Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів

Вивчення мінімальної посівної концентрації поверхневозалежних культур клітин свинячої нирки ембріональної, оптимальної інфікуючої дози вакцинного штаму ротавірусу. Розробка методів виготовлення насадок з обраного широкодоступного й біоафінного носія.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 23.08.2014
Размер файла 54,2 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет харчових технологій

УДК 57.086.83

Автореферат дисертації на здобуття ступеня

кандидата технічних наук

РОЗРОБКА ПРОМИСЛОВОЇ ТЕХНОЛОГІЇ КУЛЬТИВУВАННЯ БІОЛОГІЧНИХ АГЕНТІВ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА РОТАВІРУСНИХ АНТИГЕНІВ

БІЛОТКАЧ КАТЕРИНА МИХАЙЛІВНА

03.00.20 - біотехнологія

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному університеті харчових технологій МОН України

Науковий керівник

кандидат технічних наук, доцент Салюк Анатолій Іванович, Національний університет харчових технологій МОН України, доцент кафедри біохімії та екології харчових виробництв

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Карпов Олександр Вікторович, Національний університет харчових технологій МОН України, професор кафедри біотехнології мікробного синтезу

кандидат технічних наук, Думанський Валентин Дмитрович, Державне підприємство "Центр імунобіологічних препаратів" МОЗ України, заступник директора

Провідна установа

Національний університет “Львівська політехніка”, кафедра технології імунобіологічних препаратів, фармації та біотехнології, МОН України, м. Львів

Захист відбудеться "31__" __травня__ 2006 р. о _14-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.058.03 при Національному університеті харчових технологій за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68, корпус А, аудиторія 311

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету харчових технологій за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68.

Автореферат розісланий "28_" ___квітня___ 2006 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради В.М. Поводзинський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Культуральні противірусні вакцини та діагностичні тест-системи - важливі продукти сучасної біотехнології, що є головним засобом боротьби із поширенням вірусних інфекцій. Для виробництва культуральних противірусних вакцин та багатьох діагностичних тест-систем використовують вірусні антигени, отримані за технологією культивування культур клітин тварин та вірусів.

Рентабельність виробництва вірусних антигенів напряму залежить від використання сучасних та ефективних технологій культивування біологічних агентів (БА): культури клітин тварин (КК) та вірусу. Так, на сьогодні в Україні чимало необхідних вірусних антигенів не виробляється через відсутність сучасних високоефективних технологій культивування вірусів. Зокрема, і досі залишається нерозв'язаною проблема діагностики ротавірусної інфекції та імунізації дітей молодшого віку проти ротавірусного гастроентериту. Про важливість розв'язання цього питання свідчать дані ВООЗ, згідно яких, в світі на ротавірусний гастроентерит припадає одна чверть усіх смертельних випадків від гострих кишкових інфекцій, в той час як в Україні більшість випадків ротавірусної інфекції залишається не діагностованою внаслідок недоступності тест-систем на ротавірусну інфекцію. З іншого боку, у сфері агропромислового комплексу, частка вражених ротавірусом сільськогосподарських тварин сягає 30 %, отже, не менш важливою є діагностика ротавірусної інфекції серед сільськогосподарських тварин та їх імунізація проти ротавірусного гастроентериту.

Вирішенням проблеми виробництва діагностичних тест-систем на ротавірусну інфекцію та протиротавірусних імунобіологічних препаратів є розробка промислової технології культивування вакцинного штаму ротавірусу для одержання його поверхневих антигенів. На основі використання антигенів ротавірусу мавп SA-11, специфічних як для людини, так і для тварин, вже розроблено та рекомендовано до виробництва інактивовану протиротавірусну вакцину ветеринарного призначення “РІП-4”. Раніше було також продемонстровано, що для пасивної імунізації дітей проти ротавірусного гастроентериту може бути використане гіперімунне молоко, отримане від корів, імунізованих ротавірусними антигенами. Проте, на сьогодні, через використання класичної технології культивування ротавірусів на культурі клітин у матрасах собівартість виробництва антигенів ротавірусу мавп штаму SA-11 досить висока, що гальмує широке розповсюдження протиротавірусної вакцини серед сільськогосподарських господарств України та подальшу розробку тест-систем та вакцин на основі використання даних антигенів.

Отже, актуальним та необхідним напрямом розвитку вітчизняної біотехнології з виробництва діагностичних тест-систем та противірусних вакцин є розробка промислової технології культивування культур клітин тварин та вірусів, зокрема, ротавірусу мавп штаму SA-11. Впровадження промислової технології виробництва ротавірусів, дозволить підвищити рентабельність одержання ротавірусних антигенів для виробництва інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення "РІП-4".

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідних робіт, проведених згідно угоди про науково-технічне співробітництво між кафедрою біохімії та екології харчових виробництв Національного університету харчових технологій (НУХТ) і кафедрою вірусології Київської медичної академії післядипломної освіти ім._П._Л. Шупика МОЗ України (КМАПО) та в рамках науково-дослідних робіт кафедри вірусології КМАПО “Ротавірусна інфекція: особливості етіології у дітей на сучасному етапі. Розробка експериментально-теоретичних основ створення нових профілактичних і лікувальних препаратів, визначення принципів їх практичного застосування” (державний номер реєстрації 0102U001133), у якій здобувачем особисто виконано частину досліджень “Розробка біотехнології виробництва вакцини для профілактики ротавірусного гастроентериту”.

Мета і задачі досліджень. Мета даної роботи полягала у науковому обґрунтуванні та розробці технології промислового культивування вакцинного штаму ротавірусу мавп SA-11 та поверхневозалежної культури клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої (ПКК СНЕВ).

Для досягнення зазначеної мети були поставлені та вирішені наступні наукові задачі:

1. обрати широкодоступний на ринку України матеріал для використання його у якості носія для культивування поверхневозалежних культур клітин (ПКК) та дослідити методи покращення біоафінності поверхонь обраних матеріалів;

2. визначити мінімальну посівну концентрацію ПКК СНЕВ та дослідити методи скорочення lag-фази у випадку інокуляції низькими посівними кількостями клітин;

3. визначити оптимальну інфікуючу дозу вакцинного штаму ротавірусу;

4. дослідити вплив та визначити оптимальні концентрації субстратів глюкози та глютаміну, на основі чого визначити оптимальні умови культивування БА;

5. запроектувати систему для культивування БА та розробити методи виготовлення насадок з обраного широкодоступного та біоафінного носія;

6. розробити промислову технологію культивування ротавірусу мавп штаму SA-11 та ПКК СНЕВ у насадковій системі, з урахуванням визначених оптимальних умов культивування БА.

Об'єкт дослідження: поверхневозалежна культура клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої, ротавірус мавп штаму SA-11.

Предмет дослідження: технології промислового культивування культур клітин тварин та вірусів. Регуляція проліферації та метаболізму культур клітин тварин in vitro.

Методи дослідження: методи із використанням культур клітин тварин in vitro та вірусологічні методи. Експериментальні, біохімічні, фізико-хімічні, статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше:

-- - показано можливість культивування поверхневозалежних культур клітин (ПКК) на широкодоступних на ринку України полімерних матеріалах, зокрема, плівці поліетилену низької щільності, виготовленій за ГОСТ 10354-82, що призначена для застосування у сільському господарстві та харчовій промисловості;

-- - досліджено вплив глюкози на виживання клітин під час інокуляції. В результаті досліджень виявлено, що збільшення концентрації глюкози впливає на частку кількості живих, після інокуляції, клітин у 97,34% випадків, а визначена оптимальна концентрація глюкози під час інокуляції складає 2,8 г/л;

-- - досліджено вплив щільності моношару клітин ПКК СНЕВ під час інфікування ротавірусом на його вихідний титр. Так, вихід ротавірусу зростає при збільшенні густини до 430 000 клітин на 1 см2 після чого, вихідний титр ротавірусу зменшується.

Вдосконалено:

-- - метод покращення біоафінності поверхонь полімерів, а саме поверхні поліетиленової плівки та виявлено, що знежирена шляхом промивання хромовою сумішшю впродовж не більше ніж 5 хвилин поверхня плівки з поліетилену низької щільності не поступається за своїми біоафіннми властивостями стандартній поверхні для культивування ПКК гідрофілізованому полістиролу. При застосуванні ж стандартної методики окиснення полімерів впродовж 30 і більше хвилин, біоафінність поверхні поліетиленової плівки різко погіршується;

-- - процес внесення середовища кондиціювання при культивуванні ПКК. Зокрема, доведено, що додавання середовища кондиціювання до базового середовища скорочує тривалість lag-фази ПКК СНЕВ при її інокуляції у низьких посівних концентраціях, проте оптимальна концентрація середовища кондиціювання має не перевищувати 25%, замість згадуваних раніше іншими авторами 50%, для культур клітин тварин.

Набуло подальшого розвитку:

- дослідження позитивного впливу зменшених концентрацій глюкози під час культивування КК на питому швидкість росту клітин. Так, визначено, що під час культивування вплив глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ можна описати кінетичною моделлю субстратного інгібування. У свою чергу, для забезпечення максимальної швидкості росту ПКК СНЕВ оптимальна концентрація глюкози під час культивування має становити 0,53 г/л.

Практична цінність отриманих результатів. Розроблено технологію промислового культивування вакцинного штаму ротавірусу мавп SA-11 та поверхневозалежної культури клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої для виробництва ротавірусних антигенів.

Запропонована технологія промислового культивування зазначених БА передбачає:

1. Використання нової системи культивування БА, яка містить:

-- - розвинену поверхню для прикріплення та росту клітин у вигляді насадки, сформованої з хаотично переплетених та ущільнених стрічок поліетиленової плівки низької щільності;

-- - нову систему рециркуляції та аерації середовища культивування, розміщену всередині апарату, в основі роботи якої лежить принцип перекачування рідини водопідйомником Архімеда.

2. Використання розробленого алгоритму керування процесом культивування БА у напівбезперервному режимі з порційним внесенням субстратів. Згідно запропонованого алгоритму розраховуються об'єми концентрованих розчинів субстратів росту, які необхідно ввести, та кратність розведення середовища для підтримки концентрацій субстратів та метаболітів на оптимальному рівні.

3. Стадію виготовлення, підготовки та стерилізації насадки з плівки поліетилену низької щільності для культивування поверхневозалежних культур клітин.

Результати випробування нової технології культивування БА для виробництва антигенів ротавірусу мавп штаму SA-11 для культуральної інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення “РІП-4” у ТОВ “Інститут біотехнологій” засвідчили, що впровадження нової технології культивування БА дозволяє збільшити антигенний титр ротавірусу у 4 рази порівняно з традиційною технологією культивування зазначених БА, а також, скоротити витрати на виробництво одиниці продукції у 2 рази.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено інформаційний пошук та аналіз літератури за темою дисертації. Власноруч проведені експериментальні дослідження, оброблені їх результати та виконано статистичну обробку даних. Автор також брала участь у проведенні та впровадженні розробок у дослідно-промислове виробництво інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення на кафедрі вірусології КМАПО.

Апробація роботи. Результати досліджень доповідались здобувачем, обговорювались та отримали позитивну оцінку на VII-ій міжнародній науково-технічній конференції “Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення” (Київ, 2001 р.); 68-мій науковій конференції молодих учених, аспірантів і студентів (Київ, 2002 р.); міжнародній науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически-активных веществ” (Алушта, 2002 р.); Першій всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих учених” (Київ, 2003 р.); конференції-конкурсі робіт молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2003 р.); ІІІ-ій міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003); 70-тій науковій конференції молодих учених, аспірантів і студентів (Київ, 2004); IV-ій міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2004); ІІ-ій міжнародній конференції “Біотехнологія. Освіта. Наука” (Львів, 2004).

Публікації. Результати дисертаційної роботи повністю відображені у 13 наукових працях, в тому числі у 5 статтях у наукових фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України по спеціальності “Біотехнологія” та одному деклараційному патенті на винахід “Спосіб культивування поверхнево-залежних культур клітин тварин та людини” (№_20031211040), а також, у 7 тезах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, трьох розділів, висновків, списку використаних літературних джерел із 150 найменувань (50 вітчизняних і країн СНД та 100 іноземних) та 7 додатків. Робота викладена на 160 сторінках (основний текст на 100 сторінках), ілюстрована 13 таблицями, 16 рисунками, 4 фотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

штам ротавірус клітина

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, задачі, об'єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну роботи, розкрите її теоретичне та практичне значення, визначено особистий внесок здобувача, наведені дані про апробацію отриманих результатів.

В огляді літератури подано інформацію про сучасний стан виробництва продуктів біотехнології культивування культур клітин тварин та вірусів. Наведено статистику та масштабність захворюваності людей та сільськогосподарських тварин на ротавірусну інфекцію та обґрунтовано необхідність розробки сучасної продуктивної технології культивування ротавірусу. Описані світові тенденції у створенні високоефективних систем культивування ПКК та напрямки пошуку оптимальних умов культивування культур клітин тварин.

Матеріали та методи дослідження. Під час виконання роботи використано поверхневозалежні лінії клітин тварин і людини: КК свинячої нирки ембріональної версенізованої, КК тестикулів поросят (ПТП), КК фібробластів миші (L-929) та КК аденокарциноми гортані людини (HEP-2). КК отримані з Інституту вірусних інфекцій РАМН (Єкатеринбург) та із Музею клітинних культур Інституту цитології РАН (С.-Петербург).

Для одержання ротавірусних антигенів використовували мавпячий ротавірус, штам SA-11, наданий лабораторією етіології, епідеміології і профілактики ентеровірусних інфекцій Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М. П. Чумакова РАМН. Ротавірус зберігали і пасажували на кафедрі вірусології КМАПО у клітинній лінії СНЕВ.

Під час досліджень використовували живильні середовища: модифіковане Дульбекко, мінімальне середовище Ігла (Dulbecco's modified Eagle's Medium, ДМЕМ, D 5468, Sigma), середовище 199 (М 5017, Sigma) та збагачене мінімальне середовище Ігла (МЕМ, М3024, Sigma). Для рутинного субкультивування матричної культури ПКК СНЕВ використовували суміш середовищ ДМЕМ та 199 у співвідношенні 1:1 з додаванням 5 % сироватки ембріонів корів („Сангва”, Львів). Розчини глюкози та глютаміну готували із сухих порошкових реагентів високої чистоти, придатних для культивування КК (глюкоза G7021; глютамін G8540, Sigma), згідно з рекомендаціями виробника.

У якості носіїв органічного та неорганічного походження для дослідження можливості використання їх поверхонь для культивування ПКК, використовували: поліетиленову плівку (ГОСТ 10354-82), поліпропіленову плівку (ГОСТ 26996-86), полістиролову плівку (ГОСТ 20282-86), полівінілхлоридну трубку (ТУ 64-2-286-79), поліамідне волокно, плівковий фторопласт (ГОСТ 100007-80), нержавіючу сталь (12Х18Н10Т), радіотехнічну кераміку та склотканину.

Дослідження можливості підвищення біоафінної здатності поліетиленової плівки проводили за методикою хімічного окиснення поверхонь полімерів у хромовій суміші за умови варіювання часу окиснення: від 0 до 1800 сек. Дослідження біоафінності окиснених поверхонь поліетиленової плівки проводили, культивувуючи ПКК на стандартних поверхнях із наступним підрахунок кількості клітин, які зросли за стандартною методикою.

Визначення кількості іммобілізованих на поверхні насадки клітин проводили із використанням колориметричного методу для визначення проліферативної активності клітин шляхом їх інкубації з розчином редокс індикатора резазурина.

Дослідження впливу концентрації субстратів росту на вихід кількості клітин проводили за методом початкових швидкостей росту. Оцінку отриманих результатів проводили за допомогою регресивного та дисперсійного методів аналізу даних.

Для визначення антигенної активності ротавірусу у культуральній вірусовмісній рідині використовували специфічний еритроцитарний ротавірусний антитільний діагностикум “Ротатест” виробництва Ростовського науково-дослідного інституту мікробіології та паразитології.

Інфекційну активність ротавірусів у культуральній вірусовмісній рідині визначали мікрометодом за цитопатичною дією на ПКК СНЕВ за стандартною методикою.

Статистичну обробку отриманих в ході досліджень даних проводили загальноприйнятими методами із використанням програми “Excel”, пакету “Аналіз даних”, достовірність різниць оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень

В роботі представлені дослідження, проведені по чотирьох напрямах: вибір матеріалу для культивування на його поверхні поверхневозалежних культур клітин (ПКК) та оптимізація способу підготовки поверхні носія; оптимізація умов культивування біологічних агентів; проектування насадкової системи культивування, а також, розробка режиму культивування та принципової схеми виробництва ротавірусних антигенів.

Розробка способу культивування поверхневозалежних культур клітин на поверхнях штучних матеріалів. Досліджуючи широкодоступні на ринку України матеріали щодо придатності їх поверхонь для культивування поверхневозалежних культур клітин, було встановлено, що прикріплення та проліферація клітин можлива лише на поверхнях плівок чи пластинок полімерів. Водночас, культивування було неможливе на поверхнях гранул чи волокон тих же полімерів, а також на поверхнях поліакриламіду, полівінілхлориду та фторопласту. З іншого боку, високі ступені біоафінності по відношенню до перещеплюваних культур клітин були виявлені у харчової нержавіючої сталі та радіотехнічної кераміки (табл. 1).

Таблиця 1

Біоафінність поверхонь полімерних та неорганічних матеріалів

Матеріал

Форма

Формування клітинного моношару

1

2

3

Поліетилен

Гранули

Клітини не прикріплювалися

Стрічка

Моношар сформовано повністю

Поліпропілен

Гранули

Клітини не прикріплювалися

Стрічка

Моношар сформовано повністю

Полістирол

Гранули

Прикріплювалися окремі клітини

Стрічка

Моношар сформовано повністю

Нержавіюча сталь

Пластинка

Моношар сформовано повністю

Кераміка

Те саме

Те саме

Склотканина

Переплетені волокна

Клітини не прикріплювалися

Поліамід

Моноволокно

Те саме

Сітка

Прикріплювалися окремі клітини

Полівінілхлорид

Трубка

Те саме

Фторопласт

Стрічка

- // -

При дослідженні якості моношарів клітин, які виросли на поверхнях зразків матеріалів, встановлено, що клітини не змінювали своєї морфології та не утворювали вогнищ дегенерації, отже, визначені біоафінні матеріали виявились не токсичними для обраних ліній ПКК. Зважаючи на те, що найдоступнішим та поширеним на ринку України з досліджених матеріалів є поліетиленова плівка (ПЕП) низької щільності, що виготовляється за ГОСТ 10354-82 для застосування у сільському господарстві та харчовій промисловості, цей матеріал було обрано як найбільш придатний для подальшого створення насадки для культивування ПКК.

При дослідженні окиснювального методу покращення біоафінності поверхні носія (поліетиленової плівки), а саме модифікації поверхонь полімерів шляхом їх хімічного окиснення (у хромовій суміші), було виявлено, що обробку ПЕП доцільно проводити не довше ніж 5 хвилин (300 сек), оскільки більш тривале окиснення поверхні носія негативно впливає на вихід біомаси клітин.

Визначення оптимальних умов культивування біологічних агентів. При дослідженні можливості інокуляції ПКК СНЕВ на поверхню ПЕП у малих посівних кількостях клітин, було виявлено, що фази латентного росту культури при посівних кількостях клітин: від 25 до 200 тис. клітин/мл, сильно розтягнуті (до 48 годин), у той час, як при вищих посівних кількостях, фаза латентного росту коротша (до 24 годин). Визначення кількості живих клітин ПКК СНЕВ на 48-72 годину після інокуляції на ПЕП показало, що при посівних кількостях клітин до 100 000 клітин на один мілілітр поживного середовища (чи до 50 000 клітин на см2 ПЕП), клітини ПКК СНЕВ не здатні адаптуватися до умов культивування. У свою чергу, при інокуляції ПКК СНЕВ на ПЕП у кількості 200 000 клітин/мл хоч і спостерігається подовжена lag-фаз, проте на 96 годину культивування питома швидкість росту культури близька до питомої швидкості росту для більших кількостей клітин в інокуляті: для посівної кількості 200 000 клітин - 0,29 год-1, а для більших кількостей від 0,17 год-1 до 0,2 год-1, на відміну від повної зупинки росту при менших посівних кількостях клітин. Отже, мінімальною посівною концентрацією ПКК СНЕВ для інокуляції на поверхню поліетиленової плівки було визначено 100 000 клітин на 1 см2 поверхні росту (200 000 клітин на мілілітр живильного середовища).

З метою виявити фактори, що впливають на тривалість lag-фази при інокуляції ПКК СНЕВ у кількості 200 000 клітин/мл, було досліджено вплив середовища кондиціювання на проліферативну активність ПКК СНЕВ. Дослідження впливу середовища кондиціювання (СК) на активність росту ПКК СНЕВ проводили шляхом внесення на початку культивування від 12,5 до 50 % СК у основне живильне середовище.

За результатами підрахунку кількості клітин на першу добу культивування у середовищі без додавання СК вона зменшувалась на 10 %, у той час як у лунках із додаванням середовища кондиціювання, навпаки збільшувалась до 35%, що свідчить про позитивний вплив на проліферативну активність ПКК СНЕВ введення середовища кондиціювання.

Розрахована питома швидкість росту ПКК СНЕВ на 72 годину для проб з додаванням 50% СК була меншою, ніж для проб з меншим вмістом СК: 0,13 проти 0,33-0,37 доби-1, відповідно. Отже, для інтенсифікації росту ПКК СНЕВ було рекомендовано при інокуляції насадки додавати 25% СК до основного середовища культивування.

Для визначення оптимальної інфікуючої дози вакцинного штаму ротавірусу було проведено дослідження впливу кількості клітин ПКК СНЕВ під час інфікування на вихідний титр ротавірусу. За результатами дослідження встановлено, що при інфікуванні клітин, що зростають на ПЕП у густині більш ніж 500 000 клітин на 1 см2 поверхні, вихідний титр ротавірусу зменшується.

Окрім того, було визначено, що інфікування клітин у ранній стаціонарній фазі та пізніше негативно впливає на вихідний титр ротавірусу мавп штаму SA-11, (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив щільності клітин ПКК СНЕВ на вихід інфекційного титру ротавірусу

Щільність ПКК СНЕВ, тис клітин/см2

250

430

665

700

Доба культивування ПКК СНЕВ

1

2

3

4

Вихідний інфекційний титр ротавірусу, lgТЦД50/0,1мл

На 24 год

2,0

3,0

2,5

2,0

На 48 год

3,5

5,5

3,5

3,0

При визначенні мінімальної інфікуючої дози ротавірусу, найкращий результат було отримано при інфікуванні клітин 100 дозами вірусу або при інфікуванні 100 000 клітин 30 ТЦД50.

Згідно з результатами, отриманими в ході дослідження впливу глюкози в межах (1-4) г/л та глютаміну (0,1-0,6) г/л на вихід кількості клітин, встановлено, що глюкоза на початку культивування, як і середовище кондиціювання, позитивно впливає на приріст клітин. Розрахована з використанням регресивного методу аналізу даних оптимальна концентрація глюкози для забезпечення максимального виживання клітин ПКК СНЕВ після інокуляції на ПЕП становила 2,8 г/л.

Проте, аналізуючи розраховані значення питомих швидкостей росту, було встановлено, що підвищення концентрації глюкози впливало лише на виживання клітин на 24 годину культивування, і, навпаки, збільшення концентрації глюкози негативно впливало на питому швидкість росту культури під час культивування.

Для визначення оптимальної концентрації глюкози було проаналізовано моделі впливу субстрату на питому швидкість росту БА та визначено, що модель субстратного інгібування, запропонована Вебом, найкраще описує вплив глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ (коефіцієнт детермінації даної моделі складав 0,98):

,

де - питома швидкість росту культури, год-1; max - максимальна швидкість росту, год-1; S - концентрація субстрату, г/л; KS константа насичення субстратом; константа інгібування; b - коефіцієнт, що описує характер впливу субстрату (визначається експериментально. При b рівному одиниці рівняння Веба приймає форму рівняння Моно; концентрація субстрату (0,98), більше за нуль - субстрат впливає як активатор; менше за нуль - субстрат впливає як інгібітор).

Визначена згідно кінетичної моделі Веба за алгоритмом пошуку екстремумів функцій, оптимальна концентрація глюкози, яку потрібно підтримувати у середовищі культивування для забезпечення максимальної питомої швидкості росту ПКК СНЕВ, складає 0,53 г/л.

Дисперсійний аналіз впливу глютаміну на швидкість росту ПКК СНЕВ показав, що глютамін суттєво не впливав на питому швидкість росту ПКК СНЕВ у концентраціях, вищих за 0,1 г/л. Глютамін впливав позитивно на приріст клітин ПКК СНЕВ у межах концентрацій від 0,01 до 0,1 г/л.

Для визначення впливу метаболітів застосовували солі сульфату амонію та лактату натрію, які вводили у середовище культивування до досягнення концентрацій: амонію 1; 2; 4 мМ/л та лактату 25; 50; 75 мМ/л. За отриманими результатами було встановлено, що зазначені метаболіти впливають як інгібітори на ріст клітин ПКК СНЕВ. При співставленні впливу солей амонію та лактату, більш різка дія було виявлена для лактату, що свідчило про недопустимість закислення середовища культивування. Використовуючи модель впливу продукту-інгібітору на швидкість росту БА, була встановлена допустима концентрація амонію на рівні 5 мМ/л, оскільки за неї, питома швидкість росту культури наближалася до максимальної - 0,02·год-1. Так як, інгібуючий вплив лактату пояснюється підвищенням осмомоляльності у середовищі культивування, що виникає внаслідок корекції низьких значень рН введенням лугів, для регуляції рН у середовищі було рекомендовано від'ємно-доливні методи чи техніку перфузії середовища культивування через насадку. З іншого боку, зменшення рівня продукції метаболітів можна викликати шляхом зменшення рівня споживання субстратів росту. Отже, зважаючи на те, що у стандартних середовищах культивування рівні вказаних субстратів лежать у межах: глюкози 1 4 г/л, глютамін у 0,1 - 0,6 г/л, та виходячи з оцінених оптимальних значень концентрацій глюкози (2.8 г/л глюкози під час інокуляції ПКК СНЕВ та 0,53 г/л глюкози під час культивування), було рекомендовано використовувати для інокуляції ПКК СНЕВ стандартні середовища з найменшим вмістом глютаміну, а концентрацію глюкози на початку культивування доводити до 2,8 г/л. Проте, оскільки було виявлено інгібуючий вплив збільшених концентрацій глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ, під час культивування було рекомендовано підтримувати її концентрацію на рівні (0,3 - 0,75) г/л.

Проектування системи культивування ПКК тварин на поверхні поліетиленової плівки. При дослідженні методів формування насадок, було зроблено висновок, що найбільш зручним та ефективним методом є формування насадки з ущільнених стрічок, які попередньо нарізаються з ПЕП. Розроблена стадія виготовлення носіїв для культивування ПКК, дозволяє створювати насадки, які складаються із стрічок поліетиленової плівки, частини якої не спікаються та не змінюють своєї площі під час стерилізації (табл. 3.).

Таблиця 3

Стадія виготовлення та підготовки носія

Найменування операції

Опис операції

1

2

3

1

Виготовлення носіїв

Нарізання плівки поліетилену на стрічки шириною до 2 мм завширшки і до 100 мм завдовжки.

2

Знежирювання носіїв

Короткочасне промивання (до 5 хв.) виготовлених носіїв у хромовій суміші

3

Промивання носіїв

20-разове промивання знежирених носіїв у проточній та дистильованій воді

4

Випрямлення носіїв

Короткочасна (до 2 хв.) термічна обробка (t=100oC) носіїв у дистильованій воді

5

Формування насадки

Намотування м'яких термічно оброблених за п. 4. носіїв на стержень, що обертається

6

Монтаж насадки

Закріплення підготовленої насадки у посудині для культивування шляхом притискання перфорованим полімерним диском чи затисканням у перфорованому полімерному барабані

7

Підготовка до стерилізації

Дворазове промивання закріпленої у посудині для культивування, насадки нестерильним фізіологічним розчином з наступним заповненням 2/3 посудини нестерильним фізіологічним розчином

8

Стерилізація насадки

Парова стерилізація насадки, що занурена у фізіологічний розчин, при + 115оС впродовж 30 хвилин

9

Промивання насадки

Видалення фізіологічного розчину та одноразове промивання насадки стерильним розчином Хенкса для культур клітин та культуральним середовищем.

Готова насадка не розпушується та не ущільнюється під час культивування БА, характеризується високими співвідношенням площі поверхні для прикріплення та росту клітин до об'єму культивування: 1 см2/0,6мл.

Для перемішування та аерації середовища культивування було запроектовано новий перемішуючий пристрій, в основу роботи якого покладено принцип роботи водопідйомника Архімеда. Оптимальні розміри функціональних частин удосконаленого водопідйомника Архімеда було розраховано на основі модифікованого Данквертсом рівняння Хігбі. Принципова схема системи культивування із вмонтованим всередину модифікованим водопідйомником Архімеда, зображена на рис. 5.

Запропонована система культивування характеризується наступними параметрами: габаритні розміри 0,3 м х 0,3 м ; радіус вбудованої системи аерації 0,1 м; висота вбудованої системи аерації 0,1 м; площа поверхні культивування на насадці становить 3 м2; об'єм середовища культивування 2,05 л; об'єм насадки 2 л; кутова частота обертання системи 30 об/хв; режим руху середовища по каналах насадки ламінарний; кількість клітин забезпечених киснем 1,3·106 клітин/мл.

У створеній системі культивування було прокультивовано ПКК СНЕВ впровдож 96 год. Оскільки прямими методами було неможливо визначити кількість клітин, що зростали на насадці, використовували визначення проліферативної активності ПКК СНЕВ, яку проводили оптичним методом з використанням стандартного розчину окисно-відновлювального індикатора резазуріну. Для цього у систему культивування в середовище вносили розчин резазуріна та інкубували впродовж 3 годин. У якості зразка порівняння, використовували іненсивність забарвлення індикатором середовища культивування у присутності клітин, які зростали у матрах об'ємом 1,5 л.

Наведені у табл. 4 результати випробування ефективності культивування ПКК СНЕВ за класичною та насадковою технологіям культивування свідчать про те, що використання насадкової технології культивування ПКК СНЕВ є більш ефективним методом нарощування клітинної біомаси ПКК СНЕВ, ніж класична технологія.

Таблиця 4

Порівняння ефективності застосування класичної та насадкової технології культивування ПКК СНЕВ

Показники ефективності

Технологія

Класична

Насадкова

Кількість клітин, клітин/мл

1,6 106

*

Оптична густина середовища культивування, інкубованого у присутності резазуріну та клітин, OD

0,0688

0,1313

Примітка. * - неможливо визначити прямими методами

Для дослідження рівномірності розселення клітин по насадці, клітини були забарвлені спиртовим розчином кристалічного фіолетововго. Після забарвлення клітин, насадка була розрізана вздовж своєї вертикальної вісі. На розрізі ріст клітин було відмічено на всіх ділянках насадки: як у придонній, так і у верхній її частинах. Отже, застосування у якості пристрою для рециркуляції середовища модифікованого водопідйомника Архімеда дозволило уникнути градієнтного розселення клітин по довжині насадки, і, таким чином, підвищити вихід кількості клітин. Окрім того, в глибині насадки не було виявлено зон загибелі клітин, що свідчило про забезпечення

клітин киснем навіть у глибині насадки, чого неможливо було б забезпечити, використовуючи лише поверхневий спосіб аерації.

Розробка технологічного режиму культивування БА та принципової схеми виробництва ротавірусних антигенів. Оскільки продуктивне культивування ПКК СНЕВ неможливе без відновлення спожитих субстратів та вилучення накопичених інгібіторів росту, а концентрацію іммобілізованих на насадці клітин не можна визначити прямими методами, для керування процесом культивування було розроблено алгоритм, в основі роботи якого лежить припущення про експоненціальний ріст культури. За запропонованим алгоритмом визначалися об'єми концентрованих субстратів та кратність розведення середовища, що дозволило вести процес культивування ПКК СНЕВ у напівбезперервному режимі із порційним внесенням субстратів. Використовуючи визначені оптимальні технологічні параметри процесу культивування БА, була розроблена насадкова технологія культивування вакцинного штаму ротавірусу у напівбезперервному режимі з порційним внесенням субстратів.

Лабораторні та промислові випробування запропонованої технології у ТОВ "Інститут біотехнологій", м. Київ, показали збільшення виходу інфекційно активного вірусу та його антигенного титру, (табл. 5). Згідно розрахунку впровадження насадкової технології культивування ротавірусу для одержання його антигенів, заміна класичної технології культивування БА на насадкову дозволяє скоротити витрати на виробництво одиниці продукції у 2 рази, а також скоротити трудовитрати. Отримані результати свідчать про ефективність розробленої технології культивування та перспективність її застосування для виробництва імунобіологічної продукції на основі використання антигенів ротавірусу, зокрема, інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення "РІП-4".

Таблиця 5

Ефективність застосування насадкової технології культивування ПКК СНЕВ на вихід вакцинного штаму ротавірусу мавп SA-11

Показники ефективності культивування БА

Технологія культивування

Традиційна

Пропонована технологія

Інфекційна активність вірусу, lgТЦД50/мл

4

6

Антигенний титр вірусу, ГАО/25мкл

1:256

1:1024

Собівартість виробництва одиниці продукції, грн.

10,356

5,28

Висновки

У дисертації подані теоретичні узагальнення і нове розв'язання наукового завдання, що полягає у підвищенні ефективності процесів культивування культур клітин тварин і вірусів, зокрема у розробці ефективних методів культивування поверхневозалежних клітин на поверхнях полімерів та оптимізації режиму окисного покращення біоафінності носіїв, а також в оптимізації складу поживних середовищ щодо концентрацій основних ростлімітуючих субстратів, визначенні оптимальних умов інокуляції БА.

За результатами дослідження:

1. Підібрано матеріал - плівку з поліетилену низької щільності (ГОСТ 10354-82), поверхня якої придатна для культивування ПКК тварин in vitro.

2. Встановлено, що при інокуляції культури СНЕВ у низьких посівних концентраціях на поверхню плівки поліетилену внесення 25% (за об'ємом) середовища кондиціювання до базального поживного середовища дозволяє скоротити тривалість lag-фази ПКК СНЕВ на 24 години.

3. Визначено оптимальну інфікуючу дозу ротавірусу мавп штаму SA-11 під час його культивування у клітинах ПКК СНЕВ, які зростають на поверхні плівки поліетилену. Оптимальна множинність інфікування складає 2,9·10-4 ТЦД50/клітину.

4. За допомогою методів математичного моделювання доведено, що глюкоза на початку культивування впливає на виживання клітин, як речовина із протекторною дією, проте, в ході культивування збільшення концентрації глюкози негативно впливає на питому швидкість росту ПКК СНЕВ. Визначені оптимальні концентрації глюкози становлять: на початку культивування 2,8 г/л, під час культивування 0,53 г/л.

5. Науково обгрунтовано та експериментально підтверджено ефективність розробленої технології виготовлення насадок, що дозволяє створювати просторові та біоафінні насадки з високим співвідношенням площі поверхні для прикріплення та росту клітин до об'єму культивування (1 см2/0,6 мл). Створена насадкова система культивування із рециркуляцією та аерацією середовища, яка дозволяє рівномірно інокулювати насадку та забезпечити киснем клітини у кількості 1,3·106 клітин/мл.

6. Розроблено промислову технологію культивування ротавірусу мавп штаму SA-11 та поверхневозалежної культури клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої, яка дозволяє збільшити вихід антигенного титру ротавіруса у 4 рази, порівняно із класичною технологією культивування вказаних БА.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Періодичні фахові видання, затверджені ВАК України:

1. Білоткач К.М., Салюк А.І., Трохименко О.П., Дзюблик І.В. Культивування поверхневозалежних культур клітин тварин на нетрадиційних матеріалах. Дослідження впливу окиснювальної модифікації поліетиленової плівки на вихід біомаси клітин // Вісник Тернопільського державного технічного університету. - 2004. - Т.9. - № 2. - С. 160-167. (Особисто автором проведено оптимізацію режиму окисної модифікації (хромовою сумішшю) поверхні поліетиленової плівки та встановлено, що окиснення у хромовій суміші поверхні поліетилену має позитивний результат на вихід клітин за умови обробки полімеру не довше, ніж 5 хвилин; проведено культивування ПКК СНЕВ на насадці, виготовленій з окисненої плівки та встановлено, що новий метод окиснення дає можливість отримати на 20% більше клітин, ніж з насадки, виготовленої з неокиснених стрічок ПЕП).

2. Білоткач К.М., Трохименко О.П., Коршун Л.М. Підвищення ефективності культивування вакцинного штаму ротавірусу тварин //Аграрний вісник Причорномор'я. 2004. Вип. 25. С. 78-88. (Особисто автором запропоновано план та проведено дослідження впливу основних лімітуючих ріст субстратів на вихід біомаси клітин ПКК СНЕВ, було самостійно оброблено отримані в ході дослідження дані та виконано математичні розрахунки щодо визначення оптимальних концентрацій субстратів, проведено культивування ПКК СНЕВ у напівбезперервному режимі з порційним внесенням субстратів).

3. Білоткач К.М., Салюк А.І., Трохименко О.П., Дзюблик І.В. Штучні матеріали як носії для культивування поверхнево-залежних культур клітин // Наукові праці національного університету харчових технологій. - 2004. - № 15. -С. 80 82. (Особисто автором досліджено та доведено можливість використання штучних матеріалів вітчизняного виробництва, зокрема плівки з поліетилену низької щільності (виготовленої за ГОСТ 10354-82), як носіїв для культивування поверхнево-залежних культур клітин; власноруч виготовлено модельні насадки, на яких були прокультивовані ПКК: СНЕВ, L-929, ПТП, HEP-2).

4. Білоткач К.М., Трохименко О.П., Дзюблик І.В. Салюк А.І. Культивування ротавірусів на полімерних носіях при одержанні культуральної інактивованої протиротавірусної вакцини // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. - 2005. -№ 44, - C. 6-10 (Особисто автором розроблено план експерименту, підібрано вимірювальну техніку, проведено експеримент та математично оцінені отримані результати. Запропоновано режим культивування ПКК СНЕВ, стратегію керування процесом культивування та складено алгоритм розрахунку оцінюваних значень концентрацій клітин та субстратів, а також визначення об'ємів концентрованих субстратів росту, які необхідно вводити, та кратність розведення середовища культивування; проведене культивування ротавірусу на вирощених на насадці клітинах).

5. Дзюблик І.В., Трохименко О.П., Білоткач К.М., Салюк А.І. Спосіб культивування поверхневозалежних культур клітин тварин та людини. Деклараційний патент на винахід №20031211040, виданий 16.08.2004р.(Особисто автором опрацьовано літературні дані щодо існуючих запатентованих способів культивування ПКК та запропоновано метод культивування на стрічках ПЕП, розроблено метод виготовлення зі стрічок компактної насадки та апробовано його на практиці, визначено характер росту ПКК на модельній насадці та кількісно оцінено приріст клітин).

6. Білоткач К.М., Трохименко О.П., Салюк А.І., Коршун Л.М. Насадкова система для культивування культур клітин тварин із перемішуючим та аеруючим пристроєм модифікованим водопідйомником Архімеда. // Наукові вісті НТУ КПІ. 2005. № 6(44), С. 118 125. (Автором безпосередньо виведений математичний вираз, що описує вплив геометричних параметрів аератора на значення об'ємного коефіцієнту масопередачі, розраховані оптимальні розміри конструкційних елементів запропонованого пристрою, накреслено ескіз апарату та зроблено замовлення на його виготовлення. Автором власноруч були проведені дослідження щодо перевірки ефективності застосування запропонованої системи культивування ПКК, зроблені висновки та підготовлено статтю до друку).

Тези доповідей:

7. Білоткач К.М., Дзюблик І.В., Салюк А.І., Трохименко О.П. Створення високоефективного обладнання для мікробіологічного виробництва ротавірусної вакцини для ВРХ і свиней // Наукові праці НУХТ. спецвипуск №10. Тези VII міжнародної науково-технічній конференції “Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення” . Київ. 2001. С. 180-181.

8. Гирин. В.Н., Дзюблик И.В., Трохименко Е.П., Ковалюк Е.В., Билоткач Е.М. Поиск и создание иммунопотенциирующих компонентов для ротавирусных антигенов // Тезисы докладов Международной научно-практической конференции “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ”. Алушта. 2002. - С. 105-106.

9. Білоткач К.М., Трохименко О.П., Салюк А.І. Високопродуктивне обладнання для промислового культивування поверхневозалежних культур клітин// Тези доповідей учасників І Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених. Київ. 2003. С. 139-140.

10. Білоткач К.М., Салюк А.І., Трохименко О.П., Дзюблик І.В. Спосіб культивування поверхневозалежних культур клітин з метою досягнення високої щільності їх біомаси // Тези конференції-конкурсі робіт молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології". -Київ. 2003. С.34.

11. Білоткач К.М., Салюк А.І., Трохименко О.П., Дзюблик І.В. Оптимізація умов промислового культивування клітин тварин та людини // Тези ІІІ-ої міжнародної науково-практичної конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія”. Харків. 2003. С. 246.

12. Білоткач К.М., Трохименко О. П., Дзюблик І.В. Культивування ротавірусів на полімерних носіях при одержанні культуральної протиротавірусної вакцини // Тези IV-ї міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”. Київ. 2004.

13. Білоткач К.М., Салюк А.І., Дзюблик І.В., Трохименко О П., Коршун Л. М. Оптимізація режиму культивування біологічних агентів при виробництві інактивованої протиротавірусної вакцини // Тези ІІ-ї міжнародній конференції “Біотехнологія. Освіта. Наука”. Львів. 2004. С.

АНОТАЦІЯ

Білоткач К.М. Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів.

Дисертація (рукопис) на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20 біотехнологія. Національний університет харчових технологій. Київ, 2006.

Дисертація присвячена розробці промислової технології культивування поверхневозалежної культури клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої (ПКК СНЕВ) та ротавірусу мавп.

Одержані дані про те, що культивування поверхневозалежних культур клітин (ПКК) можливе на полімерних матеріалах, зокрема, плівці поліетилену низької щільності. Для культивування на насадці, виготовленої зі стрічок поліетиленової плівки, запропоновано використовувати нову систему рециркуляції та аерації середовища культивування, яка розміщена всередині апарату та в основі роботи якої лежить принцип перекачування рідини водопідйомником Архімеда.

Встановлено, що присутність глюкози у концентрації до 2,8 г/л на початку культивування ПКК СНЕВ позитивно впливає на виживання клітин під час інокуляції, проте, її концентрація під час культивування має становити 0,53 г/л.

Визначені мінімальна посівна концентрація ПКК СНЕВ 200 000 клітин/мл та оптимальна множинність інфікування ротавірусом 2,9·10-4 ТЦД50/клітину. Для скорочення lag-фази запропоновано вносити 25% середовища кондиціювання до основного складу живильного середовища.

Розроблено напівбезперервний режим культивування ПКК СНЕВ із порційним внесенням концентрованих субстратів росту, застосування якого дозволяє збільшити антигенний титра - у 4 рази порівняно із класичною технологією кльтивування вказаних БА.

Ключові слова: культивування поверхневозалежних культур клітин, системи культивування із зафіксованою насадкою, оптимізація складу середовища, концентрація глюкози, культивування ротавірусів.

АННОТАЦИЯ

Билоткач Е.М. Разработка промышленной технологии культивирования биологических агентов для производства ротавирусных антигенов.

Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата технических наук по специальности 03.00.20 биотехнология. Национальный университет пищевых технологий. Киев, 2006.

В диссертации представлены результаты исследований, направленных на разработку промышленной технологии культивирования поверхностно-зависимой культуры клеток свиной почки эмбриональной версенизированной (ПКК СПЭВ) и ротавируса обезьян SA-11.

Проведенными исследованиями получены данные о том, что культивирование поверхностно-зависимых клеток животных возможно на поверхностях полимерных материалов, в частности, на поверхности полиэтиленовой пленки низкой плотности. Для культивирования на насадке, изготовленной из переплетенных и уплотненных лент полиэтиленовой пленки, предложено использовать новую систему рециркуляции и аэрации среды, в основе работы которой лежит принцип роботы водоподъемника Архимеда.

Установлено, что присутствие глюкозы в концентрации до 2,8 г/л вначале культивирования позитивно влияет на выживание клеток после их пересева, в то же время, концентрация глюкозы для обеспечения максимальной скорости роста культуры во время культивирования должна составлять 0,53 г/л.

Определены минимальная посевная доза ПКК СПЄВ 200 000 клеток/мл и оптимальная множественность инфицирования клеток ротавирусом 2.9·10-4 ТЦД50/клетку. Для сокращения длительности lag-фазы предложено вносить 25% среды кондиционирования к основному составу среды.

Разработан полунепрерывный режим культивирования ПКК СПЭВ с дробным внесением концентрированных субстратов роста, применение которого позволяет повысить антигенный титр - в 4 раза, по сравнению с классической технологией культивирования указанных БА.

Ключевые слова: культивирование поверхностно-зависимых культур клеток, системы культивирования с зафиксированной насадкой, оптимизация состава среды, концентрация глюкозы, культивирование ротавирусов.

SUMMARY

Bilotkach K.M. Industrial technology development for cultivation biological agents in production rotaviral antigens.

The dissertation (manuscript) is for the degree of Candidate of Technical Science, specialization 03.00.20 - biotechnology - National Food Technology University, Kyiv, 2006.

The dissertation develops technology for industrial cultivation of anchorage-dependent embryonic porcine kidney cell culture (ADCC EPK) and ape rotavirus SA-11. The products of cultivation are used for production of anti-rotavirus vaccine. Materials, commercially available in Ukraine, are tested as potential carriers for cultivation of anchorage-dependent animal cell cultures to be used in fixed-bed cultivation systems. Optimization of conditions and regimes for cultivation and inoculation of biological agents is also studied.

Results show that cultivation of anchorage-dependent cell cultures (ADCC) is possible on polymers, which are easily commercially available in Ukraine, such as low density polyethylene film for use in agriculture and food industry. We determine that glucose in concentrations of up to 2.8 g/l in the beginning of cultivation positively impacts survival of cells during inoculation. At the same time, increasing glucose concentration positively influences share of living cells after inoculation in 97.34% of cases; however, during cultivation influence of glucose on specific rate of growth of ADCC EPK follows the substrate inhibition model. On the other hand, optimal glucose concentration to ensure maximum growth rate of ADCC EPK after lag-fase is 0.53 g/l.

The minimal starting concentration of ADCC EPK is determined to be 200 000 cells/ml or 100 000 cells/cm2 of polyethylene film. The optimal infection dose with rotavirus is determined to be 2.9 10-4 TCD50/cell. To shorten the lag-fase we propose to introduce 25% of conditioning medium to the main medium.

It was not detected any impact of the glutamine concentration in the measure of 0.1 - 0.6 g/l, but it was opened that glutamine may influence as a promotion cell culture growth substrate in the concentrations under 0.1 g/l

The influence of inhibition substances as lactate and ammonia was detected as typical product-inhibitor on the range of cell culture proliferation.

A new cultivation medium recirculation and aeration system is offered; the system is located inside the bioreactor and uses the Archimedes water lifting mechanism.

Semi-continuous ADCC EPK cultivation regime is developed, with concentrated growth substrates introduced in batches. The volume of growth substrates and dilution factor of cultivation medium are determined using the special algorithm, supporting optimal ADCC EPK cultivation regime.


Подобные документы

  • Лабораторні дослідження виділення вірусу на курячих ембріонах (КЕ). Можливость використання перепелиних ембріонів (ПЕ) для культивування МПВ на моделі вакцинного штаму 1062. В трахеї інфікованих ПЕ запальні та деструктивні процеси, слизової оболонки.

    статья [11,3 M], добавлен 26.09.2010

  • Основні процеси, за допомогою якого окремі клітини прокаріотів і еукаріотів штучно вирощуються в контрольованих умовах. Здатність перещеплених клітин до нескінченного розмноженню. Культивування клітин поза організмом. Основні види культур клітин.

    презентация [1,3 M], добавлен 16.10.2015

  • Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.

    статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017

  • Оптимізація складу живильних середовищ для культивування продуцентів біологічно активних речовин, способи культивування. Мікробіологічний контроль ефективності методів стерилізації. Методи очищення кінцевих продуктів біотехнологічних виробництв.

    методичка [1,9 M], добавлен 15.11.2011

  • Особливості та основні способи іммобілізації. Характеристика носіїв іммобілізованих ферментів та клітин мікроорганізмів, сфери їх застосування. Принципи роботи ферментних і клітинних біосенсорів, їх використання для визначення концентрації різних сполук.

    реферат [398,4 K], добавлен 02.10.2013

  • Вивчення середовища для виробництва білкових концентратів із водоростей, бактерій, рослин, дріжджів та грибів. Огляд ферментаторів для стерильного культивування мікроорганізмів. Аналіз флотації, сепарування, випарювання й сушіння для одержання протеїнів.

    дипломная работа [126,7 K], добавлен 07.05.2011

  • Вивчення різновидів комах-шкідників садових культур та основних методів боротьби з ними. Аналіз особливостей біології і поведінки шкідників плодових дерев та ягідних культур: попелиць, щитовиків, плодових довгоносиків, короїдів, метеликів, пильщиків.

    курсовая работа [693,7 K], добавлен 21.09.2010

  • Вивчення механізмів зміни, розмноження та реплікації генетичної інформації. Особливості організації, будови та функції клітин. Забезпечення редуплікації ДНК, синтезу РНК і білка. Характеристика еукаріотів та прокаріотів. Кінцеві продукти обміну речовин.

    реферат [1,0 M], добавлен 19.10.2017

  • Будова та функції біологічних мембран, їх роль в функціонуванні всіх клітин. Дифузія, активний і пасивний транспорт. Ендоцитоз та екзоцитоз, їх види. Мембранна теорія збудження. Роль біологічних мембран в даних процесах. Потенціал дії та його фази.

    курсовая работа [3,0 M], добавлен 09.04.2013

  • Основна структурно-функціональна одиниця всіх живих організмів. Основні типи клітин. Будова, розмноження клітин та утворення білка. Колоніальні та багатоклітинні організми. Заміщення відмерлих та пошкоджених тканин організму. Способи поділу клітин.

    презентация [5,6 M], добавлен 18.12.2011

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.