Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВПЛИВ ПЕРОКСИДУ ВОДНЮ НА КОНЦЕНТРАЦІЮ КАЛЬЦІЮ В ТИМОЦИТАХ ЩУРА

03.00.02 - біофізика

АРТЕМЕНКО ОЛЕКСАНДР ЮРІЙОВИЧ

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович

доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри біофізики

Офіційні опоненти:

Рибальченко Володимир Корнійович, доктор біологічних наук, професор, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач відділу цитофізіології Інституту фізіології ім. акад. Петра Богача біологічного факультету

Бабіч Лідія Григорівна, кандидат біологічних наук, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник, старший науковий співробітник відділу біохімії м'язів

Провідна установа: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Захист відбудеться 30 січня 2007 року о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ - 33 , вул. Володимирська, 64, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ - 33, вул. Володимирська, 58)

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

пероксид водень цитоплазматичний тимоцит

Актуальність проблеми. Іони кальцію виконують важливу роль внутрішньоклітинних посередників. Зміни внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію ([Ca²⁺]_і) обумовлюють м`язове скорочення, вивільнення нейротрансмітерів, забезпечують регуляцію динаміки цитоскелету, фоторецепцію, ділення клітини, експресію генів та інші фізіологічні функції клітини. Регуляція рівня [Ca²⁺]_i визначається як функціональною активністю плазматичної мембрани, так і внутрішньоклітинних органел - ендоплазматичного ретикулума, мітохондрій, ядра тощо [Carafoli, 2002]. Оскільки діючим фактором, регулятором і пусковим механізмом різноманітних клітинних функцій є концентрація вільного кальцію в цитоплазмі клітини, виникає важлива задача швидкого і точного визначення величини [Ca²⁺]_i в інтактних клітинах.

Найбільш поширеним та перспективним є флуоресцентний метод з застосуванням кальційчутливих флуоресцентних зондів. Флуоресцентні зонди індо-1, род-2 [Grynkiewicz, 1985] та інші дають можливість неперервної реєстрації змін рівня [Ca²⁺]_i у клітинах в стані спокою та під час дії різноманітних агоністів. Значна кількість робіт присвячена природі Са²⁺-сигналів в збудливих клітинах, але ще не достатньо досліджені зміни концентрації цитозольного кальцію в незбудливих клітинах.

Пероксид водню - це мала електронейтральна молекула, яка може вільно дифундувати всередину клітини. Порівняно з іншими відносно короткоживучими молекулами активними формами кисню (АФК), наприклад, супероксидним аніоном ^.О₂^-, - Н₂О₂ більш стійкий, хоча на його стабільність впливає рН та окисно-відновна рівновага всередині клітини. Ще більш важливим є те, що молекула Н₂О₂ електронейтральна і являється однією із небагатьох АФК, які вільно дифундують через клітинні мембрани. Залишок цистеїну являється легкою мішенню окиснювальної дії Н₂О₂, якщо він знаходиться в депротонованому стані. Безперечно, що тільки деякі клітинні білки мають цистеїн, який може окиснюватися за таких умов. Це є причиною того, що така маленька молекула, як Н₂О₂, може виступати у ролі специфічного вторинного посередника.

Крім того, пероксид водню, може виступати ініціатором запуску апоптозу. Цей процес, який відіграє особливу роль у підтриманні гомеостазу тканин імунної системи, зокрема тимусу, ефективно індукується під дією фізіологічних факторів, таких як специфічні цитокіни, стероїдні гормони, окисний стрес.

Важливу роль в ініціації та прискоренні апоптозу відіграє підвищення концентрації іонів кальцію у цитозолі. Причиною такого підвищення може бути, як посилення входу кальцію через плазматичну мембрану, так і порушення його внутрішньоклітинного гомеостазу, який підтримується такими системами депонування кальцію, як ендоплазматичний ретикулум та мітохондрії.

У зв'язку з цим, актуальним є дослідження зміни [Са²⁺]_і в тимоцитах, ролі внутрішньоклітинних Са²⁺ - депо на її рівень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт кафедри біофізики, біологічного факультету, Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка і виконана у межах теми № 01БФ036-07 “Дослідження та моделювання молекулярних та клітинних процесів в збудливих біологічних системах”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідити при різних температурах вплив різних концентрацій пероксиду водню на кальцієвий гомеостаз в тимоцитах щурів. Для досягнення цієї мети були сформульовані такі основні задачі:

Дослідити дію різних концентрацій пероксиду водню на зміни концентрації цитоплазматичного кальцію в тимоцитах.

Перевірити, чи впливають використані концентрації пероксиду водню на проникність цитоплазматичної мембрани до іонів кальцію.

Дослідити дію різних концентрацій пероксиду водню на зміну рН цитозолю тимоцитів.

Дослідити зміну концентрації цитоплазматичного кальцію в тимоцитах під дією пероксиду водню при різних температурах.

Об'єкт дослідження - тимоцити щура.

Предмет дослідження - вплив різних концентрацій пероксиду водню та температури на концентрацію вільного цитозольного та мітохондріального кальцію та цитоплазматичне рН.

Методи дослідження - світлова мікроскопія, флуоресцентний аналіз, статистичні методи обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що при зростанні температури від 12С до 32С (дослідження проводились при трьох температурах - 12С, 22С, 32С) підвищується ефект дії Н₂О₂ і швидкість накопичення іонів Са²⁺ в цитозолі збільшується в 12 раз. Вперше встановлено відмінності в дії різних концентрацій пероксиду водню (10 мкмоль/л та 100 мкмоль/л) на зміну [Ca²⁺]_i в суспензії тимоцитів щура.

Встановлено, що Н₂О₂ викликає накопичення іонів Са²⁺ в мітохондріях тимоцитів; підвищення концентрації кальцію в мітохондріях тимоцитів при дії різних концентрацій Н₂О₂ має дозову залежність. Показано, що ендоплазматичний ретикулум відіграє незначну роль у внутрішньоклітинному вивільненні іонів Са²⁺ при дії Н₂О₂. Показано, що при обробці клітин дігітоніном (5 мкмоль/л) спостерігається зростання інтенсивності флуоресценції род-2, що свідчить про швидке накопичення іонів Са²⁺ в мітохондріях. Протонофор СССР (2 мкмоль/л) спричиняє швидке зменшення концентрації іонів Са²⁺ в мітохондріях. Показано, що використані в експериментах концентрації пероксиду водню не змінюють проникності цитоплазматичної мембрани до іонів кальцію.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розширюють уявлення про дію різних концентрацій пероксиду водню на зміну [Ca²⁺]_i та рН у клітинах. Результати роботи можуть бути використані для пошуку шляхів контролю

[Ca²⁺]_i та рН у лімфоїдних клітинах за умов утворення ендогенного пероксиду водню, а також в курсах лекцій по біофізиці та спектральних методах дослідження.

Особистий внесок здобувача. Текст дисертації, формулювання основних положень та оформлення роботи виконано безпосередньо автором. Дисертантом особисто здійснені підбір та обробка даних літератури, статистична обробка результатів, а також оформлення рисунків і таблиць. Усі експерименти дисертаційної роботи виконані автором власноручно. В обговоренні результатів активну участь приймали співавтори друкованих робіт. Основні теоретичні та експериментальні ідеї було розроблено за участю д.б.н., проф. В. Л. Зими та д.б.н., проф. М. С. Мірошниченка.

Апробація результатів роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на Конференції молодих вченних і студентів з молекулярної біології і генетики, 23-25 Вересня 2003, Київ, на Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології, 25-28 квітня 2004 р., Львів, на I наукової конференції „Проблеми біологічної і медичної фізики”, 20-22 вересня 2004 р., Харків.

Публікація матеріалів. По матеріалам дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях, які затверджені переліком ВАК України та 3 тезах доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 136 сторінках друкованого тексту, містить 15 рисунків, 1 таблицю. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків, списку використаних джерел (145 посилань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Спектри кальційчутливих зондів індо-1 і род-2 та рН-чутливого зонда BCECF в розчинах та в суспензії тимоцитів, записували на спектрофлуориметрі СДЛ-2. Флуоресценцію індо-1 збуджували на довжині хвилі _зб=350 нм. Флуоресценцію род-2 збуджували на довжині хвилі _зб=530. нм Спектри збудження BCECF реєстрували на _р=535 нм. Флуоресценція індо-1, род-2 та BCECF реєструвалась під кутом 90 до променя збуджуючого світла з 1 см кювети в спектральному інтервалі від 360 до 600 нм, від 560 нм до 700 нм та від 360 до 530нм, відповідно, з смугою пропускання 0.5 нм на монохроматорі флуоресценції. Концентрації індо-1, род-2 та BCECF в розчинах були 5 мкМ, 0,5 мкМ та 0.5 мкМ, відповідно. Спектри записували та зберігали в ASCII кодах з можливістю подальшої обробки за допомогою програмного забезпечення.

В дослідженнях на інтактних клітинах важливе значення мала гомогенність суспензії клітин. Тому вибирався тимус щура, де величина вмісту кортикальних тимоцитів становить біля 85% на відміну від селезінки, де вона складає тільки 30% загальної популяції клітин. Для одержання тимоцитів використовувались самці щурів віком біля 3 місяців, оскільки цей вік відповідає періоду зрілого тимусу, що характеризується найбільшою чисельністю клітин в тілі органу (1 - 310⁸ кл). Видалений тимус поміщали в бюкс з холодним розчином Кребса (+4 - +7 °С) з концентрацією СаCl₂ 1.2 мМ. Тимус перетирали через ситечко із синтетичного волокна, поливаючи холодним розчином Кребса. Суспензію центрифугували 10 хв. при 1500 об/хв, надосадову рідину зливали і ресуспендували осад. Кількість клітин підраховували в камері Горяєва.

Отриману суспензію тимоцитів (5010⁶ кл/мл) навантажували індо-1/АМ (вихідний розчин індо-1 1мМ в ДМСО). Кінцева концентрація індо-1/АМ в середовищі навантаження становила 5 мкМ. Для покращення розчинення індо-1/АМ додавали Pluronic F-127 (0.05% в середовищі навантаження). Клітини навантажували індо-1 30 хв. при температурі 37 С. Після навантаження клітини відмивали від зовнішнього індо-1 центрифугуванням (3 рази).

Для контролю за внутрішньоклітинним рН тимоцити навантажувались BCECF/AM. Кінцева концентрація BCECF/AM в середовищі навантаження становила 0.5 мкМ (Pluronic F-127 0.05%). Навантаження тривало 0.5 год. при 37 С. Від зовнішнього BCECF/AM клітини відмивали центрифугуванням (3 рази, 1500 об/хв) Контроль кількості загиблих клітин проводили підраховуванням зафарбованих трипановим блакитним клітин в камері Горяєва (20 мкл суспензії клітин, 20 мкл трипанового блакитного) до навантаження індо-1 і після навантаження та відмивання.

В усіх експериментах кількість загиблих клітин не перевищувала 10%. Навантаження зондом не збільшувало кількості загиблих клітин.

В роботі використані індо-1/АМ BCECF/AM, EGTA, дігітонін, усі виробництва (“Sigma”, США), HEPES (“Fluka Chemical”, Швейцарія).

Для калібрування in vitro використовувались розчини “EGTA” та “Са²⁺ -- EGTA” такого складу: “EGTA” -- KCl 65 мМ, KOH 35 мМ, EGTA 10 мМ, HEPES 20 мМ, іонна сила =0.1, рН 7.2 при 22 С; “Са²⁺-EGTA” -- KCl 65 мМ, KOH 35 мМ, EGTA 10 мМ, HEPES 20 мМ, СаСl₂ 10 мМ, =0.1, рН 7.2 при 22 С. При реєстрації спектрів в присутності САБ, в розчини додавався САБ -- 710^-6 М. Для приготування суспензії тимоцитів використовувались розчини з концентраціями кальцію 0, 2.5 мМ такого складу: 5.9 мМ KCl, 135 мМ NaCl, 1.2 мМ MgCl₂, 11.5 мМ глюкози і 11.6 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, =0.1, рН 7.2 при 22 С. В експериментах використовували деіонізовану воду 10 МОм/см. Величину рН розчинів контролювали на рН-метрі рН-150 з точністю до 0.01 одиниці рН.

Розрахунки концентрацій вільного кальцію проводили на ЕОМ за допомогою програми WinMAXC v. 1.70 люб`язно наданої К. Паттоном (Стенфордський університет). Дана програма дозволяє розрахувати концентрацію вільного кальцію за заданими загальними концентраціями СаСl<sub>2</sub> та EGTA. Програма враховує зміни констант зв`язування EGTA при зміні температури, рН та іонної сили експериментального розчину.

Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою програми Origin 7.0 на ЕОМ. Числові експериментальні дані наведені як середнє арифметичне середнє квадратичне відхилення. Для всіх дослідів число вимірювань n5. Величини коефіцієнту кореляції r коливались в межах 0.99-0.98. Лінійні залежності на графіках отримані за допомогою лінійного регресивного аналізу.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Перевірка стану плазматичної мембрани при дії пероксиду водню в тимоцитах. Пероксид водню, як один з представників АФК, має здатність окиснювати ліпіди. Окиснення ліпідів може викликати пошкодження клітинної мембрани. Отже, нашим завданням було перевірити, чи змінює пероксид водню проникність цитоплазматичної мембрани до кальцію, що може призвести до зростання проникності для позаклітинних іонів Са²⁺, і, як наслідок, збільшення його внутрішньоклітинної концентрації іонів [Са²⁺]_і. Для перевірки цього ми до суспензії тимоцитів в безкальцієвому розчині Кребса додавали 100 мкмоль/л Н₂О₂, і, після досягнення максимального значення [Са²⁺]_і, додавали 5 ммоль/л ЕГТА (Рис 1). ЕГТА - речовина, яка є хелатором іонів кальцію, тобто зв'язує вільні іони кальцію, зменшуючи їх концентрацію в позаклітинному розчині. За таких умов клітини повинні були б дуже швидко втратити внутрішньоклітинний кальцій, врезультаті дифузії назовні. Однак, додавання ЕГТА в розчин із суспензією тимоцитів не вплинуло на рівень [Са²⁺]_і в цитоплазмі клітин, що вказує на відсутність змін в проникності цитоплазматичної мембрани до іонів кальцію при дії використаного в експериментах пероксиду водню.

Таким чином, можна зробити висновок, що хоча, можливо, і відбувається окиснення ліпідів цитоплазматичної мембрани клітини, але ці зміни не призводять до утворення в мембрані розривів, через які можуть проникати іони кальцію. Це твердження є справедливим для перших 30 хвилин дії пероксиду водню. За цей час повністю відбувалися зміни внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію. Тому ми не вважали за потрібне проводити дослідження більш тривалий термін. Не виключено, що впродовж більш тривалого терміну проникність мембрани до іонів кальцію може змінитися за рахунок окиснення мембранних ліпідів і утворення розривів, через які вище згадані іони будуть за градієнтом концентрації потрапляти в середину клітини.

Участь ендоплазматичного ретикулуму у внутрішньоклітинному звільненні іонів кальцію в тимоцитах. Наступним нашим завданням було перевірити які кальцієві депо приймають основну участь у вивільненні та поглинанні іонів кальцію в тимоцитах при дії пероксиду водню. Першим було досліджено участь ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у внутрішньоклітинному звільненні іонів Са²⁺ при дії Н₂О₂.

Для з'ясування участі ендоплазматичного ретикулуму у внутрішньоклітинному звільненні іонів Са²⁺ при дії Н₂О₂ використовували тапсигаргін, який інгібує роботу Са²⁺-помпи ЕР і не впливає на Са²⁺-помпу плазматичної мембрани. Інкубацію тимоцитів проводили в безкальцієвому розчині Кребсу (Са²⁺1 мкмоль/л) тому, що в нормальному розчині Кребсу додавання тапсигаргіну спричиняло значне підвищення [Ca²⁺]_і, яке перевищувало амплітуду Са²⁺-сигналу під дією пероксиду і маскувало його дію. В безкальцієвому розчині Кребсу додавання тапсигаргіну (240 нмоль/л) викликає швидке звільнення іонів Са²⁺ в цитоплазму, після чого [Ca²⁺]_і протягом 15 хв повертається до початкового рівня (близько 7010 нмоль/л) (рис 2). Додавання Н₂О₂ (100 мкмоль/л) до суспензії тимоцитів в безкальцієвому розчині Кребсу, спричиняло зростання [Ca²⁺]_і на 55.32 нмоль/л а зміна в часі параметра R була близька до такої

в нормальному розчині Кребсу при додаванні незначної концентрації Н₂О₂ (10 мкмоль/л) (рис. 2). Аплікація тапсигаргіну не впливала на підвищення [Ca²⁺]_і, спричинене дією Н₂О₂. Але, в безкальцієвому розчині пул кальцію ЕР практично повністю виснажений і не може дати помітного внеску в зміну концентрації вільного кальцію Са²⁺ ([Са²⁺]_i). Таке невелике зростання [Ca²⁺]_і за умов інкубації тимоцитів у безкальцієвому розчині свідчить про незначну участь ЕР у звільненні іонів Са²⁺ при дії Н₂О₂ (100 мкмоль/л).

Участь мітохондрій у внутрішньоклітинному звільненні іонів кальцію в тимоцитах. Великим за ємністю кальцієвим депо є мітохондрії. Тому ми спробували з'ясувати яку участь виконують у вивільненні та поглинанні іонів кальцію мітохондрії в тимоцитах при дії пероксиду водню.

Проведені нами модельні дослідження на тимоцитах, в яких штучно підвищували цитозольну концентрацію кальцію [Ca²⁺]_с, провівши пермеабілізацію мембран тимоцитів дігітоніном (5 мкМ/л, протягом 2 хв). Зміну внутрішньомітохондріальної концентрації [Ca²⁺]_м реєстрували через зміну інтенсивності флуоресценції І_ф род-2. На рис. 3 наведені спектри флуоресценції род-2 в мітохондріях тимоцитів до дії дігітоніну (спектр 1) і після дії дігітоніну (спектр 2). Концентрація іонів Са²⁺ в розчині була фіксованою і задавалася Са²⁺-ЕГТА - буфером.В цьому експерименті зовнішньоклітинна концентрація кальцію становила [Ca²⁺]_е = 1.2 ммоль/л. Як видно з рис. 3, після обробки тимоцитів дігітоніном інтенсивність флуоресценції І_ф значно зростає (спектр 2), що свідчило про активування уніпортера і запасання іонів Са²⁺ мітохондріями.

Для перевірки того, що род-2 навантажується в мітохондріях клітин і що він реагує на накопичення Са²⁺ в мітохондріях ми використали протонофор СССР (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone), який є роз'єднувачем протонного градієнту на внутрішній мембрані мітохондрій

В результаті його дії зникає мембранний потенціал і, відповідно, зникає рухома сила для транспорту іонів Са²⁺ за участю уніпортера. Ми порівнювали кінетичні криві зміни концентрації [Ca²⁺]_м в мітохондріях (через зміну інтенсивності флуоресценції І_ф род-2) збудливих гладеньком'язових клітин матки щура (люб'язно надані Л.А. Борисовою, відділ біохімії м'язів Інституту біохімії НАН України) і в мітохондріях незбудливих клітин (суспензія тимоцитів). Для усунення впливу роботи Са²⁺-помп саркоплазматичного ретикулуму до суспензії клітин додавався тапсигаргин. З рис. 4 видно, що і в мітохондріях гладеньком`язових клітин і в мітохондріях тимоцитів додавання дігітоніну (5 мкмоль/л) та СССР (2 мкмоль/л) спричиняє подібні зміни інтенсивності флуоресценції І_ф род-2. При додаванні дігітоніну, підвищення інтенсивності флуоресценції вказує на зростання концентрації іонів Са²⁺ в мітохондріях, яке обумовлене зростанням концентрації Са²⁺ в цитозолі клітини.

Після додавання СССР спостерігалося зниження інтенсивності флуоресценції зонду і, відповідно, концентрації Са²⁺ в мітохондріях, але не до базального рівня. Навпаки, якщо спочатку до суспензії м`язових клітин чи тимоцитів додавали СССР, це призводило до невеликого підвищення концентрації Са²⁺ в мітохондріях, а подальше додавання дігітоніну, ще збільшувало концентрацію Са²⁺, але тільки до того рівня, до якого концентрація Са²⁺ знижувалась за умови додавання СССР після дігітоніну. При додаванні ЕГТА, інтенсивність флуоресценції І_ф зонду значно зменшувалося, що свідчить про майже повне хелатування іонів Са²⁺ в буфері. У тимоцитах інтенсивність флуоресценції род-2 також знижувалась, але залишалась вищою від початкового „базального” рівня.

Зниження інтенсивності флуоресценції род-2 і, відповідно, концентрації іонів Са²⁺ в мітохондріях після додавання СССР за умови присутності дігітоніну, узгоджується з даними літератури, що пов'язують роботу мітохондріального уніпортеру за наявності потенціалу на внутрішній мембрані мітохондрії. Важче пояснити підвищення концентрації іонів кальцію в мітохондріях після додавання СССР у відсутності дігітоніну. Можливо, що при обробці клітин СССР у присутності тапсигаргину, відбувається активне вивільнення іонів Са²⁺ із ендоплазматичного (саркоплазматичного) ретикулуму. Це може спричиняти незначне накопичення іонів Са²⁺ в мітохондріях, які просторово розміщені близько від ендоплазматичного ретикулума.

Таким чином на основі вище викладених міркувань зроблено припущення, що основну роль у внутрішньоклітинному вивільненні іонів Са²⁺ при дії Н₂О₂ відіграють мітохондрії.

Мітохондріальний кальцієвий транспорт при дії пероксиду водню. Пероксид водню здатний запускати запрограмовану смерть (апоптоз) клітин. При цьому відбувається нуклеосомна фрагментація ДНК, якій передує підвищення концентрації іонів Ca²⁺ в цитозолі клітини. Ми дослідили, як впливає пероксид водню на зміну [Ca²⁺]_м в мітохондріях тимоцитів. Для цього мітохондрії тимоцитів навантажували індикатором род-2. Протягом 30 хв тимоцити витримували в буферних розчинах з різними концентраціями Н₂О₂ (10, 50, 100 мкмоль/л) і протягом цього періоду проводили неперервну реєстрацію зміни інтенсивності флуоресценції І_ф род-2. Як видно з рисунку, уже невелика концентрація Н₂О₂ (10 мкмоль/л) спричиняла помітне зростання (?9%) І_ф род-2, що свідчить про накопичення іонів Са²⁺ в мітохондріях тимоцитів. Збільшення концентрації Н₂О₂ викликало зростання І_ф род-2: Н₂О₂ - 50 мкмоль/л зростання І_ф на 11% Н₂О₂ - 100 мкмоль/л зростання І_ф на 14%. Такий результат узгоджується з уявленням про апоптичну дію Н₂О₂ на клітини, оскільки зростання концентрації іонів Са²⁺ в мітохондріях обумовлює відкривання мітохондріальних пор з великою провідністю (~1200 пСм), що в кінцевому результаті призводить до активації каспаз, які приймають безпосередню участь в апоптозі, і загибелі клітин.

Цитоплазматичний кальцієвий транспорт при дії пероксиду водню. Пероксид водню вільно дифундує через цитоплазматичну мембрану, що дозволяє додавати необхідну концентрацію Н₂О₂ до суспензії тимоцитів і через зміну флуоресценції індо-1 оцінювати зміну внутрішньоклітинної концентрації кальцію [Ca²⁺]_i. З кінетичних кривих зміни двохвильового параметра R видно, що додавання Н₂О₂ до суспензії тимоцитів спричиняє зростання параметра R: у випадку низьких концентрацій Н₂О₂ (10 і 25 мкмоль/л) параметр R повільно і незначно зростає в часі, в той час як за умови більш високих концентрація (50 і 100 мкмоль/л) він значно зростає і його зміна нагадує сигмоїдну криву з плато, коли після 25 хв параметр досягає максимального значення R_max.

За отриманним значенням R ми розрахували [Ca²⁺]_i в контрольному розчині тимоцитів (базальний рівень [Ca²⁺]_{i basal}) і в тимоцитах при дії різних концентрацій Н₂О₂, коли параметр досягав максимального значення R_max ([Ca²⁺]_{i max}) [Grynkiewicz, 1985]. З цих даних знаходили збільшення концентрації кальцію [Ca²⁺]_i за умови дії різних концентрацій Н₂О₂

Таблиця 1

Величина [Ca²⁺]_i при дії різних концентрацій Н₂О₂

Невеликі концентрації Н₂О₂ (10-25 мкмоль/л) спричиняють незначне зростання рівня [Ca²⁺]_i в тимоцитах. Можливо, за таких концентрацій в клітині молекули Н₂О₂ відіграють важливу роль як регуляторні медіатори в сигнальних процесах.

Показано, що за фізіологічно значимої концентрації Н₂О₂ (десятки мкмоль/л) збільшується продукція інтерлейкіна-2 в тимоцитах стимульованих антигеном, завдяки чому активується імунна відповідь цих клітин. Не виключено, що таке незначне зростання [Ca²⁺]_i обумовлене звільненням іонів Са²⁺ з внутрішньоклітинних депо, зокрема, з ендоплазматичного ретикулуму тимоцитів.

Значне зростання [Ca²⁺]_i (в 5 - 8 разів) (рис. 6) при додаванні до суспензії тимоцитів Н₂О₂ в концентраціях більше 50 мкмоль/л може бути сигналом для індукції апоптозу. Потужний Са²⁺ сигнал для індукції апоптозу вимагає, переважно, входу в клітину іонів Са²⁺ через Са²⁺-канали плазматичної мембрани. Незначний внесок в цей сигнал дає звільнення іонів Са²⁺ з ЕР.

На рис.8 наведена зміна за часом параметра R в тимоцитах при різних температурах. При низькій температурі, 12°С, зі значною затримкою в часі(лаг-період t ? 9 хв) спостерігалося ледь помітне зростання параметру R. Після 9 хв дії Н₂О₂ відбувалося незначне збільшення параметру ?R на 0,03 за 10 хв.

За цими даними оцінено швидкість зростання двохвильового параметра (R/t), яка певним чином відображає швидкість зростання концентрації цитозольного кальцію. При 12є С ця швидкість є достатньо мала і становить R/t = 0,003 хв^-1. Збільшення температури до 22є С спричиняло зменшення лаг-періоду (t = 1,5 хв) дії Н₂О₂ і значне зростання параметра, на R = 0,37, за 16 хв.

При цій температурі значно збільшувалась швидкість зростання цитозольного кальцію (R/t = 0,023 хв^-1). При 32є С лаг-період був <5 с і крива зміни R досить швидко (R/t = 0,036 хв^-1) виходила на плато (рис. 8, крива 3). Виявлені нами значні зміни лаг-періоду при дії Н₂О₂ і швидкості зростання двохвильового параметра R в залежності від температури свідчать, що молекули Н₂О₂ завдяки окиснювальним реакціям змінюють структуру мембранних білків, які утворюють Са²⁺ - канали. Збільшення температури спричиняє зростання швидкості окиснювальних реакцій і кількості модифікованих білків, а відповідно і зростання швидкості транспорту іонів Са²⁺ через плазматичну мембрану тимоцитів. Не можна відкидати можливе зростання проникності іонів Са²⁺ через пошкодження мембран тимоцитів. Наші попередні дослідження показали, що молекули Н₂О₂ у використаних концентраціях не пошкоджують мембрани.

Як зазначалося вище, для дослідження накопичення іонів Са²⁺ в мітохондріях використали Са²⁺ -чутливий зонд род-2. При 22є С у відсутності Н₂О₂ в буферному розчині тимоцитів (контрольна суспензія тимоцитів) протягом тривалого часу (біля 30 хв) не спостерігалася помітна зміна інтенсивності флуоресценції І_ф род-2. При додаванні до суспензії тимоцитів Н₂О₂ (100 мкмоль/л) реєструвалося значне зростання І_ф род-2, що свідчило про транспорт іонів Са²⁺ в мітохондрії і збільшення концентрації мітохондріального кальцію. Швидкість зростання концентрації кальцію в мітохондріях, при додаванні вказаної вище концентрації Н₂О₂, становила І_ф/t = 0,06 хв^-1. Ця швидкість зростання [Са²⁺]_m при 22є С в 2,6 рази більше, ніж швидкість зростання цитозольного кальцію [Са²⁺]_і при дії відповідно такої ж концентрації Н₂О₂. Можливо, що таке збільшення пов'язане з тим, що певна кількість іонів Са²⁺ може вивільнятися з ЕР через Са²⁺ - звільнюючі канали (IP₃R) і спричиняти більш активну роботу уніпортерів мітохондрій.

Зміна цитоплазматичного рН при дії різних концентрацій пероксиду водню. Додавання пероксиду водню до клітинної суспензії тимоцитів призводить, до утворення протонів в цитоплазмі і, відповідно, до зміни внутрішньоклітинного рН, а це, в свою чергу, може впливати на [Ca²⁺]_i. Тому нашою метою було, дослідити вплив різних концентрацій пероксиду водню на внутрішньоклітинне рН. Для визначення кількісних значень рН цитоплазми тимоцитів ми здійснили калібрування

BCECF (500 нМ) в розчині 100 мМ KCl (=0.1) з різним рН. Калібрування здійснювалось в діапазоні величин рН від 5.4 до 9.4. Зі спектрів збудження флуоресценції BCECF знаходився двохвильовий параметр R=I₄₉₀/I₄₄₀ [Grynkiewicz, 1985].

Результати досліджень впливу Н₂О₂ на зміну концентрації мітохондріального вільного кальцію представлені на рис. 10. Кінетичні характеристики зміни концентрації вільного кальцію в мітохондріях подібні до змін концентрацій цитоплазматичного вільного кальцію. Відомо, що при апоптозі відбувається пригнічення Na⁺/H⁺ - обмінника. Тому при дії пероксиду водню ми спостерігаємо закиснення цитоплазми, не пов'язане з перекисним окисненням. Збільшення концентрації вільного кальцію в мітохондріях одночасно із збільшенням концентрації вільного кальцію в цитоплазмі при дії Н₂О₂ є ще одним свідченням апоптичних процесів в клітині.

Підвищення концентрації вільного кальцію в мітохондріях вказує на початок апоптичних процесів в клітині, що узгоджується з даними літератури. На основі отриманих даних можна зробити припущення про початок апоптичних процесів в тимоцитах при високих концентраціях Н₂О₂ (50 та 100 мкМ) та дію пероксиду водню як специфічного посередника при малих концентраціях Н₂О₂ (10 мкМ).

ВИСНОВКИ

Досліджено флуоресцентним методом зміну концентрації іонів Са²⁺ в цитозолі і мітохондріях тимоцитів при дії різних концентрацій Н₂О₂. Показано, що при зростанні температури від 12⁰ до 32⁰С ефективність дії Н₂О₂ і швидкість накопичення іонів Са²⁺ в цитозолі та мітохондріях тимоцитів збільшується.

Встановлено, що при обробці клітин дігітоніном (5 мкмоль/л) спостерігається зростання інтенсивності флуоресценції род-2, що свідчить про накопичення іонів Са²⁺ в мітохондріях. Протонофор СССР (2 мкмоль/л) спричиняє зменшення концентрації іонів Са²⁺ в мітохондріях. Пероксид водню викликає дозозалежне підвищення концентрації іонів кальцію в мітохондріях тимоцитів.

Встановлено, що пероксид водню, при використаних концентраціях, не пошкоджує мембрани тимоцитів.

Досліджені кінетичні характеристики кальцієвого сигналу, спричиненого малими (10-25 мкмоль/л) і великими (50-100 мкмоль/л) концентраціями H₂O₂ в суспензіях тимоцитів щурів. Показано, що низька концентрація Н₂О₂ (10 мкмоль/л) викликає незначне збільшення концентрації цитозольного кальцію в тимоцитах, збільшені концентрації Н₂О₂ (більше 50 мкмоль/л) спричиняють значне зростання [Ca²⁺]_i .

Встановлено, що ендоплазматичний ретикулум відіграє незначну роль у внутрішньоклітинному вивільненні іонів Са²⁺ при дії Н₂О₂, основну роль у цьому процесі відіграють мітохондрії.

Показано, за допомогою рН чутливого флуоресцентного зонда BCECF, що низька концентрація Н₂О₂ (10 мкмоль/л) викликає незначне закислення () цитозолю в тимоцитах, тоді як більша концентрація Н₂О₂ (100 мкмоль/л) спричиняє значне закислення цитозолю ().

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Семенов Ю. В., Артеменко О. Ю., Зима В. Л., Матишевська О. П. Вплив пероксиду водню на зміну цитозольного кальцію в тимоцитах щура // Фізика живого --2003. -- №1, 11. -- С. 58-63 (Особистий внесок здобувача - опрацювання літератури, виділення тимоцитів, навантаження клітин зондом, вимірювання концентрації Са²⁺ у цитозолі тимоцитів, аналіз та інтерпретація отриманих даних).

Семенов Ю. В., Артеменко О. Ю., Зима В. Л., Ганчурін В. В. Флуоресцентний аналіз мітохондріального кальцієвого транспорту в тимоцитах // Фізика живого -- 2003. --№2, 11. --С. 22-28. (Особистий внесок здобувача - опрацювання літератури, виділення тимоцитів, навантаження клітин зондом, вимірювання
концентрації Са²⁺ у цитозолі тимоцитів, аналіз та інтерпретація отриманих даних).

Артеменко О. Ю., Зима О. В. Дослідження кальцієвого транспорту в тимоцитах // Фізика живого. - 2004. -- №2, 12. -- С. 101-106 (Особистий внесок здобувача - опрацювання літератури, виділення тимоцитів, навантаження клітин зондом, вимірювання концентрації Са²⁺ у цитозолі тимоцитів, аналіз та інтерпретація отриманих даних).

Зима В. Л., Омельянюк А. М., Філенко А. М., Артеменко О. Ю. Двохвильвий флуоресцентний метод реєстрації кальцієвих сигналів в клітинах // Фізика живого. - 2005 -- №1, 13. -- С. 91-96 (Особистий внесок здобувача - опрацювання літератури, виділення тимоцитів, навантаження клітин зондом, вимірювання концентрації Са²⁺ у цитозолі тимоцитів, аналіз та інтерпретація отриманих даних).

Semenov Yu.V.‚ Жyma V.L., Artemenko O.Yu. Studies of hydrogen peroxide action on intracellular calcium concentration in the rat thymocytes // Thesis on Conference for young scientists phD students and students on molecular biology and genetics, 23-25 September 2003, Kyiv, P. 43.

Semenov Yu.V.‚ Жyma V.L., Artemenko O.Yu. Studies of hydrogen peroxide action on cytosolic and mitochondrial calcium concentration in the rat thymocytes // Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології, 25-28 квітня 2004 р., Львів, С. 26.

Артеменко О.Ю., Семенов Ю.В. Зима В.Л. Флуоресцентний аналіз цитозольного і мітохондріального кальцієвого транспорту в тимоцитах при зміні температури // Тези доповідей I наукової конференції „Проблеми біологічної і медичної фізики”, 20-22 вересня 2004 р., Харків, С.147.

АНОТАЦІЯ

АРТЕМЕНКО О.Ю. Вплив пероксиду водню на концентрацію кальцію в тимоцитах щура. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - Біофізика. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ. - 2006.

Дисертація присвячена дослідженню концентрацій вільного Са²⁺ в цитозолі та мітохондріях та рН цитозолю на ранніх етапах дії різних концентрацій пероксиду водню в діапазоні від 10 до 100 мкМ/л.

Показано, що при зростанні температури від 12° до 32°С підвищується ефект дії Н₂О₂ і швидкість накопичення іонів Са²⁺ в цитозолі збільшується в 12 раз. Вперше

встановлено відмінності в дії невеликих концентрацій пероксиду водню (10 мкмоль/л та 100 мкмоль/л) на зміну [Ca²⁺]_i в суспензії тимоцитів щура. Пероксид водню викликає дозозалежне підвищення концентрації іонів кальцію в мітохондріях тимоцитів. Встановлено, що ендоплазматичний ретикулум відіграє незначну роль у внутрішньоклітинному вивільненні іонів Са²⁺ при дії Н₂О₂. Показано, що при

обробці клітин дігітоніном (5 мкмоль/л) спостерігається зростання інтенсивності флуоресценції род-2, що свідчить про швидке накопичення іонів Са²⁺ в мітохондріях.

Протонофор СССР (2 мкмоль/л) спричиняє швидке зменшення концентрації іонів Са²⁺ в мітохондріях.

Ключові слова: кальцій, тимоцити, пероксид водню, мітохондрії, рН, температура, дигітонін.

АННОТАЦИЯ

АРТЕМЕНКО О.Ю. Влияние пероксида водорода на концентрацию кальция в тимоцитах крысы. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.02 - Биофизика. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев. - 2006.

Диссертация посвящена исследованию концентраций свободного Са²⁺ в цитозоле и митохондриях и рн цитозоля на ранних этапах действия разных концентраций пероксида водорода в диапазоне от 10 до 100 мкм/л.

Пероксид водорода в клетках может использоваться в качестве специфического посредника, непосредственно окисляя белки. Его главной мишенью являются цистеиновые остатки в белках. Кроме того, пероксид водорода может принимать участие в инициации апоптоза. Важная роль как в процессе апоптоза, так и при активации функциональной активности клеток принадлежит изменениям концентрации ионов кальция как в цитозоле клеток, так и в митохондриях. Существует определенная зависимость между концентрацией пероксида водорода и изменениями в концентрациях цитоплазматического и митохондриального свободного кальция.

Показано, что использованные в экспериментах концентрации пероксида водорода не изменяют проницаемости цитоплазматической мембраны к ионам кальция. Показано, что при росте температуры от 12°C до 32°С повышается эффект действия Н₂О₂ и скорость накопления ионов Са²⁺ в цитозолі увеличивается в 12 раз. Впервые установлены отличия в действии разных концентраций пероксида водорода - 10 мкмоль/л и 100 мкмоль/л на изменения [Ca⁺]_і в суспензии тимоцитов крысы. Показано, что Н₂О₂ вызывает накопление ионов Са⁺ в митохондриях тимоцитов и оно имеет дозовую зависимость от концентрации пероксида водорода. Установлено, что ендоплазматический ретикулум играет незначительную роль во внутриклеточном высвобождении ионов Са²⁺ при действии Н₂О₂. Показано, что при обработке клеток дигитонином (5 мкмоль/л) наблюдается рост интенсивности

флуоресценции род-2, что может свидетельствовать о быстром накоплении ионов Са²⁺ в митохондриях. Протонофор СССР (2 мкмоль/л) служит причиной быстрого уменьшения концентрации ионов Са²⁺ в митохондриях. Полученные данные сравнимы с результатами, полученными в экспериментах на других типах клеток за данными литературных источников, что может указывает на универсальность пероксида водорода как специфического посредника и одного из инициаторов апоптоза.

Ключевые слова: кальций, тимоцити, пероксид водорода, митохондрии, рН, температура, дигитонин.

ANNOTATION

O. JU. Influence of hydrogen peroxide on calciumconcentration in rats tymocytes. - The manuscript.The dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.02 - Biophysics. - Kyiv TarasShevchenko National University, Kyiv. - 2006.The dissertation is devoted to research of free calcium concentration in cytosoland mitochondrionand pH cytosolat early stages of action of different hydrogen peroxideconcentration in a range from 10 up to 100 mM.

It is shown, that at growth of temperature from 12° up to 32°the effect of action and speed of accumulation of ions ⁺ in increases at 12 times. Differences are established in action of small concentration peroxidehydrogen 10 mkMand 100 mkMon change [Ca^{2 +}] in suspension of rats tymocytes. It is established, that causes accumulation of ions ⁺ in mitochondriontymocytesand increase the concentration of calcium in mitochondriontymocytesat action of different concentration has dozedependence.

It is shown, that endoplasmicreticulumplays an insignificant role in endocellular liberation of ⁺ions at action of . It is shown, that adding to cells digitonin (5 mkM) increasing of the intensity of fluorescence a rhod-2 that testifies fast accumulation of ions ⁺ in mitochondrion. Protonophorthe CCCP (2 mkM) leads to fast reduction of concentration of ⁺ ions in mitochondrion.

Keywords:calcium, tymocytes, peroxidehydrogen, mitochondrion, H, temperature, digitonin.

Размещено на Allbest.ru