Размещено на http://www.allbest.ru/

Чернівецький національний університет

імені Юрія Федьковича

УДК 577.113 + 575.852

Мінливість рДНК рослин та її використання

в якості молекулярного маркера

03.00.04. - бiохiмiя

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

Давидюк Юрій Миколайович

Чернiвцi - 2006

АНОТАЦІЯ

Давидюк Ю.М. Мінливість рДНК рослин та її використання в якості молекулярного маркера. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук за спеціальністю 03.00.04. - біохімія. - Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2006.

В дисертації вивчалась організація, характер мінливості та закономірності успадкування повторів рДНК при внутрішньовидовій гібридизації у представників виду Zea mays, родів Narcissus і Nicotiana. Виявлено помірну гетерогенність форм кукурудзи за довжиною МГС і за нуклеотидною послідовністю. Встановлено, що гібридні форми кукурудзи успадковують варiанти рДНК, характернi для обох батькiвських форм, і повтори рДНК виду Zea mays є стійкими до перебудов при гібридизації. Обгрунтовано можливість застосування рДНК як маркера для молекулярної паспортизації та ідентифікації ліній і гібридів кукурудзи.

У представників роду Narcissus виявлено значний поліморфізм повторів рДНК за довжиною та наявністю/відсутністю сайтів впізнавання використаних ендонуклеаз в МГС. Доведено придатність рДНК як молекулярного маркера для визначення предкових видів сучасних культурних сортів виду Narcissus x hybridus hort.

Знайдено, що для видів Nicotiana характерна внутрiшньовидова гомогенність повторiв рДНК за довжиною. Зроблено висновок про можливість ідентифікації видів тютюнів за наявністю, кількістю та локалізацією сайтів впізнавання окремих ендонуклеаз в МГС. Обгрунтовано придатність рДНК як маркера для якісного визначення ступеня спорідненості видів в роді Nicotiana і з'ясування питань систематики та філогенії в межах роду.

Встановлено нуклеотидну послідовність 5' ЗТС виду N. paniculata та доведено можливість використання порівняльного аналізу послідовностей 5' ЗТС для кількісної оцінки ступеня спорідненості видів тютюнів.

Ключові слова: мінливість рДНК, молекулярний маркер, молекулярна ідентифікація, рестрикційне картування, сиквенування, успадкування.

АННОТАЦИЯ

Давидюк Ю.М. Изменчивость рДНК растений и её использование в качестве молекулярного маркера. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. - Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Черновцы, 2006.

В диссертации изучалась организация, характер изменчивости и закономерности наследования повторов рДНК при внутривидовой гибридизации у представителей вида Zea mays, родов Narcissus и Nicotiana. Обнаружена невысокая степень гетерогенности форм кукурузы по длине большого межгенного спейсера (МГС), обусловленная, очевидно, разным количеством субповторов в области, прилегающей к 3'-концу гена 25S рРНК. Выявлена гетерогенность по последовательности, проявляющаяся в наличии/отсутствии сайтов узнавания эндонуклеазы HindIII в МГС у части исследованых форм. Установлено, что гибриды кукурузы наследуют варианты рДНК, характерные для обоих родительских, и повторы рДНК вида Z. mays проявляют устойчивость к перестройкам при гибридизации. Обоснована возможность применения рДНК в качестве маркера для молекулярной паспортизации и идентификации линий и гибридов кукурузы.

У представителей рода Narcissus обнаружен значительный полиморфизм повторов рДНК по длине и наличию/отсутствию сайтов узнавания отдельных эндонуклеаз в МГС. Различие в длине повторов рДНК связано с центральной частью МГС, в то время как участки, граничащие с генами 18S и 25S рРНК, близки по размерам. Особенности организации МГС исследованных форм нарциссов могут быть использованы для создания более совершенной классификации, поскольку существующая не всегда соответствует видовому происхождению культурных сортов. Доказано, что рДНК может найти применение как молекулярный маркер для определения предковых видов культурных сортов вида Narcissus x hybridus hort.

Обнаружена внутривидовая гомогенность размеров повторов рДНК у видов Nicotiana. Проведённый рестриктный анализ выявил специфические черты в строении рДНК видов Nicotiana из различных географических регионов. Для всех исследованных видов характерно наличие в центральной части МГС сайтов узнавания эндонуклеазы DraI, маркирующих АТ-богатую область. Строение участка МГС, граничащего с 5'-концом гена 18S рРНК, проявляет значительную степень подобности. У видов секции Paniculatae в указанной области найден сайт узнавания эндонуклеазы EcoRI, что может рассматриваться как специфическая черта видов, относящихся к данной секции. Наибольшие отличия обнаружены в строении области, прилегающей к 3'-концу гена 25S рРНК. Для южноамериканских видов характерно наличие в данной области сайтов узнавания XbaI, у австралийских видов такие XbaI-сайты не обнаружены. В целом, в строении МГС южноамериканских и австралийских видов выявлены характерные черты, присущие каждой группе. N. africana занимает промежуточное положение между двумя группами, что служит одним из аргументов в пользу выделения его в отдельную секцию. Сделан вывод о возможности идентификации видов табаков методом рестриктного анализа рДНК. Обосновано возможное использование рДНК в качестве маркера для качественного определения степени близости видов в роде Nicotiana и выяснения вопросов систематики и филогении в пределах рода.

Установлена нуклеотидная последовательность 5' внешнего транскрибируемого спейсера (5'ВТС) вида Nicotiana paniculata и проведён сравнительный анализ с последовательностями N. sylvestris, N. tabacum и N. tomentosiformis. В пределах 5'ВТС выделены три области: 1) уникальная последовательность, начинающаяся от сайта инициации транскрипции, с высокой степенью подобия у сравниваемых видов; 2) область субповторов; 3) уникальная последовательность, граничащая с 5'-концом гена 18S рРНК, также с высокой степенью подобия. Наибольшие различия найдены в области субповторов. Предложен возможный механизм молекулярной эволюции в области субповторов 5'ВТС N. paniculata. Доказана возможность использования сравнительного анализа последовательностей 5'ВТС для количественной оценки степени близости видов табаков.

Ключевые слова: изменчивость рДНК, молекулярный маркер, молекулярная идентификация, рестриктное картирование, сиквенирование, наследование.

ABSTRACT

Davidjuk Y.M. Variability of plant rDNA and its using as the molecular marker. - Manuscript.

The thesis for the candidate's degree in speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Chernivtsi National University named Yurij Fed'kovich, Chernivtsi, 2006.

Molecular organization and variability of ribosomal DNA (rDNA) and its inheritance in hybrids were studied in Zea mais and in several Narcissus and Nicotiana species. In maize, a moderate length and sequence heterogeneity was found in intergenic spacer region (IGS) of rDNA. Ribosomal DNA variants characteristic for both parental forms were detected in sexual hybrids demonstrating that in maize rDNA remains unaltered after hybridization. Therefore, the structural features of rDNA may be used for molecular identification of breading lines, varieties and hybrids of maize.

A significant length and sequence heterogeneity of IGS was revealed in genus Narcissus applying rDNA restriction mapping. Respectively, rDNA represents a proper molecular marker for identification of parental species of modern vegetatively propagated cultivars of Narcissus x hybridus hort.

In the Nicotiana species studied intragenomic length homogeneity of rDNA was observed. Each of the species can be discriminated according to the presence/absence or localization of certain restriction sites in the IGS. Suitability of rDNA as a marker for the molecular phylogeny reconstruction in the genus Nicotiana was demonstrated.

The 5' external transcribed spacer (ETS) of rDNA of Nicotiana paniculata was cloned, sequenced and compared with the 5' ETS sequence data available for other Nicotiana species. A scheme reflecting amplification of A-subrepeats during molecular evolution of the 5' ETS of N. paniculata was proposed.

Key words: rDNA variability, molecular marker, molecular identification, restriction mapping, sequencing, inheritance.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, ст. н. с., Волков Роман Анатолійович, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, завідувач кафедри молекулярної генетики та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України, професор, ГРИГОРЮК Іван Панасович, Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, професор кафедри екобіотехнології і біорізноманіття

кандидат біологічних наук, ст.н.с. СПІРІДОНОВА Катерина Василівна, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу генетики клітинних популяцій

Провідна установа: Дніпропетровський національний університет, кафедра біофізики та біохімії, м. Дніпропетровськ

Захист відбудеться “01” листопада 2006 року о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05. у Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 25, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича (58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23).

Автореферат розісланий “28” вересня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ведення цілеспрямованої роботи по створенню високопродуктивних сортів сільськогосподарських рослин вимагає глибоких досліджень геному, в тому числі і на молекулярно-біохімічному рівні, з'ясування механізмів функціонування окремих генів і мультигенних родин, закономірностей їх експресії та успадкування. Для проведення таких досліджень необхідно мати в розпорядженні надійні молекулярно-генетичні маркери, структура яких залишається стійкою до перебудов при гібридизації. Такі маркери мають бути придатними для ідентифікації окремих ділянок геному, здійснення необхідних операцій з ними та надавати можливість проведення молекулярної паспортизації видів і сортів.

Одним із таких молекулярних маркерів можуть служити гени, що кодують 18S, 5.8S та 25S рРНК (35S рДНК). Характерною рисою структури рДНК є різний ступінь мінливості окремих їх ділянок у рослин з різних таксономічних груп. Але причини, механізми та масштаби цієї мінливості залишаються недостатньо вивченими.

Організація рДНК вивчалася, зокрема, у представників родин Fabaceae, Brassicaceae, Rosaceae, Poaceae, Solanaceae. Однак, і на сьогодні багато родів цих родин все ще не охоплені дослідженнями. Також невивченими залишаються багато інших родин, зокрема Amaryllidaceae.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Експериментальна частина роботи виконувалась на кафедрі біохімії та експериментальної екології Чернівецького державного університету ім. Ю. Федьковича в межах наукових тем “Розробка способів одержання і оцінки селекційно-цінних форм сільськогосподарських рослин на основі біотехнологічних підходів” № держреєстрації 0193U023681; “Вивчення структури та молекулярної еволюції зовнішнього транскрибованого спейсеру генів 18S та 25S рРНК у рослин родини Пасльонових” № держреєстрації 0196U012065; “Молекулярна організація та регуляція транскрипції генів рРНК: пошук cis-елементів в великому міжгенному спейсері” № держреєстрації 0198U002761; наукової програми “Дослідження механізмів мінливості та адаптації організмів, розробка на цій основі біотехнологічних методів скринінгу, моніторінгу та отримання нових генотипів з високою адаптивністю та продуктивністю”. Експерименти по розшифровці первинної нуклеотидної послідовності рДНК Nicotiana paniculata проводились у межах договору про творче співробітництво з науковцями біологічного факультету університету м. Тюбінген, Німеччина.

Мета та завдання дослідження. Метою даного дослідження є вивчення особливостей будови та характеру мінливості ділянок рДНК у покритонасінних рослин з різних родин (Poaceae, Amaryllidaceae, Solanaceae) та їх гібридних форм, а також поглиблення розуміння молекулярних механізмів цієї мінливості у зв'язку з потенційною можливістю застосування рДНК в якості молекулярного маркера.

Для досягнення поставленої мети було заплановано виконати такі завдання: днк рослина молекулярний покритонасінний

- дослiдити характер та масштаби мiнливостi повторiв рДНК у представників родів Zea, Narcissus, Nicotiana;

- вивчити спосiб успадкування рДНК при внутрiшньовидовiй гiбридизацiї;

- оптимізувати методику та клонувати дiлянку спейсера рДНК Nicotiana paniculata, встановити її первинну нуклеотидну послідовність та провести порівняльний аналіз з аналогічними ділянками Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana sylvestris та Nicotiana tabacum;

- обгрунтувати можливостi використання особливостей будови рДНК як молекулярного маркера для молекулярної паспортизацiї видiв та сортiв вищих рослин.

Об'єкт дослідження - рДНК представників родів Zea, Narcissus і Nicotiana.

Предмет дослідження - будова та мінливість рДНК у вищих рослин родів Zea, Narcissus і Nicotiana та спосіб успадкування рДНК при внутрішньовидовій гібридизації.

Методи дослідження. При проведенні дослідження використовувались методи виділення та очищення ДНК з рослинного матеріалу, поліморфізму довжин рестриктних фрагментів (ПДРФ), блот-гібридизації, радіоавтографії, ампліфікації фрагментів ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), клонування продуктів ПЛР та скринінгу бактеріальних колоній, сиквенування фрагментів ДНК, методи математичної обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. В дослідженні обгрунтовано можливість проведення молекулярної паспортизації ліній та сортів культурних рослин та видів вищих рослин з різних таксономічних груп за сукупністю характеристик рДНК. Вперше проведено дослідження організації рДНК у представників роду Narcissus, деяких південноамериканських, австралійських та африканського видів роду Nicotiana, а також виявлено видоспецифічні характеристики її будови. Досліджено успадкування рДНК при внутрішньовидовій гібридизації у кукурудзи (Zea mays) та доведено, що рДНК у цього виду є стійкою до перебудов при гібридизації. Вперше встановлено первинну нуклеотидну послідовність 5'-зовнішнього транскрибованого спейсера (5' ЗТС) рДНК Nicotiana paniculata та проведено порівняльний аналіз з аналогічними ділянками видів Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana sylvestris та Nicotiana tabacum.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, представлені у роботі, розширюють і поглиблюють знання про організацію рДНК у представників родів Zea, Narcissus і Nicotiana. Отримані дані можуть бути використані при проведенні молекулярної паспортизації та ідентифікації ліній та сортів кукурудзи, сортів і видів нарцисів, а також видів тютюнів. Виявлені особливості будови рДНК досліджених видів є корисними для вирішення питань систематики та філогенії в родах Narcissus та Nicotiana. Результати роботи впроваджено в навчальний процес ЧНУ імені Юрія Федьковича на кафедрі молекулярної генетики та біотехнології біологічного факультету при підготовці лекційних і лабораторних занять з молекулярної генетики та Чернівецького факультету НТУ “ХПІ” на кафедрі екології і права при підготовці лекційних та лабораторних занять з біохімії. Представлені результати можуть також знайти застосування при підготовці занять з таких навчальних дисциплін як молекулярна біологія та ботаніка.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів пошук та аналіз літературних джерел, виконав експериментальну частину роботи, математичну обробку та попередній аналіз даних. Планування етапів роботи, аналіз отриманих даних та обговорення результатів дослідження проводилось з науковим керівником. При проведенні окремих експериментів технічну допомогу надавали студенти біологічного факультету Чернівецького державного університету В.І. Шевчук та Н.Є. Комарова.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на науковій конференції викладачів, спiвробiтників та студентiв, присвяченій 120-рiччю заснування Чернiвецького університету (Чернiвцi, 1995); ІІ Міжнародній науковій конференції молодих вчених “Молодь і досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2005); науковому семінарі кафедри молекулярної генетики та біотехнології (Чернівці, 2005).

Публікації. Результати роботи опубліковані в п'ятьох статтях, одному депонованому рукописі та одних тезах доповіді наукової конференції.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, розділу результатів досліджень і їх обговорення, висновків, списку використаних джерел, додатку. Робота викладена на 127 сторінках машинописного тексту і містить 37 рисунків і 9 таблиць. Список літератури складається із 187 джерел і розміщений на 19 сторінках. Додаток розміщений на 2 сторінках.

Огляд літератури

В першому розділі роботи представлено огляд літературних джерел, в якому подано узагальнену інформацію про молекулярно-біохімічні методи аналізу генома та використання результатів досліджень ДНК для вирішення питань систематики та філогенії. Особливу увагу приділено сучасному стану досліджень будови рДНК, особливостям її успадкування при міжвидовій гібридизації, застосуванню порівняльного аналізу послідовностей областей рДНК з різною швидкістю молекулярної еволюції для оцінки ступеня спорідненості різних таксономічних груп вищих рослин.

Матеріали та методи досліджень

Організація та мінливість рДНК вивчалась у ліній та гiбридних форм виду Zea mays L. (рис. 1); культурних сортiв виду Narcissus x hybridus hort.: Голден Харвест (Golden Harwest), Бiршеба (Beersheba), Вiкторiя бiколор (Victoria bicolor), Смарагд (Smaragd), Бiнкi (Bincie), Актеа (Actaea) і диких видiв роду Narcissus L.: N. tazetta L. i N. angustifolius Curt.; та 12 видів роду Nicotiana L., що належать до різних підродів: 1) підрід Petunioides (Don) Goodsp.: N. trigonophylla Dunal (секція Trigonophyllae Goodsp.), N. repanda Willd. (секція Repandae Goodsp.), N. noctiflora Hooker. (секція Noctiflorae Goodsp.), N. nudicaulis S.Watson (секція Nudicaules Goodsp.), N. suaveolens Lehm., N. excelsior J.M.Black, N. megalosiphon Van Huerck & Mьll.Arg., N. debneyi Domin, N. africana Merxm. (секція Suaveolentes Goodsp.); 2) підрід Rustica (Don) Goodsp.: N. knigtiana Goodsp., N. paniculata L., N. solanifolia Walp. (секція Paniculatae Goodsp.)

Сумарну ДНК виділяли з 3-4-х денних етильованих паростків кукурудзи, пелюсток квітів у фазі цвітіння нарцисів, вирощених у відкритому грунті в Ботанічному саду Чернівецького державного університету ім. Ю. Федьковича, верхніх листків у фазі цвітіння тютюнів, вирощених в оранжереї Чернівецького державного університету ім. Ю. Федьковича. Очищення ДНК від РНК проводили методом гель-фільтрації на колонці з сефарозою 4В-СL. Концентрацiю ДНК в препаратах визначали спектрофотометрично на СФ-26.

Рестрикційне картування. Для розщеплення рДНК були використанi ендонуклеази рестрикції EcoRI, EcoRV, BamHI, DraI, HindIII, XbaI. Розділення фрагментів рестрикції проводили методом електрофорезу в агарозному гелі. Перенесення фрагментiв ферментативного гiдролiзу ДНК на капроновi фiльтри та подальшу гібридизацію проводили за методом Саузерна. Як молекулярнi зонди для гібридизації використовувалися клоновані фрагменти рДНК Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis та Solanum tuberosum, що мiстили фрагменти генів 18S і 25S pPНК, а також 18S та 25S pPНК Zea mays. Зонди для гібридизації мiтили iзотопом фосфору ³²Р за допомогою методу статистичного праймування. Питома активнiсть зондiв становила 1.5-2.0 · 10⁸ Бк/мкг ДНК. Розподiл радiоактивностi на фiльтрi вивчали методом радiоавтографiї з використанням плiвки РМ-В i пiдсилюючих екранiв ЭУ-В3. На основi результатiв розшифровування та аналiзу послiдовностей рДНК, наявних в лiтературi, було побудовано рестриктнi карти.

Клонування та сиквенування. Для ампліфікації ЗТС методом полімеразної ланцюгової реакції використовувались праймери Pr-TIS (5'-AACATGTCTACTCCTGCAGCTTGG-3') і Pr-18S (5'-ATGACTACTGCAGGAT CAACCAGG-3') та ДНК-полімерази Tfl, Taq і Vent. Для розрахунку праймерів було використано послідовності великого міжгенного спейсера (МГС) та 5'-кiнця гена 18S рРНК N. tabacum, N. tomentosiformis та N. sylvestris, зі змінами, пов'язаними із введенням у праймери послідовності сайту впізнавання ендонуклеази рестрикції PstI з метою подальшого клонування. Ампліфікацію ДНК проводили у пробі загального об'єму 50 мкл складу: 1-кратний буфер для ДНК-полімерази, по 1 мкМ праймерів, 1.5 мМ MgSO₄, 20 мкМ dNTP, ДНК-полімерази - 2 од. акт./пробу, ДНК - 50 нг/пробу. ПЛР-ампліфікація проводилась за програмою: (1) початкова денатурація ДНК при 94°С - 3 хв; (2) 30 циклів при 94°С - 1 хв 30 с; 55°С - 1 хв 30 с; 72°С - 2 хв; (3) закінчення ампліфікації при 72°С - 10 хв; (4) припинення ампліфікації при +4°С. Продукти ПЛР аналізували шляхом електрофорезу в агарозному гелі і очищували з використанням стандартних процедур. Очищені ПЛР-продукти лігували у PstI-сайт вектору pUC18, і трансформували у лінію E. coli XL-blue з використанням CaCl₂. Трансформованi клiтини висаджували в агаризоване середовище 2YT з ампiцилiном (100 мг/л). Скринінг колоній здійснювали методом blue-white colony selection. З вiдiбраних колонiй методом лужного лізису виділяли рекомбiнантнi плазмiди, визначали в них розташування сайтiв впiзнавання ендонуклеаз рестрикції, використаних ранiше при рестрикційному картуваннi, та проводили сиквенування кiнцевих дiлянок вставки з використанням Big Due Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматичному сиквенаторі ABI Prism 310 (“PE Applied Biosystems”) i зiставлення їх з наявними в лiтературi послiдовностями генiв 18S та 25S рРНК. За результатами скринінгу було відібрано три клони, що містили 5' ЗТС N. paniculata, вставки яких було сиквеновано повністю з використанням праймерів Pr-TIS і Pr-18S.

Обробку даних сиквенування та зіставлення первинної нуклеотидної послідовності 5' ЗТС N. paniculata, N. tomentosiformis, N. sylvestris та N. tabacum проводили за використанням комп'ютерної програми Lasergene/MegAlign з пакету DNASTAR (1998). Для математичної обробки та аналізу отриманих даних застосовувались різні комбінації вихідних параметрів, оптимальні параметри визначались методом добору.

Результати досліджень та їх обговорення

Мінливість рДНК у кукурудзи та її успадкування у гібридів. На першому етапі метою роботи було порівняльне вивчення організації рДНК у різних ліній і сортів кукурудзи та у їх гібридів, закономірностей успадкування рДНК при внутрішньовидовій гібридизації та з'ясування можливості використання особливостей будови рДНК для молекулярної паспортизації та ідентифікації сортів. Для порівняння організації рДНК у батьківських та гібридних форм було застосовано метод рестрикційного картування. В результаті проведеного аналізу ПДРФ встановлено, що досліджені нами форми відрізняються за наявністю в геномi одного або двох варiантів повторiв рДНК різної довжини та наявністю/відсутністю в рДНК-повторах сайтів впізнавання ендонуклеаз EcoRI, HindIII (рис. 2, табл. 1).

Для досліджених нами форм кукурудзи характерна нижча варіабельність довжин повторів рДНК порівняно із літературними даними (Rocheford T.R. et al., 1990), що може бути зумовлено елімінацією інших варіантів повторів в процесі селекції. Нами виявлено, що сайти впiзнавання ендонуклеази HindIII розташованi в області 3' ЗТС лише у частини дослiджених форм кукурудзи. Поліморфність знайдених HindIII-сайтів дає можливість використання їх як молекулярного маркера для ідентифікації ліній і гібридів у виді Zea mays.

Відомо, що у природних і штучних гібридів рослин може відбуватися швидка перебудова батьківских рДНК (Joly S. et al., 2004). Це проявляється як повна або часткова елімінація рДНК одного з батьків, або навіть як поява нових варіантів повторів рДНК за рахунок зміни кількості субповторів, що розташовані до або після сайту ініціації транскрипції.

На відміну від даних літератури, результати наших досліджень показують, що у геномах досліджених гiбридiв кукурудзи присутнi тiльки варiанти повторiв рДНК, якi є у геномах вихiдних форм, тобто рДНК не зазнає структурних перебудов.

Таблиця 1

Поліморфізм довжин повторiв рДНК та сайтів впізнавання ендонуклеаз рестрикції HindIII і EcoRI у дослiджених форм кукурудзи

Примітки: 1. * - за точку відліку прийнято 5'-кінець гена 18S рРНК;

2. ** - вказана лише локалізація поліморфних сайтів рестрикції.

З літератури відомо, що iнтенсивнiсть синтезу рРНК у гетерозисних гiбридiв вища, ніж у вихідних форм. Існує також припущення, що iнтенсивнiсть транскрипцiї рДНК може бути пов'язана з кiлькiстю субповторiв у складi МГС, які функціонують як енхансери. Тому підвищений синтез рРНК у гетерозисних гібридів міг би бути зумовлений вибірковою ампліфікацією повторів рДНК з більшою кількістю субповторів. Нашi результати, проте, не підтверджують такого припущення, оскільки мiж вихiдними формами та гiбридами кукурудзи немає рiзницi по довжинi МГС, тобто по кiлькостi субповторiв. Таким чином, можна стверджувати, що пiдвищена iнтенсивнiсть синтезу рРНК у порiвняннi з вихiдними формами, яка характерна для гетерозисних гiбридiв, не пов'язана зi змiною кiлькостi субповторiв у МГС.

Особливості організації рДНК у представників роду Narcissus. Дослідження рДНК різних форм кукурудзи виявило помірний рівень гетерогенності, що може бути пояснено процесом гомогенізації повторів рДНК внаслідок селекції. Внутрішньовидове схрещування, ймовірно, приводить до значних відмінностей між геномами сучасних форм кукурудзи та предкових диких видів. У зв'язку з цим видавалось актуальним вивчення організації рДНК у видів культурних рослин, які розмножуються нестатевим шляхом. Оскільки з часу виведення культурних сортів виду Narcissus x hybridus hort. їх подальше розмноження відбувалося практично тільки вегетативно, то можна сподіватися, що геноми сучасних рослин містять у незмінному вигляді успадковані геноми предкових видів. Тому, на другому етапі досліджень було проведено вивчення та порівняльний аналіз організації рДНК культурних сортів та диких видів роду Narcissus.

В результаті проведеного аналізу ПДРФ встановлено, що в геномах всіх досліджених представників роду Narcissus міститься по два або три варіанти повторів рДНК, які відрізняються за довжиною (табл. 2).

Таблиця 2

Довжини повторів рДНК досліджених представників роду Narcissus

Примітки: 1. “ * ” - позначені повтори, в МГС яких присутні додаткові сайти впізнавання використаних ендонуклеаз рестрикції;

2. “ ' ”- позначені мінорні послідовності.

Локалізація сайтів впізнавання застосованих ендонуклеаз в кодуючій області є практично однаковою у всіх досліджених форм. Лише у сорту Смарагд в частині повторів рДНК виявлені додаткові сайти впізнавання XbaI та EcoRI. Це, імовірно, пов'язано з мікрогетерогенністю по послідовності, як було продемонстровано раніше для злаків (Вахитов В.А., 1989).

Розміри МГС у досліджених представників роду Narcissus варіюють у доволі широких межах. Зіставлення локалізації сайтів впізнавання використаних ендонуклеаз у МГС різних форм нарцисів дозволяє стверджувати, що наявна різниця за довжиною пов'язана переважно з центральною частиною МГС, тоді як ділянки 3' ЗТС та 5' ЗТС мають постійну довжину (рис. 3). Найбільш імовірно, що це пов'язано з різною кількістю субповторів у центральній частині МГС.

Більшість із досліджених представників роду Narcissus є культурними сортами, які були отримані шляхом багаторазової гібридизації на основі кількох диких видів. Існуюча класифікація нарцисів зараховує всі культурні сорти до виду Narcissus x hybridus hort. і поділяє їх на групи залежно від морфологічних ознак будови квітки. Дані картування рДНК показують, що включені до групи 1 три сорти, походження якої пов'язують із N. pseudonarcissus, значно подібні за будовою МГС, тобто результати рестрикційного аналізу підтверджують уявлення про спільність походження сортів групи 1.

Стосовно сортів, що належать до групи 2, то сорт Бінкі демонструє значну подібність до сортів групи 1 за довжиною повторів і наявністю сайту ЕсоRV. Водночас сорт Смарагд за цими характеристиками помітно відрізняється від усіх згаданих сортів та демонструє подібність до сорту Актеа (група 9), походження якої пов'язують із N. роеticus. Отже, на підставі результатів рестрикційного аналізу рДНК можна стверджувати, що в групі 2 об'єднані сорти, що мають різне походження.

В групу 10 умовно об'єднані всі дикі види. Дані рестрикційного аналізу рДНК видів N. tazetta та N. angustifolius показують, що вони значно відрізняються як за довжиною та кількістю варіантів повторів рДНК, так і за наявністю та кількістю BamHI-, HindIII-, і EcoRV-сайтів у МГС. Таким чином, об'єднання всіх диких видів в одну групу є необгрунтованим.

Мінливість рДНК у видів роду Nicotiana. Аналіз результатів дослідження організації рДНК у представників виду Zea mays і роду Narcissus надав підстави для висновку про можливість застосування рДНК в якості молекулярного маркера для ідентифікації ліній, гібридних форм і сортів. Тому на третьому етапі досліджень було проведено вивчення організації рДНК у роді Nicotiana з метою з'ясування питання щодо її придатності як маркера для встановлення філогенетичних зв'язків та ступеня спорідненості видів у межах роду. Порівняльний аналіз організації рДНК проводився у тютюнів з різних географічних регіонів, що об'єднуються в один підрід Petunioides, зокрема і для перевірки обгрунтованості такого об'єднання.

За результатами проведеного рестрикційного аналізу було встановлено, що в геномi кожного виду присутнiй лише один варiант довжини повтору рДНК (табл. 3).

Таблиця 3

Географічне походження дослiджених видiв роду Nicotiana та довжини повторiв рДНК

Нами знайдено, що всі досліджені види мають подібну органiзацiю кодуючих дiлянок та внутрішніх транскрибованих спейсерів і суттєво відрізняються за будовою МГС (рис. 4). Аналiз рестриктних карт виявив, що для всiх видiв характерна наявнiсть в центральнiй частинi МГС двох-трьох сайтiв впiзнавання ендонуклеази DraI. З літературних джерел відомо, що аналогічні DraI-сайти маркують АТ-багату ділянку МГС, характерну для багатьох видів дводольних рослин (Волков Р.А. та ін., 2003). Між АТ-багатою дiлянкою та геном 18S рРНК в МГС розташована дiлянка, в якiй локалiзованi сайти впізнавання ендонуклеази HindIII. Для більшості пiвденноамериканських видiв характерна наявнiсть двох таких сайтiв, в той час як з австралiйських видiв тiльки у N. excelsior виявлено два HindIII-сайти, у iнших - наявний лише один iз двох сайтiв. Аналiз наведених в літературі сиквенсів аналогiчної дiлянки МГС трьох видів Niconiana (Волков Р.А., 1995) показав, що вона складається з субповторiв, які мiстять послiдовностi, що вiдповiдають сайту впізнавання HindIII, або такі, що вiдрiзняються вiд нього на одну-двi нуклеотидні замiни. Отже, втрата-набуття HindIII-сайтiв в цiй дiлянцi є досить імовiрною подiєю, враховуючи значну швидкiсть еволюцiї МГС.

У видів N. knigtiana, N. paniculata та N. solanifolia в 5' ЗТС виявлений сайт впізнавання ендонуклеази EcoRI, характерний для багатьох видів родини Solanaceae. У решти досліджених нами видів, що належать до інших секцій, такого EcoRI-сайту не виявлено. Це дозволяє припустити, що даний сайт, який був успадкований предковим видом роду Nicotiana, в процесі незалежної еволюції був втрачений більшістю видів роду і зберігся тільки у представників секції Paniculatae.

Найбільші відмінності знайдено в дiлянці МГС, що безпосередньо межує iз 3'-кiнцем гена 25S рРНК. Для більшості тютюнів, що походять із Пiвденної Америки, нами виявлено наявність характерного сайту впізнавання ендонуклеази XbaI в межах ділянки, розташованої на відстані 200-500 пн вiд 3'-кiнця гена 25S рРНК. Порівняння цих результатів з результатами попередніх досліджень, проведених в нашій лабораторії, дозволяє зробити висновок, що наявність XbaI-сайтів є специфічною ознакою бiльшостi дослiджених пiвденноамериканських видiв. Водночас, у австралiйських видiв тютюнів в аналогiчнiй дiлянцi МГС таких XbaI-сайтiв не знайдено, що можливо, є наслiдком незалежної еволюцiї видiв секцiї Suaveolentes пiсля виникнення географiчної iзоляцiї мiж Австралiєю та Пiвденною Америкою. Однак, сайт впізнавання XbaI був знайдений нами в МГС африканського виду N. africana, який включений до тієї ж секції Suaveolentes, причому локалізація сайту співпадає з локалізацією у південноамериканських видів N. trigonophylla та N. noctiflora. З лiтературних джерел вiдомо, що внесення N. africana до секцiї Suaveolentes до певної мiри умовне. Наші результати пiдтверджують думку про вiдокремлене положення N. africana в секцiї Suaveolentes та можливе виділення його в окрему секцію.

В цілому, результати рестрикційного аналізу виявили значну подібність в організації МГС у південноамериканських видів тютюнів. Особливо близькими за будовою МГС виявились види N. knigtiana, N. paniculata та N. solanifolia, які об'єднуються традиційною класифікацією в одну секцію. Високий ступінь подібності в організації МГС виявлено і у досліджених австралійських тютюнів, що об'єднані в секцію Suaveolentes. За набором знайдених сайтів впізнавання використаних ендонуклеаз в МГС австралійські види значно відрізняються від південноамериканських. Африканський вид N. africana за організацією МГС демонструє приблизно однаковий ступінь подібності до обох груп, займаючи промiжне становище мiж австралiйськими та пiвденноамериканськими видами.

На відміну від результатів дослідження організації рДНК представників виду Zea mays і роду Narcissus, результати рестрикційного аналізу видів роду Nicotiana засвідчуюють відсутність поліморфізму по кількості повторів рДНК у тютюнів. Водночас, один вид роду Nicotiana від іншого відрізняється за довжиною повторів рДНК і за наявністю, кількістю та локалізацією сайтів впізнавання використаних ендонуклеаз в МГС.

Сиквенування 5' ЗТС Nicotiana paniculata та порівняльний аналіз його первинної нуклеотидної послідовності. Проведений аналіз довжин фрагментів рестрикції, побудова та зіставлення рестриктних карт рДНК видів роду Nicotiana дали можливість якісно оцінити ступінь їх спорідненості та обгрунтувати придатність рДНК як молекулярного маркера при ідентифікації видів та вирішенні питань систематики в межах роду. Для кількісного визначення ступеня спорідненості видів, з'ясування механізмів молекулярної еволюції та оцінки її швидкості в різних підродах роду Nicotiana на заключному етапі роботи нами було проведено сиквенування 5' ЗТС N. paniculata та зіставлення його нуклеотидної послідовності з послідовностями 5' ЗТС N. tomentosiformis, N. tabacum та N. sylvestris. Первинну нуклеотидну послідовність вказаних трьох видів було раніше встановлено в результаті досліджень, проведених в нашій лабораторії (Волков Р.А., 1995). Вибір для проведення сиквенування саме 5' ЗТС N. paniculata був зумовлений, по-перше, належністю даного виду до ще не дослідженого підроду роду Nicotiana; по-друге, тим, що N. paniculata є одним із батьківських видів культивованого виду N. rustica; по-третє, тим, що послідовності 5' ЗТС відіграють важливу роль в транскрипції та процесингу пре-рРНК і порівняльний аналіз їх первинної структури може бути корисним для поглиблення розуміння цих процесів.

В результаті проведеного сиквенування виявлено, що довжина 5' ЗТС N. paniculata складає 1710 пн. Аналіз первинної нуклеотидної послідовності показав, що в межах 5' ЗТС N. paniculata можна виділити три області: 1) унікальну послідовність, що починається від сайту ініціації транскрипції (область І); 2) область субповторів (область ІІ); 3) унікальну область, що межує з 5'-кінцем гена 18S рРНК (область ІІІ, яка поділяється на підобласті ІІІа та ІІІб) (рис. 5).

Довжина області I у N. paniculata - 184 пн, що є близьким за значенням до довжини аналогічної області у N. sylvestris (181 пн), N. tabacum (186 пн) і N. tomentosiformis (185 пн). Порівняльний аналіз нуклеотидної послідовності області І виявляє високий рівень подібності між даними видами, що свідчить про відносно високу еволюційну стабільність даної області та відносно низьку швидкість молекулярної еволюції. Ймовірно, що це пов'язано зі значенням даної області для ініціації транскрипції рДНК.

Область II завдовжки 967 пн у N. paniculata, значно відрізняється за довжиною від аналогічної області у N. sylvestris (697 пн), N. tabacum (2263 пн) і N. tomentosiformis (1416 пн). За результатами аналізу нуклеотидної послідовності та її зіставлення з літературними даними (Волков Р.А., 1995; Volkov R.A. et al., 1996) в області ІІ нами виявлено 7 субповторів типу А: п'ять - підтипу А1 і два - підтипу А2, які розташовані у порядку: А1/1, А2/1, А1/2, А1/3, А1/4, А2/2, А1/5, що відрізняєтся від порядку чергування А-субповторів різних підтипів у інших трьох видів тютюнів. Довжина чотирьох субповторів підтипу А1 варіювала в межах від 138 до 142 пн, тоді як у субповтору А1/5 вона дорівнювала 128 пн, що пов'язано із делецією фрагменту завдовжки близько 13 пн на 3'-кінці субповтору. Довжина субповторів підтипу А2 дорівнювала 137 пн. Рівень подібності субповторів у межах підтипу виявився високим, особливо у субповторів підтипу А2, тоді як між субповторами, що належать до різних підтипів, рівень подібності значно нижчий (табл. 4).

Таблиця 4

Рівень подібності (%) послідовностей субповторів типу А області II 5' ЗТС N. paniculata

Проведений порівняльний аналіз консенсусних послідовностей субповторів підтипів А1 та А2 виявив високий рівень подібності між субповторами підтипу А1 і значно нижчий - між субповторами підтипу А2 (табл. 5). Субповтори підтипу А1 N. paniculata більше подібні до А-субповторів обох підтипів інших видів Nicotiana, ніж до субповторів підтипу А2 в межах геному N. paniculata. Субповтори підтипу А2 N. paniculata демонструють значно нижчий рівень подібності з аналогічними субповторами N. sylvestris, N. tomentosiformis, N. tabacum. Отримані результати дають підстави зробити наступні припущення: 1) субповтори підтипів А1 і А2 мають спільне походження для всіх видів, що порівнювалися; 2) субповтори підтипу А2 утворилися з субповтору підтипу А1 шляхом перебудови на 3'-кінці у предкового виду тютюнів до дивергенції підродів Tabacum, Petunioides і Rustica; 3) у N. paniculata субповтори підтипу А2 еволюціонують з вищою швидкістю, ніж субповтори підтипу А1.

Таблиця 5

Рівень подібності (%) консенсусних послідовностей субповторів підтипів А1 і А2 області II 5' ЗТС N. paniculata (Ар1/0 і Ар2/0), N. sylvestris (Аs1/0 і Аs2/0), N. tomentosiformis (Аt1/0 і Аt2/0) та N. tabacum (Аtb1/0 і Аtb2/0)

Найімовірніше, що еволюційна подія, яка призвела до дивергенції субповторів типу А на підтипи А1 і А2, відбулася як одномоментний акт, після якого субповтори кожного підтипу еволюціонували незалежно. Оскільки найвищий рівень подібності спостерігається між парами субповторів А1/1 і А1/4 та А1/2 і А1/5 (див. табл. 4), та зважаючи на наведену в літературі ймовірну схему етапів молекулярної еволюції субповторів типу А у видів N. sylvestris та N. tomentosiformis, ми пропонуєм таку гіпотетичну схему еволюції субповторів у N. paniculata (рис. 6).

Очевидно, що етапи ампліфікації (1) та перебудови (2) відбувалися до дивергенції підродів Tabacum, Petunioides і Rustica від спільного предка. Оскільки послідовності субповторів А2/1 і А2/2 у N. paniculata відрізняються одна від одної лише на одну нуклеотидну заміну, то логічним є припущення, що етапи дуплікації (3) та елімінації субповтору А1/6 (4) у цього виду відбулися відносно недавно і, не виключено, практично одночасно. Низький рівень подібності між субповторами підтипів А1 і А2 дозволяє зробити висновок, що швидкість молекулярної еволюції в субповторі підтипу А2 у N. paniculata протягом часу між етапами (2) і (3) значно перевищувала швидкість молекулярної еволюції у субповторах підтипу А1.

Довжина області III у N. paniculata складає 560 пн. Аналіз первинної нуклеотидної послідовності області ІІІ показав, що в її межах можна виділити дві підобласті ІІІа і ІІІб, що суттєво відрізняються одна від одної.

Підобласть ІІІа у N. paniculata має довжину 190 пн. В її складі нами виявлено три cубповтори типу В. Рівень подібності підобласті ІІІа у порівнюваних видів перевищує 90%, що свідчить, очевидно, про значну еволюційну стабільність даної ділянки, яка може може бути пов'язана із її роллю в транскрипції та процесингу пре-рРНК.

Довжина підобласті ІІІб у N. paniculata складає 370 пн, що є дуже близьким за значенням до довжини аналогічної ділянки у N. sylvestris (360 пн), N. tomentosiformis та N. tabacum (по 364 пн).

В цілому, зіставлення первинних нуклеотидних послідовностей області ІІІ 5' ЗТС демонструє високий рівень подібності у всіх порівнюваних видів тютюнів. Загальний рівень подібності послідовностей області ІІІ складає: між N. paniculata та N. tomentosiformis - 93.8%; між N. paniculata та N. tabacum - 93.0%; між N. paniculata та N. sylvestris - 92.1%, що дещо перевищує рівень подібності, виявлений для послідовностей області І. Такий високий рівень подібності засвідчує близьку спорідненість видів Nicotiana, досить незначну швидкість молекулярної еволюції даної ділянки 5' ЗТС та відносно недавній час дивергенції видів N. paniculata, N. sylvestris і N. tomentosiformis.

ВИСНОВКИ

Особливості організації рДНК роблять її придатною для використання в якості молекулярного маркера при проведенні ідентифікації та молекулярної паспортизації видів і сортів, оцінки ступеня спорідненості культурних сортів і диких видів в родах Zea, Narcissus, Nicotiana, для з'ясування питань систематики та філогенії на рівні видів, секцій і підродів.

1. У виду Zea mays iснують два типи внутрішньогеномної гетерогенностi повторюваної одиниці рДНК: (1) гетерогеннiсть по довжинi та (2) гетерогеннiсть по послiдовностi. Гiбриди кукурудзи успадковують варiанти рДНК, характернi для обох батькiвських форм. Для рДНК гiбридних форм кукурудзи характерною є стійкість до перебудов при гібридизації.

2. Види та культурні сорти роду Narcissus можна розрізнити за специфічною сукупністю трьох характеристик рДНК: (1) кількістю варіантів повторів рДНК у геномі; (2) довжиною повторюваних одиниць рДНК; (3) наявністю та локалізацією в кодуючій області та МГС сайтів впізнавання певних ендонуклеаз рестрикції.

3. Види роду Nicotiana можна достовірно розрізнити за сукупністю двох характеристик рДНК: (1) за довжиною повторів; (2) за наявністю, кількістю та локалізацією сайтів впізнавання окремих ендонуклеаз рестрикції в МГС.

4. В межах 5' ЗТС Nicotiana paniculata, що має розмір 1710 пн, можна виділити три області з різною швидкістю молекулярної еволюції.

5. Нуклеотидні послідовності областей І і ІІІ 5' ЗТС N. paniculata з довжинами 184 пн та 560 пн відповідно є відносно еволюційно стабільними і демонструють високий рівень подібності до аналогічних ділянок 5' ЗТС N. sylvestris, N. tomentosiformis та N. tabacum, що може бути використано для кількісної оцінки ступеня спорідненості видів роду Nicotiana.

6. Область ІІ завдовжки 994 пн складається із 7 субповторів типу А двох підтипів А1 та А2; кількість субповторів обох підтипів та їх чергування відрізняються від кількості та чергування аналогічних субповторів у 5' ЗТС N. tomentosiformis, N. sylvestris та N. tabacum. Рівень подібності субповторів у межах підтипу знаходиться в інтервалі 85-99%, що значно перевищує рівень подібності між субповторами різних підтипів, який знаходиться в інтервалі 68-76%.