Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

БОБИР ВІТАЛІЙ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 578.835.15:578.835.17: 578.24:578.52

ПОВЕРХНЕВІ КОМПОНЕНТИ ВІРУСІВ КОКСАКІ В ТА ЇХ СЕЛЕКЦІОНОВАНИХ ВАРІАНТІВ

03.00.06 - вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор, академік НАН України,

член-кореспондент АМН України Широбоков Володимир Павлович,

Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри вірусології;

доктор медичних наук, професор Бондаренко Валентина Іванівна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В. Громашевського АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій.

Провідна установа

Вінницький Національний медичний університет імені М.І. Пирогова, кафедра мікробіології, вірусології та імунології, МОЗ України, м. Вінниця.

Захист відбудеться 18.05.2006 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.003.01 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, пр. Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія № 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий 17.04.2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Войцеховський В.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Простота структурної організації, широка розповсюдженість на всіх континентах планети та висока стійкість у зовнішньому середовищі визначають особливе місце ентеровірусів у царстві Vira (Hendry E., 2004). Поліорганний тропізм та етіологічна або патогенетична причетність до виникнення цілої низки інфекційних захворювань і патологічних станів людини зумовлюють постійне зростання наукового та практичного інтересу дослідників до даної групи вірусів (Rose N.R., 2005).

Не зважаючи на вагомі успіхи щодо ерадикації поліомієліту, інші ентеровірусні інфекції, у тому числі й спричинені вірусами Коксакі В, продовжують відігравати значну роль в патології людини (Лидский П.В., Агол В.И., 2006). У зв'язку з цим, проводяться дослідження щодо поширення даних вірусів, в тому числі і на території України (Широбоков В.П., Копаниця Л.В. 2003). Інтенсивно вивчаються властивості вірусів Коксакі В, що лежить в основі удосконалення та розробки більш ефективних методів діагностики викликаних ними інфекцій. В даному аспекті особливо важливе значення має питання дисоціації вірусів за біологічними властивостями. Очевидно, цей природний феномен має не лише теоретичне, але й значне практичне значення як для медицини, так і для біології в цілому (Широбоков В.П., 2004).

Насьогодні існує чимало наукових праць, присвячених дослідженню феномену дисоціації вірусів Коксакі на бентонітові варіанти (Абент+ та Абент-). Доведено різницю дисоціантів за рядом фізико-хімічних ознак: плавучою щільністю в CsCl, чутливістю до 2 дезокси-d-глюкози і детергентів, диференціацією за ізоелектричними властивостями та іншими важливими ознаками. Встановлені деякі особливості геномів бентонітових варіантів та отримано моноклональні антитіла, що їх диференціюють. Разом з тим, природа самого феномену, основні механізми та перспективи його практичного використання залишаються ще не вивченими.

Внутрішньотипова диференціація за відношенням до сорбентів, органічних розчинників та детергентів свідчать про можливу різницю у будові поверхневих білків вірусів Коксакі. Протягом тривалого часу дискутується питання щодо можливості формування поверхневих компонентів у ентеровірусів за рахунок клітинних структур після повного завершення циклу репродукції (Smyth M.S., 2002). Необхідність дослідження поверхневих компонентів пов'язана перш за все з тим, що саме вони можуть впливати на вірусні рецептори, від яких в першу чергу залежить взаємодія вірусів з клітиною, наслідком якої є розвиток тієї чи іншої патології. Насьогодні існує невелика кількість наукових праць, присвячених дослідженню поверхні вірусів Коксакі В та їх дисоціантів.

У зв'язку з цим, дослідження поверхневих компонентів вірусів Коксакі є актуальною проблемою, яка має важливе наукове та практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана наукова робота виконувалась як фрагмент науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології та імунології НМУ імені О.О. Богомольця “Ентеровіруси. Дисоціація: теоретичні аспекти, практичне значення. Циркуляція ентеровірусів у регіонах України. Роль в інфекційній патології людини. Удосконалення методів діагностики та профілактики ентеровірусних інфекцій”, державний реєстраційний номер 0102 U 000200.

Мета і завдання дослідження. Мета: встановити можливість формування поверхневих компонентів у вірусів Коксакі В та їх дисоціантів за рахунок клітинних структур та з'ясувати їх вплив на біологічні властивості віріонів.

Для досягнення поставленої мети були поставлені наступні завдання:

1. Визначити структурно-морфологічні особливості бентонітових варіантів вірусів Коксакі В.

2. З'ясувати можливість асоціації вірусів Коксакі В та їх бентонітових варіантів з клітинними компонентами.

3. Провести порівняльне дослідження впливу органічних розчинників на ступінь нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками вірусів Коксакі В.

4. Дослідити динаміку інфекційності бентонітових варіантів вірусів Коксакі В в процесі збереження їх при різних температурних режимах та встановити можливий вплив на даний процес інших фізико-хімічних факторів.

5. З'ясувати вплив умов ліофілізації на збереження інфекційності вірусів Коксакі В.

Об'єкт дослідження: властивості вірусів Коксакі В та їх бентонітових варіантів, можливість їх асоціації з клітинними компонентами.

Предмет дослідження: віруси Коксакі В (1-6 серотипи), бентонітові варіанти вірусів, фактори, які впливають на ефективність ліофілізації вірусів Коксакі В, оптимізація методів електронної мікроскопії для вивчення вірусної поверхні.

Методи дослідження: вірусологічні - культивування вірусів у клітинних культурах та лабораторних тваринах; імунологічні - постановка реакції віруснейтралізації; електронно-мікроскопічні - оцінка способів концентрації, контрастування вірусів, дослідження їх морфологічних особливостей, виявлення змін після обробки органічними розчинниками та ін.; фізико-хімічні - порівняльне сублімаційне висушування вірусів Коксакі В та їх бентонітових варіантів; статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено порівняльний аналіз контрастерів, способів контрастування та концентрування ентеровірусів, визначено оптимальні методичні підходи щодо їх електронно-мікроскопічного дослідження.

Вперше, методом електронної мікроскопії, на поверхні вірусів Коксакі В з вираженим афінітетом до бентоніту (варіант Абент+) виявлено додаткові неструктуровані компоненти з різним діаметром (2-7-10 нм), які вкривають всю вірусну поверхню. Встановлено здатність даних об'єктів контрастуватися специфічними для ліпідів контрастерами. Виявлено звільнення вірусів від даних субстанцій після обробки ефіром, при центрифугуванні вірусовмісного матеріалу та після селекції ентеровірусів на бентонітові варіанти. Зроблено припущення, що виявлені поверхневі структури є залишками мембран зруйнованих хазяйських клітин.

Встановлено зниження резистентності вірусів Коксакі В після обробки органічним розчинниками. Доведено, що обробка ентеровірусів ефіром сприяє зростанню ступеня їх нейтралізації віруснейтралізуючими антитілами.

Вперше показано диференціацію бентонітових варіантів вірусів Коксакі В за здатністю до агрегації та встановлено залежність даних властивостей вірусів від рН середовища: варіант Абент+ у більшості агрегує при кислих значеннях рН, на відміну від варіанту Абент-, який здатен до агрегації як при кислих, нейтральних, так і при слаболужних рН.

Практичне значення одержаних результатів. Вдосконалено методику сублімаційного висушування ентеровірусів шляхом їх попередньої сорбції на природному алюмосилікаті (бентоніті) з наступним додаванням інших складових захисного середовища. Визначено умови, при яких можливо отримання сублімаційно висушених ентеровірусних препаратів з більш тривалим терміном збереження інфекційності.

Розроблено спосіб електронно-мікроскопічного виявлення ентеровірусів у вірусовмісному матеріалі з низьким титром при використанні плівок-підложок, оброблених бентонітом.

Особистий внесок здобувача. У дисертації викладені результати теоретичних та експериментальних досліджень, проведених переважно особисто. Здобувачем самостійно проведено інформаційно-патентний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації, підбір методик дослідження, їх виконання та аналіз одержаних результатів.

Дослідником самостійно проведено порівняльний аналіз контрастерів, способів контрастування та концентрування ентеровірусів, визначено оптимальні методичні підходи до електронно-мікроскопічного дослідження цих біологічних об'єктів, власноруч селекціоновано бентонітові варіанти (Абент+ та Абент-) усіх серотипів вірусів Коксакі В. Здобувачем самостійно здійснено порівняльний аналіз захисних середовищ для ліофілізації вірусів Коксакі В.

Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Всі розділи дисертації та публікації за темою дисертації написані автором під керівництвом академіка НАН України, професора Широбокова В.П.

Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Автор приймав безпосередню участь у написанні та аналізі друкованих за темою дисертації робіт.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладені в дисертаційній роботі, були представлені на науково-практичній конференції, присвяченій пам'яті академіка Л.В. Громашевського (Київ, 11-12 листопада 2004 р.), VII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта 2005” (Дніпропетровськ, 17-21 лютого 2005 р.), 59-й науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О. Богомольця з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 6-8 квітня 2005 р.), міжнародній науковій конференції, присвяченій 160-літтю з дня народження лауреата Нобелівської премії І.І. Мечнікова “Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями в гуманній та ветеринарній медицині” (Харків, 27-29 листопада 2005 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано десять наукових праць, з яких 4 статті у фахових виданнях, визначених ВАК України, 4 - у збірниках наукових праць, матеріалах конференцій, отримано 2 патенти на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 3 експериментальних розділів, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Робота викладена на 142 сторінках, містить 15 таблиць, 22 рисунки. Список використаних джерел містить 257 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Віруси: використані прототипні штами вірусів Коксакі В, одержані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів імені М.П. Чумакова РАМН, а саме, Коксакі В-1 (штам Connecticut-5); Коксакі В-2 (штам Ohio-1); Коксакі В-3 (штам Nancy); Коксакі В-4 (штам Powers); Коксакі В-5 (штам Faulkner); Коксакі В-6 (штам Hammon).

Тварини: у дослідах були використані мишенята лінії BALB/c 1-3 денного віку.

Культури клітин: для накопичення і титрування поліовірусів та постановки реакції віруснейтралізації використовували перещеплювані культури клітин лінії НЕр-2 (з клітин карциноми гортані людини), Vero (клітини нирки африканських зелених мавп) та Неlа (клітини карциноми шийки матки людини).

Перещеплювані клітини культивували на середовищі DМЕМ “Sigma” з додаванням 7-8% ембріональної телячої сироватки (ЕТС), пеніциліну та стрептоміцину. Пасаж вірусів проводили за загальноприйнятими методами, інфікуючи моношари клітин. Селекцію бентонітових варіантів здійснювали за методом академіка Широбокова В.П.,1977.

Концентрування вірусів проводили бентонітом, поліетиленгліколем та ультрацентрифугуванням.

Титр вірусів визначали двома способами: мікрометодом за ЦПД та за бляшкоутворенням під бентонітовим покриттям (Широбоков В.П., 1977).

Дослідження впливу органічних розчинників на нейтралізацію ентеровірусів типоспецифічними імунними сироватками здійснювали наступними чином: вірусовмісний матеріал змішували з ефіром чи хлороформом у співвідношенні 1:1 та залишали в пробірці під ватно-марлевою пробкою на ніч при +4?С, далі вилучали вірусовмісну водну фазу. Розведену від 10-1 до 10-7 вірусовмісну рідину змішували з типоспецифічною імунною сироваткою робочого розведення та виявляли так званий, “поріг нейтралізації”, тобто те розведення, де ще не спостерігалась цитопатична дія вірусів. Далі концентрацію вірусовмісної рідини, яка на один логарифм менша від тієї, що відповідає порогу нейтралізації, розводили з кроком розведення 0,1 lg. Отриманими розведеннями інфікували клітинні моношари, вирощені у колбочках Ерленмейєра та заливали їх бентонітовим поживним покриттям. Результати даної реакції оцінювали через 48 годин в БУО/мл.

Дослідження структурно-морфологічних особливостей бентонітових варіантів вірусів Коксакі В проводили за допомогою електронного мікроскопу ЕМ-125К та комп'ютерного аналізу отриманих знімків, використовуючи збільшення 40 000-100 000.

Плівки-підложки готували із формвару та колодію, їх укріплення здійснювали шляхом напилювання вуглецю в вакуумі. В окремих випадках, для отримання високоякісних знімків, готували, так звані, “перфоровані” плівки-підложки. В якості контрастерів використовували 1-2% розчин фосфорно-вольфрамової кислоти, 1% розчин уранілацетату, 1% розчин осмієвої кислоти.

З метою отримання максимально можливого об'ємного зображення вірусів, підвищення роздільної здатності електронного мікроскопу та вивчення деталей вірусних поверхонь застосовували метод косого напилення (відтінення) вірусів у вакуумному універсальному посту (ВУП-5).

Сублімаційне висушування вірусів здійснювали у комплексі замороження-висушування біологічних об'єктів КЗВ 9. Охолоджувачем слугував рідкий азот. В якості захисного середовища використовували 10% знежирене молоко, 7% сахарозу, 2-3% пептон, 1-3% гідролізат лактальбуміну, сироватку новонароджених телят (Sigma), 5% гель бентоніту, яєчний порошок, Mg2+ до концентрації 0,001 М. До всіх проб додавали два антибіотики: пеніцилін 100-150 МО/мл та стрептоміцин 100 мкг/мл.

Методи статистичної обробки отриманих результатів. Отримані кількісні результати досліджень оброблені загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням значень середньої арифметичної (М), середньої похибки середньої арифметичної (m), квадратичного відхилення (у), достовірності результатів досліджень (t), достовірності результатів двох серій досліджень (р). Застосовували ПК типу ІВМ (PENTIUM-4) з використанням пакету програм фірми Microsoft.

Результати досліджень та їх обговорення. Порівняльне дослідження структурно-морфологічних особливостей вірусів Коксакі В та їх дисоціантів. Просвічуюча електронна мікроскопія вірусів на основі методу негативного контрастування широко застосовується для аналізу різного роду біологічних об'єктів. Проте, виявлення можливих додаткових поверхневих компонентів у ентеровірусів потребує підбору оптимальних контрастуючих речовин, відпрацювання існуючих та розробки нових способів їх контрастування та відтінення.

Проведений порівняльний аналіз контрастерів, які використовуються для електронно-мікроскопічних досліджень ентеровірусів, показав найбільшу ефективність 1-2% розчину фосфорно-вольфрамової кислоти (ФВК) з рН 6,0-6,5. При використанні в якості “електронних барвників” таких речовин, як 1-2% розчин фосфорно-молібденової кислоти, 2% розчин уранілацетату, 0,59 М розчин оцтовокислого свинцю, відмічено наступні, характерні для усіх них, недоліки. По-перше, виражена нерівномірність контрастування вірусів, тобто в одному полі зору відмічаються як недоконтрастовані так і високо контрастні вірусні часточки. По-друге, часто відмічається втрата міцності плівки-підложки. По-третє, виникнення зернистості зображення, особливо на великих збільшеннях електронного мікроскопу.

Дослідження, спрямовані на порівняльну оцінку способів контрастування, які можуть бути використані у електронній мікроскопії ентеровірусів, показали найбільшу зручність у використанні та високу ефективність крапельного способу. При застосуванні флотаційного способу спостерігалося зниження частоти виявлення ентеровірусів, проте зменшувалось кількість неспецифічних забруднювачів. Метод розпилення вірусовмісного матеріалу з контрастером не давав змоги визначити час контрастування, в результаті чого відмічалося “роз'їдання” плівки-підложки променем електронів.

При електронній мікроскопії вірусів Коксакі В, як і інших ентеровірусів, найбільша складність виникала при дослідженні матеріалу з низьким титром (нижче 7,0-6,0 lg). Для вирішення цієї проблеми було розроблено спосіб їх виявлення у матеріалі з низьким титром шляхом використання на поверхні плівок-підложок бентоніту - природного алюмосилікату з групи глинистих мінералів монтморилонітів, який має високі сорбційні властивості щодо цих вірусів (рис. 1).

Рис. 1. Віруси Коксакі В-6, сорбовані на бентоніті. Електронна мікроскопія. Збільшення 60 000.

Порівняльне вивчення структурно-морфологічних особливостей дисоціантів вірусів Коксакі В розпочинали з дослідження їх розмірів. В результаті аналізу 100 вірусних часточок із кожної групи вірусів та проведення статистичної обробки встановлено, що після концентрування розміри у бентонітових варіантів вірусів Коксакі В є однаковими і становлять: Коксакі В-6 (Абент+) - 27,9±0,05, Коксакі В-6 (Абент-) - 27,89±0,1; Коксакі В-2 (Абент+) - 28,4±0,1, Коксакі В-2 (Абент-) - 28,1±0,1.

Для виключення можливого впливу контрастеру на розміри цих вірусів, проведено їх відтінення платиною. Комп'ютерний аналіз електронограм підтвердив, що розміри дисоціантів вірусів Коксакі В-6 залишаються однаковими: Коксакі В-6 (Абент+) - 29,17±0,1, Коксакі В-6 (Абент-) - 29,12±0,1.

Наступним етапом досліджень було проведення порівняльної оцінки способів концентрування вірусів Коксакі В, направлених на виявлення у цих вірусів додаткових компонентів. Після концентрування бентонітом, поліетиленгліколем та ультрацентрифугування віріони за формою наближались до сферичних та мали діаметр близько 29 нм. Разом з тим, відмічено суттєву очистку препаратів від неспецифічних забруднювачів після концентрування бентонітом.

Слід зазначити, що вивчаючи концентровані віруси Коксакі В, нам не вдалось виявити у них додаткових структур. Зроблено припущення, що процес концентрації може звільняти ентеровіруси від “гіпотетичних” додаткових поверхневих компонентів. З метою з'ясування цього питання проведено вивчення нативних препаратів вірусів Коксакі В, тобто без застосування жодного з вищезгаданих методів обробки вірусовмісного матеріалу.

Електронно-мікроскопічні дослідження нативних ентеровірусних препаратів показали, що на поверхні вірусів Коксакі В (варіант Абент+) знаходяться додаткові компоненти з різним діаметром (2-7-10 нм), які переважно хаотично розміщуються по всій поверхні віріону (рис. 2А). На поверхні вірусів Коксакі В з низьким афінітетом до бентоніту (варіант Абент-) таких речовин виявлено не було (рис. 2Б). Очевидно, встановлені у вірусів Коксакі В-6 додаткові поверхневі структури мають клітинне походження та, можливо, представлені залишками їхніх зруйнованих мембран.

А Б

Рис. 2. Морфологія неконцентрованих бентонітових варіантів вірусів Коксакі В-6. А. Варіант Абент+. Б. Варіант Абент-. Електронна мікроскопія, збільшення 80 000.

Примітка. Стрілками показано додаткові поверхневі компоненти вірусів.

З метою орієнтовного з'ясування хімічного складу виявлених на поверхні вірусів Коксакі В (Абент+) додаткових структур, провели їх контрастування 1% осмієвою кислотою, як специфічним контрастером ліпідів. Результати електронно-мікроскопічних досліджень даних вірусів свідчать про те, що виявлені поверхневі компоненти ефективно контрастувалися не лише 1% фосфорно-вольфрамовою кислотою, яка має високу спорідненість до білкових структур, але й 1% осмієвою кислотою, яка застосовується як контрастер ліпідів (рис. 3А). Отже, не виключено, що встановлені у вірусів Коксакі В компоненти мають ліпідну природу. Вагомим підтвердженням цього є те, що обробка вірусовмісного матеріалу органічним розчинником - ефіром призводить до очищення вірусних поверхонь від додаткових компонентів (рис. 3Б).

А Б

Рис. 3. Віруси Коксакі В-6 (Абент+), після обробки ефіром (А), та без обробки ефіром (Б) контрастовані 1% осмієвою кислотою. Електронна мікроскопія, збільшення 80 000.

З метою підтвердження можливості існування саме клітинних залишків на поверхні вірусів, проведено серію експериментів, в яких до концентрованої вірусної популяції додавали суспензії клітинного детриту. В результаті цих досліджень було встановлено, що компоненти клітин приєднувалися до поверхні вірусів Коксакі В (варіант Абент+), і, у останніх при електронно-мікроскопічному дослідженні виявлялись структури, абсолютно ідентичні тим, що були встановлені у вірусів безпосередньо після репродукції (неконцентрованих та неочищених).

Разом з тим, встановлено, що додавання клітинного детриту до концентрованих вірусів Коксакі В з низькими сорбційними властивостями до бентоніту (варіант Абент-) не впливало на їх морфологію і поверхні вірусів залишалися вільними від клітинного детриту.

Дослідження впливу розчинників на деякі властивості вірусів Коксакі В. Відомо, що пікорнавіруси можуть тривалий час зберігати свою інфекційність, перебуваючи у сироватці крові з віруснейтралізуючими антитілами (Gwaltney I. et al., 1989). Раніше було показано зростання ступеня нейтралізації антитілами деяких риновирусів та ентеровірусів після обробки хлороформом (Fields B.N., 1996), встановлено зростання ефективності нейтралізації деяких ентеровірусів після обробки детергентами (Мельник В.В., 1996).

Виходячи з цього, наступним тестом на ліпідвмісні компоненти у складі ентеровірусів стало з'ясування ефективності нейтралізації вірусів Коксакі В типоспецифічними діагностичними сироватками після екстракції вірусовмісного матеріалу органічним розчинником (ефіром). В результаті було встановлено (табл. 1), що зростання ефективності нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками після обробки ефіром відбувалося у вірусів Коксакі В-3 - на 36,5%, В-4 - на 75%, В-5 - на 73%, В-6 - на 79%. Менше зростала повнота нейтралізації у вихідних популяцій вірусів Коксакі В-1 та не відмічалася у вірусів Коксакі В-2.

Таблиця 1

Вплив попередньої обробки вірусів Коксакі В ефіром на результати їх нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками

Віруси	Без обробки ефіром	Після обробки ефіром
Коксакі В-1	3,0?103,4	2,25?103,4
Коксакі В-2	1,25?104,6	1,25?104,6
Коксакі В-3	2,5?102,8	2,0?102,7
Коксакі В-4	5,0?103,7	1,25?103,7
Коксакі В-5	1,0?103,6	0,33?103,5
Коксакі В-6	1,25?103,5	0,33?103,4

Примітка. Титр виражений в БУО/мл (бляшкоутворюючі одиниці/мл).

Очевидно, після обробки органічними розчинниками, антигенні ділянки вірусів з вираженим афінітетом до бентоніту (варіант Абент+) стають більш “відкритими” та доступними до дії антитіл, що проявляється у зростанні ступеня їх нейтралізації.

Порівняльне дослідження факторів, які впливають на збереження інфекційності вірусів Коксакі В та їх дисоціантів у лабораторних умовах. Для з'ясування можливої протекторної (захисної) функції виявлених у вірусів Коксакі В додаткових компонентів, проведено дослідження динаміки інактивації вірусів Коксакі В у середовищі, не звільненому від залишків клітин (табл. 2).

Результати експериментів свідчать про достатньо високу стійкість усіх взятих для досліду вірусних субпопуляцій при +4?С. Їх титр мало змінювався протягом 90 діб спостереження. Разом з тим, відмічено, що присутність у вірусовмісному матеріалі залишків клітин сприяла більш тривалому збереженню інфекційності вихідної популяції вірусів Коксакі В-6, а саме “плюсового” бентонітового варіанту і майже не впливала на тривалість збереження інфекційності дисоціанту з характеристикою Абент-.

З метою з'ясування можливих механізмів захисної дії клітинних компонентів на тривалість збереження ентеровірусів, проведено електронно-мікроскопічне дослідження нативних препаратів після їх зберігання при температурі +4?С протягом 90 діб.

Таблиця 2

Залежність збереження інфекційності вірусів Коксакі В-6 та їх дисоціантів від присутності у вірусовмісній рідині клітинного детриту

Доба	Титр вірусів Коксакі В-6 (-lg10)
	Вихідна популяція	Абент+	Абент-
	I	II	I	II	I	II
3	7,0±0,12	7,0±0,20	6,5±0,20	6,5±0,20	6,0±0,20	6,0±0,19
10	7,0±0,20	7,0±0,14	6,5±0,20	6,25±0,17	5,5±0,19	5,75±0,20
18	6,5±0,18	6,5±0,20	6,5±0,20	6,25±0,20	5,5±0,20	5,0±0,20
26	6,0±0,18	5,25±0,20	6,5±0,08	6,0±0,20	5,5±0,18	5,25±0,20
37	5,0±0,17	4,25±0,19	5,25±0,14	5,0±0,19	4,75±0,20	4,0±0,20
60	5,0±0,20	4,0±0,20	5,25±0,12	4,5±0,15	3,5±0,17	3,25±0,17
90	5,25±0,20	4,0±0,20	4,5±0,15	3,5±0,12	3,25±0,15	3,0±0,20

Примітки: I - вірусовмісний матеріал не звільнений від залишків клітин II - після видалення з вірусовмісної рідини клітинного детриту. Вірус зберігався при +4?С.

Отримані дані (рис. 4) свідчать про можливість ентеровірусів залишатись вкритими залишками мембран зруйнованих хазяйських клітин і в такому стані тривалий час зберігати інфекційність. Не виключено, що саме це й сприяло зростанню термінів збереження інфекційності тих вірусів Коксакі, які не були звільнені від клітинного детриту.



Рис. 4. Віруси Коксакі В-6, оточені залишками мембрани зруйнованих ними хазяйських клітин. Електронна мікроскопія, збільшення 80 000.

Для підтвердження протективної функції клітинних компонентів у збереженні дисоціантів вірусів Коксакі В проведено порівняльне дослідження їх виживання у лабораторних умовах після обробки ефіром. Зберігали вірусовмісний матеріал при температурах +4°С, +20°С та +37°С.

Як показано на рис. 5, обробка вірусовмісного матеріалу ефіром зменшує тривалість збереження інфекційності в лабораторних умовах у варіанту Абент+ вірусів Коксакі В-6 при +4?С та +20?С. Разом з тим, за даних умов ефір не впливає на динаміку інактивації “мінусового” дисоціанту вірусів Коксакі В-6. Обробка органічним розчинником також не впливає на швидкість інактивації обох дисоціантів за умов їх збереження при 37?С.



Рис. 5. Вплив ефіру на динаміку інактивації дисоціантів вірусів Коксакі В. А. варіанту Абент+ при зберіганні +4?С. Б. варіанту Абент+ при зберіганні +20?С. В. Варіанту Абент+ при зберіганні +37?С. Г. Варіанту Абент- при зберіганні +4?С. Д. Варіанту Абент- при зберіганні +20?С. Е. Варіанту Абент- при зберіганні +37?С.

Примітки: зразок 1 - після обробки ефіром, зразок 2 - без обробки ефіром. Титр виражений в - lg10.

Проведені експерименти дозволили також встановити, що бентонітові варіанти вірусів Коксакі В відрізняються за здатністю до агрегації. Так, варіант Абент- агрегує переважно при кислих значеннях рН, на відміну від його “плюсового” аналогу, у якого дані властивості виражені як при кислих, нейтральних, так і при слаболужних значеннях рН. Не виключено, що різна здатність до агрегації пов'язана з наявністю на поверхні вірусів додаткових компонентів ліпідної природи, які можуть сприяти процесу агрегації віріонів.

Відомо, що процес агрегації мікробних клітин має важливе захисне значення і забезпечує більш тривале збереження мікробної популяції (Войцеховський В.Г., 2004). У зв'язку з цим, цілком ймовірно, що більш тривале збереження інфекційності варіанту Абент+ в лабораторних умовах забезпечується не тільки їх асоціацією з клітинними компонентами, а й з значно вираженою для них здатністю до агрегації.

Таким чином, унікальність властивостей вірусів проявляється не лише в тому, що для них характерний абсолютний внутрішньоклітинний паразитизм, а і в тому, що після виходу з клітини вони вкриваються клітинними компонентами, агрегують і цим самим забезпечують собі захист під час тривалого періоду позаклітинного існування.

Наступні дослідження стосувались з'ясування значення впливу асоціації вірусів Коксакі В з клітинними компонентами на їх стабільність при таких несприятливих для ентеровірусів умовах, як ліофільне висушування. Ліофілізації підлягав неконцентрований та не звільнений від клітинних залишків вірусовмісний матеріал після додаванням різних складових захисного середовища (знежиреного молока, гідролізату лактальбуміну, сахарози, пептону та ін.). Сублімаційно висушені віруси зберігали при температурі +4°С. Збереження інфекційності вірусів перевіряли методом титрування одразу після ліофілізації, на 26, 45, 60, 90 та 365 добу.

Показано, що після ліофілізації в не звільненому від клітинних компонентів стані, варіант Абент+ вірусів Коксакі В-3 та Коксакі В-6 був більш стійким до сублімації вологи та до інших агресивних факторів, які супроводжують процес ліофілізації і значно довший час зберігає свою інфекційність (табл. 4).

Крім того, було встановлено, що ліофільне висушування вірусів Коксакі В-3 в присутності бентоніту дало можливість істотно підвищити їх стабільність (табл. 5). Властивості вірусів після такого способу ліофілізації не змінювались, а, враховуючи його простоту та доступність, він може бути широко застосованим для довготривалого збереження музейних штамів ентеровірусів.

Таблиця 4

Динаміка збереження інфекційності вірусів Коксакі В-3 та Коксакі В-6 при ліофілізації в різних умовах

Віруси	Доба
	1	45	60	90	365
I	Коксакі В-3 Абент+	4,75±0,1	4,5±0,20	4,5±0,18	4,25±0,2	3,0±0,2
	Коксакі В-6 Абент-	1,5±0,13	-	-	-	-
II	Коксакі В-3 Абент+	4,5±0,20	4,25±0,2	4,0±0,18	3,5±0,2	1,25±0,18
	Коксакі В-6 Абент-	1,5±0,12	0,25±0,15	-	-	-

Примітки: I - вірусовмісний матеріал не звільнений від клітинного детриту; II - вірусовмісний матеріал звільнений від клітинного детриту. Цифри в таблиці означають титр вірусів в -lg10.

Таблиця 5

Вплив бентоніту на тривалість збереження інфекційності ліофілізованих вірусів Коксакі В-3

Зразок	Доба зберігання
	Титр до ліофілі-зації	1	7	14	21	28	60	90
1	7,0±0,12	3,25±0,1	3,0±0,13	3,0±0,20	2,75±0,14	2,75±0,18	1,25±0,15	-
2	7,0±0,15	4,75±0,12	4,5±0,20	4,5±0,18	4,5±0,13	4,5±0,12	4,5±0,9	4,25±0,1

Примітки: зразок 1 - віруси не сорбовані на бентоніті, зразок 2 - віруси сорбовані на бентоніті. Титр виражений у -log10.

Таким чином, проведені нами дослідження, спрямовані на з'ясування властивостей вірусів Коксакі В та їх бентонітових варіантів, дозволили встановити, що віруси після репродукції і виходу з клітини здатні зберігати зв'язок з клітинними компонентами, які підвищують їх стійкість до різних фізичних, хімічних та біологічних впливів і, тим самим, сприяють збереженню інфекційності у період позаклітинного існування. Ця закономірність для простих вірусів має безумовно важливе значення, і, не виключено, що у порівнянні з складними вірусами, які включають компоненти мембран клітини до складу суперкапсидної оболонки, ентеровіруси в процесі своєї еволюції сформували більш спрощену свою організацію, але не втратили здатності до асоціації з мембранними компонентами і, таким чином, забезпечили собі більш виражену стійкість до зовнішніх впливів.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі розв'язано актуальну наукову задачу - встановлено, що на поверхні вірусів Коксакі В, після їх репродукції залишаються клітинні компоненти ліпідної природи, які підвищують стійкість віріонів до фізичних, хімічних та біологічних впливів і тим самим сприяють збереженню їх інфекційності під час позаклітинного існування. Вдосконалена методика електронно-мікроскопічного дослідження вірусів та розроблений спосіб ліофілізації з метою довготривалого збереження вірусів Коксакі В.

1. Електронно-мікроскопічними методами встановлено, що на поверхні капсиду вірусів Коксакі В знаходяться надкапсидні компоненти, представлені ліпідвмісними залишками мембран хазяйських клітин. Виявлені компоненти не входять до структури капсиду, їх зв'язок з білковою оболонкою може бути перерваний при центрифугуванні.

Показано, що надкапсидні компоненти контрастуються 1% осмієвою кислотою, а віріони звільняються від них після обробки органічними розчинниками, що підтверджує їх ліпідну природу. Здатність до асоціації з залишками клітинних мембран характерна лише для ентеровірусів з високим афінітетом до бентоніту (варіант Абент+).

2. Доведено, що клітинні компоненти на поверхні вірусів Коксакі В підвищують їх стійкість до різних фізичних, хімічних та біологічних впливів. Це підтверджується тим, що віруси значно довше не втрачають інфекційності при зберіганні в різних температурних режимах та після ліофілізації, зменшується ефективність їх нейтралізації типоспецифічними діагностичними сироватками. Після обробки органічними розчинниками, навпаки, зменшується термін збереження їх інфекційності та підвищується ефективність нейтралізації антитілами (на 36-79%), що свідчить про захисний характер поверхневих надкапсидних структур.

3. Вдосконалено методику електронно-мікроскопічного дослідження поверхневих структур вірусів Коксакі В. Досліджено ефективність використання різних типів контрастерів та їх комбінацій. Розроблено спосіб підготовки зразків для електронної мікроскопії з використанням формварових плівок-підложок, оброблених бентонітом, що дозволило вивчати морфологію вірусів в неконцентрованому стані, безпосередньо після завершення їх репродукції.

4. Встановлено, що бентонітові дисоціанти (Абент+ та Абент-) вірусів Коксакі В-6 відрізняються за здатністю до агрегації. Показано, що варіант Абент- агрегує лише при кислих значеннях рН, на відміну від варіанту Абент+, у якого дані властивості виражені при кислих, нейтральних та слаболужних рН. Виражена здатність до агрегації у варіанта Абент+ можливо пов'язана з його властивістю приєднувати клітинні компоненти.

5. Вдосконалено методику сублімаційного висушування вірусів Коксакі В шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті. Показано, що після ліофілізації в не звільненому від клітинних компонентів стані, варіант Абент+ вірусів Коксакі В-3 та Коксакі В-6 є більш стійким до сублімації вологи та до інших агресивних факторів, які супроводжують процес ліофілізації і значно довший час зберігає свою інфекційність. Запропоновано спосіб ліофільного висушування, який може бути використаний для більш тривалого збереження музейних штамів ентеровірусів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

У періодичних виданнях, затверджених ВАК України:

1. Бобир В.В. Сучасні уявлення про хімічний склад та фізико-хімічні властивості ентеровірусів // Актуальні проблеми медицини та біології. - Київ, 2003. Т.1. - С. 283-292.

2. Бобир В.В. Вплив органічних розчинників на ефективність нейтралізації вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Збірник наукових праць співробітників КМАПО імені П.Л. Шупика. Київ, 2005. - С. 301-305.

3. Бобир В.В., Олексієнко І.П. Сучасні підходи до стабілізації ентеровірусів шляхом ліофільного висушування // Актуальні проблеми медицини та біології. Київ, 2005. Т.1. - С. 381-390. (Здобувач виконав експериментальну роботу - провів дослідження виживання ентеровірусів після ліофілізації та провів статистичну обробку одержаних результатів).

4. Широбоков В.П., Бобир В.В. Ліофілізація ентеровірусів та їх бентонітових варіантів // Журн. АМН України. - 2005. Т.11. - №2. - С. 377-381. (Здобувач удосконалив методику ліофільного висушування ентеровірусів, отримав електронно-мікроскопічні знімки препаратів, підготував матеріали для публікації ).

Патенти:

1. Пат. 9405 Україна, МКИ В01J37/32. Спосіб ліофілізації ентеровірусів: Пат. 9405 Україна, МКИ 01N33/569. Широбоков В.П., Бобир В.В. (Україна); Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. - №03222; Заявл. 07.04.2005. Опубл. 15.09.2005. Бюл. №9. (Здобувач здійснив патентно-інформаційний пошук відносно даної проблеми, удосконалив методику ліофільного висушування ентеровірусів шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті, провів експериментальне випробування цього методу з використанням вірусів Коксакі В-3 в якості модельних).

2. Пат. 9903 Україна, МКИ G 01N33/569. Спосіб підвищення сорбційної здатності плівок-підкладок в електронній мікроскопії ентеровірусів: Пат. 9903 Україна, МКИ G 01N33/569. Бобир В.В., Широбоков В.П., Войцеховський В.Г., Олексієнко І.П. (Україна); Національний медичний університет імені. О.О. Богомольця. - №03751; Заявл. 20.04.05; Опубл. 17.10.2005. Бюл. №10. (Здобувач провів аналіз патентно-інформаційний пошук, виконав експериментальну частину досліджень та приймав участь у підготовці матеріалів для публікації).

Інші видання:

1. Бобир В.В., Широбоков В.П. Поверхневі структури вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Науковий вісник Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. - 2005. - №1-2. - С. 9-12. (Здобувач виконав частину експериментальних досліджень, провів аналіз одержаних результатів, підготував матеріали для публікації).

2. Широбоков В.П., Бобир В.В. Нові уявлення про морфологічні особливості вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів // Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями в гуманній та ветеринарній медицині: матеріали міжнародної наукової конференції, присвяченої 160-літтю з дня народження лауреата Нобелівської премії І.І. Мечнікова (27-29 листопада 2005 р.). - Харків.: Інститут мікробіології і імунології імені І.І. Мечнікова. Електронна адреса: www. hniimi.da.ru. (Здобувач провів аналіз даних сучасної наукової літератури відносно даного питання, виконав експериментальну частину роботи, що включала вірусологічні та електронно-мікроскопічні методи дослідження і підготував матеріали для доповіді).

3. Бобир В.В., Широбоков В.П. Гетерогенність популяції вірусів Коксакі В з позиції їх асоціації із компонентами клітинних мембран // Наука і освіта 2005: матеріали VII міжнародної науково-практичної конференції (17-21 лютого 2005 р.). - Дніпропетровськ: 2005, Т.10. - С. 11-13. (Здобувач провів аналіз даних сучасної наукової літератури щодо даного питання, виконав частину експериментальних досліджень, підготував матеріали для публікації).

4. Бобир В.В. Ефективність ліофільного висушування вірусів Коксакі В та їх генетичних селекціонованих варіантів // Актуальні проблеми сучасної медицини: матеріали 59 міжнародної науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (6-8 квітня 2005 р.). - Київ: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, 2005. - С. 58.

АНОТАЦІЯ

Бобир В.В. Поверхневі компоненти вірусів Коксакі В та їх селекціонованих варіантів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена дослідженню формування поверхневих компонентів у вірусів Коксакі В за рахунок клітинних структур та з'ясуванню їх впливу на біологічні властивості віріонів.

Електронно-мікроскопічними методами встановлено, що на поверхні вірусів Коксакі В після репродукції залишаються клітинні компоненти, які підвищують стійкість віріонів до фізичних, хімічних та біологічних впливів і тим самим сприяють збереженню їх інфекційності під час позаклітинного існування. Доведено, що здатність до асоціації з рештками клітин характеризує лише ентеровіруси з високим афінітетом до бентоніту (варіант Абент+). Експериментально показано здатність надкапсидних компонентів контрастуватися 1% осмієвою кислотою, крім того, віріони звільняються від них після обробки органічними розчинниками, що свідчить про їх ліпідну природу.

Вперше показано диференціацію дисоціантів вірусів Коксакі В за здатністю до агрегації та встановлено залежність даних властивостей вірусів від рН середовища. Вдосконалено методику сублімаційного висушування вірусів Коксакі В шляхом їх попередньої сорбції на бентоніті.

Ключові слова: віруси Коксакі В, дисоціація, поверхневі компоненти, електронна мікроскопія, нейтралізація, агрегація, ліофілізація.

АННОТАЦИЯ

вірус коксакі біологічний віріон

Бобыр В.В. Поверхностные компоненты вирусов Коксаки В и их селекционированных вариантов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, Киев, 2006.

В диссертационной работе представлены результаты экспериментальных исследований структурно-морфологических особенностей вирусов Коксаки В и их бентонитовых вариантов.

Электронно-микроскопическими методами установлено, что на поверхности вирусов Коксаки В после репродукции остаются клеточные компоненты. Показано, что способность к ассоциации вирионов с остатками клеток характерна только для вирусов Коксаки В с высоким аффинитетом к бентониту (вариант Абент+).

Выявленные дополнительные компоненты не входят в состав вирусного капсида, энтеровирусы способны освобождаться от данных поверхностных структур после концентрирования, селекции на бентонитовые варианты и других процессов, связанных с механическим воздействием. Показано, что надкапсидные компоненты вирусов контрастируются 1% осмиевой кислотой и исчезают после обработки вирусов органическими растворителями, что свидетельствует об их липидной природе.

Установлено, что остатки клеток на поверхности вирусов Коксаки В повышают их устойчивость к физическим, химическим и биологическим воздействиям. Это подтверждается тем, что вирусы значительно дольше сохраняют инфекционность при хранении в разных температурных режимах и после лиофилизации. Кроме того, зафиксировано повышение эффективности нейтрализации вирусов типоспецифическими диагностическими сыворотками после обработки эфиром: у вирусов Коксаки В-3 - на 36,5%, Коксаки В-4 - на 75%, Коксаки В-5 - на 73%, Коксаки В-6 - на 79%. Незначительно повышается эффективность нейтрализации у вирусов Коксаки В-1 и не отмечается у вирусов Коксаки В-2.

Усовершенствована методика электронной микроскопии энтеровирусов. Научно обоснованы оптимальные способы электронно-микроскопического исследования и контрастирования поверхностных компонентов вирусов Коксаки В: обработка фосфорно-вольфрамовой или осмиевой кислотой, использование нативных, неконцентрированных препаратов. С целью выявления энтеровирусов в вируссодержащем материале с низким титром, разработан способ подготовки образцов для электронной микроскопии с использованием пленок-подложек из формвара, обработанных бентонитом, что создает возможность изучать морфологию вирусов в неконцентрированном состоянии, непосредственно после их репродукции.

На примере вирусов Коксаки В-6 установлено, что бентонитовые диссоцианты (Абент+ и Абент-) отличаются способностью к агрегации. Показано, что вариант Абент- агрегирует только при кислых рН, в отличие от варианта Абент+, у которого эти свойства проявляются при кислых, нейтральных и слабощелочных значениях рН. Высказано предположение, что выраженная способность к агрегации у варианта Абент+ связана с его способностью к ассоциации с клеточными компонентами.

Установлены различия в резистентности у диссоциантов вирусов Коксаки В после лиофилизации: более устойчивым оказался бентонитовый вариант Абент+. Обосновано эффективность использования лиофилизации энтеровирусов путем их предварительной сорбции на бентоните. Показано, что данный способ может быть использован для сохранения музейных штаммов энтеровирусов.

Ключевые слова: вирусы Коксаки В, диссоциация, поверхностные компоненты, электронная микроскопия, агрегация, нейтрализация, лиофилизация.

ANNOTATION

Bobir V.V. The superficial components of Coxsackie B viruses and their selection variants - A manuscript.

Dissertation for the candidate of medical sciences in specialty 03.00.06. - Virology. - O.O. Bogomolets National Medical University, Kyiv, 2006.

This scientific thesis is devoted to the investigation of the superficial components of Coxsackie B viruses' formation by means of the cell structures and to their influence on virions' biological properties determination.

The electric microscopic methods have demonstrated the cell components to remain on the Coxsackie B viruses' surface after the reproduction. These cell components increase the virions' resistance to physical, chemical and biological effects and in such a way contribute to their infectiosity maintenance. It has been proved that the ability to associate with the cells debris is typical only for enteroviruses with high aphinity to bentonite (Abent+ variant). The experiments have demonstrated the ability of percapsid components to be contrasted by 1% osmic acid, besides, the virions are released from them after the treatment by organic solvents; the latter confirms their lipid nature.

For the first time there has been demonstrated the differentiation of Coxsackie B viruses' disassociants by their aggregation ability and there has been found out the dependence of the viruses abovementioned properties on the pH medium. The methods of Coxsackie B viruses' freeze drying by means of their preliminary sorption on bentonite has been improved as well.

Key words: Coxsackie B viruses, disassociation, superficial components, electronic microscopy, neutralization, aggregation, freeze drying.

Размещено на Allbest.ru