв'язування. еритроцит гіпотонічний гемоліз електролітний

У випадку еритроцитів курки спостерігаються аналогічні результати як для бутанолу ( рис. 3. ) так і для гексанолу ( рис. 4 ).

Особливістю цих еритроцитів є менший коефіцієнт інгібування другої фази процесу, а саме транспорту іонів водню в клітину, що спостерігається в присутності обох досліджуваних спиртів (30% для бутанолу у порівнянні з 40% у випадку еритроцитів барана і 45% для гексанолу в порівнянні з 60% у випадку еритроцитів барана). Це може вказувати на особливості функціонування обмінника, відмінності в його конформації в еритроцитах різних видів, а також відмінності у взаємодії з ним алканолів.

Отримані в даній роботі результати узгоджуються з даними приведеними в більш ранній роботі (Forman S.A., 1985,), у якій вивчався вплив n-алканолів на кінетику зв'язування інгібітору аніонного транспорту з білком смуги 3 і також показаний інгібуючий вплив n-бутанола і n-гексанола на транспорт аніонів. Передбачалося, що n-бутанол зв'язується безпосередньо з білком смуги 3, а n-гексанол опосередковує свій ефект за рахунок зміни ліпідного мікрооточення транспортера. Результати наших експериментів показують приблизно однакову ефективність як n-бутанолу, так і n-гексанолу при інгібуванні транспорту іонів Н+, що припускає схожість механізмів їхнього впливу на стан аніонного переносника. Оскільки доведена пряма взаємодія n-бутанолу з ділянкою зв'язування нековалентного аніонного інгібітору у складі білку смуги 3, можна припустити, що n-бутанол і n-гексанол безпосередньо взаємодіють з білком смуги 3, однак з різними його ділянками. Підтвердженням цьому служить їхня однакова ефективність при дії на транспорт іонів в еритроцитах різних видів, що значно розрізняються по фосфоліпідному складу і структурі мембрани (Oyewale JO, 1991, Plasenzottі R., 2004). Відповідно важко припустити однаковий ступінь спорідненості алканолів до ліпідної фази досліджуваних еритроцитів як фактора, що визначає їхній вплив на білок смуги 3.

Розходження в початковій швидкості транспорту протонів усередину клітини, що спостерігаються для еритроцитів різних видів, можливо можна пояснити різним вмістом білку смуги 3 у цих еритроцитах (Oyewale J.O., 1991, Mateі H., 2000,), і, відповідно, різною вираженністю транспортного процесу, що оцінюється по транспорту іонів через білок смуги 3.

У такий спосіб n-гексанол і n-бутанол зменшують швидкість транспорту іонів Н+ в еритроцити сполученого з транспортом сульфату і хлору, а отже інгібують аніонний транспорт, опосередкований білком смуги 3. Ефективність n-бутанолу і n-гексанолу схожа у випадку еритроцитів барана і курки, що може вказувати на взаємодію спиртів з інтегральними білками мембрани.

Особливості гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки. З погляду доповнення загальної картини механізму гіпотонічного гемолізу клітин становило інтерес вивчення особливостей гіпотонічного гемолізу еритроцитів різних видів (курка, баран), що відрізняються по білковому (Oyewale JO, 1991, Mateі H., 2000, Plasenzottі R., 2004) і фосфоліпідному складу (Nourі-Sorkhabі M. H., 1996). Були виявлені значні розходження в динаміці гіпотонічного гемолізу Особливістю гіпотонічного гемолізу еритроцитів курки є те, що при зміні осмотичного навантаження на клітини змінюється не тільки рівень, але і швидкість гемолітичного процесу, тоді як у випадку еритроцитів барана, змінюється тільки ступінь ушкодження клітин, але швидкість гемолізу не змінюється.

Особливості розвитку гемолітичного процесу, що спостерігаються для еритроцитів різних видів, ймовірно зв'язані з розходженнями в білковому і фосфоліпідному складі їхніх мембран. Зазначені розходження відіграють важливу роль у контролі зв'язків мембрана-цитоскелет і, отже, впливають на особливості формування гемолітичних пір. Динаміка розвитку гемолізу еритроцитів курки свідчить, що в цьому випадку відбувається формування пір невеликого розміру, що супроводжується зміною об'єму і форми клітин і тільки згодом формується пора, проникна для гемоглобіну. У випадку еритроцитів барана, повільна фаза процесу відсутня і швидко формується пора, проникна для гемоглобіну.

Для визначення чутливості еритроцитів до гіпотонічного шоку в проведених експериментах, використовувалися такі параметри як індекс осмотичної крихкості І50 (тонічність середовища інкубації, коли гемоліз складає 50%) і коефіцієнт граничного ушкодження І10 (тонічність середовища інкубації, коли гемоліз складає 10% ). Як видно з таблиці 1, у не електролітному (сахароза) і електролітному (NaCl) середовищі еритроцити курки є більш стійкими до гіпотонічного шоку в порівнянні з еритроцитами барана, у сульфатному електролітному середовищі чутливість еритроцитів барана і курки до гіпотонічного шоку вірогідно не розрізняється.

Таблиця 1 - Порівняльна чутливість еритроцитів до гіпотонічного шоку в різних середовищах.

Відомо (Vіscor G, 1982), що плазматична мембрана еритроцитів курки характеризується відсутністю водяних каналів, на відміну від еритроцитів ссавців, чим імовірно, можна пояснити їх більш високу стійкість до дії гіпотонії. Відсутність розходжень в осмотичній чутливості еритроцитів барана і курки в сульфатному середовищі, ймовірно, зв'язана з більш високим внеском компонента односпрямованого транспорту іонів через аніонний транспортер (білок смуги 3) у сульфатному середовищі, у порівнянні з обмінним компонентом більш вираженим в хлоридному середовищі.

Порівняльне вивчення впливу п-алканолів і хлорпромазина на гіпотонічний гемоліз еритроцитів барана і курки в середовищах різного складу

На порівнюється антігемолітична активність досліджуваних речовин на гіпотонічний гемоліз еритроцитів барана і курки, що інкубуються у розчинах NaCl при максимально ефективній концентрації досліджуваної речовини. Видно, що максимальну ефективність у випадку еритроцитів барана виявляє гексанол, у той час, як у випадку еритроцитів курки - хлорпромазин. Слід зазначити, що хлорпромазин не виявляє антигемолітичної активності стосовно еритроцитів барана.

При заміні аніону хлору на аніон сульфату (рис. 6), антигемолітична активність хлорпромазину для еритроцитів курки трохи знижується, тоді як бутанола і гексанола збільшується. Для еритроцитів барана антигемолітична активність зазначених речовин вірогідно не змінюється. При заміні електролітного середовища на неелєктролітне (рис.7) антигемолітична активність спиртів і хлорпромазину істотно зменшується при осмотичному впливі на обидва види еритроцитів.

Виключенням є гексанол, що зберігає свою протектуючу активність стосовно еритроцитів барана незалежно від складу середовища. Розходження в ступені захисного ефекту досліджуваних речовин в електролітних і неелектролітних середовищах, як ми вже обговорювали раніше, зв'язана, ймовірно, зі зміною транспортних процесів і проникності мембрани в неелектролітному середовищі в результаті чого захисна дія бутанолу знижується. З іншого боку, менш виражена антигемолітична активність спиртів у неелектролітному середовищі може бути зв'язана з обмеженнями, що накладаються на зв'язування досліджуваних речовин з поверхнею мембрани при зміні електростатичних властивостей її поверхні.

Більш ефективна дія хлорпромазину у випадку еритроцитів курки у порівнянні з еритроцитами барана може бути зв'язана з розходженнями в динаміці гіпотонічного гемолізу цих двох видів клітин. Відомо, що хлорпромазин зменшує розмір пір, сформованих при гіпотонічному лізисі і прискорює їх закриття (Lіeber M.R., 1984). Оскільки, виходячи з динаміки лізису, ми припускаємо, що в еритроцитах курки на початку гемолітичного процесу формується багато дрібних пір, а в еритроцитах барана швидко формується одна велика пора, дія хлорпромазину буде більш ефективною у першому випадку. З іншого боку, не можна виключити різну здатність хлорпромазину вбудовуватися в мембрани еритроцитів різних видів, тому що вони значно розрізняються по фосфоліпідному складу. Так, еритроцити барана практично не містять фосфатидилхоліну, на відміну від еритроцитів курки і людини, стосовно яких хлорпромазин виявляє виражену інгібуючу дію при розвитку гіпотонічного гемолізу.

Виходячи з отриманих у роботі даних, можна також визначити ефективні концентрації вивчених протектуючих речовин стосовно до рівня і швидкості гіпотонічного гемолізу. Відповідні дані представлені в таблиці 2, де ефективна концентрація - це мінімальна концентрація протектуючої речовини, що викликає максимальний захисний ефект в даних умовах. Кр - ефективна концентрація, що визначається по зменшенню рівня гемолізу. Кш -ефективна концентрація, по зменшенню швидкості гемолізу.

Таблиця 2 - Порівняльна таблиця впливу ефективних концентрацій алканолів і хлорпромазину на рівень і швидкість гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки.

З таблиці 2 видно, що зміна рівня гемолізу при використанні спиртів досягається при визначених концентраціях і далі його рівень не змінюється, у той час як для такого параметру, як швидкість гемолізу, характерна зміна у всьому діапазоні досліджуваних концентрацій речовини. У випадку хлорпромазину має місце зворотня ситуація, що варто віднести насамперед до електролітних середовищ.

ВИСНОВКИ.

У роботі проведене порівняльне дослідження транспорту аніонів у мембранах еритроцитів барана і курки, виявлені розходження в осмотичному поводженні цих клітин, а також вивчено вплив деяких анестетиків на досліджувані процеси, що дозволило зробити припущення про механізм взаємодії цих речовин з мембранами клітин.

1. n-Алканоли (n-гексанол і n-бутанол) зменшують швидкість транспорту іонів Н+ в еритроцити курки і барана, сполученого з транспортом Cl- і SO42- , що вказує на інгібування транспорту аніонів, опосередковуваного білком смуги 3. При цьому швидкість транспорту іонів Н+ у нормі і при дії n-алканолів є більш високою у випадку еритроцитів курки, що відображує розходження параметрів функціонування обмінників Cl-/HCO3- і Cl-/SO42- - Н+ в еритроцитах курки і барана.

2. При вивільненні іонів Н+ у ході циклу Якобса-Стюарта n-бутанол виявляє більш виражену інгібуючу ефективність стосовно еритроцитів барана і меншу стосовно еритроцитів курки. У той же час n-гексанол ефективний стосовно обох видів еритроцитів. n-Гексанол і n-бутанол однаково ефективно інгібують транспорт іонів Н+ у клітини, як у випадку еритроцитів курки, так і у випадку еритроцитів барана.

3. Рівень і швидкість гемолізу еритроцитів барана і курки при переносі в гіпотонічне середовище визначається видовою приналежністю клітин. Зміна осмотичних умов середовища впливає на рівень гемолізу еритроцитів барана, але не впливає на швидкість процесу, у той час, як у випадку еритроцитів курки осмотичні умови впливають не тільки на рівень, але і на швидкість гемолітичного процесу.

4. Оцінка індексу осмотичної крихкості (І50) і коефіцієнту граничного ушкодження (І10) показує, що в електролітному (NaCl) і неелектролітному (сахароза) середовищі стійкість еритроцитів курки до гіпотонічного гемолізу є більш високою в порівнянні з еритроцитами барана. Заміна в електролітному середовищі аніонів Cl- на аніони SO42- приводить до вирівнювання реакцій клітин на осмотичний вплив, і в цьому випадку чутливість еритроцитів барана і курки до гіпотонічного гемолізу вірогідно не відрізняється.

5. Рівень гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана і курки знижується при включенні в середовище нейтральних амфіфілів n-гекcанола і n-бутанола, що відносяться до класу n-алканолів і є анестетиками. Дія n-алканолів залежить від складу середовища, воно менш виражено в неелектролітному середовищі, що включає сахарозу, і більш - в електролітному середовищі, що включає як аніони Cl-, так і аніони SO42-. При цьому ефективні концентрації n-гексанолу на порядок нижче таких у випадку n-бутанолу.

6. n-Гексанол виявляє істотно більш виражений, у порівнянні з n-бутанолом, інгібуючий ефект на розвиток гіпотонічного гемолізу еритроцитів барана, у той час як у випадку еритроцитів курки інгібуюча ефективність n-алканолів виявляє подібний характер. Як у випадку еритроцитів барана, так і у випадку еритроцитів курки інгібуюча дія бутанола зростає при заміні в середовищі аніонів Cl- на аніони SO42- і при максимальних концентраціях n-бутанола ефективність в еритроцитах курки істотно більш виражена в порівнянні з еритроцитами барана.

7. Хлорпромазин, що є катіонним амфіфілом і відноситься до амінних анестетиків, має захисну дію по відношенню до гіпотонічного гемолізу еритроцитів курки, зменшуючи як рівень, так і швидкість гемолізу, і неефективний стосовно еритроцитів барана. Ефективність хлорпромазину при дії на еритроцити курки зростає при додаванні його в середовище після початку гемолітичного процесу. Подібний ефект у випадку n-алканолів, n-гексанола і n-бутанола, відсутній.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Нипот Е.Е., Мелихова С.В., И. Али-Саламех Аль Салаймех, Бондаренко В.А.. Влияние бутанола и гексанола на анионный транспорт в эритроцитах.// Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Біофізичний вісник. - 2005. - Вип.2(16), №716. - С. 25-29. (Дисертантом проведений підбір найбільш ефективних концентрацій алканолів).

2. Ихсан Али-Саламех Аль Салаймех, Мелихова С.В., Нипот Е.Е.,

Бондаренко В.А. Влияние n-бутанола и n-гексанола на температурно-осмотическую чувствительность эритроцитов.// Вісник Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна. Серія: біологія. - 2006. - Вип.3, №729. - С. 275-280. (Дисертантом проведена серія експериментів по визначенню температурної чутливості еритроцитів до дії алканолів).

3. Мелихова С.В., И. Али Саламех Аль-Салаймех, Е.Е. Нипот, Бондаренко В.А. Модифицирующее влияние n-бутанола и n-гексанола на чувствительность эритроцитов к изменению осмотических и температурных параметров среды.// Вісник проблем біології і медицини. - 2006. - Вип.1. - С. 34-42. (Дисертантом здійснені пошук, добір та підготовка літературних джерел за темою статті).

4. Нипот Е.Е., И. Али-Саламех Аль Салаймех, Мелихова С.В., Бондаренко В.А. Влияние хлорпромазина на гипотонический гемолиз эритроцитов цыплёнка.// Вісник проблем біології і медицини. - 2006. - Вип.2. - С. 54-58.(Дисертант брав участь у підборі умов експерименту).

5. Рамазанов В.В., Писаренко Н.А., И. Али Саламех Аль-Салаймех, Бондаренко В.А. Залежність між структурним станом цитоскелету та осмотичною поведінкою еритроцитів.// - Матеріали I З'їзду Українського товариства клітинної біології. - Львів, 2004.- С.57. (Дисертант брав участь у пошуці та обробці одержаної інформації).

6. Рамазанов В.В., Мелихова С.В., Маданат Важди , И. Али Саламех Аль-Салаймех, Бондаренко В.А. Факторы контроля транспорта анионов в эритроцитах при изменении температурных и осмотических параметров среды. //Матеріали I Української наукової конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”. - Харьков, 2004. - С. 121. (Дисертантом проведений експеримент по вимірюванню транспорту аніонів при зміні осмотичних умов середовища).

АНОТАЦІЯ

Іхсан Алі Саламех Аль-Салаймех. Дія анестетиків на сполучений з обміном аніонів транспорт іонів Н+ і осмотичну чутливість еритроцитів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13. - фізіологія людини і тварин. Харківський національний університет імені В.Н.Каразіна, Харків, 2006.

У дисертації досліджуються вплив n-алканолів (гексанол, бутанол) і катіонних амфіфілів (хлорпромазин) на швидкість транспорту іонів Н+, сполученого з транспортом аніонів (хлориду і сульфату) у мембрані еритроцитів, і швидкість вивільнення іонів Н+ у циклі Якобса-Стюарта, а також на рівень і швидкість гіпотонічного гемолізу еритроцитів курки і барана в середовищах, що містять електроліт (NaCl, Na2SO4) і неелектроліт (сахарозу ).

Показано, що n-алканоли зменшують швидкість транспорту іонів Н+ в еритроцити сполученого з транспортом сульфату і хлору, а отже інгібують аніонний транспорт, опосередкований білком смуги 3.

Передбачається, що розходження в ефективності досліджуваних речовин в електролітних і неелектролітних середовищах, зв'язано, імовірно, зі зміною транспортних процесів і проникності мембрани, а також з обмеженнями, що накладаються на зв'язування досліджуваних речовин з поверхнею мембрани.

Ключові слова: еритроцит, анестетики, аніонний транспорт, цикл Якобса-Стюарта, гіпотонічний гемоліз, електролітне середовище, неелектролітне середовище.

Ихсан Али Саламех Аль-Салаймех. Действие анестетиков на сопряженный с обменом анионов транспорт ионов Н+ и осмотическую чувствительность эритроцитов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. - физиология человека и животных. Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2006.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния n-алканолов (гексанол, бутанол) и катионных амфифилов (хлорпромазин) на скорость транспорта ионов Н+, сопряженного с транспортом анионов (хлорида и сульфата) в мембране эритроцитов, и скорость высвобождения ионов Н+ в цикле Якобса-Стюарта, а также на уровень и скорость гипотонического гемолиза эритроцитов курицы и барана в средах, содержащих электролит (NaCl, Na2SO4) и неэлектролит (сахарозу).

Показано, что n-гексанол и n-бутанол уменьшают скорость транспорта ионов Н+ в эритроциты сопряженного с транспортом сульфата и хлора, а следовательно ингибируют анионный транспорт, опосредованный белком полосы 3. Результаты наших экспериментов демонстрируют примерно одинаковую эффективность как n-бутанола так и n-гексанола при ингибировании транспорта ионов Н+, что предполагает схожесть механизмов их влияния на состояние анионного переносчика. Эффективность n-бутанола и n-гексанола схожа в случае эритроцитов барана и курицы, значительно различающихся по фосфолипидному составу и структуре мембраны, что может указывать на взаимодействие спиртов с интегральными белками мембраны. Некоторые отличия транспорта ионов водорода в клетку, наблюдаемые для эритроцитов барана и курицы, которые имеют место в присутствии обоих исследуемых спиртов, могут указывать на особенности фунционирования обменника, отличия в его конформации в эритроцитах разных видов, а также отличия во взаимодействии с ним алканолов.

В работе сравнивается антигемолитическая активность алканолов и хлорпромазина на гипотонический гемолиз эритроцитов барана и курицы инкубируемых в растворах электролитов и неэлектролитов при различных концентрациях исследуемых веществ. Максимальную эффективность в среде NaCl в случае эритроцитов барана проявляет гексанол, в то время как в случае эритроцитов курицы - хлорпромазин. При замене аниона хлора на анион сульфата антигемолитическая активность хлорпромазина для эритроцитов курицы немного снижается, тогда как бутанола и гексанола увеличивается. Для эритроцитов барана антигемолитическая активность указанных веществ достоверно не изменяется. При замене электролитной среды на неэлектролитную антигемолитическая активность спиртов и хлорпромазина существенно уменьшается при осмотическом воздействии на оба вида эритроцитов. Исключением является гексанол, который сохраняет свою протектирующую активность по отношению к эритроцитам барана независимо от состава среды.

Предполагается, что различия в протектирующей эффективности исследуемых веществ в электролитных и неэлектролитных средах, связано, вероятно, с изменением транспортных процессов и проницаемости мембраны в неэлектролитной среде в результате чего защитное действие бутанола снижается. С другой стороны, менее выраженная антигемолитическая активность спиртов в неэлектролитной среде может быть связана с ограничениями, накладываемыми на связывание исследуемых веществ с поверхностью мембраны при изменении электростатических свойств ее поверхности. Более эффективное действие хлорпромазина в случае эритроцитов курицы по сравнению с эритроцитами барана может быть связано с различиями в динамике гипотонического гемолиза этих двух видов клеток. С другой стороны, нельзя исключить различную способность хлорпромазина встраиваться в мембраны эритроцитов разных видов, так как они значительно различаются по фосфолипидному составу.

Ключевые слова: эритроцит, анестетики, анионный транспорт, цикл Якобса-Стюарта, гипотонический гемолиз, электролитная среда, неэлектролитная среда.

Ihsan Ali Salameh Аl-Salameh. Еffects of anestetics on Н+-transport connected with anion-transport and red blood cells sensitivity to change of osmotic conditions of milieu. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.13. - human and animal physiology. V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv,2006.

The dissertation is denoted to research of influence n-alkanols (butanol, hexanol) and cations amphiphils (chlorpromazine) on a transport rate of hydrogen ion connected with anion-transport in red blood cells membrane and a rate of releasing hydrogen ion in extracellular medium in cycle Jacobs-Stewart and hypotonic lysis of sheep and avian erythrocytes in electrolyte (NaCl, Na2SO4) or nonelectrolitic (sucrose) milieu.

Obtained results testify that n-alkanols modification of a transport rate of hydrogen ion connected with anion-transport in red blood cells membrane and that interact with band 3 protein in red cells by changing its functional state.

It is supposed, that the differences in protective efficiency of n-alkanols in electrolyte (NaCl, Na2SO4) or nonelectrolitic (sucrose) milieu depend on transport changes and their permeability in relation to cell membrane.

Key-words: red cell, anestetics, anion transport, Jacobs-Stewart cycle, hypotonic lysis, electrolyte milieu or nonelectrolitic milieu.

Размещено на Allbest.ru