Алгогенна дія RFa-подібних пептидів на периферичні сенсорні нерви: дані in vitro та in vivо

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Алгогенна дія RFa-подібних пептидів на периферичні сенсорні нерви: дані in vitro та in vivо

Юдін Євген Костянтинович

03.00.02 - біофізика

Київ - 2005

Анотація

Юдін Є.К. Алгогенна дія RFa-подібних пептидів на периферичні сенсорні нерви: дані in vitro та in vivо. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено дослідженню периферичної дії RF-амід (RFa)-споріднених пептидів. Використання електрофізіологічного методу in-vitro та реєстрації поведінки in-vivo дало змогу вивчити ефекти та можливі механізми дії FMRFa та ряду аналогів у периферичній ноцицепції. Нами показано, що RFa пептиди в значній мірі викликають активацію в більшості C-волокон у дослідах на препараті шкіра-нерв: 82% з 60 перевірених волокон з швидкістю проведення нижче 2 м/с відповідали довготривалим підвищенням частоти імпульсації на аплікацію пептидів (20 M). Амілорид обратимо викликав пригнічення збуджуючого ефекту RFa пептидів в 21 з 38 волокон, в інших 17 випадках він не завдавав істотного впливу на рівень викликаної активності у волокнах. Таким чином, збуджуюча дія RFa пептидів не може бути пояснена лише як взаємодія з ASICs. Підшкірна ін'екція NPSF в ділянку інервації n.saphenous призводить до чіткої больової поведінки як в ASIC3-/-, так і у мишей похідного генотипу C57BL/6J. Не було виявлено різниці в загальному часі вилизування уколотої кінцівки в ASIC3-/- (194±22 с) та C57BL/6J (227±25 с) тварин. Таким чином периферична алгогенна дія NPSF не може бути інтерпретована як дія на ASIC3 канали.

Ключові слова: RF-амід споріднені пептиди, поодинокі нервові волокна, ASICs, біль.

Annotation

Yudin Y.K. Algogenic effect of RFa related peptides on the peripheral sensory fibers: evidence in vitro and in vivo. - Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree on speciality 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

This work is devoted to investigation of peripheral action of RFamide (RFa)-related peptides. Using electrophysilogical method in-vitro and experiments in-vivo gave the possibility to explore effects and possible mechanisms of the action of FMRFa and its synthetic analogues in peripheral nociception. Here we demonstrate that RFa-related peptides powerfully excite the majority of C-fibres in the skin-nerve preparation of rat: 82 % of 60 tested fibres with the conduction velocity below 2 m/s responded with long-lasting discharges to the application of peptides (20 M). Amiloride reversibly inhibited the excitatory effects of RFa peptides in 21 out of 38 fibers, in another 17 cases it was uneffective. Thus, powerful excitatory action of RFa-related peptides cannot be interpreted solely in terms of their interaction with ASICs. Subcutaneous injections of the NPSF into the n.saphenous innervation area result in a nociceptive behavior in ASIC3-/- and wild-type C57BL/6J mice. There is no significant difference in the total time of licking of injected paw in the ASIC3-/- (194±22 s) and C57BL/6J (227±25 s) animals. Thus peripheral algogenic effects of NPSF cannot be explained only in terms of their action on the ASIC3 channels. Keywords: RF-amide related peptides, single sensory fibers, ASICs, pain.

Аннотация

Юдин Е.К. Алгогенное действие RFa подобных пептидов на периферические сенсорные нервы: данные in vitro и in vivо. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению периферического действия RF-амид (RFa)-подобных пептидов. Используя in-vitro метод внеклеточной регистрации частоты потенциалов действия при отведении от изолированного одиночного нервного волокна, нами была проверена роль FMRFa (Phe-Met-Arg-Phe-амід) и ряда синтетических аналогов в периферической ноцицепции. В опытах на препарате кожа-нерв n.saphenous крысы, нами показано, что RFa пептиды вызывают значительную активацию большинства немиелинизированных ноцицептивных C-волокон, в отличие от миелинизированных А-волокон. Так, 82 % из 60 проверенных волокон со скоростью проведения ниже 2 м/с отвечали повышением частоты импульсации на аппликацию пептидов (20 M), тогда как только 29 % А-волокон продемонстрировали подобную реакцию. Мы не обнаружили связи между чувствительностью исследованных волокон к действию пептидов и протонов. Из 33 C-волокон 64 % исследованых RFa-чувствительных C-волокон оказались нечувствительными к действию протонов. Неселективный блокатор протончувствительных каналов, амилорид, угнетал RFa пептид-вызванную активацию только в определнной группе волокон. Так, в 21 из 38 волокон было обнаружено подавление активности, вызванной действием RFa пептидов, а в остальных 17 случаях амилорид не вызывал существенного изменения в пептид вызванной активации. Таким образом, возбуждающее действие RFa-подобных пептидов не может быть объяснено только как результат модуляции ионных токов, вызванных активацией ASICs. В результате исследований активности, вызванной механической стимуляцией одиночных нервных волокон было обнаружено, что RFa пептиды модулируют активность, вызванную как болевой, так и неболевой механической стимуляцией кожи. Неожиданным для нас оказался тот факт, что RFa пептиды вызывают на одном препарате два разнонаправленных эффекта. Анализ показал, что ответы на болевой стимул усиливались в 50 % исследованных С-волокон, в то время как в 44 % А-волокон, чувствительных к тактильным неболевым стимулам, механически вызванная активность под действием RFa пептидов угнеталась. Используя поведенческие опыты in-vivo было подтверждено алгогенное действие RFa пептидов при подкожной инъекции в область лапы, которая иннервируется n.saphenous. При этом изменялись как болевые (длительность и количество лизаний уклолотой лапы), так и некоторые из регистрируемых неболевых параметров поведения животных. Подкожная инъекция эндогенного пептида млекопитающих, NPSF, приводила к четкому алгогенному эффекту как у ASIC3-/- животных, так и у мышей исходного генотипа C57BL/6J. При этом, нее было выявлено разницы в общем времени вылизывания уколотой конечности как у ASIC3-/- (194±22 с), так и у C57BL/6J (227±25 с) животных. Поэтому периферическое алгогенное действие NPSF не может быть интерпретировано как действие на ASIC3 каналы. Таким образом, на основе полученных нами данных можно сделать вывод, что RFa пептиды действуют непосредственно на окончания первичных сенсорных нейронов, вызывая болевой эффект.

Ключевые слова: RF-амид подобные пептиды, одиночные нервные волокна, ASICs, боль.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Історія RFa-споріднених пептидів почалась з ідентифікації фізіологічно активного тетрапептиду FMRFa (Phe-Met-Arg-Phe-амід) в молюсках. Щонайменше існування п'яти генів RFа пептидів було виявлено у ссавців. Вони кодують NPFF, NPSF, NPAF та нещодавно винайдені нові пептиди. У ссавців RFa пептиди беруть участь в модуляції функцій опіатних рецепторів, в регуляції серцево-судинної діяльності та у сприйнятті болю в ЦНС. При інтрацеребровентрикулярному введенні FMRFa чи NPFF демонструють антиопіоідні властивості та зменшують викликану морфієм аналгезію. Інтратекальне ж введення NPFF призводить до тривалого знеболювання і підсилює антибольові ефекти морфію. В ізольованих задньокорінцевих нейронах RFa пептиди модулюють рН викликані струми, що течуть через протончутливі канали ASICs в нейронах сенсорних гангліїв.

При цьому було виявлено потенціацію струмів та уповільнення кінетики їх десенситизації. Детальні дослідження показали, що ці пептиди по різному діють на різні субодиниці ASICs. Оскільки для протончутливих каналів було показано їх експресію для всіх типів сенсорних нейронів, в тому числі і для маленьких, припустимо ноцицептивних нейронів була висунута гіпотеза про те, що ці канали відіграють роль в сприйнятті сенсорної інформації на періферії. In-vitro та in-vivo експерименти, проведені на тваринах, нокаутних по ASICs генам, вказують на участь каналів цього сімейства у сприйнятті деяких сенсорних модальностей, включаючи механочутливість, ноцицептивну чутливість та більш специфічну протончутливість. Однак роль субодиниць ASICs в сприйнятті больових стимулів на периферії до цього часу чітко не встановлена. Зокрема виникає питання, чому периферичні міелінізовані закінчення нейронів великого розміру не чутливі до дії низького рН і чутливі до тактильних сенсорних стимулів, у той час як сома цих нейронів відповідає вхідним струмом на зміну рН.

Той факт, що NPFF було виявлено в задньокорінцевих нейронах малих та середніх розмірів, пов'язаних з малими афферентними A і C волокнами, а також вивільнення цього пептиду під час запалення вказує, що він може бути ефективним не тільки в ЦНС і спинному мозку, а й на периферії. Залучення RFa пептидів в процеси, пов'язані з болем, досить добре досліджені, однак всі отримані дані стосуються дії на центральні механізми, а оскільки RFa пептиди також модулюють ASICs струми, це може бути свідченням можливої алгогенної дії цього класу пептидів на периферії. Таким чином, у зв'язку з виявленою можливістю модуляції ASICs струмів RFa пептидами стало актуальним питання, яким чином RFa пептиди діють на периферичні сенсорні системи і чи опосередкована їх дія модуляцію ASICs.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у вивченні дії RFa-подібних пептидів на рівень активності ізольованих поодиноких волокон n.saphenous шкіри, та ефекту, що можуть викликати ці пептиди при підшкірному введені в область інервації n.saphenous в in-vivo експериментах. Завдання роботи полягали в наступному:

1. Використовуючи in-vitro метод зовнішньоклітинної реєстрації частоти потенциалів дії (ПД) при відведенні від ізольованого поодинокого нервового волокна та перфузії препарата шкіри, що інервується n.saphenous, провести ідентифікацію волокон по типам в залежності від швидкості проведення, а також по модальностям стимулів, на які відповідають периферичні рецептори шкіри (механічні, термічні та хімічні стимули).

2. Використовуючи вищевказані методи, вивчити вплив RFa-подібних пептидів ендогенного та синтетичного походження на спонтанну та механічно викликану активність в ізольованих поодиноких нервових волокнах.

3. Виявити можливі механізми взаємодії RFa-подібніх пептидів з периферичними рецепторними системами.

4. Використовуючи поведінкову модель in-vivo, дослідити можливий ефект RFa пептидів при підшкірній ін'єкції у ділянку лапи, що інервується n.saphenous.

5. Використовуючи поведінкову модель in-vivo на мишах із зміненим генотипом, виявити можливий ефект RFa пептиду ендогенного походження, характерного для ссавців.

6. Вивчити можливу участь каналів ASIC3 у периферичній дії RFa пептидів.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі вперше проведено систематичне дослідження периферичної дії RFa-подібних пептидів на спонтанну та викликану активність поодиноких волокон n.saphenous (in-vitro), а також впливу цих пептидів на поведінку інтактних тварин (in-vivo) при ін'єкції пептидів в область інервації n.saphenous. Нами показано, що дія RFa пептидів полягає в активації спонтанної та модуляції механічновикликаної активності нервових волокон. Вперше показано, що RFa пептиди в основному діють на неміелінізовані ноцицептивні С-волокна. Вивчення можливого механізма дії RFa пептидів виявило, що їх вплив на рівень активності в ізольованих волокнах і на больову поведінку тварин лише частково може бути пояснений модуляцію струмів, що протікають через протончутливі канали.

Теоретичне та практичне значення роботи. Дана робота належить до галузі фундаментальних досліджень. Теоретичне значення отриманих результатів полягає у з'ясуванні можливих механізмів сприйняття стимулів, що надходять з периферії, та ролі рецепторних структур, що приймають участь в сприйнятті сенсорної інформації. Oтримані дані свідчать прo учacть RFa-подібніx пептидiв в сприйнятті болю та конкретизують роль протончутливих каналів в периферичній сенсориці та ноцицепції. Результати цієї роботи можуть бути використані при підготовці лекційних курсів по фізіології сенсорних систем. Значення методики реєстрації активності ізольованих поодиноких нервових волокон шкіри полягає у тому, що цей препарат є проміжним між дослідженнями на ізольованих сенсорних нейронах та дослідами на цілому організмі. Це дозволяє проводити системний аналіз інформації та експериментальних даних з усіх рівнів досліджень. Головним результатом даної роботи є знаходження нового класу периферичних алгогенів: за своєю ефективністю RFa-подібні пептиди можуть бути порівняні з такими відомими алгогенами як капсаїцин або АТФ. З практичної точки зору результати, отримані при проведені даної роботи, можуть бути використані для вибору найбільш перспективних пептидів при дослідженні in-vivo, а також для наступного синтезу потенціальних фармакологічних агентів, що діють як на протончутливі канали, так і на периферичні опіоідні рецептори. Винайдені в майбутньому антагоністи алгогенної дії пептидів можуть започаткувати новий клас анальгетиків.

Особистий внесок здобувача. Автором у співпраці з співробітницею інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, к.б.н. Тамаровою З.А. було проведено розробку методики зовнішньоклітинної реєстрації ПД в поодиноких нервових волокнах препаратa шкіра-n.saphenous in-vitro. Автором персонально було проведено усі електрофізіологічні експерименти з RFa пептидами та розробка відповідних лабораторних методик. Також у співпраці з Тамаровою З.А. було проведено експерименти in-vivo. Автором персонально було проведено усі повідінкoви експерименти з NPSF пептидoм на геномних мишах. Автором самостійно проведено аналіз всіх отриманих результатів та зроблено всі висновки.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення та висновки роботи доповідалися й обговорювалися на ІІ Міжнародному Сімпозіумі “Фізіологія та біофізика гладеньких м'язів“ (Київ, 2003), конференції молодих вчених Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН “Перспективні напрями досліджень сучасної фізіології“ (Київ, 2003), IBRO Advanced school of neuroscience “Receptors, channels, messengers” (Ялта, 2004), ІІІ Конференції Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2005), 30 Конгрес FEBS - 9 IUBMB конференції “Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization” (Будапешт, Венгрія, 2005).

2. Основний зміст роботи

Літературний огляд. Розглянута історія відкриття та дослідження RFa-споріднених пептидів, а також взаємодія пептидів даного класу з протончутливими каналами та G протеінзв'язаними рецепторами.

Матеріали та методи досліджень.

Електрофізіологічни дослідження in-vitro. В експериментах були використані дорослі щури самці лінії Вістар вагою 250-350 г. Для вивчення дії FMRFa та структурноспоріднених пептидів (FRRFа, FMVFа та KNFLRFa, концентрація 20-25 М) на спонтанну та механічно викликану активність в аферентних нервових закінченнях шкіри нами було використано препарат шкіра-n.saphenous in-vitro. Препарат уявляв собою шматок шкіри, який вирізався з нижньої третини гомілки та тильної поверхні стопи разом з іннервуючим цю частину шкіри нервом saphenous. Після цього препарат переносили в робочу камеру, де ізольовану ділянку шкіри фіксували волосяною поверхньею донизу, при цьому вільний кінець нерву продівався крізь отвір (d~ 0,2 мм) у суміжну камеру, заповнену мінеральною олією. Aерований розчин (95% O₂+5% CO₂) складу (в mM): 128 NaCl; 1,9 KCl; 1,2 KH₂PO₄; 0,69 MgSO₄; 25 NaHCO₃; 1,54 CaCl₂ та 10 глюкози, pH 7,40,1 термостатувався на рівні 301⁰ C та подавався у робочу камеру.

Під візуальним контролем нерв звільнявся від епіневрію та періневрію, після чого його розділяли на декілька філаментів, з яких відокремлювали поодинокі нервові волокна. Монополярне відведення ПД від ізольованого нервового волокна здійснювалося за допомогою активного платинового електроду. Для вимірювання швидкості проведення ПД по нервовому волокну застосовувалася електрична стимуляція в області рецептивного поля нервового закінчення. Волокна зі швидкістю проведення нижче 2 м/с розглядалися як немієлінізовані С-волокна, волокна зі швидкістю проведення від 2 до 14 м/с - як слабкомієлінізовані А-волокна, а волокна зі швидкістю проведення вище 14 м/с - як мієлінізовані А-волокна. Механічна активація волокна здійснювалася шляхом нанесення больового (укол голкою) та/чи небольового (дотик волосяним пензликом) стимулу в області рецептивного поля ізольованого поодинокого волокна. Механічна стимуляція здійснювалася за допомогою керованого електростимулятором електромагнітного релє, який переміщував голку чи пензлик. Статистичні розходження були оцінені t-Student тестом із рівнем значимості P0.05.

Поведінкові дослідження in-vivo. В експериментах були використані нелінійні білі миші, миші з порушеним генотипом лінії C57Bl/6J та миші з нокаутом гена ASIC3, які були виведені на основі мишей C57Bl/6J. Досліди проводилися на дорослих статевозрілих самцях вагою 20-32 г.

Пептиди FMRFa (2 мМ), KNFLRFа (1 та 2 мМ) та NPSF (2мМ) розчинялися у 0,9 % ізотонічному розчині NaCl. Ін'єкція здійснювалася в об'ємі 10 мкл розчину на 10 г ваги тварини, підшкірно у тильну поверхню задньої лівої кінцівки тварини, що іннервується нервом saphenous. В серії контрольних експериментів використовувався аналогічний об'єм 0,9 % розчину NaCl. У випадку білих нелінійних мишей, тварин розділяли на дві групи. Перша група мишей отримувала ін'єкцію розчину RFа пептиду, у випадку FMRFa n=15 та для кожної концентрації KNFLRFа n=5 відповідно. Друга група (n=15) була контрольною. У випадку лінійних мишей тварин розділяли на шість груп (по три групи тварин кожного генотипу, C57Bl/6J та ASIC3 -/- відповідно). Дві групи (n=12 у кожній групі) використовувались для реєстрації поведінки тварин в нормі (без будь-яких ін'єкцій). Дві групи тварин (n=10 у групі) отримували ін'єкцію розчину NPSF. Дві інші групи (n=10 у групі) були контрольними. Вимірувалися шість параметрів поведінки тварин: тривалість та кількість облизування уколотої кінцівки (больові параметри) та тривалість вмивання, сну, приймання їжі, бігу (небольові параметри). Усі параметри реєструвалися протягом 60 хвилин після ін'єкції. Статистичні розходження були оцінені дисперсійним аналізом (ANOVA) та t-Student тестом із рівнем значимості P0.05. Усі реактиви, які були використані у роботі, а також пептид FMRFa було отримано від фірми “Sigma-Aldrich-Flucka”. Пептиди FRRFa, FMVFa та KNFLRFa були люб'язно надані доктором Леонідом Морозом (Університет Флориди, США). Пептид NPSF було люб'язно надано проф. М.Лаздунським (Франція).

Результати досліджень.

Вплив RFa пептидів на спонтанну активність у нервових волокнах. Загалом вплив RFa пептидів на фонову активність було досліджено для 265 ізольованих поодиноких нервових волокон n.saphenous. З них, під дією RFa пептидів, активація спостерігалася у 125 волокнах. З усієї сукупності досліджених волокон 60 мали швидкість проведення нижче 2 м/с, що відповідає немієлінізованим С-волокнам та 155 волокон мали швидкість проведення вище 2 м/с, що відповідає слабкомієлінізованим А-волокнам та мієлінізованим А-волокнам. Співставлення характеру реакції та швидкості проведення показало, що ефект активації під дією RFa пептидів переважав в повільнопровідних волокнах, а відсутність реакції - в швидкопровідних. А саме: 82% волокон зі швидкістю проведення нижче 2 м/с (С-волокна) відповідали на аплікацію пептидів з підвищеням частоти ПД, на відміну від А-волокон. Так, в групі А-волокон (n=98) в 35% спостерігалася активація під дією RFa пептидів, у той же час у групі А-волокон (n=57) лише у 19% спостерігалася схожа реакція.

Залежність доза-ефект. Для більш надійного дослідження модулюючих властивостей RFa пептидів на спонтанну активність нами було проведено вивчення залежності доза-ефект. Концентрації змінювались від 10 до 100 М. Ці експерименти показали, що дія протестованих RFa пептидів стає незначною при концентрації 10 М. При збільшенні концентрації спостерігалося значне збільшення частоти імпульсації та часу відповіді.

Залежність ефекту RFa пептидів від рН середовища. Нами було досліджено вплив RFa пептидів на активність нервових закінчень сенсорних нейронів як при рН розчину 5,2, так і при рН 7,4, а також ефекту самого рН 5,2. У першій серії експериментів ми дослідили вплив зміни рН середовища з 7,4 на 5,2 на рівень активністі ізольованих нервових волокон. При цьому спостерігалося підвищення активністі в деяких поодиноких нервових волокнах. А саме: з 122 досліджених волокон під впливом зміни рН середовища в 47 волокнах спостерігалася активація. З них 19 волокон відносяться до групи С-волокон та 28 волокон відносяться до групи А-волокон. При аналізі виявилось, що аплікація розчину з рН 5,2 протягом 2 хвилин призводить до поступового підвищення рівня активності у волокні, що може свідчити про сенситизацію волокон до низького рН. У другій серії експериментів нами було проведено послідовні аплікації розчину з рН 5,2, пептиду при рН 5,2 та пептиду у нормальному розчині з рН 7,4. При цьому було виявлено, що RFa пептиди мають збуджуючий ефект на нервові закінчення як при рН 5,2, так і при рН 7,4, тобто незалежно від рН середовища. Так, з 34 C-волокон, які були нами використані у цій серії дослідів, 28 активувалися під впливом пептидів, 18 були нечутливими до дії протонів і лише 14 активувалися як під дією пептидів, так і pH = 5,2. Таким чином, 64% перевірених RFa-чутливих C-волокон виявилися нечутливими до дії протонів.

Взаємодія RFa-подібних пептидів з протончутливими каналами. Виникає запитання: чи опосередкована збуджуюча дія RFa пептидів на периферичні сенсорні волокна безпосередньою взаємодією з протончутливими каналами (ASICs), як раніш було показано для модулюючого впливу RFa пептидів на ізольованих нейронах? Для цього нами було використано неселективний блокатор протончутливих каналів - амілорид. Було виявлено, що лише в 21 з 38 пептид-чутливих волокон амілорид викликав часткове пригнічення збуджуючого ефекта RFa пептидів. В інших 17 випадках аплікація амілориду не призводила до жодних змін в активації волокон під дією RFa пептидів.

Аналіз по швидкостям проведення показав, що у групі волокон, де амілорид не виявляв свого пригнічуючого ефекта, 59 % волокон являються С-волокнами і, навпаки, у групі, де амілорид пригнічував RFa-викликану активацію, лише 38 % С-волокон. Таким чином, амілорид викликав пригнічення збуджуючого ефекту RFa пептидів в 8 з 18 (44 %) перевірених волокон зі швідкістю проведення нижче 2 м/с та у 13 з 20 (65 %) волокон зі швідкістю проведення більше 2 м/с. Взаємодія RFa-подібних пептидів з опіатними рецепторами. Для вирішення питання про можливу взаємодію RFa пептидів з периферичними опіоїдними рецепторами нами було проведено серію дослідів з використанням морфіна,

неселективного агоніста -, - та -опіоїдних рецепторів. В результаті проведених дослідів нами було показано, що з 14 волокон, в яких спострерігалася активація під дією RFa пептидів, в 10 волокнах морфін не впливав на рівень активації волокон пептидом. І лише в 4 волокнах спостерігалося часткове пригнічення відповіді на аплікацію пептидів під дією морфіну.

Адаптація в волокнах під дією RFa-подібних пептидів. Для нервових волокон спостерігалось два типи відповідей на аплікацію RFa-пептидів. Так, для однієї групи волокон, не зважаючи на тривалу аплікацію пептиду, спостерігалося повільне зниження частоти розрядів, тобто адаптація, у другій групі волокон адаптація була майже відсутня, що може свідчити про існування різних механізмів дії RFa-пептидів на периферії.

Порівняння волокон, в яких спостерігалася акомодація чи її відсутність, з впливом амілориду на викликану активацію під дією RFa пептидів у волокнах показав, що в волокнах, де амілорид пригнічував відповідь, в 13 з 18 (72 %) спостерігалася відсутність акомодації. І навпаки, в волокнах, де спостерігалася акомодація, в 8 з 12 волокон (67 %) дія амілориду на викликану активацію була відсутня. Можна припустити, що у випадку внутрішньотканевої флуктуації рН, достатньої для того, щоб викликати активацію струмів через ASICs, ендогенні RFa пептиди можуть відігравати значну роль в фасилітації цих струмів і, таким чином, призводити до значного підвищення сенсорної інформації, що надходить з периферичних рецепторів. Відсутність акомодації в 72 % амілоридчутливих волокон добре співпадає з фактом поступової сенситизації волокон до дії низького рН (5,2). Все це може свідчити про те, що у деякій частині волокон дія RFa пептидів визначається модуляцією протонвикликаних струмів.

Больовий ефект RFa-подібних пептидів in-vivo. Значний активуючий ефект RFа пептидів на спонтанну активність поодиноких нервових волокон, особливо ноцицептивних неміелінізованих С-волокон на ізольованому препараті шкіра-нерв, може свідчити про їх можливу алгогенну роль. Для виявлення впливу, який мають RFa пептиди при периферичному введенні, нами було використано підшкірну ін'єкцію в ділянку, яка іннервується n.saphenous. Рис. 8 демонструє зміну в поведінці нелінійних мишей після введення RFa пептидів. Так, введення FMRFa чи KNFLRFa викликає значне збільшення часу вилизування тваринами уколотої кінцівки в порівнянні з контрольною серією дослідів, під час яких вводився 0,9 % NaCl. Вивчення больової поведінки у випадку KNFLRFa показало чіткий доза-залежний ефект RFa пептидів. Так, збільшення концентрації пептиду призвело до збільшення часу вилизування кінцівки майже у 1,6 рази: з 138 с до 228 с протягом 60 хв спостереження.

Після підшкірної ін'єкції пептидів змінилися не тільки больові, але й деякі небольові параметри поведінки тварин (табл.1). Так, після введення FMRFa пептиду для двох виміряних больових та одного небольового параметрів поведінки було виявлено суттєві розбіжності. F-значення ANOVA F_1,28=15,78 (р0,001) для тривалості лизання уколотої кінцівки та 2,69 (р0,05) для кількості облизувань. Для їжі F_1,28=6,12 (р0,05). Введення FMRFa викликало значне збільшення загального часу лизання уколотої кінцівки (4,5 раз, p<0,001) у порівнянні з контролем. Кількість облизувань також було більше в 2,28 рази (p<0,05). Щодо небольових параметрів, то час прийому їжі скоротився після ін'єкції FMRFa в 2,5 рази (p<0,05) в порівнянні з контрольною групою тварин.

Після введення 1 mM KNFLRFa загальний час лизання уколотої лапи збільшився в 5,4 рази (p<0,01), кількість облизувань збільшилася в 3 рази (p<0,05) в порівнянні з контролем.

Таблиця 1. Тривалість параметрів поведінки у мишей протягом 60 хвилин спостереження після підшкірного введення 0,9 % NaCl, 2 mM FMRFa, 1 mM та 2 mM KNFLRFa в ліву задню кінцівку. *р0,05; ** р0,01; *** р0,001 в порівнянні з групою отримавших ін'єкції NaCl (інакше не суттєво).

Після збільшення концентрації KNFLRFa до 2 mM збільшення часу лизання уколотої лапи було більш значним (8,8 рази в порівнянні з контрольною групою, p<0,001). У випадку KNFLRFa F_2,22=25,24 (p<0,001) для тривалості лизання уколотої лапи і 28,48 (p<0,001) для кількості облизувань. Для небольових параметрів F-значення (F_2,22) було 3,79 (p<0,05) для їжі. Таким чином, підшкірна ін'єкція RFa пептидів викликає у мишей достовірне збільшення часу та кількості циклів лизання ураженої кінцівки, а також достовірне скорочення часу споживання їжі.

Порівняльний аналіз поведінки мишей лінії C57BL/6J та мишей з нокаутом гена ASIC3 при підшкірній ін'єкції NPSF. Для виявлення ролі ендогенних RFa пептидів ссавців нами було проведено in-vivo дослідження периферичного ефекту NPSF. Підшкірна ін'єкція розчину NPSF у ліву задню кінцівку призводила до значних змін у поведінці тварин обох генетичних груп у порівнянні з контрольною ін'єкцією NaCl (табл. 2). У групі C57BL/6J мишей ін'єкція NPSF викликала значні зміни в усіх вимірюваних параметрах поведінки, окрім вмивання. F-значення ANOVA F_2,29=50,98 (р 0,001) для тривалості лизання вколотої кінцівки та 34,05 (р0,001) для кількості облизувань. Для небольових параметрів F_2,29=5,21 (р0,05) для сну та 7,51 (р0,01) для бігу. Так, час вилизування уколотої кінцівки був у 6,8 разів довшим (p<0,05) у порівнянні з контролем. Кількість облизувань уколотої кінцівки у цих тварин також зросла у 3,4 рази (p<0,001). Окрім цих параметрів, також скоротився період сну в 2,4 рази (p<0,05), а загальний час бігу по клітці збільшився в 3,9 разів після введення NPSF (p<0,01).

Таблиця 2. Тривалість параметрів поведінки у мишей протягом 60 хвилин спостереження після підшкірного введення 0,9 % NaCl чи 2 mM NPSF в ліву задню кінцівку. *р0,05; ** р0,01; *** р0,001 в порівнянні з C57BL/6J мишами (інакше не суттєво).

Ці дані вказують, що підшкірна ін'єкція NPSF призводить до збільшення параметрів поведінки, які характеризують дію пептиду як алгогенну. Схожа реакція на ін'єкцію NPSF спостерігалася у групі мишей з нокаутом гена ASIC3. F-значення ANOVA F_2,29=45,31 (р0,001) для тривалості лизання уколотої кінцівки та 133,6 (р0,001) кількості облизувань. Для небольових параметрів F_2,29=5,3 (р0,05) для сну та 5,32 (р0,001) для вмивання. Час вилизування уколотої кінцівки збільшився у 4 рази (p<0,001) у порівнянні з контролем. Кількість облизувань у цих тварин після ін'єкції NPSF також зросла: у 3,2 рази (p<0,001). Також, скоротився у 6 разів (p<0,01) період сна. Таким чином, не спостерігалось жодної різниці на підшкірне введення NPSF у реакції тварин обох генотипів, які були використані у цій серії експериментів.

Ці результати демонструють, що підшкірна ін'єкція NPSF викликає значну зміну в поведінці як C57BL/6J, так і ASIC3 -/- мишей.

Відповіді поодиноких волокон на механічне подразнення шкіри у нормі. В експериментах на ізольованому препараті шкіра-n.saphenous було вивчено дію FMRFa та структурно спорідненого до нього пептиду FRRFа на активність 44 поодиноких аферентних волокон, викликану механічним подразненням шкіри. Швидкість проведення досліджених волокон змінювалася від 0,3 до 29 м/с, що відповідає групам волокон С, А і А. З них 10 волокон відносяться до групи С-волокон (діапазон швидкостей проведения 0,3-1,3 м/с), 27 волокон - до групи А (діапазон швидкостей проведення 3-13 м/с), та 7 волокон - до А (діапазон швидкостей проведення 17-29 м/с). З усієї популяції волокон відповіді на больовой стимул (укол шкіри голкою) було вивчено для 40 волокон, з яких 5 відповідали також на небольовий стимул (дотик волосяним пензликом). Також відповіді 4 волокон були вивчені тільки на небольовий стимул. При цьому на больовий стимул відповідали як С-волокна (n=10) так і А-волокна (n=30), тоді як на небольовий стимул з 18 досліджених (5 С- та 13 А-волокон) відповідали тільки 9 волокон, і всі вони відносяться до группи А-волокон з високими швидкостями проведення.

Модуляція RFa пептидами відповідей, викликаних нанесенням больового механічного стимула. Модулюючий вплив RFa пептидів (рН=7,4) на відповіді, викликані больовим механічним подразненням шкіри (укол голкою), було вивчено для 40 поодиноких нервових волокон. З них 10 відносяться до групи С-волокон (25 %) та 30 до групи А-волокон (75 %). На фоні аплікації RFa пептидів у більшості С-волокон спостерігалося чітке полегшення відповіді на больове подразнення нервових закінчень шкіри (рис. 10), що виражалося у збільшенні кількості ПД чи зменшенні тривалості латентного періоду першого ПД. Так, у 5 з 10 С-волокон (50 %) під впливом RFa-подібних пептидів спостерігався ефект полегшення. У 4 волокнах (40 %) відповідь не змінювалась, і лише в одному волокні (10 %) спостерігався ефект пригнічення, що виражалось у зменшенні кількості ПД чи збільшенні тривалості латентного періоду першого ПД.

В групі А-волокон реакція була протилежною. Так, для 13 з 30 А-волокон (44 %) відповіді, викликані больовим механічним подразненням шкіри, виявилися пригніченими. У 10 волокнах (33 %) характер відповіді не змінювався під дією RFa пептидів, і лише у 7 волокнах (23 %) спостерігалося полегшення відповіді. Також було виявлено, що для 3 волокон похідний ефект полегшення під дією RFa пептидів змінювався на подальший ефект пригнічення відповіді. Таким чином, дослідження результатів дії RFa пептидів на відповіді, викликані нанесенням больового механічного стимулу, в двух групах волокон виявилися у своїй більшості протилежно направленими. Також слід відмітити той факт, що ефект пригнічення відповідей на механічний больовий стимул під дією RFa пептидів у часі розвивався пізніше, на 30-180 с у порівнянні з ефектом полегшення, який розвивався значно швидше, вже через 15-30 с після аплікації пептидів. У середньому латентний період для ефекту полегшення складав 182 с (n=8), а пригнічення 10913 с (n=15). Різниця статистично достовірна (р<0,001). Це дозволяє припустити, що ефекти полегшення та пригнічення відповідей на больовий стимул під впливом RFa пептидів реалізуються через різні клітинні механізми.

Модуляція RFa пептидами відповідей, викликаних нанесенням небольового механічного стимула. Модулюючий вплив RFa пептидів (рН=7,4) на відповіді, викликані небольовим механічним подразненням шкіри (дотик пензликом), було перевірено для 9 поодиноких волокон. Всі волокна, які відповідали на небольовий стимул, відносяться до групи А-волокон. При аплікації RFa пептидів у 3 з 9 (33 %) волокон, відповідь на небольовий стимул пригнічувалася. У 5 (56 %) волокнах, відповідь на механічне підразнення, під впливом пептида не змінювалася у порівнянні з контролем. І лише в одному волокні (11 %) відповідь, викликана дотиком пензлика, полегшувалася під дією пептида (рис. 11 А).

Обговорення результатів.

Протончутливі канали на периферії. На відміну від рецепторних систем соми нейронів, які досить глибоко досліджені, механізми сприйняття стимулів на периферії та самі молекулярні рецепторні структури залишаються досить слабо вивченими, і тут існує більше припущень, ніж чітко доведених механизмів. Накопичені в результаті дослідів на ізольованих нейронах дані про значну роль в сенсорних функціях сімейства протончутливих іонних каналів (ASICs) переосмислюються лише в останні роки. Одне з питаннь: чому периферичні закінчення нейронів великого розміру не чутливі до дії низького рН і чутливі до тактильних сенсорних стимулів, у той час як сома цих нейронів відповідає вхідним струмом на зміну рН?

Проведені нами досліди по вивченню сенсорних властивостей ізольованих аферентних нервових волокон показали, що лише менша частина загальної популяції волокон, які інервують шкіру, активуються під впливом низького рН (5,2). Так, з 122 волокон лише в 38 % спостерігалася активація протягом аплікації розчину з рН 5,2. Отримані нами результати про рН-чутливість нервових закінчень добре співпадають з раніш отриманими даними про вплив низького рН на механочутливі сенсорні волокна шкіри {Steen, Reeh, et al. ID: 214}.

Дія RFa-подібних пептидів на сенсорні поодинокі волокна. З 265 досліджених волокон під дією RFa пептидів активація спостерігалася у 125 сенсорних волокнах. Аналіз по типам волокон, в яких спостерігався цей ефект, показав, що ефект активації під дією RFa пептидів переважає в повільнопровідних волокнах, а відсутність реакції - в швидкопровідних. В групі С-волокон (n=60) 82 % відповідали на аплікацію пептидів з підвищенням частоти ПД, на відміну від А-волокон, де лише 29 % волокон продемонстрували подібний характер реакції. Припустимо, що частина А-волокон в області своїх терміналій втрачають мієлінізовану оболонку і також мають немієлінізовані закінчення, завдяки чому збільшується чутливість нервових волокон до дії RFa пептидів. Оскільки припускалося, що дія RFa пептидів на нервові закінчення в шкірі опосередкована модуляцією струмів в протончутливих каналах, як це було показано для соми сенсорних нейронів, для більш чіткого дослідження як ефекту самого рН, так і ефекту RFa пептидів нами було вивчено ефект послідовних аплікації розчину з рН 5,2, RFa пептиду при рН 5,2 та RFa пептиду у нормальному розчині з рН 7,4 на спонтанну активність аферентих нервових волокон. При цьому було виявлено, що RFa пептиди мають збуджуючий ефект на нервові закінчення як при рН 5,2 так і при рН 7,4, тобто незалежно від рН середовища. На основі отриманих нами результатів можна припустити, що збуджуючий ефект RFa пептидів та розчину з рН 5,2 проявляється окремо, і їх конвергенція через ASICs може представляти лише одну з можливих комбінацій їх дії. Також припустимо, що у випадку флуктуації внутрішньотканевого рН, достатнього для активації ASICs струму, ендогенні RFa пептиди можуть відігравати фасілітаційну роль на протонвикликані струми в ASICs. Точність контролю рН в великих кровоносних судинах составляє ±0,01 одиницю рН: зсув рН крові з 7,4 до 7,2 являєтся вже небезпечним для життя, а флуктуації цього параметру для плазми при нормальному функціюванні не перевищують ±0,03 одиниці рН. Однак локальні зміни рН можуть бути значно більшими, звичайно вони викликані порушеннями в переносі та забезпеченні тканин киснем і, таким чином, призводять до ацидозу тканин. Також практично всі продукти екзоцитозу мають кислий рН, включаючи продукти секреторної активності тучних клітин.

Взаємодія RFa-подібних пептидів з протончутливими каналами. Як було нами показано, збуджуючий ефект RFa пептидів на сенсорні волокна лише у в 21 з 38 протестованих пептид-чутливих волокон виявився амілорид залежним. В інших 17 випадках аплікація амілориду не змінювала рівень активації у волокнах під дією RFa пептидів. Однак, оскільки амілорид не є специфічним блокатором і діє не тільки на ASICs, а й на інші епітеліальні Na⁺-канали, а також впливає на Na⁺/Ca²⁺ обміники та Na⁺/H⁺ антипорт, можлива його неселективна дія. Тому чутливість до дії амілориду можна вважати як необхідну, але недостатню умову для того, щоб розглядати ефект RFa пептидів як безпосередній, що здійснюється через модуляцію протонвикликаних струмів. Таким чином, можна зробити висновок, що ефект RFa пептидів лише частково опосередкований дією на ASICs канали.

В результаті наших досліджень механічновикликаної активності в поодиноких нервових волокнах виявилося, що RFa пептидів також модулюють активність, викликану больовим та небольовим подразненням шкіри. Для нас несподіваним виявився той факт, що RFa пептиди викликають на одному препараті два різнонаправлені ефекти. Як виявилося, відповіді на больовий стимул підсилювалися у 50 % досліджених С-волокон і навпаки, для 44 % А-волокон, які чутливі до тактильних (не больових) стимулів, активність пригнічувалася. Дані, що RFa пептиди вивільняються при процесах запалення та ішемії, дозволяють припустити, що при цьому підвищується чутливість до болю рецепторів шкіри, в першу чергу ноцицепторів, збудження від яких передається по немієлінізованим С-волокнам і, таким чином, можна припустити, що RFa пептиди приймають участь в процесах механічної сенситизації і гіпералгезії аферентів шкіри.

Таким чином, нами показано, що RFa пептиди діють прямо на периферичні ноцицептори та викликають значну активацію, а також сенситизацію немієлінізованих C-волокон, які відповідають за інервацію шкіри. Тобто, RFa пептиди можна розглядати як один з типів алгогенних речовин. Це спонукало нас до вивчення можливого ефекту RFa пептидів при їх підшкірній ін'єкції in-vivo і впливу, який вони можуть оказати на поведінку тварин при периферичному введенні. Дані, які були намі отрімани в результаті цих дослідів, показали, що RFa пептиди викликають больову реакцію, яка виражається в значному підвищенні часу лизання уколотої кінцівки у тварин у порівнянні з контролем, а також зміни інших небольових параматрів поведінки. Це лише підтверджує результати, які були нами отримані в результаті in-vitro дослідів. Для вирішення питання про можливі механізми дії RFa пептидів, зокрема участі в цьому процесі ASIC3 каналів, нами було проведено серію дослідів на мишах, нокаутних по цьому гену. Підшкірне введення в область інервації n.saphenous ендогенного RFa пептида NPSF, який було вперше ізольовано саме з щурів, призводило до значної зміни поведінки мишей. При цьому значно зростала тривалість лизання уколотої кінцівки, а також змінювалися деякі з небольових параметрів поведінки у порівнянні з тваринами, які отримували ін'єкції NaCl. Однак, для нас виявився несподіваним той факт, що параметри поведінки, як больові, так і не больові, в двох генетичних групах тварин (C57BL/6J I ASIC3-/-) не відрізнялися між собою. Оскільки, як було показано, RFa пептиди викликають модуляцію протонвикликаних струмів головним чином в ASIC3 {Xie, Price, et al. ID: 207}, очікувалося, що втрата гену цього каналу призведе до зміни у параметрах поведінки при болі, що викликана ін'єкцією NPSF. Але втрата ASIC3 гену не завдала жодних істотних змін. Таким чином, алгогенна дія RFa пептидів на периферичні нервові закінчення не може бути інтерепретована як результат їх дії на ASIC3 канали. Також треба відмітити, що FMRFa та NPFF, окрім ASIC3, також модулюють гомомерні канали ASIC1 шляхом уповільнення кінетики інактивації {Askwith, Cheng, et al. 2000 ID: 82}. Відповідно ці результати не можуть виключити повністю можливе залучення представників сімейства протончутливих каналів в алгогенну дію RFa пептидів на периферії.

Взаємодія RFa-подібних пептидів з опіатними рецепторами. Однак, припустимо існує і інший механізм дії RFa пептидів на периферії. Велика кількість експериментальних даних вказують на опосередковану взаємодією RFa пептидів з системою опіатних рецепторів. Для виявлення можливості взаємодії RFa-подібних пептидів з системою опіатних рецепторів на периферії нами було проведено попередні досліди по вивченню впливу неселективного агоністу морфіну на активацію, викликану дією RFa пептидів, на ізольовані нервові волокна. Так, в 10 з 14 досліджених волокон, в яких спостерігалася пептид викликана активація, морфін не завдавав жодних змін в активності, яка спостерігалася у волокні, у той час в 4 з 10 волокон спостерігалося часткове пригнічення відповіді на пептид.

Bідсутність пригнічення RFa викликаної активності під дією морфіну не дозволяє однозначно вирішити, чи є взаємодія між системами опіатних рецепторів і пептидів в сенсорних нервових волокнах. Механізми дії RFa пептидів на периферії вимагають подальшого вивчення.

Таким чином, на основі отриманих нами даних можливо зробити висновок, що RFa пептиди діють прямим чином на закінчення первинних сенсорних нейронів, викликая больовий ефект.

пептид нервовий периферичний інервація

Висновки