Роль NO-залежних сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) є однією з найважливіших медико-соціальних проблем і належить до трійки захворювань, які найчастіше виявляються причиною ранньої інвалідності та смертності серед населення більшості країн світу [Gale, 2002]. ЦД супроводжується порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до формування ряду ускладнень, зокрема, інтенсифікації процесів зсідання крові при одночасному гальмуванні механізмів фібринолізу [Гарбарчук, 1998]. Посилення коагуляції крові зумовлене збільшенням кількості фібриногену, фактора Віллебранда, зростанням в'язкості крові та активації тромбоцитів [Офозу, 2002].

Кров'яним пластинкам належить одна із провідних ролей у патогенезі пізніх діабетичних ускладнень. Підтвердження гіпотези про первинність порушень функціонального стану ендотеліоцитів у патогенезі ангіопатій за умов цього захворювання та включення у комплексну терапію антиагрегантів послужило поштовхом до дослідження молекулярних механізмів активації тромбоцитів, опосередкованих оксидом азоту (NO), продуктами вільнорадикального окислення і змінами в процесах сигналізації під дією індукторів агрегації. Виявлення змін у функціонуванні протеїн- та ліпідкіназ, з'ясування причин підвищеної чутливості кров'яних пластинок до агоністів дозволить вести ефективний пошук нових медичних препаратів скерованої дії для лікування діабетичних ангіопатій.

Підвищена агрегаційна здатність кров'яних пластинок при ЦД є наслідком дії різних факторів. Так, зниження активності аденілатциклази, яке спостерігається при високій активності фосфоліпази А2, індукує перетворення арахідонової кислоти по циклооксигеназному шляху з утворенням тромбоксану А2 - надзвичайно потужного індуктора агрегації. Інгібування активності основних ферментів антиоксидантного захисту (АОЗ) та пов'язана з цим інтенсифікація процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) призводить до зниження плинності плазматичної мембрани [Winocour et al., 1994; Tschoepe et al., 1997]. Зростання рівня глікозилювання рецепторів на поверхні тромбоцитів, інтенсифікація обміну фосфоінозитидів, зміна активності NO-синтази (NOS, КФ 1.14.13.19), підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ спричиняє активацію сигнальних мереж, що забезпечують реалізацію біологічних відповідей, включаючи зміни в архітектоніці цитоскелету, адгезії і метаболізмі клітин [Winocour et al., 1994]. Провідна роль у перебудові актинового цитоскелету належить сигнальним шляхам, залежним від низькомолекулярних G-білків та фосфатидилінозит-3-кінази (РІ-3-кінази, КФ 2.7.1.137) [Tapon et al., 1997; Pigazzi et al., 1999; Soulet et al., 2001]. Порушення функціонування сигнальних білків є однією з основних причин, що пояснюють підвищену чутливість тромбоцитів до дії агоністів [Winocour, 1994; Fox, 1996].

За умов цукрового діабету чітко виражений зв'язок між рівнем продукції NO в організмі і проявами оксидативного стресу, який характеризується різким зниженням вмісту оксиду азоту в кров'яному руслі на фоні накопичення вільних радикалів кисню і перекисів. Оскільки вільнорадикальні процеси та реакції перекисного окислення знаходяться серед факторів, що впливають на функцію тромбоцитів, і тісно пов'язані з продукцією NO, актуальним було з'ясувати вплив основного субстрату (L-Arg) та інгібіторів NO-синтази L-NAME (Nщ-nitro-L-arginine-methyl ester) і AG (аміногуанідину) на вміст продуктів ПОЛ і активність ферментів АОЗ в кров'яних пластинках щурів за умов стрептозотоцинового діабету. З'ясування особливостей функціонування системи антиоксидантного захисту та NO-залежних сигнальних шляхів, а також ролі PI-3-кінази у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів дозволить розширити наші уявлення про механізми виникнення і розвитку мікро- та макроангіопатій за умов ЦД 1-го типу.

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було дослідження взаємодії системи антиоксидантного захисту і NO-залежних сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу та пошук шляхів корекції метаболічних порушень при даній патології.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Дослідити активність NO-синтази в тромбоцитах у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам з питною водою її субстрату (L-Arg) та інгібіторів (L-NAME і AG).

2. Оцінити вплив L-Arg, L-NAME та аміногуанідину на стан системи антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів в кров'яних пластинках контрольних тварин і на моделі експериментального стрептозотоцинового діабету.

3. Порівняти динаміку транслокації регуляторної p85б субодиниці РІ-3-кінази у детергент-нерозчинну фракцію за умов індукції агрегації кров'яних пластинок різними концентраціями ADP та при дії селективного інгібітора РІ-3-кінази вортманіну у нормі і при діабеті.

4. Вивчити вплив вортманіну на агрегаційну здатність та активність NO-синтази тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу.

5. За допомогою трансмісійної електронної мікроскопії дослідити ультраструктуру тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу після впливу досліджуваних чинників (L-Arg, L-NAME, AG, вортманіну) in vitro та in vivo.

6. Проаналізувати спектр білків лізатів тромбоцитів здорових донорів і людей, хворих на ЦД 1-го типу, що взаємодіють in vitro з конститутивно активованими формами (Gly12>Val) високоафінних GTPаз Rac, Rho та Cdc42.

1. Матеріали і методи досліджень

Експериментальний цукровий діабет у щурів-самців масою 120-150 г викликали введенням стрептозотоцину фiрми “Sigma” (США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [Tringer, 1969]. Починаючи з моменту індукції діабету тваринам з питною водою вводилися досліджувані речовини : L-аргінін (“Reanal”, Угорщина) у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів; L-NAME (“Beckenham”, Велика Британія) у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів; AG (“Sigma”, США) у концентрації 1 г/л протягом 30 днів. В експериментi використовували щурів із рівнем глюкози 14-16 ммоль/л.

Забір крові для отримання тромбоцитів людей, хворих на ЦД 1-го типу, проводили зранку (натщесерце і до прийому інсуліну) у силіконізовані пробірки, що містили 1/10 об'єму 3,8%-ного розчину цитрату натрію у якості антикоагулянту і 1,5 од/мл апірази (“Fluka”, Швейцарія). Агрегаційну здатність кров'яних пластинок досліджували у збагаченій тромбоцитами плазмі на автоматичному аналізаторі “Биола” (Росія) згідно з [Gabbasov et al., 1989].

Тромбоцити виділяли шляхом диференційного центрифугування згідно [Ferrell et al., 1989]. Лізис тромбоцитів проводили протягом 30 хв на льодяній бані холодним буфером лізису такого складу: 10 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 % тритон Х-100, 5 мМ ЕДТА, 50 мМ NaF, 1 мМ фенілметилсульфонілфторид (“Fluka”, Швейцарія), 5 мМ бензамідин (“Sigma”), 10 мкг/мл апротиніну (“Sigma”), 10 мкг/мл лейпептину (“Sigma”), 2 мкг/мл пепстатину (“Fluka”), 0,25 мМ Na3VO4 1:10 за об'ємом. Детергент-нерозчинну фракцію осаджували центрифугуванням за 12000 g і 40С протягом 15 хв. Дослідження активності ферментів проводили в супернатанті. Концентрацію білка вимірювали за методом [Peterson, 1977]. Супероксиддисмутазну активність (КФ 1.15.1.11) визначали за допомогою реакції відновлення нітросинього тетразолію до нітроформазану [Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6) визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н2О2 з молібдатом амонію [Королюк и др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (КФ 1.11.1.9) визначали за допомогою методу, в основі якого лежить розвиток кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана [Моин, 1986]. Активність глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2) оцінювали за зменшенням вмісту NADPH у реакції з окисленим глутатіоном [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали згідно [Тимирбулатов и др., 1981]. Активність NO-синтази визначали як описано в роботі [Сумбаев, 2000] або опосередковано контролювали за вмістом у тромбоцитах кінцевих продуктів обміну NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989], нітратів за методом [Cawse, 1967]. Вміст глікозильованого гемоглобіну визначали колориметричним методом [van Kampen, 1983]. Статистичну обробку даних проводили згідно [Кокунин, 1975].

Для вивчення динаміки рівня регуляторної р85 субодиниці PI-3-кінази відмиті тромбоцити ресуспендували у середовищі: 137 мМ NаСl, 2 мМ КСl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ СаCl2, 0,4 мМ NaН2РО4, 5,6 мМ глюкози, 5 мМ HEPES (4-(2-гідроксиетил)-1-піперазин-етансульфанілова кислота, “Sigma”, США) (рН 7,4), 1 од/мл апірази та інкубували з різними концентраціями ADP (“Sigma”) (0,5мкМ; 1,0мкМ; 5,0 мкМ). Індукцію зупиняли через відповідні проміжки часу додаванням холодного двократного буферу лізису. Вирівнювання білка за концентрацією проводили електрофоретично. Білки лізатів тромбоцитів розділяли електрофорезом в блоках градієнтного (5-18%) поліакриламідного гелю в присутності SDS [Laemmli, 1970] з наступним імуноблотингом [Towbin, 1979]. Детекцію регуляторної p85 субодиниці PI-3-кінази та індуцибельної NO-синтази на блотах здійснювали, використовуючи моноклональні анти-р85 антитіла, люб'язно надані д-ром І. Гутом (Людвігівський інститут ракових досліджень, Велика Британія) і моноклональні анти-iNOS антитіла (“Sigma”), відповідно. Як другі антитіла використовували анти-мишачі IgG, кон'юговані з пероксидазою хрону (“Sigma”). Імунореактивні плями виявляли за допомогою реагенту для підсиленої хемілюмінесценції (“Amersham”, Велика Британія). Денситометричний аналіз результатів імуноблотингу здійснювали з використанням пакету програми “Image Tool”.

Білок-білкові взаємодії вивчали in vitro з використанням кон'югованих з глутатіон-S-трансферазою (GST) рекомбінантних форм GTPаз. Для трансформації E.coli штаму BL-21 використовували відповідні pGEX-2T плазмідні вектори, люб'язно надані доктором І. Гутом. Очистку GST-кон'югованих білків із оброблених на ультразвуковому дезінтеграторі (УЗДН-1, Росія) бактерійних лізатів здійснювали за допомогою глутатіон-сефарози 4B (“Pharmacia Biotech”, Швеція) згідно протоколу фірми - виробника. Стандартизовані за концентрацією білка (1 мг/мл) лізати тромбоцитів інкубували впродовж 2 год. при 40С із глутатіон-сефарозою, асоційованою з рекомбінантними GST-білками підродини Rho. Для визначення рівня неспецифічного зв'язування лізати тромбоцитів інкубували з GST. Білки, що специфічно зв'язались із глутатіон-сефарозою, розділяли електрофорезом в блоках градієнтного (5-18%) ПААГ за присутності SDS. Зафарбовування електрофореграм проводили за допомогою азотнокислого срібла [Wray, 1981]. Для детекції молекулярної маси білків використовували білкові стандарти фірм “Pharmacia” та “TRIZМA”.

Дослідження ультраструктури тромбоцитів проводили методом трансмісійної електронної мікроскопії на зрізах за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100. Виділення, відмивання та фіксацію тромбоцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою [Васильева, 1982].

2. Результати досліджень та їх обговорення

Вивчення впливу основного субстрату NO-синтази (L-Arg) та її інгібіторів (L-NAME і аміногуанідину) на активність NOS, стан системи АОЗ та рівень ПОЛ тромбоцитів щурів у нормі та за умов експериментального стрептозотоцинового діабету. Введення аргініну у контролі викликало достовірне підвищення активності NO-синтази на 47%. Неспецифічний інгібітор (L-NAME) знижував вихідний рівень активності на 45%, а AG проявляв дуже слабку дію, що свідчить про незначний вклад iNOS у сумарну активність NOS у нормі.

За умов експериментального стрептозотоцинового діабету введення L-Arg призводило до зниження активності NOS на 29%. Імовірно, такий ефект можна пояснити інгібуванням активності фермента за принципом негативного зворотного зв'язку за умов значного збільшення концентрації NO. Відомо, що оксид азоту має здатність зв'язуватися з гемовою групою ферменту, знижуючи тим самим його активність [Albakri, 1996].

При введенні інгібіторів за умов стрептозотоцинового діабету спостерігалося пригнічення активності NOS в тромбоцитах щурів. Необхідно відзначити, що зниження активності цього ферменту у випадку дії AG (селективного інгібітора iNOS) за умов ЦД було утричі стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов даної патології.

Показано, що в тромбоцитах людей за умов ЦД 1-го типу в 1,9 рази зростає рівень експресії iNOS, здатної продукувати у значних кількостях NO. Останній проявляє цитотоксичну дію, взаємодіючи з О-2, і утворює потужний оксидант пероксинітрит ONOО-, котрий індукує пошкодження ДНК та інгібує активність багатьох ферментів шляхом посттрансляційних модифікацій. Таким чином, NO з фактора фізіологічної регуляції функції клітини за умов цукрового діабету перетворюється у фактор патогенезу.

Результати дослідження антиоксидантної системи кров'яних пластинок експериментальних тварин представлено в табл.1. Зниження супероксиддисмутазної активності тромбоцитів за умов стрептозотоцинового діабету на 39% може бути зумовлене неферментативним глікозилюванням і дією ONOО-. Відомо, що в тканинах людей, хворих на ЦД, а також у щурів із стрептозотоциновим діабетом рівень глікозилювання Cu,Zn-CОД зростає більш ніж у два рази, що веде до значного пригнічення її активності [Takata et al., 1996]. ONOО-, у свою чергу, нітрифікує СОД по тирозинових залишках з утворенням стабільного протеїнзв'язаного комплексу [Ischiropoulos, 2003]. Експериментально доведено, що глікозильовані білки легше піддаються модифікації пероксинітритом [Nagai et al., 2002]. Активність каталази в тромбоцитах щурів за умов стрептозотоцинового діабету зменшувалась на 29%. Зниження активності СОД і каталази внаслідок глікозилювання та окисної модифікації слід розглядати як фактор, який безпосередньо впливає на агрегаційну здатність тромбоцитів за умов ЦД, визначаючи, таким чином, розвиток судинних ускладнень. Імовірно, низька активність цих ферментів зумовлює ініціацію процесів ПОЛ у тромбоцитарних мембранах, що призводить до порушення їх фізико-хімічних властивостей [Mazzanti et al., 1997].

Пригнічення активності ГПО може бути зумовлене алостеричним інгібуванням ферменту NADPH, зниженням концентрації відновленого глутатіону за умов даної патології, а також глікозилюванням ферменту в тромбоцитах [Di Simplicio et al., 1995]. Зростання активності ГР може бути пов'язано із обмеженням використання NADPH у біосинтезі жирних кислот та зниженням співвідношення NADP/NADPH за умов діабету [Великий и др., 1992].

Співвідношення інтенсивності ПОЛ і активності системи АОЗ, що відображає степінь ендогенної інтоксикації в організмі, значною мірою залежить від рівня продукції NO. Введення L-аргініну та інгібіторів NO-синтаз як у нормі, так і за умов ЦД супроводжувалося підвищенням активності СОД різного ступеня. Каталазна активність змінювалася подібним чином. Глутатіонпероксидазна активність у випадку індукованого стрептозотоцином діабету на фоні введення L-Arg не зазнавала суттєвих змін, в той час як інгібітори NOS мали нормалізуючий вплив, тобто підвищували її активність. Введення аргініну приводило до підвищення активності ГР лише у нормі, тоді як інгібітори NO-синтаз однаковою мірою знижували цей показник лише у випадку ЦД.

Продемонстровано зростання рівня ТБК-позитивних продуктів в кров'яних пластинках у щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом на 78% порівняно з контролем (див. табл.1), що є наслідком збільшення вмісту активних кисневих метаболітів (АКМ) за умов інтенсифікації окисних процесів в тромбоцитах при даній патології. Виявлені зміни рівня ПОЛ в тромбоцитах при діабеті можуть бути пов'язані із модифікацією антиоксидантних ферментів як активним киснем, так і глюкозою.

Таким чином, за умов експериментального стрептозотоцинового діабету інтенсифікація ПОЛ на фоні зниження активності ферментів АОЗ в тромбоцитах може виступати одним із провідних факторів, що впливають на активацію кров'яних пластинок, і прискорюють розвиток ангіопатій, характерних для даної патології. АКМ та продукти вільнорадикального окислення можуть стимулювати агрегацію тромбоцитів як безпосередньо, так і впливати на неї через пошкодження клітинних мембран шляхом окисної модифікації мембранозв'язаних білків-транслокаторів та рецепторів агоністів. Аналізуючи зміни активності ферментів системи АОЗ тромбоцитів в контексті динаміки змін вмісту ТБК-позитивних продуктів на фоні введення інгібіторів NO-синтази, слід відмітити антиоксидантні властивості L-NAME та AG, введення яких супроводжувалося нормалізацією співвідношення процесів ПОЛ та інактивації АКМ.

Дослідження впливу L-Arg та інгібіторів NOS на рівень глюкози і глікозильованого гемоглобіну в крові експериментальних тварин та ультраструктуру тромбоцитів у нормі та за умов цукрового діабету 1-го типу. Виявлено, що при введенні L-аргініну рівень глюкози в крові зростав на 14%, а вміст глікозильованого гемоглобіну (HbA1c) в еритроцитах тварин із стрептозотоциновим діабетом підвищувався на 13%. Введення AG знижувало ці показники на 31 та 32% відповідно за рахунок пригнічення неферментативного глікозилювання білків.

Результати електронної мікроскопії свідчать, що тромбоцити за умов ЦД мають характерні ознаки активації та деградації. Це проявляється втратою тромбоцитами дископодібної форми, утворенням псевдоподій. В самих клітинах спостерігається зменшення електронної густини та зниження кількості -гранул. Інкубація кров'яних пластинок здорових донорів з L-Arg не призводила до суттєвих змін їх форми чи кількості гранул. Порівнюючи ультраструктуру тромбоцитів у хворих на ЦД 1-го типу до інкубації з L-Arg і після, слід відзначити наявність кров'яних пластинок з округлими псевдоподіями, що вказує на зворотну агрегацію.

Введення L-аргініну щурам з експериментальним діабетом посилювало пошкодження ультраструктури кров'яних пластинок. В той же час введення інгібіторів NO-синтази мало протекторний вплив на структуру тромбоцитів за умов цукрового діабету. Найбільш яскраво коригуючу дію виявляв аміногуанідин.

Таким чином, застосування інгібіторів NO-синтаз як фармакологічних чинників для запобігання розвитку судинних ускладнень за умов цукрового діабету 1-го типу може розглядатися як перспективний напрямок у створенні лікарських препаратів.

Вплив селективного інгібітора РІ-3-кінази вортманіну на агрегаційну здатність, активність NO-синтази та ультраструктуру тромбоцитів за досліджуваних умов. Як свідчать отримані результати, за умов цукрового діабету змінюється функціональний стан тромбоцитів, що було зареєстровано за підвищеною здатністю до агрегації. Інкубація збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) з вортманіном у здорових донорів призводить до різкого падіння агрегаційної здатності кров'яних пластинок, тоді як у хворих на ЦД 1-го типу цей ефект не спостерігається, що може свідчити про порушення шляхів трансдукції сигналу до білків цитоскелету, опосередкованих PI-3-кіназою, в тромбоцитах людей, хворих на цукровий діабет.

Збільшення концентрації кінцевих продуктів метаболізму NO - нітритів та нітратів (NO2-+NO3-) - після інкубації ЗТП з вортманіном у нормі свідчить про підвищення активності NO-синтази у тромбоцитах. Це узгоджується з даними прямого визначення вмісту NO та cGMP у тромбоцитах після інкубації з інгібіторами PI-3-кінази [Clutton et al., 2004]. За умов цукрового діабету вортманін не мав достовірного впливу на показник сумарної концентрації NO2- та NO3-.

У нормі фізіологічний дезагрегувальний вплив на тромбоцити здійснює NO, який продукується в клітині за участю ендотеліальної ізоформи NOS [Mazzanti, 1997]. Є дані про складні взаємовідносини РІ-3-кінази з системою NO-синтаз, які є відмінними для кожної ізоформи зокрема [Pahan et al., 1999; Snyder, 1999]. Антиагрегаційний вплив NO здійснює щонайменше двома шляхами: активацією гуанілатциклази та інгібуванням РІ-3-кінази [Pigazzi et al., 1999]. Як свідчать отримані нами дані, у нормі спостерігається адитивна дезагрегувальна дія NO та вортманіну, тоді як за умов цукрового діабету механізм корекції функціонального стану тромбоцитів є розрегульованим.

Для з'ясування впливу вортманіну на стан білків цитоскелету тромбоцитів були проведені дослідження їхньої ультраструктури методом трансмісійної електронної мікроскопії. На електронограмі кров'яних пластинок здорових донорів після інкубації з вортманіном зафіксовано абсолютно інертні клітини. -гранули та щільні тільця рівномірно розподіляються у цитоплазмі, тромбоцити мають округлу форму, характерну для неактивованої клітини. У хворих донорів кров'яні пластинки залишаються активованими, їхній грануломер переміщений у центр клітини, спостерігаються псевдоподії.

Вивчення динаміки транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної p85 субодиниці РІ-3-кінази при дії вортманіну та за умов індукції агрегації кров'яних пластинок різними концентраціями ADP. У результаті інкубації ЗТП з вортманіном у здорових донорів зростає рівень р85 у цитозольній фракції тромбоцитів (рис.5), тобто інгібітор перешкоджає інкорпорації РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію, що узгоджується із зниженням агрегаційної здатності кров'яних пластинок (див. табл.3). За умов ЦД 1-го типу інкубація з вортманіном теж викликає підвищення вмісту р85 у цитозольній фракції, але воно не супроводжується зміною агрегаційної здатності. На фоні зниження інкорпорації у цитоскелетну фракцію тромбоцитів РІ-3-кінази агрегаційна здатність кров'яних пластинок залишається дуже високою.

Проаналізовано in vitro вплив різних концентрацій індуктора агрегації ADP на рівень p85б у цитозольній фракції кров'яних пластинок за різних часових проміжків, що дало б можливість розмежувати окремі фази агрегації. У здорових донорів вміст р85 у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів спадає по мірі підвищення концентрації індуктора, а крива, яка характеризує динаміку транслокації РІ-3-кінази, що розраховувалася як відсоток від вихідного рівня, свідчить про поступально зростаючу інкорпорацію у цитоскелетну фракцію.

Для хворих на ЦД 1-го типу характерною є сповільнена інкорпорація при дії низьких концентрацій ADP (двофазна агрегація) і лише за умов дії високої концентрації агоніста агрегації (однофазна агрегація) були відмічені достовірні зміни вмісту р85 у тритон Х-100 розчинній фракції тромбоцитів та транслокації РІ-3-кінази у детергент-нерозчинну фракцію кров'яних пластинок.

Аналіз робіт, присвячених впливу NO на агрегаційну функцію тромбоцитів, свідчить про те, що він здійснюється на ранніх етапах активації кров'яних пластинок, тобто ще до інтегрин-залежної інкорпорації РІ-3-кінази у цитоскелет клітини [Guinebault et al., 1995]. Уповільнена транслокація РІ-3-кінази у цитоскелетну фракцію тромбоцитів за умов ЦД 1-го типу при дії ADP у низьких концентраціях на фоні високої агрегаційної здатності може свідчити про зниження контролю NO над процесами, що забезпечують зміни морфофункціонального стану кров'яних пластинок за умов даної патології.

При дослідженні постагрегаційної динаміки змін рівня р85б слід відзначити подібний профіль і фазний характер включення р85б у цитоскелетну фракцію тромбоцитів як у нормі, так і за умов цукрового діабету 1-го типу. При 4-х хвилинах інкубації з індуктором агрегації транслокація p85б спостерігалася лише за найнижчої концентрації ADP.

На підставі імуноблот-аналізів вмісту регуляторної p85б субодиниці РІ-3-кінази та іNOS показано, що підвищення експресії регуляторної р85б субодиниці за умов ЦД не перешкоджає індукції іNOS в мегакаріоцитах - попередниках тромбоцитів. Аналіз спектрів білків лізатів тромбоцитів здорових донорів і хворих на ЦД 1-го типу, що взаємодіють in vitro з конститутивно активованими формами високоафінних GTPаз Rac, Rho та Cdc42. При детальному аналізі отриманих електрофореграм виявлено суттєві зміни у спектрах ефекторних білків, які взаємодіють in vitro з активованими формами GST-Rho, -Rac, та -Cdc42. Білок p116 був присутній в GST-Rho-преципітатах лише в нормі, причому тільки в двох зразках. Відсутність даного білка в одному з контрольних зразків може свідчити про певні генетичні передумови для захворювання на цукровий діабет. Білок з молекулярною масою 90 кДа зв'язується з GST-Rac лише в лізатах тромбоцитів здорових донорів. Зміни у рівні зв'язування ефекторних білків з молекулярними масами 135, 155, 170, 250 і 300 кДа тільки в одному дослідженому зразку тромбоцитів, ізольованих із крові хворого на ЦД 1-го типу, може свідчити про конститутивну активацію Cdc42-залежного сигналювання. Подальша ідентифікація білків, що взаємодіють з низькомолекулярними G-білками підродини Rho, допоможе зрозуміти механізми, які залучені до регуляції морфофункціонального стану актинового цитоскелету тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу.

Висновки

аміногуанідин антиоксидантний діабет тромбоцит

Отримані результати доповнюють і розширюють уявлення про роль ферментативної системи антиоксидантного захисту і NO-залежних сигнальних шляхів у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів при цукровому діабеті 1-го типу та обґрунтовують можливості корекції метаболічних порушень за умов даної патології. Зміни в експресії та транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної р85б субодиниці фосфатидилінозит-3-кінази, неферментативне глікозилювання та зміна функціонального стану низькомолекулярних G-білків підродини Rho є провідними молекулярними механізмами порушення морфофункціонального стану тромбоцитів за умов цукрового діабету 1-го типу, яке виступає у ролі однієї з основних причин розвитку діабетичних мікро- та макроангіопатій.

1. За умов ЦД 1-го типу в кров'яних пластинках змінюється співвідношення активностей конститутивної та індуцибельної ізоформ NO-синтази. Посилення експресії та зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів лежать в основі розвитку оксидативного стресу і ведуть до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії.

2. У тромбоцитах при ЦД 1-го типу виявлено підвищення експресії та порушення процесу транслокації у детергент-нерозчинну фракцію регуляторної р85б субодиниці РІ-3-кінази, що може бути ланкою реципрокної регуляції активностей РІ-3-кінази та NO-синтази.

3. Досліджено вплив L-аргініну, L-NAME, аміногуанідину і вортманіну на ультраструктуру тромбоцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу in vitro та in vivo. Встановлено, що аміногуанідин має найбільший протекторний ефект на структуру тромбоцитів за умов цукрового діабету. L-аргінін посилює пошкодження ультраструктури кров'яних пластинок. Вортманін проявляє виражений вплив на стан білків цитоскелету тромбоцитів у нормі, проте не викликає таких змін при ЦД.

4. Для послаблення токсичної дії NO і корекції патологічного стану, пов'язаного з його гіперпродукцією в організмі за умов ЦД 1-го типу, доцільним є використання аміногуанідину як селективного інгібітора iNOS, антиоксиданта та інгібітора неферментативного глікозилювання.

5. Зміни у зв'язуванні специфічних ефекторних білків з низькомолекулярними G-білками підродини Rho у тромбоцитах людей, хворих на цукровий діабет 1-го типу (р60 і р90, що зв'язуються з GTPазою Rac; р75 і р116, що взаємодіють з Rho) можуть знайти застосування у молекулярній діагностиці генетичних передумов маніфестації і прогресування захворювання.

Література

1. Сибірна Н., Вовк О., Дробот Л. Роль фосфатидилінозит-3-кінази та індуцибельної NO-синтази у регуляції морфофункціонального стану тромбоцитів у разі інсулінозалежного цукрового діабету // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2003. - Вип. 34. - С.52-56.

2. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Кулачковський О.Р., Горбачевська І.В. Вплив вортманіну на ультратонку структуру тромбоцитів у нормі та за умов цукрового діабету I типу // Експ. та клін. фіз. і біох. - 2004. - №2(26). - С.121-124.

3. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Дробот Л.Б. Зміни функціонального стану низькомолекулярних G-білків тромбоцитів за цукрового діабету 1-го типу // Укр. біохім. журнал. - 2004. - Т.76, № 2. - С.117-120.

4. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Великий М.М. Роль фосфатидилінозитол-3-кінази в регуляції агрегаційної здатності тромбоцитів за цукрового діабету 1-го типу // Укр. біохім. журнал. - 2004. - Т. 76, № 5.- С. 96-101.

5. Сибірна Н., Вовк О., Бурда В., Федорович А. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи тромбоцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2004. - Вип.38. - С.50-56.

6. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Кулачковський О.Р., Вовк О.І., Зарицька М.В. Вплив аміногуанідину на структурно-функціональні властивості тромбоцитів при стрептозотоциновому діабеті у щурів // Тез. докл. науч.-практ. конф. “Международные дни диабета”. - Днепропетровск (Украина). - 2003. - Вып. 6. - С.116-117.

Размещено на Allbest.ru